Αφηρημένο

βιοφυσικών και βιοχημικών ιδιοτήτων του μικροπεριβάλλοντος ρυθμίζουν κυτταρικές αποκρίσεις όπως η ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, τη μορφογένεση και μετανάστευση σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα. Δεδομένου ότι δύο διαστάσεων (2D) καλλιέργειες δεν διαθέτουν τα ουσιώδη χαρακτηριστικά του φυσικού κυτταρικό μικροπεριβάλλον, έχουν τρισδιάστατη (3D) καλλιέργειες έχουν αναπτυχθεί για να μιμηθεί καλύτερα το φυσικό εξωκυττάρια μήτρα. Μέχρι σήμερα, τα συστήματα καλλιέργειας 3D έχουν στηριχθεί κυρίως σε κολλαγόνο και υδροπηκτές Matrigel ™, επιτρέποντας μόνο περιορισμένο έλεγχο δυσκαμψίας, πρωτεολυτική ικανότητα αποδόμησης, και η πυκνότητα συνδέτη. Σε αντίθεση, bioengineered υδρογέλες μας επιτρέπουν να ανεξάρτητα μελωδία και συστηματικά διερευνηθεί η επίδραση των παραμέτρων αυτών στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) υδρογέλες, ενεργοποιημένη με το αργινίνη-γλυκίνη-ασπαρτικό οξύ (RGD) μοτίβα, κοινά μοτίβα δέσμευσης κυττάρων σε εξωκυτταρικές πρωτεΐνες μήτρας, και μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας θέσεις διάσπασης (ΜΜΡ), χαρακτηρίστηκαν σχετικά με την ακαμψία τους, διάχυτη ιδιότητες και ικανότητα να υποστηρίζουν την ανάπτυξη των εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη. Βρήκαμε ότι οι μηχανικές ιδιότητες διαμορφωμένα την κινητική ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP στην υδρογέλη PEG. Σε περιόδους του πολιτισμού 28 ημερών, τα κύτταρα LNCaP υπέστησαν μορφογενετικές αλλαγές, σχηματίζοντας δομές όγκου-όπως και σε 3D πολιτισμό, με υποξική και αποπτωτικών πυρήνων. Έχουμε περαιτέρω σύγκριση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης και γονιδίου μεταξύ 3D και 2D καλλιέργειες κατά τη διέγερση με το συνθετικό ανδρογόνο R1881. Είναι ενδιαφέρον ότι, η κινητική της R1881 διεγείρεται υποδοχέα ανδρογόνων (AR) πυρηνική μετατόπιση διέφερε μεταξύ 2D και 3D καλλιέργειες όταν παρατηρούνται με χρώση ανοσοφθορισμού. Επιπλέον, μελέτες μικροσυστοιχίας αποκάλυψαν ότι οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης του ανδρογόνου γονιδίων που αποκρίνονται κατά την κατεργασία R1881 διέφεραν σημαντικά μεταξύ 2D και 3D καλλιέργειες. Στο σύνολό τους, καλλιέργεια κυττάρων LNCaP στα συντονίσιμα υδροπηκτές PEG αποκαλύπτει διαφορές στις κυτταρικές αποκρίσεις σε ανδρογόνα διέγερση μεταξύ των περιβαλλόντων 2D και 3D. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι το παρουσίασε σύστημα καλλιέργειας 3D αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο για την υψηλή απόδοση δοκιμή φάρμακο για τον καρκίνο του προστάτη που ανακεφαλαιώνει το μικροπεριβάλλον του όγκου

Παράθεση:. Sieh S, Taubenberger AV, Rizzi SC, Sadowski Μ, Lehman ML, Rockstroh Α, et al. (2012) Η φαινοτυπική Χαρακτηρισμός του καρκίνου του προστάτη LNCaP κύτταρα που καλλιεργήθηκαν μέσα σε ένα Οι βιομηχανικοί μικροπεριβάλλον. PLoS ONE 7 (9): e40217. doi: 10.1371 /journal.pone.0040217

Επιμέλεια: Elizabeth Wilson, Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας στο Chapel Hill, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Νοεμβρίου του 2011? Αποδεκτές: 6 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 του Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Sieh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Queensland University of Technology εκκίνηση επιχορήγηση για την καρέκλα Καθ DW Hutmacher, προστάτη Ίδρυμα Καρκίνου της Αυστραλίας, της Αυστραλίας καναδική προστάτη Cancer Research Alliance, της Αυστραλίας καρκίνο του προστάτη Κέντρο Ερευνών-Queensland και επιχορήγηση NHMRC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (ΚΓΠ) είναι μία από τις πιο διαδεδομένες κακοήθη νοσήματα μεταξύ των ανδρών στις δυτικές χώρες. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για τους άνδρες διαγνώστηκαν με εντοπισμένες CaP προσεγγίζει το 100%? λαμβάνοντας υπόψη ότι η πρόγνωση επιδεινώνεται ταχέως κατά την εξέλιξη της ΚΓΠ στις προηγμένες και μεταστατική νόσο [1] – [2]. Παρά την πρόοδο στην μεθόδους ανίχνευσης και θεραπείες, καπάκι παραμένει μια σημαντική αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να αποκτήσουν μια καλύτερη κατανόηση της εξέλιξης από εντοπίζεται σε προχωρημένο CaP χρησιμοποιώντας τις σχετικές φυσιολογικών συστημάτων. Όπως πολλές άλλες καρκινικά κύτταρα, κύτταρα CaP έχουν μελετηθεί εκτενώς σε δύο διαστάσεων (2D) καλλιέργειες, μέσω της οποίας έχει αποκτήσει σημαντικό βασική κατανόηση της βιολογίας του καρκίνου. Ωστόσο, σε φυσικούς ιστούς, τα κύτταρα ενσωματωμένα σε εξωκυττάρια μήτρα (ECM) που παρέχει όχι μόνο αρχιτεκτονική υποστήριξη, αλλά επίσης χημική και μηχανική συνθήματα σε κύτταρα [3] – [4]. Πρόσφατα, η σημασία των μηχανικών ιδιοτήτων του μικροπεριβάλλον του όγκου έχει όλο και περισσότερο αναγνωρίζεται. Σε γενικές γραμμές, ο καρκινικός ιστός και το στρώμα του είναι πιο σκληρή από μη κακοήθεις ιστούς λόγω ανώμαλη εναπόθεση και την αναδιαμόρφωση της ECM στο στρώμα [5] – [7].

