Αφηρημένο

Η υπερέκφραση ή ενεργοποίηση του στοιχείου δεσμευτική πρωτεΐνη κυκλικού ΑΜΡ-απόκρισης (CREB ) έχει γίνει γνωστό ότι εμπλέκονται σε διάφορες ανθρώπινες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα. Γονίδια που ρυθμίζονται από CREB έχουν αναφερθεί ότι καταστέλλουν την απόπτωση, επάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, φλεγμονή, και μετάσταση όγκου. Ωστόσο, τα κρίσιμα γονίδια στόχους του CREB στον καρκίνο του πνεύμονα δεν έχουν κατανοηθεί καλά. Εδώ, ταυτοποιήσαμε GSK-3α ως ένα από τα γονίδια-στόχους CREB η οποία είναι κρίσιμη για τη βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Η knockdown CREB μείωσε σημαντικά την έκφραση της GSK-3α και την άμεση σύνδεση του CREB στον υποκινητή του

GSK3A

ταυτοποιήθηκε. Η ανάλυση Kaplan-Meier με μια δημόσια βάση δεδομένων έδειξε μία προγνωστική σημασία του έκτροπου GSK-3α έκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα. Η αναστολή της GSK-3α κατέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα, σχηματισμό αποικιών, και την ανάπτυξη του όγκου. Για πρώτη φορά, αποδείξαμε ότι η GSK-3α ρυθμίζεται από CREB στον καρκίνο του πνεύμονα και απαιτείται για την βιωσιμότητα των κυττάρων. Τα ευρήματα αυτά εμπλέκουν άξονα CREB-GSK-3α ως νέο θεραπευτικό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Πάρκο ΑΕ, Lee JW, Herbst RS, Koo JS (2016) GSK-3α είναι ένα μυθιστόρημα στόχος του CREB και CREB-GSK-3α Σηματοδοσίας Συμμετέχει στο κυττάρων Βιωσιμότητα στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 11 (4): e0153075. doi: 10.1371 /journal.pone.0153075

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 6 Φεβρουαρίου 2015? Αποδεκτές: 23 Μαρτίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 6 Απριλίου 2016

Copyright: © 2016 Πάρκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου επιχορήγηση R01-CA126801 (σε Ja Seok Koo) και το Αντικαρκινικό Κέντρο υποστήριξης Grant CA-16359 (για τον Καρκίνο Yale Κέντρο). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η κυκλική πρωτεΐνη στοιχείο δέσμευσης ΑΜΡ-απόκρισης παράγοντα μεταγραφής (CREB) ρυθμίζει διάφορες κυτταρικές διεργασίες που περιλαμβάνουν κυτταρική διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, το μεταβολισμό της γλυκόζης, το ανοσοποιητικό ρύθμιση, και τη συναπτική πλαστικότητα που συνδέονται με τη μνήμη [1-7] . Προηγουμένως, δείξαμε ότι το CREB είναι κρίσιμη για τη ρύθμιση των βλεννωδών διαφοροποίησης φυσιολογικών κυττάρων ανθρώπινης τραχειοβρογχικού επιθηλιακά (NHTBE) [8]. Επιπλέον, η μειωμένη διάρκεια επιβίωσης συσχετίστηκε σημαντικά με υπερέκφραση του CREB ή ενεργοποιημένου CREB (ρ-CREB) σε μη καπνιστές με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [9] και ο knockdown του CREB καταστέλλει την βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα [10]. Αρκετές κινάσες σερίνης-θρεονίνης μπορεί να ενεργοποιήσει CREB και ρ-CREB επάγει την έκφραση πολλαπλών γονιδίων των στοιχείων που περιέχουν απόκρισης cAMP, εκείνοι των οποίων παίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του CREB. Αρκετές προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση γονιδίων-στόχων CREB αναφερθεί [11-14], αλλά διακριτά γονίδια στόχους του CREB στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

GSK-3, η οποία έχει δύο ισομορφές της GSK-3α και GSK- 3β, είναι μία πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης η οποία εμπλέκεται στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση και απόπτωση. Η GSK-3 είναι ουσιαστικά δραστική σε κύτταρα σε κατάσταση ηρεμίας και φωσφορυλιώνει και αναστέλλει ογκογόνες σηματοδότησης όπως β-κατενίνης /WNT μονοπάτι [15-21]. Παρά το γεγονός ότι η GSK-3 έχει μελετηθεί ως καταστολέας όγκου [22-24], υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η GSK-3 παίζει ένα ογκογόνο ρόλο σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους. Οι περισσότερες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στο ρόλο του συνόλου της GSK-3 ή της GSK-3β [25-27], αλλά πρόσφατες μελέτες ενοχοποιηθεί την ογκογόνο ρόλο της GSK-3α στην οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML) [28], του καρκίνου του προστάτη [29], και τον καρκίνο του παγκρέατος [30]. Είναι ενδιαφέρον ότι, CREB υπερέκφραση ή αυξημένη δραστηριότητα του έχει συνδεθεί με την εξέλιξη αυτών των καρκίνων του ανθρώπου [31-36]. Ειδικότερα, CREB λειτουργεί ως πρωτο-ογκογονίδιο AML [31, 37] και GSK-3α είναι επίσης ένας κρίσιμος στόχος για θεραπεία AML [28]. Πρόσφατα, η GSK-3α και GSK-3β έχουν αναφερθεί ότι είναι νέοι στόχοι κινάσης του tivantinib, η οποία είναι ένας ισχυρός εκλεκτικός αναστολέας του υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης c-met, σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Tivantinib έδειξαν υψηλότερη ισχύ για GSK-3α περισσότερο από ό, τι για την GSK-3β και την αναστολή της GSK-3α ή GSK-3β έκφραση που προκαλείται απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα [38].

