Αφηρημένο

Το κύριο πρόβλημα που προκύπτει από τον καρκίνο του προστάτη (PCA) είναι η τάση του να μεταστάσεις στα οστά. Τα microRNAs (miRNAs) διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο σε πολλές μεταστάσεις των όγκων. Η σημασία των miRNAs στο οστών μετάσταση του προστάτη δεν έχει διευκρινιστεί μέχρι σήμερα. Ερευνήσαμε αν η έκφραση ορισμένων miRNAs συνδέθηκε με μετάσταση στα οστά του προστάτη. Εξετάσαμε τα προφίλ έκφρασης των miRNAs του μεταστατικού δειγμάτων 6 πρωτοβάθμιας και 7 οστών προστάτη με ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA. Η έκφραση των 5 miRNAs μειώθηκε σημαντικά σε μετάσταση στα οστά σε σχέση με την πρωτογενή προστάτη, συμπεριλαμβανομένων Mirs-508-5p, -145, -143, -100 -33a και. Εξετάσαμε περαιτέρω άλλα δείγματα της 16ης πρωτοβάθμια προστάτη και 13 οστικές μεταστάσεις, χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR. Οι εκφράσεις του Mirs-143 και -145 επαληθεύθηκαν να μειορυθμίζουν σημαντικά στα δείγματα μετάσταση. Με τη διερεύνηση της σχέσης των επιπέδων της Mirs-143 και -145 με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά των ασθενών προστάτη, βρήκαμε κάτω κανονισμούς της Mirs-143 και -145 είχαν αρνητική συσχέτιση με μετάσταση στα οστά, το Gleason σκορ και το επίπεδο του ελεύθερου PSA στην πρωτοβάθμια προστάτη . Υπερ-έκφραση miR-143 και -145 με επιμόλυνση ρετροϊό μείωσε την ικανότητα της μετανάστευσης και εισβολής

in vitro

, και την ανάπτυξη του όγκου και των οστών εισβολή

in vivo

από PC-3 κύτταρα, μια ανθρώπινη προστάτη κυτταρική γραμμή προήλθε από ένα οστό μεταστατικό δείγμα του προστάτη. αυξορρύθμιση τους αυξήθηκε επίσης έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένη έκφραση ινωδονεκτίνης από PC-3 κύτταρα τα οποία αποκάλυψαν μια λιγότερο επεμβατική φαινότυπο μορφολογικά. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι Mirs-143 και -145 συνδέονται με οστική μετάσταση προστάτη και προτείνουν ότι μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην μετάσταση στα οστά και να εμπλέκονται στην ρύθμιση της ΕΜΤ Και οι δύο μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν κλινικά ως νέων βιολογικών δεικτών στην διακριτική διαφορετικά στάδια της ανθρώπινης προστάτη και την πρόβλεψη μετάσταση στα οστά

Παράθεση:. Peng X, Guo W, Liu Τ, Wang Χ, Tu Χ, Xiong D, et al. (2011) Ταυτοποίηση των Mirs-143 και -145 που σχετίζεται με μετάσταση στα οστά του καρκίνου του προστάτη και εμπλέκονται στη ρύθμιση της EMT. PLoS ONE 6 (5): e20341. doi: 10.1371 /journal.pone.0020341

Επιμέλεια: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Πανεπιστήμιο, Γαλλία

Ελήφθη: 27, Ιανουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 21 Απρ του 2011? Δημοσιεύθηκε: May 27, 2011

Copyright: © 2011 Peng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. NSFC- κοινή Guangdong χρηματοδότηση, η Κίνα (Αρ u0732001)? το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Guangdong, Κίνα (Νο 06021290)? Επιστήμη και Τεχνολογία έργο του σχεδιασμού της επαρχίας Guangdong, Κίνα (Αρ 2008B030301037) και Επιστήμης και Τεχνολογίας Σχεδιασμού Έργου της Zhuhai, Κίνα (2009). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ο συγγραφέας Tiejian Liu απασχολείται από μια εμπορική εταιρεία, η Laura Biotech Co., Ltd ., και προσχώρησε ερευνητική ομάδα των συγγραφέων για ιδιωτικούς λόγους. Λόγω της δουλειάς του στην ερευνητική ομάδα, θα αποκτήσουν σημαντική εμπειρία η οποία θα είναι χρήσιμη για την εφαρμογή του για το διδακτορικό του. Αυτό το έγγραφο δεν έχει κανένα εμπορικό ενδιαφέρον από την άποψη της Laura Biotech, και τα δεδομένα και τα αποτελέσματα που περιγράφονται στο παρόν δεν έχουν καμία σχέση με την εν λόγω εταιρεία. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι αυτό δεν μεταβάλλει την προσκόλλησή τους σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκονται κακοήθης όγκος και το δεύτερο κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο στις δυτικές χώρες [1]. Το κύριο πρόβλημα που προκύπτει από PCA είναι η τάση του να κάνει μετάσταση στα οστά. Σκελετικές μεταστάσεις συμβαίνουν σε όσο το 90% των ασθενών με προχωρημένο προστάτη. Είναι σημαντικό ότι, άπαξ οι όγκοι υφίστανται μετάσταση στα οστά, είναι σχεδόν ανίατη και οδηγούν σε σημαντική νοσηρότητα πριν από τον θάνατο του ασθενούς [2], [3]. Είναι πολύ σημαντικό να κατανοήσουμε το μηχανισμό σχηματισμού μετάστασης για την πρόληψη της μετάστασης και την ανάπτυξη αντι-μεταστατική θεραπείες που μπορούν να παρέχουν επιπλέον μείωση της νοσηρότητας και θνησιμότητας των ασθενών προστάτη.

