Αφηρημένο

προγεστίνη αντίσταση είναι ένα σημαντικό εμπόδιο για τη θεραπεία πρώιμο στάδιο, καλά διαφοροποιημένο καρκίνο του ενδομητρίου καθώς και υποτροπιάζοντος καρκίνου του ενδομητρίου. Ο μηχανισμός πίσω από την μη ιδανική απόκριση σε προγεστίνη δεν είναι καλά κατανοητός. Η

PTEN

ογκοκατασταλτικό γονίδιο είναι συχνά μεταλλάσσεται στον τύπο Ι του ενδομητρίου καρκίνων και αυτή η μετάλλαξη έχει ως αποτέλεσμα την υπερενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K /AKT. Υποθέσαμε ότι η αυξημένη ενεργοποίηση της ΑΚΤ προωθεί ανεπαρκή ανταπόκριση σε προγεσταγόνα στην ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα. κύτταρα Ishikawa σταθερά επιμολυσμένα με τον υποδοχέα προγεστερόνης Β (κύτταρα PRB23) υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον αναστολέα ΑΚΤ, ΜΚ-2206, η οποία μειώθηκε αποτελεσματικά τα επίπεδα του p (Ser473) -Akt σε ένα εξαρτώμενο από την δόση (10 ηΜ έως 1 μΜ) και χρονο-εξαρτώμενη τρόπο (0,5 ώρα έως 24 ώρες). ΜΚ-2206 ανέστειλε επίπεδα ρ (Thr308) -Akt και ένα προς τα κάτω στόχος, p (Thr246) -PRAS40, αλλά δεν άλλαξε τα επίπεδα του p (Thr202 /Tyr204) ERK ή ρ (Thr13 /Tyr185) SAPK /JNK, αποδεικνύοντας την εξειδίκευση του MK-2206 για την ΑΚΤ. Επιπλέον, ΜΚ-2206 αγωγή των κυττάρων PRB23 οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων του υποδοχέα προγεστερόνης Β πρωτεΐνης (PRB). ανάλυσης μικροσυστοιχιών των κυττάρων PRB23 προσδιορίζονται PDK4 ως η πιο μεγάλη ρυθμίζεται προς τα πάνω γονιδίου μεταξύ 70 ρυθμίζεται αυξητικά γονίδια σε απάντηση R5020. Αναστολή της ΑΚΤ απορυθμίζεται περαιτέρω έκφραση προγεστερόνη μεσολάβηση της PDK4 αλλά δεν επηρέασε ένα άλλο γονίδιο προγεστερόνη-απόκρισης, SGK1. Η επεξεργασία των κυττάρων με PRB23 R5020 και ΜΚ-2206 μειώθηκαν ανεξάρτητα βιωσιμότητα των κυττάρων, ενώ ο συνδυασμός των R5020 και ΜΚ-2206 προκάλεσε τη μεγαλύτερη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων. Επιπλέον, ποντίκια με ξενομόσχευμα όγκων που έλαβαν θεραπεία με μόνο ή με προγεστερόνη ΜΚ-2206 και μόνο εμφάνισαν μέτριες μειώσεις στο μέγεθος του όγκου τους. Η μεγαλύτερη μείωση του μεγέθους του όγκου παρατηρήθηκε στα ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν με δύο ΜΚ-2206 και η προγεστερόνη? Αυτοί οι όγκοι εμφάνισαν το λιγότερο πολλαπλασιασμού (Ki67) και την πιο απόπτωση (διασπασμένη κασπάση-3) από όλες τις ομάδες θεραπείας. Εν ολίγοις, η αναστολή της ΑΚΤ σταθεροποιεί την υποδοχέα προγεστερόνης Β και αυξάνει ανταπόκριση προγεστερόνης στο ενδομήτριο καρκινικά κύτταρα που έχουν υπερδραστηριοποιημένο ΑΚΤ

Παράθεση:. Παντ Α, Lee II, Lu Ζ, Rueda BR, Schink J, Kim JJ ( 2012) Αναστολή της ΑΚΤ με την από του στόματος ενεργός Αλλοστερική ΑΚΤ αναστολέα, MK-2206, ευαισθητοποιεί κύτταρα καρκίνου του ενδομητρίου σε προγεστίνη. PLoS ONE 7 (7): e41593. doi: 10.1371 /journal.pone.0041593

Συντάκτης: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 του Μάρτη 2012? Αποδεκτές: 22 του Ιούνη 2012? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Pant et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας R21 CA127674 (JJK), Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου T32CA09560 επιχορήγηση της κατάρτισης, και από το Πρόγραμμα Malkin Scholars από τον Robert H. Lurie Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου του Πανεπιστημίου Northwestern (IIL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του ενδομητρίου είναι η πιο κοινή κακοήθεια γυναικολογικό στις Ηνωμένες Πολιτείες. Το 2010, 43.470 νέες περιπτώσεις είχαν προβλεφθεί με αποτέλεσμα 7950 θανάτους [1]. Η συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων του καρκίνου του ενδομητρίου σχετίζονται με ομόφωνα δράση οιστρογόνου αναφέρονται ως Τύπου Ι ενδομητριακών καρκίνων. Η πιο κοινή γενετική μετάλλαξη που συμβαίνει σε περίπου 50-80% όλων των περιπτώσεων σε Τύπου Ι καρκίνο του ενδομητρίου είναι στη ογκοκατασταλτικό γονίδιο

ΡΤΕΝ

[2], [3]. Μια μετάλλαξη στο

PTEN

γονιδίου οδηγεί σε κατάντη συστατική ενεργοποίηση της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3′-κινάση (PI3K) /μονοπατιού AKT [4]. ΑΚΤ είναι μία κινάση σερίνης /θρεονίνης που ενεργοποιεί διαφορετικές οδούς προαγωγής κυτταρικής επιβίωσης και την αναστολή της απόπτωσης [4], [5]. Έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι υπάρχουν αυξημένα επίπεδα των ενεργοποιημένων ΑΚΤ σε καρκίνο του ενδομητρίου και ότι αυτό μπορεί να προμηνύουν μία κακή πρόγνωση για τους ασθενείς αυτούς [6]. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η αναστολή της οδού ΑΚΤ σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα έχει σαν αποτέλεσμα αυξημένη απόπτωση, πράγμα που δείχνει ότι η ρύθμιση αυτής της οδού θα μπορούσε να παίξει σημαντικό θεραπευτικό ρόλο [7], [8].