Εδώ, εντοπίστηκε για πρώτη φορά ότι η GSK- 3α, δεν GSK-3β, ρυθμίζεται από CREB σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Επιπλέον, εξετάσαμε ότι υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ της υψηλής έκφρασης GSK-3α και βραχύτερη επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Knockdown της GSK-3α εξασθενίζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων, σχηματισμό αποικιών, και την ανάπτυξη του όγκου. Μαζί, αυτά τα ευρήματα εμπλέκει ότι η GSK-3α είναι ένα κρίσιμο γονίδιο στόχο του CREB και σηματοδότησης CREB-GSK-3α είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρων πολιτισμού

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (H1993, H1437, H1734, και Α549) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Lung καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Invitrogen), συμπληρωμένο με 10% (όγκος /όγκος) θερμο-απενεργοποιημένο εμβρυϊκό βόειο /ορού (FBS? Sigma Aldrich), 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνης G νατρίου και 100 μg /ml στρεπτομυκίνης θειικής (Invitrogen). Φυσιολογικά ανθρώπινα τραχειοβρογχικού επιθηλιακά κύτταρα (NHTBE) ελήφθησαν από την Lonza Walkersville, Inc. και καλλιεργήθηκαν σε BEGM

™ με πολλά συμπληρώματα. Όλα τα κύτταρα έχουν ανακαλλιεργηθεί απευθείας από την αρχική αποθέματα χαμηλής διόδου και είχαν χρησιμοποιηθεί πριν το πέρασμα 30. Τα κύτταρα ελέγχθηκαν επίσης εντός των τελευταίων τριών μηνών για τη σωστή μορφολογία με μικροσκόπιο και για την ανίχνευση μόλυνσης από μυκόπλασμα χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης MycoAlert μυκοπλάσματος (Lonza Walkersville, Inc .). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2.

Αντισώματα /Χημικά

Τα μονοκλωνικά αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (A2228) ήταν αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich. Κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της GSK-3α (ab28833) αγοράστηκε από την Abcam. Φορσκολίνη (3828), αντι-CREB (9197), αντι-ρ-CREB (9198), αντι-κυκλίνης Α2 (4656), αντι-κυκλίνης Β1 (4138), αντι-κυκλίνης Ε2 (4132), και GSK-3β ( 12456) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology. Κουνέλι μονοκλωνικό κυκλίνης D1 αντίσωμα (2261-1) αγοράστηκε από Epitomics

Νοκ ντάουν /υπερέκφραση των γονιδίων

σιγαστήρα CREB siRNA και η GSK-3α siRNAs αγοράστηκαν από Θέρμο επιστημονική ή Invitrogen.? CREB siRNA (109.994, Invitrogen), GSK-3α siRNA-1 (L-003009-00-0005, ON-TARGETplus SMARTpool, ThermoScientific), και η GSK-3α siRNA-2 (145.366, Invitrogen). BLOCK-it Fluorescent Oligo (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Κάθε siRNA διαμολύνθηκε χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen). Επίσης, τα κύτταρα μολύνθηκαν με λεντοϊού shScrambled ή Τα siRNAs που στοχεύουν CREB ή GSK-3α με 8 μg /ml polybrene και τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με πουρομυκίνη. Οι αλληλουχίες Τα siRNAs παρατίθενται στον Πίνακα S1 (διαθέσιμο στο διαδίκτυο). Για CREB υπερέκφραση, H1437 και Α549 κύτταρα επιμολύνθηκαν με DNA πλασμιδίου pCMV-κενών ή pCMV-CREB (Clontech Laboratories, Inc.) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen).

Βιωσιμότητας Κυττάρων

Κυττάρων βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Αφού τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα siRNA για 72 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με ΜΤΤ (τελική συγκέντρωση 0.5 mg /ml) για 4 ώρες στους 37 ° C επωαστήρα. Μετά την επώαση ΜΤΤ, 150 μΙ 100% DMSO προστέθηκε για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι. Βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με ανάγνωση της απορρόφησης στα 570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας SpectraMax (Molecular Devices).

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με τις υποδεικνυόμενες siRNAs, 2 χ 10

3 κύτταρα μεταφέρθηκαν στα τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 7-14 ημέρες. Το μέσο απομακρύνθηκε, σταθεροποιήθηκαν με 10% φορμαλίνη για 15 λεπτά, και ακολούθησε χρώση με κρυσταλλικό ιώδες για την οπτικοποίηση των αποικιών.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA καθαρίστηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας μια RNeasy Mini Kit (Qiagen). Αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της ανάστροφης μεταγραφάσης Μ-ΜΕν (Promega). Ποσοτική PCR (qPCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τα

SYBR

Πράσινο PCR Πυρήνας Αντιδραστήρια (Applied Biosystems) και iCycler θερμικό ανακυκλωτή (Bio-Rad Laboratories). Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1 (διαθέσιμο στο διαδίκτυο).