In vitro μελέτες

και λίγοι

in vivo

μελέτες έχουν αποδείξει ότι η ακαμψία της περιβάλλουσας μήτρας μπορεί να αυξήσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, να διαμορφώνει σηματοδότηση κυττάρων και να διευκολυνθεί η κυτταρική εισβολή [8] ​​- [11]. Λαμβάνοντας υπόψη το ζωτικό ρόλο της ακαμψίας της μήτρας, τεχνητή γεωμετρικών περιορισμών και την υψηλή ακαμψία που επιβάλλονται στα κύτταρα σε 2D πλαστικό καλλιέργειας ιστών θα μπορούσε να επηρεάσει την ανάπτυξη του όγκου, πρόσφυση, κυτταρική πολικότητα, μορφολογία, τη μετανάστευση και τους μηχανισμούς πρωτεόλυση [12] – [15].

τα τελευταία χρόνια, πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η μελέτη όγκων σε 3D καλύτερα αναπαράγει

in vivo

χαρακτηριστικά ανάπτυξης και αντίσταση ενάντια χημειοθεραπευτικών παραγόντων από ένα 2D προσέγγιση [16] – [18]. Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα μοντέλα 3D μήτρας ζωικό ανασυσταθεί εκχύλισμα βασικής μεμβράνης, Matrigel ™ [17], [19] – [20], και τον τύπο του κολλαγόνου ουράς αρουραίου μήτρες Ι [21] – [24]. Αν και αυτά τα φυσικά παραγόμενα μήτρες έχουν ECM-όπως βιολογικές ιδιότητες, τα εγγενή χαρακτηριστικά τους περιορίζουν την ευελιξία προσαρμογής δυσκαμψίας χωρίς ταυτόχρονα να επηρεάζουν άλλες ιδιότητες της μήτρας, όπως πρωτεολυτική ικανότητα αποικοδόμησης και την πυκνότητα συνδέτη. Επιπλέον, Matrigel ™ δείχνει παρτίδα σε παρτίδα παραλλαγές, η οποία μειώνει την αναπαραγωγιμότητα των πειραμάτων και η συγκρισιμότητα των συνόλων δεδομένων μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων. Για την απλοποίηση των αλλιώς πολύπλοκων κυτταρικών αλληλεπιδράσεων των πολλαπλών συστατικών τα οποία υπάρχουν σε φυσικώς προερχόμενο μήτρες, υπάρχει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη χρήση των μητρών μηχανικής με ειδικές βιολογικές και βιοχημικές λειτουργίες του φυσικού ECM [25] – [28]. Αυτά τα βιομιμητικά πίνακες επιτρέπουν μια πιο συστηματική μελέτη των επιπτώσεων ορισμένων συστατικών ή των ιδιοτήτων του μικροπεριβάλλον του όγκου σε καρκινικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, οι αναδυόμενες προσεγγίσεις σε βιοϋλικό επιστήμη έχουν επικεντρωθεί στην ανάπτυξη συνθετικών μήτρες όπως hyaluronon προερχόμενα ή αλγινικό μήτρες για καρκίνο καλλιέργεια κυττάρων [25] – [28]. Ένα άλλο παράδειγμα είναι υδρογέλες PEG-based που είναι αδρανείς ίδιοι από την άποψη της ενεργοποίησης των κυττάρων μονοπατιών σηματοδότησης, αλλά μπορεί να είναι εξοπλισμένο με βιοχημικές (π.χ. θέσεις πρωτεολυτικής αποδόμησης) και βιολογικές λειτουργίες (π.χ. RGD μοτίβα με ελεγχόμενο τρόπο) [29]. Πλεονεκτικά, η ακαμψία του τέτοιες υδρογέλες μπορεί να συντονιστεί με ακρίβεια, ανεξάρτητα από την πρωτεολυτική ευαισθησία και συνδέτη κυτταρική πυκνότητα τους.

Προηγουμένως, εμείς και άλλοι έχουν χρησιμοποιήσει ΜΜΡ-ευαίσθητη υδρογέλες PEG που βασίζεται στο οποίο ενσωματώνονται RGD μοτίβα σε ένα ορίζεται πυκνότητα [13], [30] – [32]. Οι RGD μοτίβα παρέχουν θέσεις για κύτταρα δέσμευσης μέσω ιντεγκρίνες και τα ΜΜΡ αλληλουχίες διάσπασης επιτρέπουν στα κύτταρα να αποικοδομούν τη μήτρα, η οποία δημιουργεί χώρο για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Για το σκοπό αυτό, μια διεξοδική φαινοτυπική χαρακτηρισμός των κυττάρων CaP καλλιεργήθηκαν εντός αυτού του βιομιμητική ECM δεν έχει αναφερθεί. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να καθιερώσει και να επικυρώσει μια 3D σύστημα καλλιέργειας για τα κύτταρα LNCaP που επιτρέπει τη μοντελοποίηση του σχηματισμού ανάγγειας όγκου πρώιμο στάδιο. Για να γίνει αυτό, διερευνήσαμε την επίδραση της δυσκαμψίας υδρογέλης επί της κυτταρικής ανάπτυξης. Στη συνέχεια, εξετάσαμε μορφολογία, την έκφραση του γονιδίου και την πρωτεϊνική σύνθεση των κυττάρων LNCaP που αναπτύσσονται σε 3D υδρογέλες σύγκριση με τα συμβατικά καλλιέργειες 2D. Χρησιμοποιήσαμε επίσης αυτό το 3D σύστημα καλλιέργειας για να μελετήσει τις επιπτώσεις των συνθετικών ανδρογόνων, R1881, για σηματοδότηση AR σε σύγκριση με 2D καλλιέργειες [33] – [34]

Τα ευρήματά μας παρέχουν γνώσεις σχετικά με το ρόλο του μικροπεριβάλλοντος. στη ρύθμιση της κυτταρικής και μοριακής συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, έχουμε αποκαλύψει διαφορές στις κυτταρικές αποκρίσεις σε ανδρογόνα μεταξύ 2D και 3D πολιτισμούς. Αυτό το μοντέλο είναι ένα σκαλοπάτι για την ανάπτυξη των συστημάτων καλλιέργειας 3D αναπαράγει το

in vivo

μικροπεριβάλλον του όγκου, επιτρέποντας τη δημιουργία ισχυρών εργαλείων για την καλύτερη κατανόηση της βιολογίας CaP, ιδίως σε απάντηση στα ανδρογόνα.