καρκίνο του ενδομητρίου συνήθως αντιμετωπίζεται με χειρουργική αφαίρεση της θεραπείας μήτρας και ανοσοενισχυτικό όπως υποδεικνύεται από την συγκεκριμένη παθολογία. Για τη νόσο πρώιμο στάδιο Αυτή η επεξεργασία καταλήγει σε εξαιρετικές τιμές 5-ετή επιβίωση άνω του 90% [9]. Ωστόσο, αυτή η οριστική χειρουργική επέμβαση αποκλείει οποιαδήποτε περαιτέρω τη γονιμότητα. Δεδομένου ότι τα ποσοστά παχυσαρκίας αυξάνουν μεταξύ του πληθυσμού, αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του αριθμού των νεότερων γυναικών με καρκίνο του ενδομητρίου και θεραπεία γονιμότητας καλιοσυντηρητικά θα γίνει πιο πολύτιμη. Επί του παρόντος, οι προγεστίνες χρησιμοποιούνται ως κύρια θεραπεία σε προχωρημένη ή υποτροπιάζουσα νόσο, σε ασθενείς που δεν είναι λειτουργικές υποψήφιοι λόγω ιατρικών νοσηρότητα, και σε ασθενείς με την ελπίδα να διατηρήσουν τη μελλοντική γονιμότητα τους. Πολλαπλές σειρές περίπτωση των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με προγεσταγόνα έχουν δημοσιευθεί με ενθαρρυντικά, αν και δεν είναι απόλυτο, αποτελέσματα. Τα ποσοστά ανταπόκρισης για την υπερπλασία του ενδομητρίου με ατυπία έχουν κυμανθεί 67 έως 82 ποσοστά% και απόκρισης για χαμηλής ποιότητας του ενδομητρίου εύρος καρκίνου από 50-70% (αναθεωρούνται στο [10]). Για εκείνους τους ασθενείς οι οποίοι δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με προγεστερόνη, υστερεκτομή συνιστάται. Αυτή η κλινική κατάσταση είναι κοινή ως το ποσοστό των ασθενών ηλικίας μικρότερης των 45 διαγνωστεί με καρκίνο του ενδομητρίου τώρα κυμαίνεται από 5 έως 29% [10],.

Η προγεστερόνη διαμεσολαβεί ανασταλτικές επιδράσεις του στο ενδομήτριο και καρκίνου του ενδομητρίου μέσω του υποδοχέα προγεστερόνης (PR), ένα ενδοκυτταρικό υποδοχέα στεροειδών με ισομορφές Α και Β. Μια αύξηση στα ποσοστά ανταπόκρισης για την προγεστερόνη θεραπεία και βελτίωση των αποτελεσμάτων της επιβίωσης έχουν αναφερθεί σε όγκους με ένα υψηλότερο ποσοστό των δημοσίων σχέσεων [12]. PRA στερείται 164 αμινοξέων από το Ν-άκρο και οι δύο ισομορφές μεταφράστηκε από μεμονωμένα είδη mRNA ενός γονιδίου υπό τον έλεγχο των υποκινητών διακριτές και θεωρούνται λειτουργικά διακριτές [13]. Ενώ οι συγκεκριμένους ρόλους για PRA και PRB παραμένουν ασαφείς σε καρκίνο του ενδομητρίου, οι μελέτες δείχνουν ότι PRB μπορεί να είναι ο πρωταρχικός ισομορφή υπεύθυνος για την ανασταλτική της ανάπτυξης και του όγκου κατασταλτικός δράσεις της προγεστερόνης in vitro. Σε PRB-σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα Ishikawa, θεραπεία MPA οδήγησε σε αναστολή του πολλαπλασιασμού, μετανάστευσης, και εισβολή, ενώ PRA-σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα Ishikawa απέτυχε να αναστείλει τις διαδικασίες αυτές [14], [15]. Επιπλέον, PRB-επιμολυσμένα κύτταρα Hec50co σε επεξεργασία με προγεστερόνη καταδειχθεί σημαντικές μειώσεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή, ενώ τα κύτταρα που εκφράζουν Hec50co PRA είχε μόνο μέτρια ανασταλτικά αποτελέσματα [16].

ΜΚ-2206 είναι ένας από του στόματος, ο αναστολέας αλλοστερικοί του ΑΚΤ. Πολυάριθμες προκλινικές μελέτες έχουν αποδείξει την αποτελεσματικότητα στην αναστολή ΑΚΤ και την προώθηση θάνατο των καρκινικών κυττάρων ως μονοθεραπεία όσο και σε συνδυασμό με άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [17], [18], [19], [20]. Κλινικές δοκιμές βρίσκονται σε εξέλιξη με τη χρήση αυτής της νέας ένωσης για τη θεραπεία του καρκίνου για διάφορους συμπαγείς όγκους. ΜΚ-2206 αποδείχθηκε ότι γενικά καλά ανεκτή σε δόσεις μέχρι και 60 mg από το στόμα QOD και είχε ως αποτέλεσμα συγκεντρώσεις πλάσματος εντός του θεραπευτικού εύρους αποδεκτή [21]. Επί του παρόντος, υπάρχει μια ανοιχτή μελέτη φάσης ΙΙ, που χρηματοδοτείται από το NCI για ασθενείς με προχωρημένο ή υποτροπιάζοντα καρκίνο του ενδομητρίου. Τα πρωτογενή αποτελέσματα είναι χωρίς εξέλιξη της νόσου και αντικειμενική ανταπόκριση του όγκου.

Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι η αναστολή του μονοπατιού AKT από MK-2206 έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη βιωσιμότητα και την αυξημένη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του ενδομητρίου. Επιπλέον, η αναστολή της ΑΚΤ αυξάνει τα επίπεδα πρωτεΐνης PRB, τροποποιεί την έκφραση των γονιδίων προγεστίνης ρυθμιζόμενων και συνεργεί με προγεστίνη να μειώσει τον όγκο του όγκου του ξενομοσχεύματα. Συνδυαστική θεραπεία με προγεσταγόνα και αναστολείς ΑΚΤ θα μπορούσε να θεωρηθεί για να ευαισθητοποιήσει το αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου σε θεραπεία με προγεστερόνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το Northwestern University των ζώων Επιτροπή φροντίδα.

τα κύτταρα καρκίνου του ενδομητρίου

κύτταρα PRB23 Ishikawa ελήφθησαν από L. Blok (Erasmus University, Κάτω Χώρες). κύτταρα Ishikawa προήλθε από μια καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου με μία γνωστή μετάλλαξη ΡΤΕΝ [14]. Τα κύτταρα PRB23 δημιουργήθηκαν με σταθερή επιμόλυνση του φορέα έκφρασης pcDNA3.1 PRB σε κύτταρα Ishikawa στερείται ενδογενούς PR [14]. Τα κύτταρα PRB23 διατηρήθηκαν σε DMEM /F12 με 10% FBS, πυροσταφυλικό νάτριο, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, υγρομυκίνη, και G418. Σε περίπου 60-80% συρροή, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού όλη τη νύκτα σε DMEM /F12. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή την επόμενη ημέρα με όχημα, 100 ηΜ ΜΚ-2206 (2 ώρες προεπεξεργασία), 10 ηΜ R5020, ή ένα συνδυασμό των ΜΚ-2206 και R5020. ΜΚ-2206 (Merck) ελήφθη μέσω του Προγράμματος Αξιολόγησης Cancer Therapy.

Western Blot

λύματα ολόκληρων κυττάρων ελήφθησαν επί πάγου με τη χρήση του θηλαστικού διάλυμα λύσης Μ-PER (Thermo Scientific) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης (Sigma). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στα προϊόντα λύσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Micro BCA (Thermo Scientific). Απομονωμένα δείγματα πρωτεΐνης αναλύθηκαν σε πηκτώματα ακρυλαμιδίου 8% και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Whatman). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA, Sigma) σε ΤΒδ-Τ σε θερμοκρασία δωματίου για μία ώρα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια φωσφορυλιωμένων (Ser473) -Akt, φωσφορυλιωμένη (Thr 308) -Akt, φωσφορυλιωμένη PRAS40, PRAS40, φωσφορυλιωμένη (Thr202 /Tyr 204) ERK, ERK, (pThr183 /Tyr185) SAPK /ΙΝΚ, JNK, διασπασμένη PARP, διασπασμένη κασπάση 3 (Cell Signaling) και PR (Dako). Οι κηλίδες πλύθηκαν τέσσερεις φορές σε ΤΒδ-Τ σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενή υπεροξειδάση-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού ή αντίσωμα αντι-ποντικού κατσίκας για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν με το κιτ ανίχνευσης ECL σήμα υπέρ West Femto (Thermo Scientific). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν με χρήση Restore Western Blot απογύμνωσης ρυθμιστικό (Pierce) και ανιχνεύθηκαν με ένα αντίσωμα προς βήτα-ακτίνης (Sigma) για ένα στοιχείο ελέγχου φόρτωσης.

Βιωσιμότητας Κυττάρων

Για την εκτίμηση για την κυτταρική βιωσιμότητα, χρησιμοποιήθηκε το Αντιδραστήριο την Κυτταρική Βιωσιμότητα alamarBlue (Invitrogen). κύτταρα PRB23 σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων διαυγούς πυθμένα μαύρη πλάκα σε περίπου 1500 κύτταρα ανά φρεάτιο σε επωαστή 37 ° C. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύχτα και την επόμενη μέρα, πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια στερήθηκαν ορού όλη τη νύκτα σε άνευ ορού DMEM /F12. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα προ-επεξεργασία με 1 μΜ ΜΚ-2206 για μία ώρα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 ηΜ R5020 για 120 ώρες. Στο τέλος του χρόνου θεραπείας, 10 μL του αντιδραστηρίου Alamarblue προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για δύο ώρες και στη συνέχεια το σήμα φθορισμού μετρήθηκε σε αναγνώστη πλάκας Synergy ΗΤ από την Bio-Tek με το λογισμικό KC4 3,4 στα 530/590 nm για να προσδιοριστεί βιωσιμότητα των κυττάρων.