Ανάλυση Western Blot

Τυπική SDS-PAGE και κηλίδωση Western διαδικασίες χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της έκφρασης διαφόρων πρωτεϊνών. κυτταρολύματα Ολόκληρο από κάθε μία από τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές του πνεύμονα δοκιμάστηκαν παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης SDS (50 mM Tris-HCl, ρΗ 6.8, 2% SDS, 10% γλυκερόλη και 0.02% μπλε βρωμιοφαινόλης) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης. Όλες οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα χρένου δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση και Amersham ECL

™ Western Blotting Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης (GE Healthcare Life Sciences). Ένταση των επιμέρους ζωνών προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ πυκνότητας και εκφράζεται σε σχέση με το σήμα ακτίνης, ως μέτρο της πρωτεΐνης σχετική αφθονία στα διαφορετικά δείγματα.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (chip) θα

Το κιτ SimpleChIP Ενζυμική (Cell Signaling) χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Διεξήχθη PCR με εκκινητές ειδικούς για τις υποδεικνυόμενες περιοχές προαγωγού και οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν και 1% του συνολικού δείγματος εισόδου χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1 (διαθέσιμα στο διαδίκτυο).

Ανοσοβαφή

Για ανοσοφθορισμό, την ανίχνευση των πρωτογενών αντισωμάτων έγινε με φθορίζουσα συζυγή της Alexa Fluor

® 488 αντίσωμα (Invitrogen) μαζί με παρατείνουν

® αντιδραστηρίου αντιξεθωριάσματος Χρυσό με DAPI (Invitrogen). Πριν από χρώση των σταθερών ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη, ακολουθήσαμε το πρότυπο πρωτόκολλο που περιλάμβανε στάδια όπως αποπαραφινώσεως, ανάκτηση αντιγόνου, και διαπερατοποίηση.

Κυτταρομετρία Ροής

Για κυτταρικού κύκλου κυτταρομετρία ροής, τα κύτταρα σταθερό σε 70% αιθανόλη και χρωματίστηκαν με χρώση ιωδιούχου προπιδίου (BD Pharmingen) για την περιεκτικότητα σε DNA. Η απόπτωση μετρήθηκε με τη χρήση της FITC Annexin V απόπτωση Detection Kit (BD Pharmingen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

In Vivo

Μελέτες

Όλες οι διαδικασίες αυτές εγκρίθηκαν από το Φροντίδα Ζώων Θεσμικών και Χρήση Επιτροπής (IACUC) στο Πανεπιστήμιο του Yale και συμφωνήθηκε με τις νομικές εντολές και ομοσπονδιακές οδηγίες για τη φροντίδα και τη συντήρηση των πειραματόζωων (πρωτόκολλο #: 2.012 – 11.464). Θηλυκά J: NU γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από Jackson Laboratory και χρησιμοποιήθηκαν όταν παλαιών 6-7 εβδομάδων. κύτταρα H1993 προ-επεξεργασία με 20 ηΜ siRNA ελέγχου ή GSK-3α siRNA για 24 ώρες, ακολουθούμενη από μεταμόσχευση (2 χ 10

6 κύτταρα /πλευρού ξενομοσχεύματος η = 7 /ομάδα) στο πλευρό των ποντικών. Επίσης, H1993-shScrambled, H1993-shGSK3A # 2, ή H1993-shGSK3A # 4 κύτταρα εμβολιάσθηκαν σε ραχιαία πλευρές (6 χ 10

5 κύτταρα /πλευρό? ShScrambled n = 9, shGSK3A # 2 n = 4, και shGSK3A # 4 n = 5). Όλα τα ξενομοσχεύματα μεταμοσχεύθηκαν τόσο στην δεξιά και αριστερή πλευρές της ραχιαίας των ποντικών. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε με ψηφιακό παχύμετρο και υπολογίζεται από τον τύπο 0.52 χ πλάτος χ μήκος

2. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν στο τέλος της μελέτης με την τοποθέτησή τους σε ένα θάλαμο διοξειδίου του άνθρακα.

Στατιστικές Μέθοδοι

Η ποσοτικοποίηση Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων καθορίστηκε με Μαθητή

t-test

, με ένα

P

τιμή κάτω από 0,01 θεωρείται στατιστικά σημαντική. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση μονοπαραγοντική επιβίωση, και οι συγκρίσεις των κατανομών επιβίωσης μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank.

Αποτελέσματα

GSK-3α ρυθμίζεται από CREB σε πνεύμονα καρκινικά κύτταρα

για να διερευνηθούν οι κρίσιμες γονιδίων στόχων CREB στον καρκίνο του πνεύμονα, εκτελέσαμε ανάλυση qPCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές έναντι ενός υποσυνόλου γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα σε CREB knockdown κυττάρων. Βρήκαμε ότι το επίπεδο του mRNA της GSK-3α, όχι το επίπεδο της GSK-3β, ήταν σημαντικά μειωτικά από CREB siRNA σε όλες τις καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές που εξετάσαμε (H1993, H1437, H1734, και Α549) (Εικ 1Α). Επιπλέον, η πρωτεΐνη έκφραση της GSK-3α δραματικά καταστέλλεται από CREB knockdown σε όλες τις τέσσερις πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 1Β), αλλά το επίπεδο της πρωτεΐνης της GSK-3β δεν άλλαξε από CREB knockdown (Σχήμα 1 C).