Αποτελέσματα

Μηχανική και διάχυσης ιδιότητες των βιομιμητικά υδρογελών εξαρτώνται από την PEG

περιεχόμενο

για να μιμηθεί το αρχικό στάδιο του σχηματισμού όγκων CaP σε 3D, θα ορίζεται με τον πολιτισμό των κυττάρων LNCaP σε βιομιμητική PEG υδρογέλες. Οι πρόδρομοι PEG συζευγμένων με ΜΜΡ θέσεις διάσπασης και RGD μοτίβα ενσωματώθηκαν στο δίκτυο υδρογέλης για να προσδώσει ουσιαστική βιομιμητική χαρακτηριστικά του φυσικού ECM (Σχήμα 1Α). Δεδομένου ότι οι μηχανικές ιδιότητες της υδροπηκτής που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την ανάπτυξη, τη μορφολογία, και επεμβατική φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων [5], [10], [35], πρέπει πρώτα προσπάθησε να βελτιστοποιήσει ακαμψία της υδρογέλης για καλλιέργεια κυττάρων. Ελεύθερα κυττάρων PEG υδρογέλες ποικίλης ακαμψίας παρασκευάστηκαν με ρύθμιση της περιεκτικότητας PEG σε 1,5, 2, 2,5% (w /v). Η ακαμψία της υδρογέλης προσδιορίστηκε με ανεμπόδιστη δοκιμές συμπίεσης χρησιμοποιώντας μια microtester (Σχήμα 1Β, αριστερά) και μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM) μετρήσεων οδόντωση (Σχήμα 1 C, αριστερά) τα οποία μετατράπηκαν σε μια καμπύλη τάσης-παραμόρφωσης (Σχήμα 1Β, μέση) .

(Α) Μια σχηματική δείχνει την προετοιμασία των βιομιμητικά υδρογέλες. LNCaP κύτταρα αναμίχθηκαν με προδρόμους PEG που περιέχουν θέσεις διάσπασης ΜΜΡ και πεπτίδια RGD πριν FXIII καταλυόμενη πολυμερισμού. (Β) Η παγκόσμια ακαμψία του ελεύθερου κυττάρων υδρογέλες με διαφορετικό περιεχόμενο PEG (νν /ν) μετρήθηκε με τη χρήση microtester. Μια αντιπροσωπευτική καμπύλη τάσης-παραμόρφωσης καταγράφονται για 2% γέλη PEG. Η (ελαστικότητας) του Young, Ε, υπολογίστηκε από την κλίση της γραμμής τοποθετηθεί στην καμπύλη τάσης-παραμόρφωσης σε% στέλεχος 9-12 (μέση). Ένα οικόπεδο Scatter δείχνει συντελεστές του Young μετρήθηκε για διαφορετικές υδρογέλες PEG (δεξιά). είναι διάμεσες υποδεικνύεται από τις κόκκινες γραμμές. (Γ) την τοπική ακαμψία του ελεύθερου κυττάρων υδρογέλες με διαφορετικό περιεχόμενο PEG (w /v) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM). Ένα σχήμα πυραμιδική AFM cantilever χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή μετρήσεων εσοχή. Ένας εκπρόσωπος της καμπύλης δύναμης-άκρη-δείγμα-διαχωρισμού εμφανίζεται κάτω από το AFM σχηματικό. Η κόκκινη γραμμή αντιπροσωπεύει την εφαρμογή που χρησιμοποιείται για την προσέγγιση της καμπύλης προσέγγισης με ερτζιανά μοντέλο εσοχή. συντελεστές του Young μετρήθηκε για ένα PEG υδρογέλη 2% διανέμεται κανονικά στην περιοχή από 4 kPa (μέση). διάγραμμα διασποράς δείχνει τα μεσαία συντελεστές του Young μετρήθηκε για διαφορετικά υδροπήγματα (δεξιά). Κόκκινες γραμμές αντιπροσωπεύουν τις διαμέσους. Και οι δύο μετρήσεις microtester και AFM εσοχή αποδώσει συντελεστές παρόμοια Νέοι και δείχνουν μια γραμμική αύξηση στην ακαμψία με περιεκτικότητα σε PEG. (D) οικόπεδα ασφαλείας δείχνουν τους συντελεστές διάχυσης, D μετράται για την E133 χρωστική τροφίμων (794 Da) και FITC-BSA (66 kDa) σε ελεύθερο κυττάρων υδροπηκτές σε διαφορετικό περιεχόμενο PEG. Οι τιμές του D για E133 είναι μία τάξη μεγέθους μεγαλύτερη από ότι για FITC-BSA. Τουλάχιστον τρία δείγματα μετρήθηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Ενώ η microtestor ανιχνευτές οι παγκόσμιες ελαστικές ιδιότητες των υδροπηκτών PEG, οι μετρήσεις AFM εσοχή δώσει πληροφορίες σχετικά με την τοπική κατανομή της ακαμψίας τους (σχήμα 1Γ). Και οι δύο μέθοδοι απεκάλυψε μία γραμμική αύξηση ελαστικότητας με αύξηση της περιεκτικότητας σε PEG και υποδεικνύεται παρόμοια μέτρα ελαστικότητας, που κυμαίνονται μεταξύ περίπου 0,8 kiloPascal (kPa) έως 10 kPa για τις υδροπηκτές PEG 1,5% και 2,5%, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β και 1C, δεξιά) . μετρήσεις AFM αποκάλυψε μία ομογενή κατανομή του μέτρου του Young τοπικών, Ε κατά τη διάρκεια των ανιχνεύθηκαν υδρογέλες (Σχήμα 1 C, μέση). Όταν οι 2,0% υδροπηκτές ελέγχθηκαν με τη χρήση της microtester πριν και μετά από περισσότερο από 4 εβδομάδες καλλιέργειας, βρήκαμε καμία σημαντική αλλαγή στη συνολική ακαμψία μήτρας (2.5 έως 4.2 kPa), το οποίο ήταν σύμφωνο με τη διακύμανση των δοκιμαζόμενων 2% υδρογέλες ( Εικόνα S1). Όπως έχει ήδη αναφερθεί σε κυτταρικές καλλιέργειες 3D εντός παρόμοιες μήτρες [5], [10], [35], αυτό υποδεικνύει ότι αυτά βιομιμητική υδρογέλη PEG-based αποδομούνται μόνο τοπικά από τα ενσωματωμένα κύτταρα, ενώ η συνολική δυσκαμψία δεν επηρεάζεται κατά τη διάρκεια της αναλύθηκαν περίοδο ανάπτυξης.