Σκελετική μετάσταση του όγκου είναι ένα περίπλοκο πολλών βημάτων διαδικασία που περιλαμβάνει την κυτταρική απεμπλοκή και την κινητικότητα από το τοπικό μικροπεριβάλλον, η υποβάθμιση του περιβάλλοντος εξωκυττάριας μήτρας, την κυτταρική κίνηση, συνελήφθη στο άπω τριχοειδή αγγεία, εξαγγειώνονται και, τέλος, πολλαπλασιάζονται για να σχηματίσουν μακρινό όγκους δευτεροβάθμιας οστών. Όλες αυτές οι διαδικασίες ρυθμίζονται από πολλαπλούς παράγοντες και μοριακών οδών [4]. Παρά το γεγονός ότι οι βασικές γνώσεις που σχετίζονται με αυτή τη δομημένη διαδικασία έχει αυξηθεί πρόσφατα, πολλά από τα βασικά στοιχεία είναι ακόμη πλήρως κατανοητό.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών μη κωδικοποιητική ρυθμιστικών RNAs (19-25 νουκλεοτίδια) που εκφράζονται από τα φυτά και ζώα που εμπλέκονται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ασκούν λειτουργία τους με σύνδεση προς το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή από ένα υποσύνολο των mRNAs με αποτέλεσμα την υποβάθμιση ή την καταστολή της μετάφρασης [5] τους. Βιοπληροφορικής αναλύσεις έχουν προβλέψει ότι μόνο miRNA έχει πολλαπλούς στόχους, και ως εκ τούτου miRNAs θα μπορούσε να μεσολαβήσει τη ρύθμιση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη. Πρόσφατες εκτιμήσεις δείχνουν ότι το ένα τρίτο των ανθρώπινων mRNAs μπορεί να ρυθμίζεται από miRNAs [6], [7]. έχουν miRNAs αποδειχθεί ότι παρεμβαίνει κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό κυττάρων, διαφοροποίηση κυττάρων, και την απόπτωση [8].

Πολλές αναφορές έχουν αποσαφηνίσει το ρόλο ορισμένων miRNAs ως υποκινητές ή καταστολείς των όγκων [9], [10] , [11]. Ένας αυξανόμενος αριθμός των παρατηρήσεων δίνει επίσης μια συλλογική αποδείξεις ότι miRNAs συντονίσει ορισμένα από τα περίπλοκα προγράμματα γονιδιακής έκφρασης και διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη μετάσταση του όγκου [12]. miRNAs μπορεί να επηρεάσει πολλαπλά στάδια των μεταστατικών καταρράκτη, όπως είναι η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εισβολή και ενδαγγείωση. Για παράδειγμα, ο καρκίνος του μαστού είναι μία από τις πιο σημαντικούς παράγοντες των μεταστάσεων στα οστά [13]. Μια σειρά από microRNAs έχουν ταυτοποιηθεί ως υποκινητές μετάσταση, συμπεριλαμβανομένων ας-7, miR-9, miR-10b, miR-21, miR-373, miR-520c, και miR-103/107 [12], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Αντίθετα, miR-335, miR-206, miR-31, miR-145, miR-661 και miR-126 έχουν ταυτοποιηθεί ως μετάσταση καταστολέα miRNAs σε ανθρώπινο καρκίνο του μαστού [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27].

Στο προστάτη, αρκετές miRNAs έχουν αναγνωριστεί ως διαμεσολαβητές της μετάστασης. Αποδείχθηκε ότι η απορρύθμιση του miR-221 και miR-222 συνδέθηκε με προστάτη εξέλιξη, κακή πρόγνωση, καθώς και την ανάπτυξη των μεταστάσεων [28]. miR-21 ήταν επίσης υπερ-εκφράζεται σε PCa και ενεργεί ως βασικό ογκογόνους ρυθμιστή που συμβάλλει στην ανάπτυξη του όγκου, διεισδυτικότητα και τη μετάσταση [29], [30], [31]. Μια μελέτη έδειξε ότι το miR-146a στοχεύει ROCK1, και αυξημένα επίπεδα ROCK1 προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εισβολή και τη μετάσταση στα κύτταρα του προστάτη [32]. Επιπλέον, η γονιδιωματική απώλεια του miR-101 σε ανθρώπινα PCa, που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου, οδηγεί σε υπερέκφραση του ΕΖΗ2 [33], [34]. Ωστόσο, η σημασία της miRNAs σε μετάσταση στα οστά του προστάτη δεν έχει διευκρινιστεί μέχρι σήμερα.

επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) είναι ένα συγκεκριμένο μονοπάτι σήμα της περιγραφής ένα βασικό βήμα της προόδου της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων η οποία περιλαμβάνει διαδοχικές διαδικασίες του κυττάρου-αποσύνδεσης, που μεταναστεύουν, εισβάλλοντας, διασπορά και η τελική κατοικούν [35]. Έχει αναγνωριστεί ως σήμα κατατεθέν της μετάστασης σε πολλαπλούς όγκους, τη σύνδεση με την αφθονία των μεταγραφικών παραγόντων [36], [37], [38], [39]. miRNAs είναι επίσης συστατικά του κυκλώματος κυτταρικής σηματοδότησης που ρυθμίζει το πρόγραμμα ΕΜΤ [40]. Πρόσφατες εργασίες έχει αποδείξει πολλές miRNAs, συμπεριλαμβανομένων των miR-200 οικογένεια και miR-205, έπαιξε κρίσιμο ρόλο στην EMT [41], [42]. Μέχρι τώρα, ο ακριβής ρόλος των miRNAs στην ρύθμιση EMT είναι ακόμα ασαφής.