(Α) Επίδραση CREB νοκ ντάουν στο επίπεδο του mRNA της

GSK3A

,

GSK3B

, και

CREB

. Κάθε μία από τις υποδεικνυόμενες κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή CREB siRNA (40 ηΜ, το καθένα) για 48 ώρες, ακολουθούμενη από ανάλυση qPCR. Όλες οι τιμές στα γραφήματα αντιπροσωπεύουν μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Δύο όψεων

t-

δοκιμή. *,

P

& lt? 0.01. (Β-Ο) Επίδραση CREB knockdown για τα επίπεδα της πρωτεΐνης της GSK-3α (Β) και GSK-3β (C). Κάθε μία από τις υποδεικνυόμενες κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή CREB siRNA (40 ηΜ, το καθένα) για 72 ώρες, ακολουθούμενη από ανάλυση Western blot.

Η

Παρατηρήσαμε ότι η

GSK3A

υποκινητή περιείχε αρκετές θέσεις σύνδεσης υποθετική CREB, όπως καθορίζεται από TFSEARCH (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (Σχήμα 2Α). Για να εξεταστεί εάν CREB δεσμεύεται με τον ανθρώπινο

GSK3A

υποκινητή, πραγματοποιήσαμε ποσοτικό προσδιορισμό ChIP χρησιμοποιώντας ανοσοκαθίζηση αντισώματος CREB και IgG ως αρνητικός έλεγχος. Όχι μόνο εκκινητή που Α το οποίο καλύπτει την θέση σύνδεσης CREB συναινετική (-39 έως -53), αλλά και τρία άλλα σύνολα εκκινητών (Β: -459 έως -476, C: -545 έως -557, και D: -603 έως – 616) έδειξε ότι η σύνδεση του CREB στο

GSK3A

υποκινητή. Ωστόσο, μη ειδικές περιοχές (NS-1, NS-2, και NS-3) του προαγωγέα δεν δείχνουν οποιαδήποτε σύνδεση του CREB (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, το νοκ ντάουν του CREB κατέστειλε σημαντικά τη σύνδεση του CREB με το

GSK3A

υποκινητή (Σχήμα 2C). Σε συμφωνία με προηγούμενα δεδομένα τα οποία έδειξαν CREB knockdown κατέστειλε την έκφραση της GSK-3α, η υπερέκφραση του CREB έντονα έκφραση που προκαλείται από GSK-3α στο πρωτεϊνικό επίπεδο μετά από παροδική ή σταθερή υπερέκφραση CREB (Εικ 2Δ). Στην πραγματικότητα, οι εκφράσεις του ρ-CREB και GSK-3α αυξήθηκαν κατά φορσκολίνη, το οποίο ενεργοποιεί το ένζυμο αδενυλική κυκλάση και αυξάνει τα επίπεδα ενδοκυτταρικού κυκλικού ΑΜΡ (Σχήμα 2Ε). Στο σύνολό τους, προτείνουμε ότι CREB είναι ένα δυναμικό ανάντη ρυθμιστή της GSK-3α σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

(Α) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τις θέσεις των στοιχείων δέσμευσης CREB βρίσκεται στο γονίδιο υποκινητή της ανθρώπινης

GSK3A

(TFSEARCH). AD: οι συγκεκριμένες περιοχές για εκκινητών που καλύπτουν δεσμευτική CREB στοιχεία, Α: -39 έως -53, Β: -459 έως -476, C: -545 έως -557, D: -603 έως -616, NS-1, – 2, και -3: οι περιοχές για εκκινητές που περιλαμβάνουν μη ειδική δέσμευση στοιχεία NS-1: -126 -230 να, NS-2: -183 -378 να, και NS-3: -1214 να -1356. Primer ακολουθίες είναι στο S1 πίνακα (διαθέσιμα στο διαδίκτυο). (Β) άμεση σύνδεση του CREB στο

GSK3A

υποκινητή. Μια δοκιμασία ChIP έγινε με χρωματίνη που παρασκευάζονται από κύτταρα H1993 και H1734. Η σύνδεση του CREB στην

GSK3A

υποκινητή ανιχνεύθηκε με οπτικοποίηση του προϊόντος PCR. Οι μονές ζώνες που ανιχνεύονται σε δείγματα εισόδου δείχνουν την ειδικότητα των εκκινητών PCR. (Γ) Η άμεση σύνδεση του CREB στο

GSK3A

προαγωγό σε CREB-νοκ ντάουν κύτταρα. Το επίπεδο πρωτεΐνης CREB σε κάθε σταθερή κυτταρική γραμμή επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδος Western. (D) Επίδραση CREB υπερέκφρασης στην έκφραση της GSK-3α. κύτταρα H1437 επιμολύνθηκαν με την ίδια ποσότητα του pCMV-κενό ή pCMV-CREB φορέα έκφρασης και την έκφραση του CREB, ρ-CREB, και GSK-3α εξετάσθηκε με ανάλυση κηλίδος western (αριστερά). Α549-ελέγχου (Α549-Ctrl) ή Α549-CREB κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορείς pCMV και επιλέγονται από πουρομυκίνη (1 μg /ml). Η επίδραση του CREB στην έκφραση της GSK-3α Επιβεβαιώθηκε επίσης (δεξιά). (Ε) Επίδραση της φορσκολίνης για την επαγωγή του επιπέδου της ρ-CREB και GSK-3α. Α549 και H1437 κύτταρα επεξεργάστηκαν με φορσκολίνη (10 μΜ, 30 λεπτά) και την έκφραση της κάθε πρωτεΐνης εξετάσθηκε με ανάλυση κηλίδος western.