Αλλαγές στην περιεκτικότητα σε PEG αναμένεται να μεταβάλλει το μέγεθος των πόρων των υδρογελών PEG [36], η οποία θα μπορούσε να επηρεάσει την μεταφορά μικρών μορίων, όπως τα συνθετικά ανδρογόνα R1881, και επίσης παράγοντες ανάπτυξης που υπάρχουν στο ο μέσο στα πειράματά μας. Για να εκτιμηθεί η διάχυση του R1881, μετρήθηκε η διάχυση συντελεστή D, του E133 χρωστικής τροφίμων (792 Da), που έχει ένα μεγαλύτερο μοριακό βάρος από R1881 (284 Da). Βρήκαμε ότι οι μέσες τιμές της διάχυσης μειώνεται με την αύξηση της περιεκτικότητας σε PEG (Σχήμα 1D) από 2,99 ± 0,06 × 10

-6 εκατοστά

2 /s για 1,5% υδροπηκτές PEG σε 1,9 ± 0,13 × 10

– 6 εκατοστά

2 /s για 2,5% υδροπηκτές PEG. Για να ελεγχθεί εάν έχει σημασία αυξητικούς παράγοντες όπως αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών, αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας και αιμοπετάλια αυξητικός παράγοντας (20-50 kiloDalton, kDa) μπορούν επίσης να διεισδύσουν στο υδρογέλης, διερευνήσαμε την διάχυση ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη συζευγμένη με βόεια λευκωματίνη ορού (FITC -BSA) (66 kDa), το οποίο έχει ένα μεγαλύτερο μοριακό βάρος από αυτούς τους παράγοντες ανάπτυξης. Ο συντελεστής διάχυσης του FITC-BSA ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με E133 και μειώθηκε με την αύξηση της περιεκτικότητας PEG (Σχήμα 1 D). τιμές D για 1,5-2,5% υδροπηκτές PEG (1,5-3,0 × 10

-7 εκατοστά

2 /s) είναι εντός της ίδιας τάξης μεγέθους (6 × 10

-7 εκατοστά

2 /s) που αναφέρθηκαν από Ramanujan

et al

(2002) και Erikson

et al

(2008) διάχυση μέτρηση της BSA στα μαλακότερα τζελ κολλαγόνου [37] -.. [38]. Όταν PEG υδρογέλες επωάστηκαν με FITC-BSA επί 24 ώρες, παρατηρήσαμε ευρεία διείσδυση του FITC-BSA (Εικόνα S2). Από αυτά τα ευρήματα μπορούμε να συμπεράνουμε ότι, αν και μεταφορά του R1881 και αυξητικών παραγόντων μπορεί να επιβραδυνθεί σε πηκτές με υψηλότερη περιεκτικότητα σε PEG, το μέγεθος των πόρων όλων των γελών είναι αρκετά μεγάλη ώστε να παρέχει ενσωματωμένο κυττάρων με διαλυτό παράγοντες από το μέσο καλλιέργειας.

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων LNCaP μέσα βιομιμητική υδρογέλες επηρεάζεται από την περιεκτικότητα σε PEG και ακαμψία των υδρογελών

στη συνέχεια, για να αξιολογηθεί η επίδραση της ακαμψίας μήτρας επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, καλλιεργήσαμε κύτταρα LNCaP σε 1,5, 2,0 και 2,5% υδρογέλες πάνω από 28 ημέρες (Σχήμα 2Α, άνω πάνελ, δεξιά). μονοστρωματικές καλλιέργειες (χρόνος διπλασιασμού, Td = 27 ώρες) αυξήθηκε εκθετικά μέχρι την 5η ημέρα και άρχισε να σταθεροποιείται μετά (Σχήμα 2Α, επάνω πλαίσιο, αριστερά). Αντιθέτως, τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν βραδύτερα σε 1,5% (Td = 54 hr) και 2% (Td = 58.5 hr) PEG υδρογέλες. Εκθετική ανάπτυξη σημειώθηκε μεταξύ ημέρες 7 και 14 σε 3D καλλιέργειες (Σχήμα 2Α, άνω πάνελ, δεξιά). LNCaP κύτταρα συνέχισαν να πολλαπλασιάζονται τουλάχιστον έως και 28 ημέρες στα 2,0% υδρογέλες, ενώ το μέγιστο αριθμό κυττάρων που επιτεύχθηκε μετά από 14 ημέρες σε 1,5% υδρογέλες. Τα υψηλότερα ποσοστά αύξησης στην μαλακότερη 1,5% υδρογέλης σε σύγκριση με το 2,0% υδρογέλη μπορεί να οφείλεται σε χαμηλότερη πίεση που ασκείται επί των κυττάρων από το περιβάλλον μαλακότερο υδρογέλης [39] – [40]. Η σιγμοειδής καμπύλη ανάπτυξης που παρατηρούμε είναι συγκρίσιμη με την παρατηρούμενη αύξηση των LNCaP ξένων μοσχευμάτων με ενδείξεις αργής ανάπτυξης κατά το αρχικό στάδιο, εκθετική αύξηση στο ενδιάμεσο στάδιο και επιβράδυνση της ανάπτυξης σε μεταγενέστερο στάδιο [41] – [46]. Από την άλλη πλευρά, καμία αύξηση ανιχνεύθηκε στο 2,5% υδρογέλες όπως επιβεβαιώθηκε από το ζωντανό νεκρό χρώση (Σχήμα 2Α, κάτω πλαίσιο) αποκαλύπτοντας την παρουσία κυρίως μη βιώσιμων κυττάρων στην υδρογέλη 2,5% την ημέρα 24. φωτεινές εικόνες πεδίο έδειξαν ότι κύτταρα ήταν σε θέση να σχηματίσουν αποικίες στο 1,5 και 2,0%, αλλά όχι σε 2,5% υδρογέλες.