Για να διερευνήσει το ρόλο των miRNAs στο οστών μετάσταση του προστάτη και η σχέση τους με την EMT, είναι κατ ‘αρχάς χρειάζεται να γνωρίζουμε την έκφραση των miRNAs προφίλ στην πρωτοβάθμια και οστών μεταστατικό ΣΕΣΣ. Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε τα προφίλ έκφρασης των miRNAs στην πρωτοβάθμια και οστά μεταστατικό προστάτη του ανθρώπου και προσδιόρισε Mirs-143 και -145 που σχετίζονται με μετάσταση στα οστά. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι τα upregulations του Mirs-143 και -145 καταστέλλεται μετανάστευση και εισβολή

in vitro

, την ανάπτυξη των όγκων και των οστών εισβολή

in vivo

, και ΕΜΤ του PC-3 κύτταρα, μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά προστάτη προήλθε από ένα οστό μεταστατικό δείγμα του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

τα δείγματα ιστών από δύο ομάδες των ασθενών προστάτη μελετήθηκαν. Πρωτεύοντες ιστούς προστάτη ήταν από προστατεκτομή ή διαουρηθρική εκτομή στη θεραπεία της τοπικής καρκινώματος του προστάτη. Σκελετική μεταστατικό ιστούς προστάτη ήταν από τη λειτουργία για τη θεραπεία της μετάστασης οστών. Όλα τα δείγματα ήταν σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) με τυποποιημένες διαδικασίες. Περιοχές δείγματα ιστών & gt? 70% καρκινικού ιστού χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή του ολικού RNA. Η ιστολογική διάγνωση έγινε από έναν παθολόγο και έχει εκ νέου επιβεβαιωθεί από ένα δεύτερο παθολογοανατόμο (Ο.Η.). Μετάσταση στα οστά διαγνώστηκε σύμφωνα με κλινικό σύμπτωμα και σημάδι, σπινθηρογράφημα οστών, ακτινογραφίες, αξονική τομογραφία, μαγνητική τομογραφία και. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει εισαγωγική ορμόνη, ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία πριν πάρει τους ιστούς όγκων. Η κλινική πληροφορίες αναθεωρήθηκε για την ηλικία, μετάσταση στα οστά, το συνολικό επίπεδο PSA, δωρεάν επίπεδο PSA και το σκορ Gleason στην πρωτοβάθμια ασθενείς ΣΕΣΣ. Η μελέτη εγκρίθηκε από την ηθική Διοικητικό Θεσμικών (IRB) στο πρώτο συνδεδεμένες νοσοκομείο της Sun Yat-sen University και συναινέσει από τους ασθενείς που συμμετέχουν.

RNA

εξόρυξη

Όλα τα δείγματα εστάλησαν σε CapitalBio Corp . και το συνολικό RNA από δείγματα ιστών FFPE απομονώθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. Εν συντομία, δείγματα ιστού κόπηκαν σε φέτες από μπλοκ παραφίνης και τοποθετήθηκαν σε σωλήνες 1,5 ml άνευ νουκλεάσης μικροφυγόκεντρο (Eppendorf), τότε αποπαραφινοποιήθηκαν τρεις φορές σε 1 mL λιμονένιο, που ακολουθείται από πλύση με 1 mL αιθανόλης 100% δύο φορές και ξήρανση στον αέρα σε θερμοκρασία δωματίου θερμοκρασία. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν με ρυθμιστικό πέψης (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1% SDS) και πρωτεϊνάση Κ (Merck) στους 55 ° C όλη τη νύχτα για να ληφθεί πλήρης πέψη των δειγμάτων. Στη συνέχεια, προστέθηκε αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen), και το υπόλοιπο του πρωτοκόλλου διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δείγματα RNA επανααιωρήθηκαν σε RNase-free νερό μετά το τελικό στάδιο καθίζησης. την ποιότητα και την ποσότητα του RNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα biophotometer (Eppendorf).