Η

GSK-3α είναι μια φτωχή πρόγνωση παράγοντας στον καρκίνο του πνεύμονα

υπάρχουν ενδείξεις ότι η GSK-3β υπερεκφράζεται στον καρκίνο του πνεύμονα. Η υπερέκφραση της GSK-3β χρησιμεύει ως ανεξάρτητος δείκτης κακής πρόγνωσης για NSCLC και η αναστολή του καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε NSCLC κύτταρα [39]. Ωστόσο, ο ρόλος της GSK-3α στον καρκίνο του πνεύμονα εξακολουθούν να χρειάζονται περισσότερο έρευνα. Εδώ, βρήκαμε ότι η GSK-3α υπερεκφράζεται σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με κύτταρα NHTBE (Σχήμα 3Α).

(Α) Τα επίπεδα πρωτεΐνης της GSK-3α, ρ-CREB, και CREB σε πολλαπλές πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τα κύτταρα NHTBE. ανάλυση (BD) Kaplan-Meier για τη συνολική επιβίωση από χαμηλή ή υψηλή

GSK3A

(

GSK3A

σετ καθετήρα 202210_x_at) έκφραση στο (Β) 1760 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, (C) 487 ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα , και (Δ) 422 πνεύμονα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων με επικουρική θεραπεία. Συνολική ανάλυση επιβίωσης των ασθενών έγινε με τη χρήση Cox μοντέλα αναλογικών κινδύνων και τα δεδομένα παρακολούθησης για την αναφερόμενη περίοδο.

Η

Για να εκτιμηθεί περαιτέρω αν το εύρημα μας

GSK3A

υπερέκφραση είναι σχετικές στον καρκίνο του πνεύμονος ανθρώπου, χρησιμοποιήσαμε δημοσίως διαθέσιμες plotter Kaplan-Meier (https://kmplot.com/analysis), η οποία αποτελείται από 1.760 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα που λαμβάνουν χημειο /ακτινοθεραπεία με βάση τις βάσεις δεδομένων (CARRAY: n = 504? GSE14814 : n = 90? GSE19188: n = 156? GSE29013: n = 55? GSE31210: n = 246? GSE3141: n = 111? GSE37745: n = 196? GSE4573: n = 131? GSE8894: n = 138? και TCGA: n = 133). Για να καθοριστεί εάν

GSK3A

mRNA (202210_x_at) αφθονία σε όγκους συνδέθηκε με τη συνολική επιβίωση, πραγματοποιήσαμε στη συνολική ανάλυση επιβίωσης των ασθενών με τη χρήση Cox μοντέλα αναλογικών κινδύνων και παρακολούθησης δεδομένων για 200 μήνες μετά την επέμβαση. Η υπερέκφραση του

GSK3A

επίπεδα mRNA συσχετίστηκε με κακή συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα (harzard αναλογία (HR) = 1,42, logrank P = 4.9e-06) (Εικόνα 3Β). Είναι ενδιαφέρον,

GSK3A

επίπεδα mRNA ήταν πιο έντονα σχετίζονται με την κακή συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα με αδενοκαρκίνωμα (HR = 1,99, logrank P = 2.4e-06) (Σχήμα 3C). Ωστόσο, τα θετικά

GSK3A

έκφραση δεν συσχετίστηκε σημαντικά με μικρότερο χρόνο επιβίωσης των ασθενών με ιστολογία πλακώδες κυτταρικό τύπο (Εικ 3D). Βρήκαμε επίσης ότι η υπερέκφραση του

CREB

mRNA επίπεδο συσχετίστηκε με κακή συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα με πολύ παρόμοιο πρότυπο για

GSK3A

mRNA (S2 σχήμα). Τα αποτελέσματά μας επί κλινικά δείγματα όγκων αποδεικνύουν ότι ανώμαλη ενεργοποίηση της GSK-3α συνδέεται με την ανθρώπινη θνησιμότητα των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, ειδικά με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα.

Αναστολή της GSK-3α καταστέλλει την βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

για να προσδιοριστεί η επίδραση της GSK-3α, το οποίο είναι ένα γονίδιο στόχος CREB, επιβεβαιώσαμε την επίδραση της CREB knockdown στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές μας [10], η αναστολή CREB κατέστειλε την βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 4Α). Στη συνέχεια, knockdown της GSK-3α με ειδικό siRNA του είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της βιωσιμότητας όλων καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές που εξετάσαμε (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, knockdown της GSK-3α οδήγησε σε μειωμένο σχηματισμό αποικίας των κυττάρων (σχήμα 4Γ). Κατά συνέπεια, η GSK-3α knockdown κατέστειλε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα KRAS-WT (H1993 και H1437), σε σύγκριση με KRAS-μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (H1734 και Α549). Εξετάσαμε περαιτέρω την επίδραση της GSK-3α νοκ ντάουν για τον θάνατο των κυττάρων χρησιμοποιώντας ανάλυση FACS. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 4D, τα κύτταρα τα οποία εξέφραζαν shGSK3A έδειξε την αυξημένη κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με κάθε κυτταρική γραμμή ελέγχου. Η επικύρωση των siRNAs ή Τα siRNAs στην έκφραση της GSK-3α διεξήχθη με qPCR ή ανάλυση Western Blot σε πολλαπλές καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές (S1 Εικ). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η GSK-3α ρυθμίζει θετικά τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα.