microarray ανάλυση και Στατιστική ανάλυση

Τρεις ξεχωριστές κυτταρικές καλλιέργειες PRB-Ishikawa χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση μικροσυστοιχιών. Οι πειραματικές συνθήκες ήταν οχήματος ή θεραπεία με 10 ηΜ R5020 για 2 ώρες. Όλα τα δείγματα RNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στην εγκατάσταση Genomics πυρήνα στο Κέντρο Γενετικής Ιατρικής στο Πανεπιστήμιο Northwestern (Chicago, IL). Η ποιότητα του ολικού RNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). 1,5 μg από κάθε δείγμα RNA, με 260/280 και 28S /18S αναλογία μεγαλύτερη από 1,8, χρησιμοποιήθηκε για να κάνει δίκλωνο cDNA. ποιοτικών ελέγχων και την επεξεργασία επίπεδο ανιχνευτή των δεδομένων μικροσυστοιχιών Illumina περαιτέρω γίνει με το πακέτο R Bioconductor, lumi (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/lumi.html). Η επεξεργασία δεδομένων που περιλαμβάνονται επίσης μια διαδικασία κανονικοποίησης που χρησιμοποιεί τη μέθοδο κανονικοποίησης ποσοστημόριο [22] να μειωθεί η διακύμανση συσκότιση μεταξύ μικροσυστοιχίες, οι οποίες θα μπορούσαν να εισαχθούν κατά τη διάρκεια των διαδικασιών της παρασκευής του δείγματος, την κατασκευή, την επισήμανση φθορισμού, υβριδισμό ή /και σάρωση. Ιεραρχική ομαδοποίηση και Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών πραγματοποιήθηκαν στα δεδομένα κανονικοποιούνται σήμα να αξιολογήσει τη σχέση του δείγματος και τη μεταβλητότητα. Probes απουσιάζει σε όλα τα δείγματα διηθούνται σύμφωνα με ρ-τιμές ανίχνευση Illumina στην κατάντη ανάλυση. Διαφορική γονιδιακή έκφραση μεταξύ των διαφορετικών συνθηκών εκτιμήθηκε με ανάλυση στατιστικής γραμμικό μοντέλο με τη χρήση της limma πακέτο βιομεταβιβαστή, κατά την οποία μια εμπειρική μέθοδος Bayes χρησιμοποιήθηκε για να μετριάσει τα τυπικά σφάλματα των εκτιμώμενων log-πλάσια μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης, και οδήγησε σε μια πιο σταθερό εξαγωγής συμπερασμάτων και τη βελτίωση της δύναμης, ειδικά για τα πειράματα με μικρό αριθμό των μικροσυστοιχιών ([23]? https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html). Οι τιμές p μετριάστηκε t-στατιστική προκύπτει από την ανάλυση limma παραπάνω, προσαρμοσμένη για πολλαπλές δοκιμές από Benjamini και τη μέθοδο Hochberg να ελέγχει ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR). Οι κατάλογοι των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων ελήφθησαν από τα κριτήρια του FDR του & lt? 5% και διπλώστε την αλλαγή αποκοπής & gt?. 1.5, και οπτικοποιούνται με οικόπεδα ηφαίστειο

Real Time PCR

RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συγκέντρωση και καθαρότητα του RNA εκχυλίζεται προσδιορίσθηκαν με τη χρήση του ND-1000 φασματοφωτόμετρο (NanoDrop). Σύνολο δείγματα RNA ήταν DNase Ι (Zymo Research) κατεργασία για να απομακρυνθούν τυχόν μολυσματικές DNA. Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με το Smart MMLV αντίστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen) για την σύνθεση του cDNA με τη χρήση του πρωτοκόλλου του κατασκευαστή. Real-time PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές (Applied Biosystems) για να PDK4 και SGK1 και το γονίδιο οικοκυρική ΤΒΡ. Το φορές μεταβολή στην έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt [24], με ΤΒΡ ως εσωτερικός έλεγχος. Όλες οι PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα ΑΒΙ PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) για 40 κύκλους (95 ° C για 15 s, 60 ° C για 1 λεπτό) μετά από 10 λεπτά επώασης στους 95 ° C.

Ξενομοσχεύματα όγκου

ηλικίας έξι εβδομάδων CD-1 nude, με ωοθηκεκτομή θηλυκά ποντίκια αγοράστηκαν από Charles River Laboratories. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο Επιτροπή Φροντίδας Ζώων Northwestern. Ένα εκατομμύριο PRB23 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 1:02 PBS /Matrigel (BD Biosciences) σε συνολικό όγκο 100 μL και υποδόρια ένεση σε δεξιά και αριστερά ράχη του κάθε ποντικού. Ένα σύνολο 32 ποντικών ενέθηκαν προκειμένου να έχει 8 ποντίκια ανά ομάδα αγωγής. Οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 8 εβδομάδες. Από 32 ποντίκια, οι όγκοι αυξήθηκαν σε 28 ποντίκια. Επιπλέον, 2 ποντίκια πέθαναν για άγνωστους λόγους. Τα υπόλοιπα 26 ποντίκια διαιρέθηκαν σε 4 ομάδες, οχήματος (6), η προγεστερόνη (7), ΜΚ-2206 (7), και ΜΚ-2206 + προγεστερόνη (6). σφαιρίδια προγεστερόνη (50 mg, απελευθέρωση 21 ημερών για 2,4 mg /ημέρα) εμφυτεύθηκαν υποδόρια. Οι ποντικοί έλαβαν 120 mg /kg ΜΚ-2206, 3 φορές την εβδομάδα επί 9 ημέρες σε όγκο 0.3 mL του 30% Captisol. Όλες οι μελέτες τοξικότητας έχουν διεξαχθεί σε τρωκτικά από την Merck και 120 mg /kg είναι η συνιστώμενη να μελετήσει αποτελέσματα επί όγκων, χωρίς να προκαλεί τοξικότητα [25] δόση. Οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου φορέα δόθηκαν 0.3 ml 30% Captisol. Οι ποντικοί ζυγίστηκαν πριν και μετά τις θεραπείες. Τα μεγέθη των όγκων μετρήθηκαν με παχύμετρα μέσα από την πορεία 8 εβδομάδων, καθώς και μετά τις θεραπείες. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο:

Το μέγεθος του όγκου

= 1/2 (

μήκος

×

πλάτος

)

2 [25] . Οι όγκοι αποκόπηκαν και υπέστησαν επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία.

Ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και εγκλεισμένων σε παραφίνη, και 4 μm τομές ιστών τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες. Τα τμήματα των όγκων-παραφινοποιήθηκαν. Θερμική ανάκτηση επαγόμενη επιτόπιο στη συνέχεια διεξήχθη σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού 10 ηΜ νάτριο με 0,05% Tween (Sigma) σε ρΗ 6.0. Το κιτρικό ρυθμιστικό προ-θερμαίνεται σε υδατόλουτρο στους 99 ° C και στη συνέχεια τα πλακίδια τοποθετήθηκαν σε ρυθμιστικό για 45 λεπτά. Τα πλακίδια αφέθηκαν να κρυώσουν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκαν σε TBS-T για 5 λεπτά. Το κιτ Dako EnVision HRP IHC χρησιμοποιήθηκε. 3% υπεροξείδιο του υδρογόνου εφαρμόστηκε στις τομές ιστού για 10 λεπτά που ακολουθήθηκε από 2 πλύσεις για 10 λεπτά σε TBS-T. μπλοκ πρωτεΐνη εφαρμόστηκε επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές του ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε PR (Dako) ή διασπασμένη κασπάση 3 (Cell Signaling) όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο. Αντι-κουνελιού ή δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού στη συνέχεια εφαρμόστηκε στις τομές ιστού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια πλένονται σε ΤΒδ-Τ δύο φορές για 5 λεπτά. διάλυμα DAB εφαρμόστηκε σε κάθε τομή ιστού για 5 λεπτά και στη συνέχεια ξεπλένονται. Αιματοξυλίνη Mayer χρησιμοποιήθηκε αιματοξυλίνης και οι πλάκες ξεπλύθηκαν. Οι τομές στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε ένα διάλυμα από 28% υδροξείδιο του αμμωνίου και στη συνέχεια ξεπλένονται. Οι τομές αφυδατώθηκαν μέσω 2 αλλαγές από 95% αιθανόλη, 2 αλλαγές 100% αιθανόλη, και 2 αλλαγές ξυλένιου. Οι τομές στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε καλυπτρίδες χρησιμοποιώντας Cytoseal XYL μέσα στερέωσης (Richard-Allan Scientific). Οι πλάκες στη συνέχεια, οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το Axiovert 200 (Zeiss) μικροσκόπιο και φωτογραφίες που τραβήχτηκαν με την κάμερα Zeiss AxioCam.

Αποτελέσματα

MK-2206 Αναστέλλει ΑΚΤ

Έχει προηγουμένως ανέφεραν ότι τα κύτταρα Ishikawa φέρουν μια μετάλλαξη ΡΤΕΝ και αυτό έχει ως αποτέλεσμα ιδιοσυστατική κατάντη ενεργοποίηση ΑΚΤ [7], [8]. Προκειμένου να προσδιοριστεί αν ΜΚ-2206 ανέστειλε ΑΚΤ στα κύτταρα PRB23, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του ΜΚ-2206 (0-1 μΜ) και επωάστηκαν για διάφορους χρόνους (0-24 h) (Σχ. 1Α, 1Β). Η φωσφορυλιωμένη (Ser473) -Akt ανιχνεύθηκε σε κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με όχημα και τα επίπεδα προοδευτικά μειώθηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ΜΚ-2206 (Σχ. 1Α). Τα συνολικά επίπεδα ΑΚΤ δεν επηρεάσθηκαν από κατεργασία με ΜΚ-2206. Επίπεδα p (Ser473) -Akt μειώθηκε, ήδη από 1 ώρα, και παρέμεινε χαμηλότερο από κύτταρα επεξεργασμένα όχημα στις 24 ώρες (Εικ. 1Β). Επίπεδα p (Thr308) -Akt μειώθηκε επίσης με 100 ηΜ αγωγή ΜΚ-2206, τόσο σε 4 ώρες και 24 ώρες (Εικ. 1 C). PRAS40 είναι μια άμεση υπόστρωμα του ΑΚΤ και τα επίπεδα ρ (Thr246) -PRAS40 μειώθηκε κατά ΜΚ-2206 αγωγή σε 4 ώρες και 24 ώρες, υποδεικνύοντας ότι η δραστηριότητα μειώνεται ΑΚΤ (Εικ. 1 C). Στη συνέχεια, προκειμένου να αποδείξει ότι το ΜΚ-2206 ήταν ειδική προς την οδό ΑΚΤ σε κύτταρα PRB23, μετρήθηκαν τα επίπεδα των άλλων φωσφορυλιωμένων κινάσες, οι οποίες δεν είναι άμεσοι στόχοι της ΑΚΤ. Τα επίπεδα της p (Thr202 /Tyr204) -ERK καθώς και p (Thr183 /Tyr185) -JNK δεν άλλαξε κατά MK-2206 της θεραπείας είτε σε 4 ώρες ή 24 ώρες (Εικ. 1Γ).

PRB- ειδικά κύτταρα Ishikawa (PRB23) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Α) αυξανόμενες συγκεντρώσεις (0-1 μΜ) της ΜΚ-2206 για 24 ώρες και Β) 100 ηΜ ΜΚ-2206 για διάφορους χρόνους (0-24 ώρες). Τα επίπεδα πρωτεΐνης του ρ (Ser473) -Akt, ΑΚΤ και ακτίνης μετρήθηκαν με κηλίδωση Western. C) κύτταρα PRB23 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 nM MK-2206 για 4 ώρες ή 24 ώρες και τα επίπεδα της p (Thr308) -Akt, ΑΚΤ, p (Thr246) PRAS40, PRAS40, p (Thr202 /Tyr204) ERK, ERK, p ( Thr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK και ακτίνης μετρήθηκαν με κηλίδα western.