(Α) καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων LNCaP επί 7 ημέρες για την 2D καλλιέργειες (αριστερά) και 28 ημέρες για τις 3D καλλιέργειες ( δεξιά) σε κανονικό μέσο ανάπτυξης μετριέται με ολική περιεκτικότητα DNA (μέση ± SE). Σε 2D καλλιέργειες κύτταρα πολλαπλασιάζονται πολύ γρηγορότερα επίτευξη συρροής εντός 7 ημερών (άνω πάνελ, αριστερά). Το προφίλ ανάπτυξη των κυττάρων εξαρτάται από τις μηχανικές ιδιότητες των μητρών bioengineered PEG, όπου ο ρυθμός ανάπτυξης είναι υψηλότερος στα 1.5% ακολουθούμενη από κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε 2% υδρογέλες (άνω πάνελ, δεξιά). Δεν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανιχνεύεται στους πιο σκληρή υδρογέλες (2,5%). Ζωντανά-νεκρός εξέταση διεξήχθη χρησιμοποιώντας φθοροσκεΐνη χρώση με ιωδιούχο προπίδιο διοξική-την ημέρα 24 των LNCaP κυττάρων που αναπτύσσονται σε διαφορετικό περιεχόμενο PEG (κατώτερο πάνελ). Η χρώση ζωντανών-νεκρών αποκαλύπτει ότι τα περισσότερα κύτταρα είναι βιώσιμα (πράσινο) και στα δύο 1,5 και 2,0% υδρογέλες αλλά όχι βιώσιμος (κόκκινο) σε 2,5% υδρογέλες. Εικόνες ελήφθησαν με CLSM (10 ×, 0.4 NA). Φωτεινές εικόνες τομέα επιβεβαιώνουν επίσης ότι τα κύτταρα σε 2,5% υδρογέλες δεν σχηματίζουν αποικίες όπως παρατηρείται σε 1,5% και 2,0% υδρογέλες την ημέρα 28. (Β) (άνω πάνελ) έναν αντιπρόσωπο προεξοχές CLSM 3D του LNCaP αποικίες επισημαίνονται με Φαλλοϊδίνη (ακτίνη, κόκκινο ) /DAPI (πυρήνες, μπλε) από την ημέρα 7 έως την ημέρα 28 (20 ×, 1.0 NA). Αποικίες είναι πιο στρογγυλεμένες την ημέρα 7 και την ημέρα 14, αλλά να γίνει ακανόνιστη μακροοικονομικών μεγεθών από την ημέρα 21 και μετά. Κουτί οικόπεδα μέγεθος της αποικίας και συντελεστή σχήματος που αναλύθηκαν από έξι εικόνες CLSM (κάτω πίνακας) δείχνουν σημαντική αύξηση στην σφαιροειδές μέγεθος και μείωση του συντελεστή σχήματος (ρ & lt? 0.001) κατά την ημέρα 28 σε σχέση με την ημέρα ανιχνεύονται 7 πολιτισμούς. (Γ) Ένα αντιπροσωπευτικό τμήμα ιστολογία 28η ημέρα πολιτισμών αποκαλύπτουν το σχηματισμό των χωροκατακτητικών «δάχτυλα» (βέλος) διαπερνούν τη γύρω υδρογέλης (αριστερά). Η Η &? Ε χρώση (μέση) δείχνει ένα κοίλο πυρήνα. Ανοσοϊστοχημεία λεκέ της κασπάσης 8 (δεξιά) επιβεβαιώνει αποπτωτικών κυττάρων μέσα στον πυρήνα (καφέ). οικόπεδα (D) Scatter του μεγέθους της αποικίας, ο αριθμός των κυττάρων και το μέγεθος του πυρήνα τυχόν αναλυθεί από 10 μm πάχους τομές ιστολογία. Αυτό δείχνει ότι κάθε μέγεθος αποικιών αυξάνεται γραμμικά με τον αριθμό των κυττάρων. Μέγεθος πυρήνα αυξάνει επίσης γραμμικά με το μέγεθος της αποικίας. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν για κάθε ανάλυση. Ράβδοι κλίμακας: (Α, αριστερά, Β) 250 μm, (A, δεξιά) 100 μm και (C) 50 μm

Η

Με βάση αυτή τη μελέτη πολλαπλασιασμού, έχουμε επιλέξει 2,0% υδροπηκτές PEG για. διεξαγωγή μετέπειτα πειράματα. Μέχρι σήμερα, η τοπική ακαμψία εντός του προστάτη αδενικό ιστό είναι άγνωστη. Ωστόσο, η ακαμψία των πηκτών 2% 4 kPa βρίσκονται εντός της αναφερθείσης περιοχής των μαλακών ιστών (1-10 kPa) και του μαστού αδενικό ιστό (4 kPa) [5], [47].

σφαιροειδή LNCaP σε βιομιμητικές υδροπηκτές ποικίλλει μορφολογικά και φαινοτυπικά από τα κύτταρα LNCaP σε 2D καλλιέργειες

στη συνέχεια, εξετάσαμε τη μορφολογία των κυττάρων LNCaP που καλλιεργούνται για έως και 28 ημέρες σε 2% βιομιμητικές υδροπηκτές PEG. Ομοεστιακή εικόνες Φαλλοϊδίνη και 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) βάφονται υδροπηκτές (Σχήμα 2Β, επάνω πίνακα και το σχήμα S3, αριστερά) και ο χρόνος παρέλευσης βιντεομικροσκοπία (Βίντεο S1) έδειξε ότι μεμονωμένα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε αποικίες μέχρι 200 μικρά σε διάμετρο στην υδρογέλη. Αυτές οι αποικίες έμοιαζε με τη μορφολογία των αποικιών LNCaP σε Matrigel καλλιεργήθηκαν ™ (Σχήμα S3, δεξιά) όπως και άλλοι έχουν περιγραφεί προηγουμένως [48] – [49]. Το μέγεθος της αποικίας αυξήθηκε από την ημέρα 7 έως την ημέρα 21 και παρέμεινε σταθερή μετά (Σχήμα 2Β, κάτω πλαίσιο). Τα συσσωματώματα κυττάρων είχαν σφαιρικό σχήμα μέχρι την ημέρα 21, στη συνέχεια να γίνει ακανόνιστη, όπως επιβεβαιώνεται από μια σημαντική μείωση στην παράγοντα σχήματος την ημέρα 28 (Σχήμα 2Β, κάτω πλαίσιο). Η φαλλοειδίνη-ϋΑΡΙ και αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώσεις κατεψυγμένων τομών έδειξε ότι οι ημέρες 28 αποικίες που σχηματίστηκαν δομές «δάχτυλο-όπως» και συχνά παρουσιάζεται ένα κοίλο κεντρικό πυρήνα (Σχήμα 2C). Η παρουσία αποπτωτικών κυττάρων στην περιοχή αυτή, όπως ανιχνεύθηκε μέσω χρώσης κασπάσης 8, παρατηρήθηκε επίσης. Αυτή η αύξηση του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων εντός του πυρήνα το οποίο έχει επίσης περιγραφεί σε άλλες