(Α) Επίδραση CREB νοκ ντάουν στην βιωσιμότητα των κυττάρων. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα (H1993, H1437, H1734, και Α549) διαμολύνθηκαν παροδικά με έλεγχο siRNA (50 ηΜ), ή siRNA CREB (10, 50 ηΜ) για 72 ώρες, που ακολουθείται από ανάλυση ΜΤΤ. Όλες οι τιμές στα γραφήματα αντιπροσωπεύουν μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Δύο όψεων

t-test

. *,

P

& lt? 0.01. (Β) Επίδραση της GSK-3α νοκ ντάουν στην βιωσιμότητα των κυττάρων. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με έλεγχο siRNA, ή GSK-3α siRNA (40 ηΜ, το καθένα) για 72 ώρες και το ποσοτικά δεδομένα ακολουθήθηκε από ανάλυση ΜΤΤ. Όλες οι τιμές στα γραφήματα αντιπροσωπεύουν μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Δύο όψεων

t-

δοκιμή. *,

P

& lt? 0.01. (C) Επίδραση της GSK-3α νοκ ντάουν για σχηματισμό αποικιών. Μια ημέρα μετά την επιμόλυνση του siRNA ελέγχου (40 ηΜ), ή GSK-3α siRNA (10, 40 ηΜ), τα κύτταρα σπάρθηκαν πάλι σε 6-φρεάτια με χαμηλής πυκνότητας (2 χ 10

3 /φρεάτιο) και επωάστηκαν για 7-14 ημέρες. Η μέση ± SD σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Δύο όψεων

t-

δοκιμή. *,

P

& lt? 0.01. (D) Επίδραση της GSK-3α νοκ ντάουν στον κυτταρικό θάνατο. H1734 και H1993 κύτταρα μολύνθηκαν με λεντοϊού που εκφράζουν shRNA στόχευση GSK-3α (δύο ακολουθίες? ShGSK3A # 2 και # 4 shGSK3A) με 8 μg /ml polybrene. Μετά από 48 ώρες μόλυνση, τα κύτταρα επιλέγονται με 0.5 μg /ml πουρομυκίνη για 3 ημέρες. Τα επιλεγμένα κύτταρα έγιναν με χρώση αννεξίνης V και ΡΙ για ανάλυση αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο από LSRII.

Η

σηματοδότησης CREB-GSK-3α είναι κρίσιμη για τη ρύθμιση των κυκλινών

Για να αποκτήσετε εικόνα για το ρόλο της GSK-3α στη βιωσιμότητα του καρκίνου του πνεύμονα, που εξέτασε πρώτα κατά πόσον η GSK-3α ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο χρησιμοποιώντας ανάλυση FACS. Είναι ενδιαφέρον ότι, η GSK-3α knockdown κατέστειλε φάση S του κυτταρικού κύκλου, οι οποίες θα μπορούσαν να συμβάλουν στην μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 5Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, η έκφραση της πρωτεΐνης πολλών κυκλινών συμπεριλαμβανομένων κυκλίνης Α2, κυκλίνη Β1, κυκλίνη D1, και κυκλίνης Ε2 ήταν αξιοσημείωτα καταστάλθηκε από GSK-3α knockdown σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τις προηγούμενες αναφορές ότι CREB μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση των κυκλινών [12, 31, 40, 41]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η GSK-3α θα μπορούσε να λειτουργήσει θετικά στη βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με τη ρύθμιση της έκφρασης των κυκλινών.

(Α) Επίδραση της GSK-3α knockdown επί του κυτταρικού κύκλου. Ενδείκνυται κύτταρα στερήθηκαν τροφής εντός μέσου RPMI άνευ ορού για 24 ώρες και αναπληρώνονται με RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS για άλλες 24 ώρες. Συγκομιδής κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙ για ανάλυση κύκλου κυττάρου με LSRII. (Β) Επίδραση της GSK-3α νοκ ντάουν στις γονιδιακή έκφραση που σχετίζονται με τη βιωσιμότητα των κυττάρων ή του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένων κυκλίνη Α2, κυκλίνη Β1, κυκλίνη D1, και κυκλίνης Ε2. Τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα επιμολύνθηκαν παροδικά με έλεγχο siRNA, ή GSK-3α siRNA (40 ηΜ, το καθένα) για 48 ώρες και ακολούθησε ανάλυση κηλίδας western.