η

η αναστολή της ΑΚΤ Αυξάνει PRB πρωτεΐνη Επίπεδα

Είναι ενδιαφέρον ότι, η αγωγή με ΜΚ-2206 οδήγησε επίσης σε μια σημαντική αύξηση στα επίπεδα PRB στα κύτταρα PRB23, υποδεικνύοντας ότι η ΑΚΤ επηρεάζει τα επίπεδα πρωτεΐνης PR σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 2Α). Λαμβάνοντας υπόψη την ανταγωνιστική λειτουργία της προγεστερόνης στο ενδομήτριο, οι επιπτώσεις της ρύθμισης των επιπέδων PR είναι σημαντικές. Πρώτον, μια μικροσυστοιχία διεξήχθη για να προσδιορίσει PRB-ρυθμιζόμενα γονίδια σε κύτταρα PRB23. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα PRB23 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ R5020 για 2 ώρες και έτσι θα πρέπει να προσδιορίζονται μόνο τα γονίδια νωρίς απόκριση προς προγεστίνες. Ένα σύνολο 70 γονιδίων ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω κατά περισσότερο από 1,5 φορές και 16 γονίδια μειωτικά σημαντικά (Σχ. 2Β). Τα πιο υψηλά ρυθμισμένη προς τα πάνω γονίδια ήταν PDK4 (9,92 φορές), TIPARP (7,79 φορές), και SGK1 (4,41 φορές). Γονίδια αναλύθηκαν περαιτέρω με τη «λειτουργική σχολιασμό ομαδοποίηση» εργαλείο της βάσης δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (David) [26]. Γονίδια κατηγοριοποιούνται ανάλογα με τη βάση δεδομένων SP-PIR Λέξεις-κλειδιά. Η κατηγορία που περιλάμβανε ο μεγαλύτερος αριθμός των γονιδίων που ρυθμίζονται από R5020 ήταν «φωσφοπρωτείνες» και το δεύτερο υψηλότερο ήταν τα γονίδια που τα προϊόντα της συνδέθηκαν με τον πυρήνα (Σχ. 2C).

Α) PRB-ειδικά Ishikawa κύτταρα (PRB23) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα, 100 ηΜ ΜΚ-2206, 10 ηΜ R5020, ή ένας συνδυασμός των ΜΚ-2206 + R5020 (Μ + Κ) για 4 ώρες και τα επίπεδα πρωτεΐνης του ρ (Ser473) -Akt, ΑΚΤ, PRB και ακτίνη μετρήθηκαν με κηλίδωση Western. Β) Ανάλυση μικροσυστοιχιών κυττάρων PRB23 αγωγή με όχημα ή 10 ηΜ R5020 Διεξήχθη και γονιδίων που ρυθμίζονται σημαντικά με 1,5-πλάσια ή μεγαλύτερη ταυτοποιήθηκαν. Ανάλυση C) κατηγορίες γονιδίων οντολογίας έγινε χρησιμοποιώντας DAVID για τα γονίδια που ρυθμίζονται από περισσότερο από 1,5 φορές από R5020.

Η

Στη συνέχεια, η επίδραση της ΑΚΤ στην γονιδίων στόχων PRB εξετάστηκε. κύτταρα PRB23 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ R5020 με την παρουσία ή απουσία 100 ηΜ ΜΚ-2206. Έκφραση των PDK4 και SGK1 στη συνέχεια μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR. PDK4 και SGK1 είχαν χαρακτηριστεί ως φωσφοπρωτείνες. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3, και οι δύο PDK4 και SGK1 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω με R5020, επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα μικροσυστοιχίας. ΜΚ-2206 αγωγή μόνη της δεν επηρέασε την έκφραση οποιουδήποτε από τα γονίδια δοκιμάστηκαν σε σύγκριση με κύτταρα υποστεί αγωγή με έκδοχο. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε συνδυασμό με R5020 και ΜΚ-2206, η έκφραση του PDK4 αυξήθηκε σημαντικά, ωστόσο, η έκφραση SGK1 δεν άλλαξε με τη θεραπεία συνδυασμού σε σύγκριση με το R5020 μόνο. Αυτή η διαφορική ρύθμιση των γονιδίων στόχων PRB στα κύτταρα PRB23 όταν ΑΚΤ αναστέλλεται ισχυρά υποδηλώνει ένα πιο σύνθετο μηχανισμό ρύθμισης γονιδίων από την απλή αύξηση των επιπέδων του PRB πρωτεΐνης.

κύτταρα PRB23 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, 10 ηΜ R5020, 100 ηΜ ΜΚ-2206, ή ένας συνδυασμός των ΜΚ-2206 + R5020 (Μ + Κ) και γονιδιακή έκφραση των PDK4 και SGK1 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές αλλαγές από επεξεργασμένα δείγματα όχημα και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± sem από 6 ανεξάρτητα πειράματα. «*» Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. P ≤ 0,05.

Η

MK-2206 και προγεστερόνης Μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και των όγκων Μέγεθος

Για να μετρηθούν οι επιπτώσεις της ΑΚΤ και προγεστερόνης για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων, τα κύτταρα PRB23 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με R5020 με την παρουσία ή απουσία του ΜΚ-2206 και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε. Ενώ R5020 και ΜΚ-2206 μειώθηκαν ανεξάρτητα βιωσιμότητα των κυττάρων κατά τη διάρκεια 5 ημερών ο συνδυασμός των R5020 και ΜΚ-2206 προκάλεσε τη μεγαλύτερη μείωση στην βιωσιμότητα (Εικ. 4).

κύτταρα PRB23 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, 100 ηΜ R5020, 1 υΜ ΜΚ-2206, ή ένας συνδυασμός των ΜΚ-2206 + R5020 (Μ + Κ) για 5 ημέρες και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρήση της ανάλυση Alamar Blue. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως% βιωσιμότητα από επεξεργασμένα δείγματα όχημα και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± sem 4 ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Στη συνέχεια, τα αποτελέσματα της προγεστερόνης και ΜΚ-2206 εξετάστηκαν σε ξενομόσχευμα όγκων που αναπτύχθηκαν από υποδόρια ένεση των κυττάρων PRB23 σε γυμνά ποντίκια. Οι όγκοι αναπτύχθηκαν για 8 εβδομάδες και στη συνέχεια κατεργάζεται για 9 ημέρες με όχημα, προγεστερόνη, ΜΚ-2206, ή προγεστερόνη + ΜΚ-2206 (εικ. 5Α). Βάρος των ποντικών δεν μεταβλήθηκε σημαντικά με τις θεραπείες (Εικ. 5Β). Σε σύγκριση με τους ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με όχημα, οι ποντικοί που έλαβαν μόνο ΜΚ-2206 ή προγεστερόνη μόνη εμφάνισαν μέτριες μειώσεις στον όγκο του όγκου τους με βάση τις φορές μεταβολής από το μέγεθος του όγκου πριν από τη θεραπεία. Η μεγαλύτερη μείωση του μεγέθους του όγκου παρατηρήθηκε στα ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν με δύο ΜΚ-2206 και προγεστερόνη (Εικ. 5C).

