Αφηρημένο

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα είναι δεσμοπλαστικού και υποξική, τα οποία σχετίζονται με κακή πρόγνωση. Οι υποξία-ενεργοποιημένα προ-φάρμακα (HAPS) ενεργοποιούνται συγκεκριμένα στην υποξική περιβάλλοντα για να απελευθερώσει κυτταροτοξικά ή κυτταροστατικά τελεστές. TH-302 είναι ένα HAP που βρίσκεται στο στάδιο αξιολογήθηκε σε μία κλινική μελέτη Φάσης ΙΙΙ σε καρκίνο του παγκρέατος. Χρησιμοποιώντας μοντέλα ζώων, δείχνουμε ότι η υποξία του όγκου μπορεί να επιδεινωθεί χρησιμοποιώντας ένα αγγειοδιασταλτικό, υδραλαζίνη, βελτιώνοντας TH-302 αποτελεσματικότητα. Hydralazine μειώνει τη ροή αίματος όγκου μέσω του φαινομένου «κλέψει», στο οποίο ατονικά ανώριμα αγγειακό σύστημα του όγκου αποτυγχάνει να διαστέλλονται σε συνδυασμό με την κανονική αγγείωση. Δείχνουμε ότι ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι εμφανίζουν ένα αποτέλεσμα «κλέψει» σε απάντηση υδραλαζίνη, με αποτέλεσμα την μειωμένη ροή αίματος στον όγκο και την επακόλουθη μείωση του ρΗ του όγκου. Το αποτέλεσμα δεν παρατηρείται σε SU.86.86 όγκους με ώριμο αγγειακό σύστημα του όγκου, όπως μετράται με CD31 και χρώση ανοσοϊστοχημείας λείου μυός ακτίνη (SMA). Η συνδυασμένη θεραπεία του υδραλαζίνη και TH-302 οδήγησε σε μείωση της ΜΙΑ PaCa-2 αύξηση του όγκου του όγκου μετά από 18 ημέρες θεραπείας. Αυτές οι μελέτες υποστηρίζουν ένα μηχανισμό συνδυασμό δράσης για TH-302 με ένα αγγειοδιασταλτικό που αυξάνει παροδικά υποξία του όγκου

Παράθεση:. Bailey KM, Cornnell HH, Ιμπραήμ-Χασίμ Α, Βοζτκόβιακ JW, Hart CP, Zhang Χ, et al. (2014) Η αξιολόγηση του φαινομένου «κλέβουν» σχετικά με την αποτελεσματικότητα της υποξία Ενεργός προφάρμακο TH-302 σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (12): e113586. doi: 10.1371 /journal.pone.0113586

Επιμέλεια: Pankaj Κ Singh, του Πανεπιστημίου της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 του Ιουνίου, 2014? Αποδεκτές: 26 Οκτ 2014? Δημοσιεύθηκε: 22, Δεκεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Bailey et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις R01CA125627-02? R01CA077575-10? P30CA076292-16 (Robert J. Gillies) και P30CA023074-35 (Amanda F. Baker). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και τους συγγραφείς αυτού του χειρογράφου έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά ενδιαφέροντα: Charles P. Hart είναι υπάλληλος της Pharmaceuticals Threshold. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα (PDAC) ασθενείς έχουν εξαιρετικά φτωχή πρόγνωση, με ποσοστό επιβίωσης 5 ετών περίπου 6%. Επιβίωσης παραμένει σε χαμηλά επίπεδα, λόγω τόσο της έλλειψης έγκαιρης ανίχνευσης των εντοπισμένων PDAC και την αναποτελεσματικότητα των παραδοσιακών χημειοθεραπείες για τον έλεγχο PDAC εξέλιξη. Αυτά τα χαμηλά ποσοστά επιβίωσης καταδεικνύουν την ανάγκη να αναπτυχθούν νέες στρατηγικές θεραπείας. Παθολογικά, PDAC όγκοι είναι εξαιρετικά ετερογενής και περιέχει μια δυναμική δεσμοπλαστικού διαμέρισμα στρωματικά, δύο από τα οποία συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου και χημειοθεραπεία αντίσταση [1], [2]. Εκτός του ότι είναι ένας μηχανικός φραγμός για τη διείσδυση του φαρμάκου, δεσμοπλαστικό στρώμα συμβάλλει στην υποξία όγκου? ένα κοινό φυσιολογικό χαρακτηριστικό των όγκων που PDAC συνδέεται επίσης με την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία [3] – [5]. Η υποξία σχετιζόμενη αντίσταση χημειοθεραπεία μπορεί να προκαλείται από: την έλλειψη παροχής φαρμάκου στον όγκο λόγω της κακής αιμάτωσης [4]? υποξία προκαλούμενη αντοχή σε απόπτωση [6]? και μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων των κλασμάτων υποξικών κυττάρων [7]. Επιπλέον, έχουν υποξικών καρκινικών ιστών έχει αποδειχθεί ότι έχουν αυξημένη μεταστατικού δυναμικού [8] και η πλειοψηφία των όγκων PDAC υπάρχουν ως μεταστατική νόσο τελικού σταδίου [9].