μικροσυστοιχιών ανάλυση

δείγματα ολικού RNA αναλύθηκαν από CapitalBio (CapitalBio Corp.) για πειράματα μικροσυστοιχιών miRNA. Κάθε μικροσυστοιχιών τσιπ miRNA περιέχονται 924 ανιχνευτές εις τριπλούν, που αντιστοιχούν σε 677 άνθρωπο (συμπεριλαμβανομένων 122 προβλέψει miRNAs), 461 το ποντίκι, και 292 miRNAs αρουραίων που βρέθηκαν στο Μητρώο miRNA (https://microrna.sanger.ac.uk? MiRBase Release 10.0, 2007). Διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται λεπτομερώς στην ιστοσελίδα του CapitalBio (https://www.capitalbio.com). Εν συντομία, το RNA χαμηλού μοριακού βάρους (LMW-RNA) απομονώθηκε χρησιμοποιώντας PEG μέθοδο καθίζησης λύση σύμφωνα με ένα προηγούμενο πρωτόκολλο [44]. LMW-RNA αποφωσφορυλιώθηκε με αλκαλική φωσφατάση (ΝΕΒ) στο πρώτο ακολουθώντας το πρωτόκολλο που δίδεται από τον Wang Η, et al. [45]. Στη συνέχεια, το αποφωσφορυλιωμένο LMW-RNA σημάνθηκε με 500 ng 5′-φωσφορική-cytidyl-ουριδύλ-cy3-3 »(Dharmacon) με 2 μονάδες Τ4 RNA λιγκάσης (ΝΕΒ) [44]. Σημασμένο RNA καταβυθίστηκε με 0.3 Μ οξικό νάτριο, 2,5 όγκους αιθανόλης και επαναιωρήθηκε σε 20 μΐ ρυθμιστικού υβριδισμού που περιέχει 3 χ SSC, 0,2% SDS και 15% φορμαμίδιο. Η συστοιχία υβριδοποιήθηκε στους 42 ° C όλη τη νύκτα και πλένεται με δύο διαδοχικά διαλύματα πλύσης (0.2% SDS, 2 χ SSC στους 42 ° C για 4 λεπτά, και 0,2% SSC για 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου). Συστοιχίες σαρώθηκαν με ένα σαρωτή λέιζερ διπλού καναλιού (LuxScan 10K /A, CapitalBio). Η ρύθμιση σάρωσης προσαρμόστηκε για να ληφθεί ορατή ίση ένταση U6 σημεία σε όλη συστοιχίες. Τα δεδομένα που εξάγονται από τις εικόνες TIFF χρησιμοποιώντας LuxScanTM 3,0 λογισμικού (CapitalBio Corp). Ανεπεξέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την Ανάλυση Σημασία των μικροσυστοιχιών (SAM, έκδοση 2.1, το Πανεπιστήμιο του Stanford, CA, USA) λογισμικού. ανάλυση ομαδοποίηση έγινε από Cluster 3.0 [46]. Όλα τα δεδομένα είναι MIAME συμβατό και ότι η ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME (GEO, ID ένταξης: GSE26964).

Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-PCR

Το cDNA που λαμβάνεται με τη χρήση TaqMan miRNA Detection Kit Q-PCR (GeneCopoeia). Εν συντομία, miRNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας εκκινητές αλληλουχίας ειδικού stem-loop (Invitrogen) στις ακόλουθες miRNAs: HSA-miR-125b, HSA-miR-145, HSA-miR-153, HSA-miR-210, HSA-miR-143 , HSA-miR-100, HSA-miR-363, HSA-miR-451, HSA-miR-572 και HSA-miR-508-5p, με βάση την ανάλυση των μικροσυστοιχιών και προέβλεψε γονίδια στόχους τους. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε με τις ακόλουθες τιμές παραμέτρων: 15 λεπτά στους 37 ° C, 10 λεπτά στους 65 ° C, 5 λεπτά στους 85 ° C, και -20 ° C μέχρι τη χρήση. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα iQ5 Real Time Σύστημα Ανίχνευσης PCR (Bio-Rad) με αντίδραση όγκο 20 μι που περιέχει 2 μι προϊόν αντίστροφης μεταγραφής, 10 μι 2 χ All-in-One ™ Q-PCR Mix, 2 μL PCR πρόσθιος εκκινητής (2 μΜ), 2 μλ καθολικής Adaptor PCR Primer (2 μΜ), 4 μλ ddH2O. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων στους 95 ° C για 10 λεπτά, μετά από 40 κύκλους, και κατόπιν ανέβηκε από 66 ° C έως 95 ° C για να ληφθεί η καμπύλη τήξεως. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Αριθ πρότυπο και καμία αντίστροφη μεταγραφή συμπεριλήφθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ομαλοποίηση. Οι σχετικές τιμές έκφραση από τρία ανεξάρτητα πειράματα υπολογίστηκαν μετά την 2

-ΔΔCt μέθοδο Schmittgen και Livak [47].

Locked νουκλεϊκό οξύ (LNA) in situ υβριδισμό

Η διαδικασία ήταν διεξάγεται όπως περιγράφεται προηγουμένως [48]. Εν συντομία, τομές ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη αποπαραφινοποιήθηκαν, αφυδατωμένα, στη συνέχεια κατεργάζεται με πρωτεϊνάση Κ (20 μg /mL? Roche) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Μετά πλύση με 0.2% γλυκίνη /PBS για 1 λεπτό και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, οι τομές επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδοποίησης (50% φορμαμίδιο, 5 χ SSC, 0.1% Tween, 9.2 mM κιτρικό οξύ για ρύθμιση σε ρΗ 6,0, 50 μg /mL ηπαρίνη, 500 μg /mL RNA ζύμης) στους 37 ° C για 2 ώρες. Προστέθηκαν διγοξιγενίνη-επισημασμένο, LNA-τροποποιημένο ανιχνευτές του miR-143 (20 nmol /L?? 5′-GAGCTACAGTGCTTCATCTCA-3 ‘, Exiqon) και miR-145 (5′-AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-3 20 nmol /L’, Exiqon) αντίστοιχα, και επωάστηκαν στους 55 ° C για 18 ώρες. Οι τομές πλένονται με 2 × SSC δύο φορές, στη συνέχεια με 2 χ SSC και 50% φορμαμίδιο στους 50 ° C τρεις φορές (30 λεπτά η κάθε μία). Το αντι-DIG-ΑΡ (1:1000, Roche) προστέθηκε μετά από PBS-T (0.1% Tween 20) πλύση και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι τομές πλύθηκαν τέσσερεις φορές με ΡΒδ-Τ, και το φωσφορικό χλωρίδιο νιτροτετραζολίου /5-βρωμο-4-χλωρο-3-indonyl χρησιμοποιήθηκε για χρώση.