Α) κύτταρα PRB23 ήταν ξενομόσχευμα υποδόρια σε γυμνούς ποντικούς CD1. Μετά από 8 εβδομάδες, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, 120 mg /kg ΜΚ-2206 από το στόμα, 3 φορές την εβδομάδα για 9 ημέρες, προγεστερόνη ή συνδυασμός των ΜΚ-2206 και προγεστερόνη. Β) Βάρη των ποντικών μετρήθηκαν πριν και μετά τις θεραπείες και C) οι όγκοι μετρήθηκαν πριν και μετά από τις θεραπείες και ο όγκος υπολογίστηκε. «*» Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. P ≤ 0,05.

Η

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση έγινε σε τομές όγκων χρησιμοποιώντας αντισώματα προς τον υποδοχέα προγεστερόνης, Κί67 και διασπασμένη κασπάση-3 (Εικ. 6). Χρώση για PR ήταν εμφανής στους όγκους, αν και δεν είναι όλα τα κύτταρα ήταν θετικά για PR. θεραπεία προγεστερόνης μειωμένα επίπεδα PR τόσο με την παρουσία και απουσία του ΜΚ-2206. Σε αντίθεση, το ΜΚ-2206 αγωγή προώθησε μια αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης PR στους όγκους, παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα (Εικ. 2Α). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με τα επίπεδα πρωτεΐνης Ki67, η οποία μειώθηκε με προγεστερόνη, ΜΚ-2206, καθώς και ο συνδυασμός προγεστερόνης + ΜΚ-2206 αγωγή. Τα χαμηλότερα επίπεδα χρώσης Κί67 παρατηρήθηκε με τη συνδυασμένη θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συνδυασμένη θεραπεία μειώνει πιο αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Επίπεδα διασπασμένη κασπάση 3, ένας δείκτης της απόπτωσης, ήταν αμελητέες στους όγκους των ποντικών που έλαβαν όχημα, ενώ χρώση ήταν εμφανής στους όγκους της προγεστερόνης ή ΜΚ-2206 αγωγή ποντικούς. Η συνδυασμένη θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη έκφραση της διασπασμένης κασπάσης-3, ενδεικτικό της αυξημένης απόπτωσης.

ξενομόσχευμα όγκων μονιμοποιήθηκαν, ενσωματωμένα και τεμαχίστηκαν. Ανοσοϊστοχημική χρώση των όγκων για PR, Ki67 και διασπάστηκε casapse-3 (ΥΧ3) πραγματοποιήθηκε.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι MK-2206 μειώθηκαν αποτελεσματικά τα επίπεδα της p (Ser473) -Akt και p (Thr308) -Akt στα PTEN-μεταλλαγμένα κύτταρα Ishikawa. Ως αποτέλεσμα, τα επίπεδα του p (Thr246) -PRAS40, ένας προς τα κάτω στόχος του ΑΚΤ, μειώθηκε επίσης, ενδεικτικό ότι η δραστηριότητα της ΑΚΤ αναστάλθηκε από ΜΚ-2206. Αυτός ο αναστολέας δεν επηρέασε τα επίπεδα άλλων κινασών, όπως pERK και pJNK αποδεικνύοντας την εξειδίκευση για αυτή την ένωση με την οδό ΑΚΤ. Η αναστολή της ΑΚΤ αύξησε επίσης τα επίπεδα του PRB. Προηγουμένως, δείξαμε ότι ένα διαφορετικό αναστολέα ΑΚΤ, API-59CJ-OMe (EMD4Biosciences), επίσης αυξηθεί σημαντικά τα επίπεδα PR στα κύτταρα PRB23 Ishikawa [8]. Gu et al., [27], πρόσφατα έδειξαν ότι η αναστολή της ΡΙ3Κ LY294002 χρησιμοποιώντας αυξημένα επίπεδα PR στα κύτταρα Ishikawa. Η επιρροή της οδού ΑΚΤ στην έκφραση PR και η λειτουργία δεν έχει μελετηθεί λεπτομερώς και οι μηχανισμοί με τους οποίους αυτή η αύξηση της πρωτεΐνης PR συμβαίνει επί του παρόντος διερευνάται στο εργαστήριο μας. τρέχουσα υπόθεση εργασίας μας κέντρα σχετικά με το ρόλο της ΑΚΤ στη μείωση της ευαισθησίας στην προγεστερόνη στον καρκίνο του ενδομητρίου. Η μείωση των επιπέδων PR ήταν το πρώτο κομμάτι των στοιχείων που υποστηρίζουν την υπόθεσή μας. Θεωρήθηκε ότι τα αυξημένα επίπεδα PR θα πρέπει να ενισχύσει PR μεταγραφική λειτουργία, ωστόσο, τα στοιχεία αποκαλύπτουν ότι η δράση PR είναι πιο περίπλοκη, δεδομένου ότι δεν είναι όλα τα γονίδια που προγεστερόνης-ρυθμίζονται επηρεάστηκαν από την αναστολή ΑΚΤ. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι, όπως και άλλοι υποδοχείς στεροειδών ορμονών, ρύθμιση των γονιδίων από το PR εμπλέκει πολλές αλληλεπιδράσεις με άλλους παράγοντες μεταγραφής, DNA, coregulators, και σύμπλοκα αναδιαμόρφωσης χρωματίνης. δράση PR είναι το γονίδιο συγκεκριμένο το γεγονός ότι διαφορετικοί μηχανισμοί απασχολούνται σε διαφορετικά σημεία της χρωματίνης. ανάλυσης μικροσυστοιχιών μας προσδιορίζονται PDK4 να είναι η πιο μεγάλη απορυθμίζεται γονίδιο (πάνω από 50 φορές αύξηση) με βραχυπρόθεσμη θεραπεία προγεστερόνης. Αυτό ήταν επίσης ένα γονίδιο το οποίο αυξήθηκε περαιτέρω με προγεστίνη όταν ΑΚΤ αναστάλθηκε, υποδεικνύοντας ότι υπερδραστήρια ΑΚΤ στα κύτταρα Ishikawa αποσβένει τη δράση προγεστερόνης σε αυτό το συγκεκριμένο γονίδιο. Έχει δειχθεί ότι PDK4 επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω με γλυκοκορτικοειδή, μέσω GR, σε κύτταρα HepG2 [28]. Απέδειξαν ότι η υπερέκφραση του PKBα κατήργησε τη διέγερση δεξαμεθαζόνης του υποκινητή PDK4 το οποίο υποστηρίζει τα ευρήματά μας. Επιπλέον, αποδεικνύεται ότι FOXO1, η οποία είναι άμεσα φωσφορυλιώνεται από ΑΚΤ και εξάγονται στο κυτταρόπλασμα, ήταν απαραίτητη για την GR-μεσολάβηση προς τα πάνω ρύθμιση PDK4. Έχουμε αποδείξει μια συνεργασία του PR και FOXO1 στη ρύθμιση γονιδίων σε στρωματικά κύτταρα του ενδομητρίου [29], [30], [31] και ως εκ τούτου είναι πιθανό ότι PDK4 αυξορρύθμιση από προγεστίνες απαιτεί τόσο PR και FOXO1 σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα. Έτσι, όταν AKT είναι ενεργή, τα ανεπαρκή επίπεδα FOXO1 είναι διαθέσιμα για να δράσει στον πυρήνα και την έκφραση της PDK4 είναι βρεγμένο. Θα ήταν ενδιαφέρον να προσδιοριστεί η σημασία της PR και FOXO1 συνεργασία στις άλλες γονίδια προγεστερόνη αποκρινόμενα που επηρεάστηκαν από την αναστολή της ΑΚΤ στον καρκίνο του ενδομητρίου.