Πρόσφατα, οι προσπάθειες να στοχεύουν θεραπευτικώς τις υποξικές διαμερισμάτων των όγκων έχουν επιδιωχθεί μέσω της χρήσης της υποξίας-ενεργοποιημένων προφαρμάκων (HAPS). Haps είναι σχετικά αδρανή σε ιστούς με φυσιολογική οξυγόνωση (ΡΟ

2), αλλά μειώνονται επιλέξτε οξειδοαναγωγάσες ένα ηλεκτρόνιο κάτω από υποξικές συνθήκες για να απελευθερώσουν κυτταροτοξικούς κεφαλές. Μια ΗΑΡ πρώτης γενεάς, τιραπαζαμίνη, έδειξε δυνητικό θεραπευτικό όφελος σε συνδυασμό με τυπικές θεραπείες [10] – [12], και επέδειξε μέτρια επιτυχία στη Φάση Ι – ΙΙ κλινικών δοκιμών [13], [14]. Ατελής διείσδυση όγκου και ένα σύντομο χρόνο ημίσειας ζωής έχουν διεγερθεί προσπάθειες να σχεδιάσουν βελτιωμένες αναλόγων τιραπαζαμίνη με καλύτερη διαλυτότητα, η κυτταροτοξικότητα, η επιλεκτικότητα και η διείσδυση του ιστού [15] – [17]. Μια δεύτερη ΗΑΡ γενιάς, TH-302, συναρμολογείται σε ένα 2-νιτροϊμιδαζολίου υποξία ευαίσθητη σκανδάλη και επιλεκτικά ενεργοποιείται υπό ακραίες υποξία (& lt? 0,5% O

2) απελευθερώνοντας βρωμο-ισοφωσφοραμίδιο, ένα DNA σταυροδεσμών κυτταροτοξικών τελεστών [18]. TH-302 είναι εξαιρετικά αποτελεσματική σε προκλινικά μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου [19], και αποτελεί αντικείμενο έρευνας κλινικά για διάφορες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων PDAC. Ένα φάσης Ι /ΙΙ μελέτη έδειξε ότι η TH-302, σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη, η αυξημένη επιβίωση χωρίς εξέλιξη κατά 2 μήνες για PDAC ασθενείς [20], και ο συνδυασμός αυτός έχει πλέον προχωρήσει σε Φάσης ΙΙΙ (NCT01746979, EMD Serono).

Τα προκλινικά TH-302

in vitro

και

in vitro

μελέτες μονοθεραπείας σε προσδιορισμό των ευαίσθητων και ανθεκτικών παγκρέατος γραμμές καρκίνου που μοιάζουν στενά με την κλινική ανταπόκριση σε PDAC ασθενείς [21], [22]. Όπως υποξία του όγκου που απαιτείται για την δραστικότητα TH-302, και επειδή TH-302 παρουσιάζει ένα φαινόμενο γειτνιάσεως με θανάτωση κυττάρων σε παρακείμενες νορμοξικά ιστούς [22], υποθέσαμε ότι TH-302 αποτελεσματικότητα θα μπορούσε να βελτιωθεί με παροδικά αυξάνοντας την υποξική κλάσμα σε συμπαγείς όγκους . Σε μοντέλα silico και πειραματικά στοιχεία δείχνουν ότι η πιο αποτελεσματική προσέγγιση για τη μείωση του όγκου pO