Cell Culture

κυτταρικές σειρές Μεταστατικό PCa περιλαμβάνεται PC-3 και LNCaP στην παρούσα μελέτη. PC-3 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε F-12 μέσο καλλιέργειας (Hyclone) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone). LNCaP αγοράστηκε από τη Σαγκάη Τράπεζας Κυττάρων, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, και διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibico, Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone). Σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσα με την παρουσία πουρομυκίνης (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε υγρή ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ° C.

Δημιουργία σταθερά διαμολυσμένων κυτταρικών σειρών

Η αλληλουχία του PRI-miR-143 και PRI-miR -145 κλωνοποιήθηκαν σε pMSCV-πουρομυκίνης πλασμιδίου με ένζυμο περιορισμού Bgl II και EcoR Ι (New England Biolabs). 293FT κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με πλασμίδια κατασκευασμένα προαναφερθέντα συνδυασμό με φορέα PIK ή κενό pMSCV-φορέα ως έλεγχο, με τη χρήση της μεθόδου του φωσφορικού ασβεστίου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [49]. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 6 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα μέσα άλλαξαν και τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Για την παραγωγή νέου ιού, τα μέσα συλλέχθηκαν τρεις φορές την ημέρα μέχρι 293FT κύτταρα φθάσουν στο σύνολο των συρροή. Οι ιοί χρησιμοποιούνται για να μολύνουν κύτταρα PC-3 και LNCaP. 24 ώρες μετά την προσθήκη των ιών, τα μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν με προσθήκη πουρομυκίνη σε μέσο ανάπτυξης. Σταθερές κυτταρικές γραμμές πιστοποιήθηκαν με qRT-PCR. Και οι δύο pMSCV και PIK πλασμίδια χορηγήθηκαν από γενναιόδωρες Καθ Song LB, η Sun Yat-Sen University Κέντρο Καρκίνου, Guangzhou, Κίνα.

Ναρκωτικά επούλωσης της πληγής

δοκιμασία

Μια μέρα πριν από το μηδέν, σταθερές κυτταρικές σειρές PC-3 και LNCaP κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν εξίσου σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 6-φρεατίων, και μεγάλωσε για να φτάσει σχεδόν πλήρη συρροή σε 24 ώρες. Όταν ασιτία μη ορού διατηρούνται για 24 ώρες μετά που σχηματίζονται κυτταρική μονοστιβάδα, ένα τεχνητό ομοιογενής πληγή δημιουργήθηκε πάνω στην μονοστιβάδα με ένα αποστειρωμένο άκρο 100 μL. Μετά το ξύσιμο, τα κύτταρα πλύθηκαν με μέσο χωρίς ορό. Εικόνες των κυττάρων που μεταναστεύουν εντός του τραύματος συλλήφθηκαν σε χρονικά σημεία 0 ώρες, 6 ώρες, 12 ώρες και 24 ώρες με ανεστραμμένο μικροσκόπιο (40 Χ).

In vitro

δοκιμασία εισβολής

Η δοκιμασία εισβολή έγινε με τη χρήση Transwell θάλαμο που αποτελείται από 8 μm ένθετα φίλτρο μεμβράνης (Corning) επικαλύφθηκαν με Matrigel (BD Biosciences) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [50]. Εν συντομία, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και εναιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό. Στη συνέχεια, 1,5 × 10

5 κυττάρων προστέθηκαν στον άνω θάλαμο, ενώ κάτω θάλαμο γέμισε με μέσο με 10% FBS. Μετά επωάστηκαν για 48 ώρες, τα κύτταρα εισέβαλαν διαμέσου της μεμβράνης επικαλυμμένη στην κάτω επιφάνεια, στην οποία τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Η κυτταρική απαρίθμηση έγινε κάτω από το μικροσκόπιο (100 Χ).

δοκιμασίας προσκόλλησης

Η δοκιμασία προσκόλλησης διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [51]. Εν συντομία, πλάκες των 96 φρεατίων επικαλύφθηκαν με 50 μΙ ινονεκτίνη (50 μg /ml) σε αρχικό μέσο σε επωαστή κυττάρων για 1 ώρα. Μετά πλύση με ζεστό μέσα, οι πλάκες μπλοκαρίστηκαν με 1% BSA στους 37 ° C για 1 ώρα και πλύθηκαν δύο φορές. Μετά θρυψινοποίηση, αναστέλλεται κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο με μέσο χωρίς ορό σε πυκνότητα 1,5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Όταν οι πλάκες επωάστηκαν για 30 λεπτά, τα μη-προσκολλημένα κύτταρα αφαιρέθηκαν και οι πλάκες ηπίως πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα προσκολλημένα κύτταρα στερεώθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και μετρήθηκαν υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο (100 Χ).

κηλίδωση Western

Για την ανάλυση της έκφρασης του EMT- σχετικές πρωτεΐνες, δοκιμασία ανοσοκηλίδωσης διεξήχθη. Όλες οι σταθερές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των PC-3 /φορέα, PC-3 /miR-143, PC-3 /miR-145, LNCaP /φορέα, LNCaP /miR-143 και LNCaP /miR-145, σπάρθηκαν σε 100 χιλιοστά πιάτα καλλιέργειας ιστού. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS προψυχθεί όταν η συρροή ανήλθε σε 60-70%, που ακολουθείται από τη συγκομιδή σε ρυθμιστικό δείγματος [62.5 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 6.8), 2% SDS, 10% γλυκερόλη, και 5 % 2-β-μερκαπτοαιθανόλης]. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από το υπερκείμενο φορτώθηκαν ανά λωρίδα και αναλύθηκαν με SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση. Στην αλληλουχία, η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε μεμβράνη PVDF (Millipore), εμποδίζεται από 5% άπαχο γάλα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (1:1000) επί 3 ώρες, συμπεριλαμβανομένων των αντι-Ε-καδερίνης (BD Biosciences ), ποντικού αντι-Ινονεκτίνης (BD Biosciences) και ποντικού αντι-βιμεντίνης (BD Biosciences). Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές (10 λεπτά η κάθε μία) σε ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ και επωάστηκαν για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας. Οι κηλίδες πλύθηκαν τρεις φορές (10 λεπτά κάθε φορά) σε ΤΒδ-Τ και αναπτύχθηκαν με χρήση του συστήματος ECL. Πρωτεΐνη φόρτωση ομαλοποιήθηκε με της ανιχνεύσεως των κηλίδων με ποντικού αντι-α-τουμπουλίνης αντίσωμα (Abcam).