vitro

καλλιέργειες όγκου σε 3D [17], [19]. Περαιτέρω ιστολογική εξέταση των 3D καλλιέργειες υποστηρίζει ότι η αύξηση σε μέγεθος της κάθε αποικίας ήταν ανάλογη προς τον αριθμό των κυττάρων και το μέγεθος των πυρήνων που σχηματίζεται (Σχήμα 2D). Τα αποπτωτικά πυρήνας σχηματισμοί παρατηρήθηκαν πιο συχνά σε ημέρες 28 καλλιέργειες σε σύγκριση με τα άλλα χρονικά σημεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Δεδομένου ότι τα περισσότερα από το προηγούμενο χαρακτηρισμό του φαινοτύπου LNCaP κυττάρων βασίζεται σε 2D καλλιέργειες, προσπαθούμε να εξέταση της μορφολογίας καλλιεργημένων LNCaP κυττάρων 3D. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, κύτταρα LNCaP σε 2D απλώθηκαν με ατρακτοειδόμορφα μορφολογία. Όμως, τα 3D καλλιέργειες, τα κύτταρα τοποθετημένα σε συμπαγή συσσωματώματα κυττάρων, οπότε μόνο τα κύτταρα υιοθετήσει μια πιο στρογγυλεμένη μορφολογία σε σύγκριση με τα κύτταρα μονοστιβάδας. Εντός της αποικίας LNCaP, η επιθηλιακή δείκτης Ε-καδερίνης (ECAD) συν-εντοπίζεται με επαφές κυττάρου-κυττάρου, ενώ σε 2D καλλιέργειες ECAD ήταν πιο ομοιόμορφα κατανεμημένα στην επιφάνεια του κυττάρου. Εμείς επόμενο εκτελείται χρώση για τον προσωπικό υποξία με πιμονιδαζόλη και στις δύο καλλιέργειες για να αξιολογηθεί η διαθεσιμότητα οξυγόνου στα κύτταρα, την ανίχνευση ενός υψηλότερου επιπέδου υποξία σε 3D από 2D σε καλλιέργειες. Αυτή η παρατήρηση είναι συνεπής με ξενομοσχεύματα όγκων και κλινικές όγκων όπου υποξίας και κεντρική απόπτωση /νέκρωση είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό σε φτωχά αγγειοποιημένου στερεούς όγκους και πολιτισμούς προηγούμενες 3D σφαιροειδές ανεξάρτητη από τους τύπους κυττάρων [42], [50] – [54]. έκθεση μας έδειξαν επίσης ότι στις προηγούμενες 3D καλλιέργειες (ημέρα 14), όπου το μέγεθος σφαιροειδές ήταν μικρότερη (Σχήμα S4), λιγότερη χρώση πιμονιδαζόλη ήταν εμφανής σε σύγκριση με την ημέρα 28 οι καλλιέργειες (Σχήμα 3). Αυτό υποδηλώνει ότι πολυκύτταρους συσσωματώματα, ανάλογα με το μέγεθος της αποικίας μπορεί να επηρεάσει τη μεταφορά του οξυγόνου μέσα στην αποικία. Ομοίως, όταν τα κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν σε μαλακότερα πηκτώματα (π.χ. κολλαγόνο Ι και Matrigel ™), υποξία ανιχνεύθηκε με χρώση πιμονιδαζόλη την ημέρα 24 της ανάπτυξης της καλλιέργειας (Σχήμα 3Β). Τα σφαιροειδή σε καλλιέργειες εναιωρήματος αντιμετωπίζουν επίσης εξάντληση του οξυγόνου ειδικά προς το κέντρο των σφαιροειδών [42], [50], [55]. Αυτό υποδεικνύει ότι ο περιορισμός μεταφοράς οξυγόνου δεν είναι ειδικό για την μήτρα υδρογέλης PEG αλλά είναι επίσης πιθανό να επηρεάζεται από τη στενή επαφή κυττάρου-κυττάρου και υψηλή πυκνότητα κυττάρων σε 3D καλλιέργειες.

(Α) Μια σύγκριση των 2D καλλιέργειες (ημέρα 6) και τα τμήματα ιστολογία του 3D καλλιέργειες (ημέρα 28) αποκαλύπτει τις διαφορές στη μορφολογία των κυττάρων και φαινότυπο. Κυτταροσκελετού οργάνωση (ακτίνη, κόκκινο) των κυττάρων σε 2D καλλιέργειες αποκαλύπτει μια εξάπλωση έξω και επιμήκη μορφολογία των κυττάρων (πάνω πίνακα). Το κύτταρο και στον πυρήνα (μπλε) το μέγεθος του 2D πολιτισμών είναι μεγαλύτερο από ό, τι τα 3D πολιτισμών. Σε 3D καλλιέργειες, τα κύτταρα υιοθετήσει μια μορφολογία πλακόστρωτα και διάταξη συμπαγή κυττάρων. Αποτελούν επίσης εκτεταμένη επαφή κυττάρου-κυττάρου μέσα στην αποικία. Τα επιθηλιακά δείκτη, Ε-καδερίνης (ECAD, πράσινο) εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη και σε επαφές κυττάρου-κυττάρου και για τις δύο καλλιέργειες (μεσαίο πλαίσιο). χρώση υποξία με πιμονιδαζόλη (πράσινη) υποδεικνύει ότι υπάρχουν λιγότερα υποξικά κύτταρα σε 2D καλλιέργειες σε σχέση με το 3D καλλιέργειες (κάτω πίνακας). Η υποξία ανιχνεύεται μέσα στην αποικία LNCaP σε παρουσία ενός αποπτωτικού πυρήνα (βέλος). (Β) πιμονιδαζόλη χρώσεις πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν σε υδρογελών PEG, κολλαγόνο Ι και Matrigel ™ για 24 ημέρες, παρουσιάζουν παρουσία υποξίας σε όλες τις μήτρες. εικόνες CLSM ελήφθησαν σε μεγέθυνση 40 φορές και 1,25 ΝΑ. Ράβδοι κλίμακας: (Α) 75 μm και (Β) 100 μm

Η

επίπεδα πρωτεΐνης και του mRNA των δεικτών LNCaP σε 3D καλλιέργειες διαφέρουν από 2D καλλιέργειες κατά τη διέγερση με 1 ηΜ R1881 για 48 ώρες

.