2 είναι να αυξήσει την κυτταρική αναπνοή [23]. Αυτό είχε προηγουμένως αποδειχθεί στην κυτταρική γραμμή καρκινώματος κόλου, RKO, στην οποία φαρμακολογική αναστολή του HIF-1α με echinomycin αυξημένη κατανάλωση οξυγόνου, μειωμένη όγκου pO

2 και αύξησε τη δραστηριότητα του ΗΑΡ, η τιραπαζαμίνη [24]. Αυτή η κατεργασία είχε ως αποτέλεσμα μια χρονίως υποξικό περιβάλλον που θα μπορούσε να οδηγήσει σε περαιτέρω υποξικής προσαρμογή των κυττάρων του όγκου και τις παρενέργειες ΗΑΡ. Αντίθετα, προτείνουμε ότι παροδικές και οξεία επιδείνωση της υποξίας, σε συνδυασμό με ΤΗ-302, θα ήταν πιο αποτελεσματική με λιγότερες παρενέργειες. Πριν από την εργασία έχει επίσης παρατηρηθεί ότι η εξωγενής πυροσταφυλικό αυξάνει την υποξική κλάσμα σε πλακώδες καρκίνωμα (SCC) όγκους [25] μέσω ενός παροδική αύξηση της κατανάλωσης οξυγόνου [26]. Έχουμε επίσης παρατηρήσει ότι η εξωγενής πυροσταφυλική αυξημένη αποτελεσματικότητα του TH-302 σε προ-κλινικές SCC και PDAC μοντέλα [26], [27]. Να διερευνήσει εναλλακτικές φαρμακολογικές μεθόδους για να επιδεινώσει παροδικά υποξία και ως εκ τούτου, να ενισχύσει τις αντικαρκινικές ιδιότητες του TH-302, είμαστε εδώ να διερευνήσει το φαινόμενο «κλέβουν». Το φαινόμενο «κλέψει» εμφανίζεται όταν αγγειοδιασταλτικά, όπως η υδραλαζίνη, προκαλούν υγιή αιμοφόρα αγγεία να διαστέλλονται οδηγώντας σε μειωμένη συστηματική πίεση του αίματος. Όγκου αγγειακό σύστημα είναι συχνά ανώριμος και ατονική, δεν έχει την ικανότητα να συστέλλονται ή διαστέλλονται. Ως εκ τούτου, κατά τη διάρκεια συστημική αγγειοδιαστολή, υπάρχει μία φυσιολογική μείωση της αρτηριακής πίεσης, που δεν μπορεί να συνδυαστεί με το μικροπεριβάλλον του όγκου και αγγείωση. Η προκύπτουσα διαφορά πίεσης δημιουργεί μια παροδική μείωση της αιμάτωσης όγκου, που επηρεάζουν τη φυσιολογία του όγκου και με αποτέλεσμα την αύξηση υποξία και οξέωση [28] – [33]

Στη μελέτη αυτή υποθέσαμε ότι υδραλαζίνη θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να μειωθεί έντονα διάχυσης. και να αυξήσει υποξία εντός μικροπεριβάλλον του όγκου, ενισχύοντας έτσι την αποτελεσματικότητα του TH-302. Εμείς επιλέξαμε τρία ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά μοντέλα ξενομοσχεύματος κυτταρικής γραμμής, η οποία είχε προηγουμένως δειχθεί ότι είναι ευαίσθητα σε μεταβλητά TH-302 μονοθεραπεία [18], [21], [22]. Tumor ρΗ μετρήθηκε πριν και μετά τη χορήγηση του υδραλαζίνη ως βιοδείκτη για μειωμένη αιμάτωση. Αλλαγές στη ροή του αίματος μετά την αγωγή υδραλαζίνη ποσοτικά μετρήθηκε χρησιμοποιώντας υπερηχογράφημα Doppler για να επιβεβαιωθεί η μείωση της αιμάτωσης του όγκου και να σχεδιάσουν δοσολογικά σχήματα για να μεγιστοποιηθεί το αποτέλεσμα του φαινομένου «κλέβουν». Η συνδυασμένη θεραπεία του υδραλαζίνη και ΤΗ-302 αξιολογήθηκε με την υπόθεση ότι η υδραλαζίνη θεραπεία θα αυξήσει TH-302 αποτελεσματικότητα σε «κλέψει» ευαίσθητου γραμμές. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υδραλαζίνη βελτιωμένη TH-302 αποτελεσματικότητα, αν και το μέγεθος της επίδρασης ήταν μικρό και ήταν μόνο μετρίως σημαντική σε όγκους (ΜΙΑ PaCa-2) που παρουσιάζουν ενδιάμεση ευαισθησία στο TH-302 ως μονοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