In vivo

μοντέλα καρκίνου του προστάτη οστικών μεταστάσεων

Intra-κνημιαίο ένεση χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο. δέκα αρσενικά σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) της 3~4 εβδομάδων αγοράστηκαν από HFK Bio-Technology.CO., LTD (Πεκίνο, Κίνα). Πριν από τον εμβολιασμό, PC-3 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 40 μL Ορός χωρίς μέσο F-12 σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα ανά 40 μΐ, και ένεση με μια βελόνα 26-gauge στην κνήμη χρησιμοποιώντας μία κίνηση διάτρησης . Τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες εξίσου, όπου κάθε 5 ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή με PC-3 /miR-143 ή PC-3 /miR-145 στο δεξί κνημών αντίστοιχα. Όλες οι 10 ποντικοί ενέθηκαν με PC-3 /φορέα στο αριστερό κνημών ως αυτο-ελέγχου. Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν εβδομαδιαίως για την ανάπτυξη του όγκου. Στις εβδομάδες 5, οπισθίων άκρων ήταν ραδιογραφία χρησιμοποιώντας μία μηχανή Faxitron ακτίνων Χ (Faxitron Χ-ray Corp, USA) για την ανίχνευση των αλλοιώσεων των οστών. Στη συνέχεια, τα ποντίκια θυσιάστηκαν, και κνημών συλλέχθηκαν, απασβεστωμένες και σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη για περαιτέρω ιστολογική ανάλυση. Οστικές αλλοιώσεις αξιολογήθηκαν και υπολογίζεται όπως περιγράφεται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [52], όπου το 0 βαθμός για καμία βλάβη, 1 για ήσσονος σημασίας τραύματα, 2 για τις μικρές βλάβες, 3 για σημαντικές βλάβες με μικρές διάλειμμα των περιθωρίων, και 4 για σημαντικές βλάβες με μεγάλες διάλειμμα στις περιφερειακές βλάβες.

η στατιστική ανάλυση

Για να καθοριστεί διαφορετική έκφραση των miRNAs στην μικροσυστοιχιών, Σημασία ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM, έκδοση 2.1) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δύο κατηγορίας αταίριαστα σύγκριση με τη διαδικασία SAM. Σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων miRNAs επιλέχθηκε ως εξής πρότυπα: | Βαθμολογία (δ) | ≥2 [αριθμητή (r) /Παρονομαστής (s + S0)], Διπλώστε Change≥2 ή ≤0.5, και q-αξίας (%) ≤5 ( ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη, FDR) στην οστική μετάσταση του προστάτη σε σύγκριση με το πρωτεύον του προστάτη.

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Στατιστικά αξιολογήθηκαν με τη χρήση SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Σε πραγματικό χρόνο PCR και τα πειράματα σε ζώα, τα δεδομένα συγκρίθηκαν με Student

t-test

. Η σχέση μεταξύ της έκφρασης των miRNAs κάτω-ρυθμίζονται και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά στην πρωτοβάθμια και οστά μεταστατικό προστάτη αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ συσχέτισης τάξης Spearman. Σε πειράματα δοκιμασία που βασίζεται μετάστασης, τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA. Για την κατανόηση της σχέσης μεταξύ miRNAs, οι σημαντικές συσχετίσεις προσδιορίσθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ Kendall rank συσχέτιση.

σ

-τιμές των & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

miRNA έκφραση προφίλ μεταξύ πρωτοβάθμιας προστάτη και οστικές μεταστάσεις από μικροσυστοιχιών ανάλυση

Για να διερευνήσουν αν miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε πρωτογενείς προστάτη και οστικές μεταστατικούς ιστούς, συλλέξαμε έξι συνδυασμένα ζεύγη των πρωτογενών και μεταστατικών ιστών (από ίδιο ασθενή) και συγκρίθηκαν τα προφίλ έκφρασής τους χρησιμοποιώντας μια μικροσυστοιχία miRNA. Επειδή το συνολικό RNA σε πέντε ζεύγη δειγμάτων δεν ήταν αρκετά για ένα πείραμα μικροσυστοιχιών, μόνο ένας ζεύγους των δειγμάτων εκτελέστηκε επιτυχώς με ένα πείραμα μικροσυστοιχίας. Παρατηρήσαμε μια προφανώς αυξημένη έκφραση της 18ης miRNAs στην μετάσταση στα οστά σε σχέση με την πρωτογενή προστάτη, συμπεριλαμβανομένων Mirs-451, -210, -141, -19β, -29b, -16, -20a, -30b, -193a-3ρ, -15a , -181a, -26b, -200a, -106b, -20b, -486-5p, -15b, -363. Η έκφραση του τρία miRNAs (Mirs-145, -143, -612) ήταν προφανώς μειώθηκε στην μετάσταση στα οστά, ειδικά την έκφραση του miR-145 και miR-143 με τη μείωση του 5,4-φορές και 2,7 φορές, αντίστοιχα.