PDK4 είναι μια κινάση που αδρανοποιεί το σύμπλοκο πυροσταφυλικής αφυδρογονάσης (PDC) . Το PDC παράγει ακετυλο-CoA, το οποίο είναι ο πρόδρομος για τη σύνθεση των λιπαρών οξέων και την παραγωγή ενέργειας από τον κύκλο του Krebs. PDC δραστηριότητα ρυθμίζεται από PDKs και φωσφατάσες PDC να φωσφορυλιώσει ή αποφωσφορυλιώνουν το συστατικό E1a του συγκροτήματος. Αυτή η ρύθμιση είναι σημαντική για τον έλεγχο του μεταβολισμού γλυκόζης και των λιπιδίων. Προς τα πάνω ρύθμιση PDK4 από προγεστίνες και περαιτέρω ενίσχυση της αύξησης αυτής κατά ΜΚ-2206 αγωγή υποδεικνύει ότι προγεστίνες μπορούν να δράσουν για να αδρανοποιήσουν το PDC και αναστέλλουν τη μετατροπή του πυροσταφυλικού σε ακετυλο-CoA. Αυτή η αναστολή της παραγωγής ακετυλο-CoA μπορεί, κατά συνέπεια, να οδηγήσει στην αξιοποίηση των εναλλακτικών μεταβολικών οδών, όπως η γλυκόλυση. Λόγω του κεντρικού ρόλου που διαδραματίζει PDK4 στη ρύθμιση την επιλογή μεταξύ γλυκόλυση και οξειδωτική φωσφορυλίωση, PDK4 έχει ενοχοποιηθεί σε ένα αριθμό διαφορετικών καρκίνων. Έχει προηγουμένως δειχθεί ότι η αναστολή της δράσης PDK είναι επαρκής για να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει ότι PDKs μπορούν να οδηγούν ογκογένεση [32]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι η υπερέκφραση του PDK4 είναι επαρκής για να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του μαστού και ότι η έκφραση PDK4 ρυθμίζεται μειωτικά σε ένα αριθμό διαφορετικών ιστών του καρκίνου [33]. Ο ειδικός ρόλος που διαδραματίζει PDK4 στον καρκίνο του ενδομητρίου μένει να αποκρυπτογραφηθεί.

Οι προκλινικές μελέτες έχουν δείξει MK-2206 για να αναστέλλουν αποτελεσματικά την οδό ΑΚΤ, καθώς και τον πολλαπλασιασμό μείωση και την αύξηση του όγκου των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών [25]. Έχει επίσης δειχθεί ότι ο συνδυασμός του ΜΚ-2206 και χημειοθεραπευτικούς παράγοντες είναι πιο αποτελεσματικό στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου [25]. ΜΚ-2206 μαζί με έναν αναστολέα ΜΕΚ αποδείχθηκε να έχει μια συνεργική επίδραση επί της ανάπτυξης του όγκου και οδήγησε σε αύξηση των ποσοστών επιβίωσης σε ποντίκια που φέρουν εξαιρετικά επιθετική ανθρώπινους όγκους του πνεύμονα [34]. ΜΚ-2206 ήταν σε θέση να αποκαταστήσει την ευαισθησία των ανθεκτικών κυττάρων σε sorafenib, έναν αναστολέα κινάσης τυροσίνης, για να επάγει απόπτωση σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [35]. Σε συνδυασμό με Gefitinib, ένα μικρό μόριο αναστολέα της κινάσης τυροσίνης EGFR, ΜΚ-2206 προωθηθούν αποτελεσματικά απόπτωση σε κακόηθες γλοίωμα [17].