Κατά τη διάρκεια του αρχικού σταδίου της ΚΑΠ, η μεγάλη πλειονότητα των όγκων που εξαρτώνται από ανδρογόνα και ανταποκρίνεται? Επιπλέον, η οδός σηματοδότησης AR παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων και είναι σημαντικό καθ ‘όλη την εξέλιξη της [56] – [57]. Για το λόγο αυτό, εξαρτώμενη από ανδρογόνα LNCaP κύτταρα χρησιμοποιούνται ευρέως σε 2D καλλιέργειες για τη μελέτη του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σηματοδότησης, η οποία ενεργοποιείται από τα ανδρογόνα και τα ανάλογα όπως R1881. Προκειμένου να επεκτείνει τις γνώσεις μας για την αντιμετώπιση LNCaP να R1881 σε πειράματα με βάση 2D πολιτισμό, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της R1881 στην έκφραση δείκτη CaP σε 3D καλλιέργειες (Σχήμα 4). χρώση ανοσοφθορισμού αποκάλυψε μετατόπιση του AR στον πυρήνα του κυττάρου, τόσο 2D και 3D καλλιέργειες μετά από 7 h 1 θεραπεία ηΜ R1881 (Σχήμα 4Α). Έχει καθιερωθεί σε 2D καλλιέργεια που κάποτε AR δεσμεύεται με R1881, μεταφέρεται στον πυρήνα όπου ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων, όπως ειδικό προστατικό αντιγόνο /καλλικρεΐνη 3 (PSA) [58]. προκαταρκτική μελέτη μας έδειξε ότι τα γονίδια AR-στόχο, όπως PSA, επάχθηκαν σε υψηλότερα επίπεδα και μετά από παρατεταμένη θεραπεία R1881 (μετά 36 ώρες) σε 2D και 3D καλλιέργειες (Σχήμα S5A). Ως εκ τούτου, επιλέξαμε για αυτή τη μελέτη ενός 48 ώρες θεραπείας R1881 και για τις δύο κουλτούρες. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και 2D και 3D καλλιέργειες ανταποκρίθηκαν στην θεραπεία 48 ώρες R1881, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση του mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης του PSA, εντοπισμός του AR σε κυτταρικό πυρήνα ανιχνεύθηκε σε μικρότερο βαθμό σε 3D καλλιέργειες σε σύγκριση με 2D καλλιέργειες. Ωστόσο, ούτε η εντόπιση ούτε την ένταση του επιθηλίου του αυλού δείκτη, Cytokeratin 8 (Ck8) επηρεάστηκε από τη θεραπεία R1881 σε 2D ή 3D πολιτισμών.

(Α) ανοσοφθορισμού χρώσεις των κυττάρων LNCaP μετά τη θεραπεία 7 ώρες με R1881 παράσταση συν -localization του AR και πυρήνα του κυττάρου σε δύο 2D (ημέρα 6) και 3D (ημέρα 28) καλλιέργειες (άνω πάνελ). Αντίστοιχη εντοπισμό AR και στις δύο κουλτούρες φαίνεται στην κλίμακα του γκρι εικόνες (κάτω πίνακας). (Β) Οι κυτταρικές φαινότυποι των 2D (ημέρα 6, αριστερό πάνελ) και 3D (ημέρα 28, δεξί πάνελ) καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε ανδρογόνο εξαντλημένο μέσο ή R1881 συμπληρωμένο μέσο (48 ώρες) συγκρίθηκαν με χρώσεις ανοσοφθορισμού. Πρωτεΐνες ενδιαφέροντος είναι σε πράσινο, ακτίνης σε κόκκινο και πυρήνα σε μπλε χρώμα. Σε 2D καλλιέργειες, AR είναι εντοπισμένη στον πυρήνα και PSA στο κυτταρόπλασμα κατά R1881 διέγερση. Χωρίς θεραπεία, το AR παραμένει στο κυτταρόπλασμα και PSA δεν ανιχνεύεται. Η επιθηλίου του αυλού δείκτη, Ck8 ανιχνεύεται στις δύο καλλιέργειες ανεξάρτητα από την κατάσταση θεραπείας. Σε 2D πολιτισμούς, Ck8 χρωματίζει σαφώς τις ίνες του νήματος, ενώ σε 3D, Ck8 εντοπίζεται στα σύνορα των κυττάρων. Σε 3D πολιτισμούς, Extranuclear AR εντοπισμού παρατηρείται τόσο σε μη κατεργασμένα και R1881 αντιμετωπίζονται πολυκύτταρους αδρανών υλικών. PSA παράγεται επίσης άφθονα στο R1881 επεξεργασία 3D καλλιέργειες αλλά μόνο σε πολύ χαμηλό επίπεδο, όταν δεν αντιμετωπίζεται. μεγεθύνονται περιοχές κάθε ειδική χρώση και τον πολιτισμό κατάσταση (λευκά κουτιά) εμφανίζονται κάτω από τις αντίστοιχες εικόνες. εικόνες CLSM ελήφθησαν σε 60 × μεγέθυνση (1,4 ΝΑ) για το Α και 40 × μεγέθυνση (1.25 ΝΑ) για Β Ράβδοι κλίμακας:. (Α) 30 μm, (Β) 75 μm και 25 μm (μεγεθύνονται περιφέρειες)