για να καθοριστεί περαιτέρω αν η έκφραση των miRNAs είχε στατιστικώς διαφορά στην πρωτοβάθμια προστάτη και οστικές μεταστατικό ιστούς, συγκρίναμε την έκφραση miRNAs σε 6 βασικά δείγματα προστάτη και 7 οστών μεταστατικό δείγματα χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες miRNA. Βρήκαμε ότι η έκφραση των 5 miRNAs είχαν στατιστικά σημαντική μείωση στη μετάσταση στα οστά σε σχέση με την πρωτογενή προστάτη, συμπεριλαμβανομένων Mirs-508-5p, -145, -143, -100 -33a και με τη μείωση του 4,1 φορές, 8,1 φορές, 5,7-φορές, 3,2 φορές και 5,3 φορές, αντίστοιχα. Δεν έκφραση miRNA αυξήθηκε σημαντικά (Πίνακας 1).

Η

ληφθούν όλα τα στοιχεία μαζί, έχουμε να αναλύονται τα δεδομένα της έκφρασης των miRNAs 10, συμπεριλαμβανομένων Mirs-508-5p, -143, -145, -100 , -125b, -153, -210, -363, -451 και -572, με ανάλυση διασποράς (Σχήμα 1

Α

).

Α,

Το πιστοποιημένο αποτέλεσμα της ανάλυσης μικροσυστοιχιών.

Β,

πραγματικό χρόνο προσδιορισμούς RT-PCR για miR-143 (αριστερή πλευρά), miR-145 (δεξιά πλευρά), και miR-125b (κάτω πίνακας) σε 16 πρωτοπαθή καρκίνο του προστάτη και 13 ιστούς μετάσταση στα οστά . Η σειρά των δειγμάτων ιστού είναι η ίδια και για τα τρία οικόπεδα.

p-τιμές

από

t-test

.

Η

Η επαλήθευση των δεδομένων μικροσυστοιχιών miRNA με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση στην πρωτοβάθμια προστάτη και των οστών μετάσταση

για να επιβεβαιώσετε τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας, σε πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη για να αναλύσει την έκφραση των πιο σημαντικά ρυθμίζονται miRNAs, συμπεριλαμβανομένων Mirs-508-5p, -143, -145, -100 -33a και. Εξετάσαμε την έκφραση του miRNAs πάνω από ανεξάρτητα δείγματα από 16 πρωτογενείς προστάτη και 13 οστικές μεταστάσεις, οι οποίες δεν είχαν χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση μικροσυστοιχίας. Μετά ατομικό επίπεδο miRNA σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε ποσοτικά και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση U6, σε πραγματικό χρόνο δεδομένα PCR επιβεβαίωσε ότι η έκφραση του Mirs-145, -143, -100 και -33a με τη μείωση του 17.3-φορές, 12.9 φορές, 1.7 φορές σε και 1,7-φορές στους μεταστατικούς ιστούς των οστών, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης του Mirs-143 και -145 έχουν ρυθμισμένα προς τα κάτω σημαντικά σε δείγματα μετάσταση έναντι πρωτογενούς PCa (

σ

= 0.012 και ρ = 0.014, αντίστοιχα) (Σχήμα 1

B

). Ωστόσο, η έκφραση της Mirs-33α και -100 δεν είχε καμία στατιστική σημασία (

σ

= 0.236 και

σ

= 0,448, αντίστοιχα). miR-508-5p δεν εκφράζουν σε όλα τα στοιχειώδη δείγματα προστάτη και οστικές μεταστατικό δείγματα. Αν και η έκφραση της Mirs-125β, -153, -210, -363, -451 και -572 ήταν πάνω από 2-φορές αλλαγές στη μετάσταση στα οστά σε σχέση με το πρωτογενές δείγματα PCA σε ανάλυση μικροσυστοιχιών, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά εκτός από το έκφραση του miR-125b με τη μείωση των 3-φορές στους μεταστατικούς ιστούς των οστών με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση. Αυτό ήταν στατιστικά σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της οστικής μεταστατικής δείγματα (

σ

= 0,012) (Εικόνα 1

Β

). Έτσι, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρξε μια σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των Mirs-145, -143, και -125b όταν προστάτη όγκοι με μεταστάσεις στα οστά.

Για να προσδιορίσετε περαιτέρω τις κύριες πηγές έκφραση σε πρωτογενή δείγματα προστάτη, η τεχνική LNA-ish εφαρμόστηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Mirs-143 και -145 που εκφράζονται κυρίως σε καρκινικά κύτταρα και η έκφραση τους στα στρωματικά κύτταρα ήταν χαμηλότερες ή απούσα (σχήμα 2).

Τμήματα στο άνω πάνελ έδειξε την ταυτοποίηση των καρκινικών κυττάρων και στρωματικών κύτταρα από την H & amp? E-stainning. Τμήματα στο κάτω πάνελ έδειξε την θέση του miR-143 (αριστερά) και miR-145 (δεξιά) στα κύτταρα του προστάτη από LNA-ish. Σήματα της Mirs-143 και -145 ήταν σε μωβ μπλε. Φωτογραφίες τραβήχτηκαν κάτω από το μικροσκόπιο 200 ×.