SU.86.86 και τα κύτταρα Hs766T ελήφθησαν από Pharmaceuticals Όριο (South San Francisco, CA) και τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 λήφθηκαν από την American Συλλογή Τύπος κυττάρων (ATCC, Manassas, VA). Τα κύτταρα διατηρούνται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές ATCC. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS (Hs766T και SU.86.86) ή ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS (ΜΙΑ PaCa-2), και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. Mycoplasma και κυτταρική γραμμή αυθεντικότητα πραγματοποιήθηκαν (καρυότυπος) δοκιμές.

Μελέτες σε ζώα

Όλες οι διαδικασίες ήταν, σύμφωνα με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των εργαστηριακών ζώων Πόρων (1996), το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας, και εγκρίθηκε από την Υγειονομική υπηρεσία και την Επιτροπή Χρήσης, Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα στο πλαίσιο του εγκεκριμένου πρωτοκόλλου R4033. Ανοσοκατασταλμένα ποντίκια που στεγάζεται σε ένα καθαρό εγκατάσταση με ειδικούς όρους, που περιλαμβάνουν HEPA φιλτράρεται αεριζόμενα συστήματα κλουβιών, κυψελωτό κρεβάτι, κυψελωτό στέγαση, αυτόκαυστο νερό, ακτινοβολείται ειδικές διαδικασίες αλλαγή κλουβί φαγητό και. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 εισπνοή αν οι όγκοι συνέβαλαν στην αύξηση του & gt? 20% στο σωματικό βάρος σε σύγκριση με τους μάρτυρες κατά την ίδια χρονική στιγμή, ή ποντίκια παρουσίασαν a & gt? Απώλεια 10% του σωματικού βάρους, ένας όγκος μετράται μεγαλύτερο από 2000 mm

3, ή ποντίκια δείχνουν σημάδια της διάχυτης νόσου, όπως η πνευμονική μετάσταση υποδεικνύεται από δυσκολία στην αναπνοή. Όλα τα ζώα στεγάστηκαν είτε στο USF ιχθυοτροφείου εντός Moffitt Κέντρο Καρκίνου ή εντός της εγκατάστασης της Αριζόνα Κέντρο Καρκίνου

SCID-beige θηλυκά ποντίκια (Harlan Laboratories, Indianapolis, ΙΝ) εμβολιάστηκαν με 5 -. 10 × 10

6 κύτταρα σε 1: 1 Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ): PBS διάλυμα υποδορίως στην δεξιά πλευρά. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε δύο φορές την εβδομάδα με ηλεκτρονικό παχύμετρο καθ ‘όλη τη διάρκεια των πειραμάτων. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με τη χρήση: όγκος = (

l

×

w

2) /2, όπου

l

= μεγαλύτερο μήκος και

w

= βραχύτερο μήκος. Ορθοτοπική παγκρέατος μοντέλο όγκου: Γυμνό αρσενικά ποντίκια (η = 3) έλαβαν ένεση με 1 χ 10

6/20 μλ MIA κυττάρων PaCa-2 σε PBS. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με 3% ισοφλουράνη και διατηρήθηκε με 1.5% ισοφλουράνιο κατά τη διάρκεια της όλης διαδικασίας. Μετά πλευρική τομή, η σπλήνα και περιφερικό πάγκρεας κινητοποιήθηκαν και τα κύτταρα εγχέονται κατευθείαν μέσα στο πάγκρεας. Η κοιλιακή εσωτερικό τοίχωμα ράφτηκε και η εξωτερική τομή του δέρματος κλείστηκε με συνδετήρες. Η αναλγησία χορηγήθηκε στη χειρουργική θέση για την ανακούφιση του πόνου. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν ημερησίως μέχρι απομακρύνθηκαν οι συνδετήρες, περίπου μία εβδομάδα. Ο όγκος του όγκου παρακολουθήθηκε εβδομαδιαία με υπερήχους.