Η

GSK-3α είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη του όγκου

Εμείς απευθύνεται επόμενο το ρόλο της GSK-3α στην ανάπτυξη του όγκου

in vivo

χρησιμοποιώντας υποδόριες ενέσεις του ελέγχου ή της GSK-3α-εξαντλημένα κύτταρα. Η ανάπτυξη των όγκων παρακολουθήθηκε επί πέντε εβδομάδες μετά τα κύτταρα αφαιρέθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες των ποντικών στο τέλος πέντε εβδομάδων έδειξαν ότι η ανάπτυξη των όγκων που προέρχονται από τα GSK-3α-εξαντλημένο κυττάρων καταστάλθηκε αξιοσημείωτα σε σύγκριση με όγκους που προέρχονται από τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 6Α). Συνεπής με την υπόθεση και τα δεδομένα μας, GSK-3α knockdown είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική καταστολή της ανάπτυξης του όγκου και ο όγκος του όγκου (Σχήμα 6Β). Επιβεβαιώσαμε την επίδραση της εξάντλησης GSK-3α για την έκφραση της GSK-3α ή κυκλίνης Β1 στους ιστούς που προέρχονται από ξενομοσχεύματα (S5 Εικ). Επανειλημμένα, έχουμε παρατηρήσει ότι η πλήρης διαγραφή των

GSK3A

στα κύτταρα δεν θα μπορούσε να αναπτύξει τους όγκους σε άτριχα ποντίκια (Σχήμα 6C και 6D). Συνολικά, τα στοιχεία αυτά καταδεικνύουν σαφώς ότι τα μειωμένα επίπεδα ανάπτυξης GSK-3α βλάπτουν τον καρκίνο του πνεύμονα όγκου

in vivo

.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες των ξένων μοσχευμάτων προέρχεται από siRNA ελέγχου ή της GSK-3α siRNA κατεργασμένους H1993 κυττάρων. Μετά από 24 ώρες siRNA διαμόλυνση (20 ηΜ, το καθένα), τα κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως στην δεξιά και αριστερή πλευρά λαγόνες ραχιαία θηλυκών γυμνών ποντικών (ξενομόσχευμα η = 7 /ομάδα). (Β) Ο όγκος του όγκου του ξενομοσχευμάτων που προέρχονται από τον έλεγχο ή GSK-3α-ελλειμματικά κύτταρα H1993 αξιολογήθηκαν σε κάθε χρονικό σημείο όπως υποδεικνύεται. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε με ψηφιακό παχύμετρο και υπολογίζεται από τον τύπο 0.52 χ πλάτος χ μήκος

2. Δύο όψεων

t-test

. *,

P

& lt? 0.01. (C) Εκπρόσωπος εικόνες των ξένων μοσχευμάτων προέρχεται από H1993-shScrambled, shGSK3A # 2, ή shGSK3A # 4 κύτταρα. Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως σε ραχιαία πλευρά γυμνών ποντικών (αριστερά: shScrambled κύτταρα, δεξιά: κύτταρα shGSK3A) και ο όγκος του όγκου μετρήθηκε επί τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία (shScrambled n = 9, shGSK3A # 2 n = 4, και shGSK3A # 4 η = 5). Δύο όψεων

t-test

. *,

P & lt?

0.05

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίστηκε για πρώτη φορά GSK-3α ως νέο στόχο του CREB στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.. Η μελέτη μας αποκαλύπτει ογκογόνο ρόλους της GSK-3α ως γονίδιο στόχος CREB και ως νέο προγνωστικό βιοδείκτη σε καρκίνο του πνεύμονα. GSK-3α έχει δειχθεί ότι είναι ένας θεραπευτικός στόχος σε πολλαπλούς ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου AML, παγκρεατικό καρκίνο, και καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, ο ρόλος της GSK-3α στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Εδώ, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μείωση των επιπέδων της GSK-3α επηρεάσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

in vitro

και

in vivo

. GSK-3α υπερεκφράζεται σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και των ιστών του πνεύμονα όγκου. Επίσης, η παρεκκλίνουσα υπερέκφραση της GSK-3α σχετίστηκε με μικρότερο χρόνο επιβίωσης ιδιαίτερα σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Το πιο σημαντικό, CREB ρυθμίζει την έκφραση της GSK-3α, αλλά όχι GSK-3β, γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχει μια συγκεκριμένη βραχίονας του CREB-GSK-3α σηματοδότηση στον καρκίνο του πνεύμονα.

Η δραστικότητα του CREB ρυθμίζεται από πολλαπλούς φωσφορυλίωσης μηχανισμοί και η φωσφορυλίωση του CREB στη σερίνη-133 απαιτείται για την πρόσληψη του συν-ενεργοποιητή CREB-δεσμευτική πρωτεΐνη (CBP) /p300 και μεταγραφική δραστηριότητα της. Στην πραγματικότητα, η GSK-3 έχει γίνει γνωστό ως καταστολέας της δραστικότητας CREB. δραστικότητα σύνδεσης CREB DNA αναστέλλεται από GSK-3β υπερέκφραση και αυξήθηκε κατά λίθιο ή βαλπροϊκό νάτριο που είναι GSK-3 αναστολείς σε ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος [42]. Επιπλέον, η GSK-3β έχει αναφερθεί ότι καταστέλλει πολλαπλά γονίδια από CREB στόχος [43, 44]. Αντίθετα, πρόσφατη μελέτη έχει αναφερθεί ότι η GSK-3 προάγει τη σύνδεση των CREB και συν-ενεργοποιητών της με MEIS1, ένα ομοιοακολουθίας (ΗΟΧ) δέσμευσης DNA-συμπαράγοντα, να επάγουν ΗΟΧ μεσολάβηση μεταγραφή και μετασχηματισμός σε MLL λευχαιμίες [45]. Παρά το γεγονός ότι η λειτουργική συνέπεια της δραστηριότητας του CREB από GSK-3 δεν είναι ακόμη σαφής, η μελέτη μας δείχνει καθαρά ότι CREB ρυθμίζει θετικά GSK-3α, δεν GSK-3β, στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα, παρέχοντας έτσι μια νέα αντίληψη του CREB-GSK-3α σηματοδότηση .