Η

Σχετική έκφραση Mirs-143 και -145 στο ίδιο δείγμα

Για να διερευνηθεί περαιτέρω αν η τάση έκφραση του miR-145 και ΜΙΚ 143 ήταν ταυτόσημη στο ίδιο δείγμα, η σχετική έκφραση του miR-145 και miR-143 στο ίδιο δείγμα απεικονίστηκε γραφικά από την PCR πραγματικού χρόνου σε όλες τις 22 δείγματα πρωτογενών προστάτη (συμπεριλαμβανομένων 6 δείγματα microarray) (Σχήμα 3

Α

) και 20 δείγματα των μεταστάσεων στα οστά (συμπεριλαμβανομένων 7 δείγματα microarray) (Σχήμα 3

B

), αντίστοιχα. Οι σημαντικές συσχετίσεις των miR-145 και miR-143 βρέθηκαν στην πρωτοβάθμια προστάτη (Kendall συσχετισμός = 0,850,

σ

& lt? 0.001) και οστικές μεταστάσεις (Kendall συσχετισμός = 0,765,

σ

& lt ?.. 0.001)

Α-Β,

Εκδήλωση Mirs-143 και -145 και τις σχέσεις τους σε δείγματα πρωτογενούς καρκίνου του προστάτη (Α) και τα δείγματα μετάσταση στα οστά (Β)

η ελαττωμένη Mirs-143 και -145 συσχετίζεται αρνητικά με μετάσταση στα οστά, το επίπεδο του PSA στον ορό και το σκορ Gleason στην πρωτοβάθμια προστάτη

από τη στιγμή που διαπίστωσε ότι Mirs-143 και -145 ήταν προς τα κάτω σε μετάσταση στα οστά, θα υποτεθεί ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του Mirs-143 και -145 μπορεί επίσης να σχετίζεται με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών προστάτη. Πρώτον, πραγματοποιήσαμε μια αναδρομική έρευνα των 22 ασθενών με πρωτοπαθή προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν 12 ασθενείς χωρίς μετάσταση στα οστά και 10 ασθενείς με μετάσταση στα οστά. Η κατανομή της ηλικίας σε 22 ασθενείς με και χωρίς οστικές μεταστάσεις δεν ήταν σημαντική διαφορά. Η έκφραση της Mirs-143 και -145 σε 10 ασθενείς με οστικές μεταστάσεις ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε 12 ασθενείς χωρίς οστικές μεταστάσεις (

σ

= 0.039 και

σ

= 0,041, σχήμα 4,

Μια

και

D

). Δεύτερον, αξιολόγησε κατά πόσο η έκφραση της Mirs-143 και -145 είχε σχέση με το συνολικό αντιγόνο επίπεδο (PSA) στον ορό ειδικού προστατικού και δωρεάν επίπεδο PSA στην πρωτοβάθμια ΣΕΣΣ. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των Mirs-143 και -145 και δωρεάν επίπεδο PSA (Spearman συσχέτισης = -0,501,

σ

= 0,018? Spearman συσχέτισης = -0,536,

p

= 0,010. Σχήμα 4,

Β

και

E

), και μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-145 και το συνολικό επίπεδο του PSA (Spearman συσχέτισης = -0,456,

p

= 0,033, Εικόνα 4

F

)? ενώ καμία συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-143 και το συνολικό επίπεδο του PSA (Spearman συσχέτισης = -0,403,

σ

= 0,063). Τέλος, διερευνήθηκε αν η έκφραση της Mirs-143 και -145 σχετιζόταν με σκορ Gleason στην πρωτοβάθμια ΣΕΣΣ. Υπάρχει επίσης μια στατιστικά σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των Mirs-143 και -145 και το σκορ Gleason (Spearman συσχέτισης = -0,574,

σ

= 0.005? Spearman συσχέτισης = -0,546,

p

= 0,009, σχήμα 4,

C

και

G

). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι downregulations του Mirs-143 και -145 συνδέθηκαν με την εξέλιξη του όγκου και μετάσταση στα οστά. Προς τα κάτω ρύθμιση mir-125β δεν συσχετίζεται με μετάσταση στα οστά, το επίπεδο PSA και το σκορ Gleason στην πρωτοβάθμια προστάτη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α και D,

η έκφραση Mirs-143 ή -145 σε ασθενείς με οστικές μεταστάσεις ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι χωρίς μεταστάσεις (

t-test

,

σ

= 0,039,

σ

= 0,041, αντίστοιχα).

Β και Ε,

δείγματα όγκων χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες με περίπου ίσα μεγέθη δείγματος με βάση το επίπεδο του ελεύθερου PSA. Το επίπεδο του ελεύθερου PSA σε ασθενείς με πρωτογενή όγκο παρουσιάζεται στον άξονα χ. Ο άξονας γ είναι ο μέσος όρος των Mirs-143 ή -145 μέσα σε κάθε ομάδα. Οι μπάρες αντιπροσωπεύουν τα τυπικά σφάλματα. Υπήρξε μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση Spearman που χαρακτήριζε μια αντίστροφη σχέση μεταξύ Mirs-143 ή -145 έκφρασης και την ελεύθερη PSA (Spearman συσχέτισης = -0,501,

σ

= 0,018? Spearman συσχέτισης = -0,536,

p

= 0,010).

F,

Το επίπεδο του συνολικού PSA επίσης συσχετίζεται με miR-145 (Spearman συσχέτισης = -0,456,

σ

= 0,033).

C και G,

η Gleason αποτελέσματα της πρωτογενούς ομάδας όγκου παρουσιάζονται στον άξονα x. Ο άξονας γ είναι ο μέσος όρος των Mirs-143 ή -145 μέσα σε κάθε ομάδα. Οι μπάρες αντιπροσωπεύουν τα τυπικά σφάλματα.