Ηλεκτρόδιο pH

μετρήσεις pH ελήφθησαν με τη χρήση ενός μετρητή FE20 Πέντε εύκολα pH (Mettler-Toledo, Columbus, ΟΗ). Όλα τα ζώα ναρκώθηκαν με ισοφλουράνιο (3.5%), και παρέμειναν υπό αναισθησία (1.5 έως 3.5% ισοφλουράνιο) για τη διάρκεια του πειράματος. Ένα ηλεκτρόδιο αναφοράς και το ρΗ (MI-401F και ΜΙ-408b, αντίστοιχα, Microelectrodes Inc., Bedford, ΝΗ) χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση του ρΗ εισάγοντας πρώτα το ηλεκτρόδιο αναφοράς (OD 1 mm) κάτω από το δέρμα του ποντικού κοντά στον όγκο (πλευρά). Το ηλεκτρόδιο pH (OD 0,8 mm) στη συνέχεια εισήχθη μέχρι 1,3 cm μέσα στο κέντρο κάθε υποδόριου όγκου. Ηλεκτρόδια βαθμονομηθεί πριν και μετά από κάθε σειρά μετρήσεων. Λήφθηκαν δύο μετρήσεις σε κάθε χρονικό σημείο και ο μέσος όρος. Μετά τις αρχικές μετρήσεις του ρΗ, τα ζώα χορηγήθηκαν 100 μι ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) ένεση 10 mg /kg υδραλαζίνη (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Το ρΗ μετρήθηκε κάθε 30 λεπτά μέχρι και τρεις ώρες μετά την ένεση ip, και λήφθηκε φροντίδα για τη μέτρηση του ρΗ σε περίπου την ίδια θέση στον όγκο σε κάθε χρονικό σημείο. Μετά την τελική μέτρηση του ρΗ, τα ζώα θυσιάστηκαν και οι όγκοι συλλέχθηκαν για ιστολογία.

Τα δεδομένα υποβάλλονται σε επεξεργασία από τη λήψη του μέσου όρου των δύο τιμές ρΗ μετρήθηκε σε κάθε χρονικό σημείο. Η μεταβολή στο ρΗ, ή δέλτα (Δ (

t

), όπου το

t

είναι ο χρόνος μετά την ένεση του υδραλαζίνη ή αλατόνερο, σε λεπτά) μετρήθηκε ως η διαφορά μεταξύ του πρώτου σημείου φορά pH και κάθε επόμενο χρονικό σημείο pH. Για κάθε τύπο όγκου, ο μέσος όρος δέλτα (

Μέση

Δ) είναι ο μέσος όρος δέλτα για όλα τα ζώα αυτού του τύπου όγκου:

όπου

t

είναι ο χρόνος, η οποία κυμαίνεται από 30 έως 180 λεπτά μετά την ένεση,

Μια

είναι το ζώο,

n

t

είναι ο χρόνος αριθμός σημεία μέτρησης, και

n

Μια

είναι η αριθμός των ζώων με αυτόν τον τύπο του όγκου. Η μέγιστη μεταβολή του ρΗ οποιαδήποτε χρονική στιγμή μετά την ένεση προσδιορίστηκε για κάθε ζώο. Η μέση μέγιστη κατά μήκος κάθε τύπο του όγκου υπολογίστηκε, και η μεγαλύτερη αλλαγή για οποιοδήποτε ζώο σε κάθε ομάδα προσδιορίστηκε επίσης. Ο αριθμός των ζώων μετρήθηκε ποικίλει ανά τύπο του όγκου: Hs766T, η = 3? ΜΙΑ PaCa-2 n = 4? και SU.86.86, n = 7.