Αν και η υπερέκφραση της GSK-3β και τη λειτουργία του ως ένα προαγωγό όγκου στον καρκίνο του πνεύμονα έχει δειχθεί [39], ο ρόλος της GSK-3α στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένει αόριστη. Στην τρέχουσα μελέτη μας βρήκαμε ότι η GSK-3α υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με φυσιολογικά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα. Knockdown της GSK-3α σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα προκαλεί καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και επίσης επαγωγή σημαντικών απόπτωσης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η GSK-3α παίζει επίσης έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων.

Ο μηχανισμός της GSK-3α ως υποκινητή όγκου στον καρκίνο του πνεύμονα είναι σχεδόν άγνωστο. Έχει δειχθεί ότι η GSK-3α προάγει ογκογόνο KRAS λειτουργία μέσω δραστικότητα ΙΚΚ-NF-κΒ σε καρκίνο του παγκρέατος. Οι συγγραφείς πρότειναν GSK-3α ως βασικό καθοδικός τελεστής του μεταλλαγμένου KRAS να ρυθμίζουν μονοπάτια σηματοδότησης ΝΡ-κΒ [30]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μελέτη μας έδειξε ότι η GSK-3α νοκ ντάουν πολύ κατέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα του KRAS-WT κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, H1993 και H1437 κυττάρων, σε σύγκριση με KRAS μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών, H1734 (G13C) και Α549 κύτταρα (G12S) . Αν και παραμένει ασαφές εάν η κατάσταση του KRAS είναι άμεσα συνδεδεμένη με το ρόλο της GSK-3α στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων, προτείνουμε ότι η λειτουργία της GSK-3α στο KRAS σηματοδότησης μπορεί να ρυθμιστεί με ειδικό τρόπο κυτταρικό τύπο.

Για να κατανοήσουμε καλύτερα το ρόλο της GSK-3α και να εξετάσει τα κρίσιμα γονίδια που επηρεάζονται από GSK-3α στον καρκίνο του πνεύμονα, που αρχικά προβλήθηκε ένα υποσύνολο των γονιδίων στόχων του NF-κΒ, όπως

MYC

,

WT1

,

BIRC2

,

IL-9

,

HMOX1

, και

TERT

, οι οποίες ρυθμίζονται από μια παν-GSK-3 αναστολέας AR -014.418 σε καρκίνο του παγκρέατος [30]. Τα δεδομένα μας δεν ήταν απόλυτα συνεπής με την προηγούμενη μελέτη, αλλά παρατηρείται μια σημαντική μείωση στο επίπεδο του mRNA της TERT από GSK-3α νοκ ντάουν και μικρή διαφορά στο άλλο NF-κΒ ως στόχο την ανάλυση (EDN1, CYP19A1, HMOX1, WT1, και BIRC2) (S3 Εικ). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκφραση αρκετών κυκλινών οι οποίες είναι γνωστές ως γένος στόχος CREB ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω από την GSK-3α knockdown σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Αν και η μελέτη μας δεν εντόπισε άμεσα πώς κυκλίνες ρυθμίζονται από GSK-3α, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την νέα ρόλο της GSK-3α ως ενεργό ρυθμιστής της βιωσιμότητας των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

Θεωρητικά, η αναστολή της GSK-3 μπορεί να οδηγήσει σε σταθεροποίηση β-κατενίνης και υπερενεργοποίηση του Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση [46-49]. Ωστόσο, Doble et al. έδειξαν ότι και οι δύο ισομορφές της GSK-3 θα πρέπει να αναστέλλεται για σταθεροποίηση β-κατενίνης. Η GSK-3α /β διπλό νοκ-άουτ το ποντίκι εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (ESC) εμφανίζεται υπερενεργοποιημένη Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης [50]. Συνεπής με αυτή την έκθεση, υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η ενιαία απώλεια είτε GSK-3α ή GSK-3β ισομορφή δεν οδηγεί σε σταθεροποίηση β-κατενίνης [28, 39]. Τα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι η αναστολή της GSK-3α δεν επάγει το επίπεδο της β-κατενίνης και AXIN2, ένα Axin σχετίζεται πρωτεΐνη η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι /β-κατενίνης (S4 Εικ). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι η GSK-3α μπορεί να λειτουργήσει ανεξάρτητα από τη σταθεροποίηση της β-κατενίνης στον καρκίνο του πνεύμονα, αλλά περαιτέρω ανάλυση πρέπει να ολοκληρωθεί για να κατανοήσει πλήρως τους ρόλους της GSK-3α και GSK-3β στην β-κατενίνης σταθεροποίηση στον καρκίνο του πνεύμονα.

Οι παρατηρήσεις ότι η GSK-3α έκφραση παίζει έναν αιτιώδη ρόλο στην επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, δείχνουν GSK-3α θα μπορούσε να είναι χρήσιμη ως προγνωστικό βιοδείκτη στον καρκίνο του πνεύμονα, ιδιαίτερα του πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα. Περαιτέρω μελέτες που εξετάζουν τους μηχανισμούς για τη στόχευση της οδού CREB-GSK-3α στον καρκίνο του πνεύμονα θα είναι ουσιαστικής σημασίας για τον προσδιορισμό και την ανάπτυξη των ειδικών αναστολέων της GSK-3α.