για να εξεταστεί το αποτέλεσμα R1881 στα επίπεδα των πρωτεϊνών, εστιάσαμε στην έκφραση του AR, PSA και Ck8 εκτελώντας ανάλυση κηλίδος Western. Κατά την θεραπεία R1881, τα επίπεδα PSA και Ck8 ενισχύθηκαν σε 2D και 3D καλλιέργειες σε σύγκριση με τους μάρτυρες που έλαβαν μη αιθανόλης αν και ανύψωση της πρωτεΐνης Ck8 με R1881 δεν ήταν εμφανής σε χρώση ανοσοφθορισμού σε 2D και 3D καλλιέργειες, οι οποίες μπορούν να αποδοθούν στην έλλειψη ευαισθησίας (του αντισώματος που χρησιμοποιείται) (Σχήμα 5Α, Β). Είναι ενδιαφέρον, στην αγωγή 2D καλλιέργειες, τα επίπεδα πρωτεΐνης AR ήταν αυξημένα σε σύγκριση με μη-κατεργασμένους ελέγχους, ενδεικτική της σταθεροποίησης του δεσμευμένου συνδεσμικού AR και /ή σε αύξηση της παραγωγής AR [59] – [60]. Σε αντίθεση, δεν υπάρχουν σημαντικές αλλαγές ανιχνεύθηκαν σε 3D καλλιέργειες. Στο σύνολό τους, αυτό δείχνει μια διαφορική ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης AR σε 2D και 3D πολιτισμών σε απάντηση R1881. Η επίδραση της R1881 στα επίπεδα mRNA σε 2D και 3D καλλιέργειες ερευνήθηκε περαιτέρω με ποσοτική Real Time-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qRT-PCR). Σύμφωνα με τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης, PSA και τα επίπεδα mRNA Ck8 αυξήθηκε σε αμφότερες τις καλλιέργειες (Σχήμα 5C). Παρόμοια με την ανάλυση κηλίδος western, το επίπεδο AR mRNA δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τη θεραπεία R1881 σε 3D πολιτισμών, αλλά έκανε δείχνουν μια πτωτική τάση όταν η θεραπεία επιμηκύνθηκε (Σχήμα S5B). Παρά υψηλότερη έκφραση AR σε 2D καλλιέργειες σε σύγκριση με 3D καλλιέργειες, η έκφραση PSA ήταν παρόμοια μεταξύ τους πολιτισμούς, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C. Περιέργως, σε μη επεξεργασμένες καλλιέργειες, το επίπεδο του mRNA PSA αρχική τιμή ήταν σημαντικά υψηλότερη στην 3D σε σχέση με 2D καλλιέργειες. AR και PSA mRNA επίπεδα σε ξενομοσχεύματα όγκου LNCaP από ανέπαφα μη παχύσαρκους διαβητικούς /Σοβαρή Συνδυασμένη ImmunoDefficiency (NOD /SCID) (Σχήμα S5c) ήταν συγκρίσιμες με το R1881 διεγερμένα 3D καλλιέργειες αλλά όχι τα 2D καλλιέργειες. Έτσι, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η 3D πολιτισμούς μας αντικατοπτρίζουν καλύτερα

in vivo

όγκους.

(Α) Ένας εκπρόσωπος κηλίδα Western αποκαλύπτει αυξημένο επίπεδο όλων των διερευνώνται πρωτεϊνών σε 2D καλλιέργειες όταν λαμβάνουν θεραπεία με R1881 σε σύγκριση με την μη θεραπεία (μάρτυρες αιθανόλη) ενώ σε 3D καλλιέργειες, μόνο PSA και Ck8 είναι σημαντικά αυξημένα. αναλογία (Β) Σήμα πρωτεϊνών σε σχέση με το α-τουμπουλίνης από κηλίδες Western των R1881 θεραπεία και έλεγχο ομάδες αιθανόλη (-R1881) παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. Οι ποσοτικοί προσδιορισμοί πρωτεΐνης στηρίξει τις αλλαγές που εμφανίζονται σε ανοσοστυπώματα παραπάνω. (C) qRT-PCR που αντιπροσωπεύουν έκφραση δεικτών κυτταρικής LNCaP (μέση τιμή ± SE) όπου PSA και Ck8 είναι up-ρυθμίζονται σε επίπεδο mRNA κατά την κατεργασία σε 2D και 3D καλλιέργειες σε σύγκριση με μη κατεργασμένα 2D ή 3D ομάδες. Το AR είναι αυξημένα μόνο σε 2D καλλιέργειες. Σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05) μεταξύ κατεργασμένα και μη-κατεργασμένα δείγματα εντός παρόμοιες ομάδες (είτε 2D ή 3D καλλιέργειες) συμβολίζεται με (*) και μεταξύ όμοια επεξεργασία των διαφόρων ομάδων υποδηλώνονται με (Δ). δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

ανδρογονική απόκριση των κυττάρων LNCaP σε 3D πολιτισμούς μεταβάλλεται σε σύγκριση με καλλιέργειες 2D υπό R1881 στερηθεί κατάσταση

Με δεδομένες τις παραπάνω διαφορές στην PSA και η έκφραση Ar και Ar εντοπισμού μεταξύ καλλιέργειες κυττάρων LNCaP 2D και 3D, πραγματοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών να αξιολογήσει πλήρως μεταγραφική διαφορές μεταξύ των κυτταρικών καλλιεργειών 2D και 3D LNCaP κάτω ανδρογόνων στερηθεί και R1881 αντιμετωπίζονται συνθήκες, εστιάζοντας σε γονίδια που αποκρίνονται στο ανδρογόνο. Βρήκαμε διαφορική ρύθμιση του 4157 (1896 έως, 2261 κάτω) και 3306 (1304 έως 2002 κάτω) ανδρογόνο γονιδίων που αποκρίνονται σε R1881-θεραπεία κυτταρικής καλλιέργειας 2D και 3D LNCaP, αντίστοιχα. Το R1881 επεξεργασμένο 2D (2D + R1881) και 3D (3D + R1881) καλλιέργειες κοινόχρηστο 2862 κοινώς ρυθμιζόμενα γονίδια που αποκρίνονται στο ανδρογόνο (1165 ανάντη και 1.697 ρυθμισμένα προς τα κάτω γονίδια) σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους αιθανόλη (Σχήμα 6Α). Είναι ενδιαφέρον ότι η πολλαπλή μεταβολή στο επίπεδο έκφρασης του 898 (31%) αυτών των γονιδίων ήταν σημαντικά μειωμένη σε 3D + R1881 σε σύγκριση με 2D + R1881. Αυτό ήταν ιδιαίτερα εμφανές για up-ρυθμιζόμενα γονίδια, όπως φαίνεται στα διαγράμματα διασποράς (Εικ. 6Α), προτείνοντας ένα ανδρογόνο απόκριση απουσία ανδρογόνων όταν τα κύτταρα LNCaP αναπτύσσονται στην καλλιέργεια 3D. Σύγκριση των ελέγχων 3D και 2D αιθανόλη (3D + EtOHvs2D + EtOH) αποκάλυψε ότι 1.469 γονίδια που αποκρίνονται στο ανδρογόνο εκφράστηκαν διαφορικά (Σχήμα 6Β). Αυτό υποδηλώνει σαφώς ότι μειώθηκε φορές μεταβολής ανδρογόνων ρυθμισμένων γονιδίων σε απόκριση προς R1881 στο 3D καλλιέργεια σε σχέση με 2D + R1881 προκλήθηκε από μια ισχυρή μετατόπιση στο επίπεδο έκφρασης γραμμή βάσεως των ανδρογόνων ρυθμιζόμενων γονιδίων (Σχ. 6Β).