OxyLite

επίπεδα οξυγόνωσης του όγκου παρακολουθούνταν χρησιμοποιώντας OxyLab (Oxford Optronics, Oxford, UK) τριπλό παράμετρος E-series ανιχνευτές οπτικών ινών που εισήχθησαν στην όλοι οι όγκοι. Αυτά τα προ-βαθμονομημένη microprobes υποξία βασίζεται στην φωταύγεια σβέση και τη μέτρηση του ρΟ2 βασίζεται στο οξυγόνο αποσβέστηκε διάρκεια της φωταύγειας βαφής. Σήματα από τον αισθητήρα OxyLab αποκτήθηκαν με τη χρήση των συστημάτων παρακολούθησης OxyLab pO2 Ε και OxyLab LDF συνδεθεί με έναν υπολογιστή. σήματα δεδομένων εξόδου από αυτές τις οθόνες μετατράπηκαν σε pO2 τιμές (mmHg) και καταγράφονται σε πραγματικό χρόνο, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απόκτησης δεδομένων πολλαπλών καναλιών (PowerLab 8SP, ADInstruments, Αυστραλία) λειτουργεί υπό Διάγραμμα για τα Windows (Ver.5.02, ADInstruments, Αυστραλία) . Αναισθητοποιημένων ποντικών (Ισοφλουράνιο, 100% O

2) έχουν περιοριστεί σε μια πλατφόρμα έθιμο ακινητοποίηση να αποτραπεί η μετακίνηση και εκ των υστέρων με ένα μαξιλάρι θέρμανσης για τη διατήρηση της θερμοκρασίας του σώματος. Ελήφθησαν επιπλέον προφυλάξεις για να αποφευχθεί οποιαδήποτε κίνηση των ανιχνευτών υποξία, καθώς και τον περιορισμό παρεμβολές από εξωτερικές πηγές φωτός εξαλείφοντας έτσι τεχνούργημα. Microprobes (OD ~ 450 μm) εισήχθησαν μέσα στον όγκο και στερεώνονται στη θέση τους χρησιμοποιώντας στερεοτακτικές μεθόδους. Έναρξη κάθε μία από τις όγκων έγινε με μια βελόνα σύριγγας 19 g και microprobes τροφοδοτήθηκαν εντός του όγκου σε ~ 3 mm από την επιφάνεια του όγκου και βελόνα αποσύρεται. Microprobes προσεκτικά σημειώνονται με διαβαθμίσεις, προκειμένου να επιτευχθεί το ίδιο βάθος σε όλους τους όγκους. Tumor επίπεδα ρΟ2 παρακολουθήθηκαν έως ότου παρατηρήθηκε σταθερή γραμμή βάσης. μετρήσεις σε πραγματικό χρόνο λήφθηκαν για 10 λεπτά κατά την έναρξη και συνεχώς για 60 λεπτά μετά ένεση 100 μL ενδοπεριτοναϊκή (ip) 10 mg /kg υδραλαζίνη. επίπεδα όγκου οξυγόνωση πριν και μετά την υδραλαζίνη ενέσεις συγκρίθηκαν. Ο αριθμός των ζώων που μετράται: ΜΙΑ PaCa-2 n = 4.

Ultrasound Imaging

Υπερηχογράφημα απεικόνισης διεξήχθη στο Vevo2100 με το μετατροπέα MS550D 22-55 MHz (VisualSonics, Τορόντο, Οντάριο, Καναδάς). Ποντικοί που φέρουν ΜΙΑ PaCa-2 όγκους (η = 4) ναρκώθηκαν (όπως περιγράφεται παραπάνω), μέσω της διάρκειας της απεικόνισης. Ελήφθησαν εικόνες Color Doppler για τον καθορισμό της θέσης ενός μείζονος αιμοφόρο αγγείο εντός του όγκου. Μόλις βρισκόταν ένα αρκετά μεγάλο αιμοφόρο αγγείο, ένα παλμικού κύματος (PW) Doppler ελήφθη για την ποσοτικοποίηση της ροής. Το ζώο έλαβε μια ένεση 100 μL 10 mg /kg υδραλαζίνη, και η ροή στο ίδιο αιμοφόρο αγγείο μετρήθηκε κάθε 5 λεπτά για 30 λεπτά. Για ΜΙΑ PaCa-2 ορθοτοπική όγκων, τη ροή του αίματος μετρήθηκε επί 180 λεπτά.

Drug Σχήματα και ανάπτυξη όγκου Kinetics

Παρακολούθησης

Τα ζώα ζεύγος κατ ‘όγκο του όγκου (όπως υπολογίζεται με ηλεκτρονικό παχύμετρο) όταν όγκοι έφτασαν περίπου 200 mm

3. Τα ζώα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες θεραπείας φαρμάκου (n = 9 ζώα ανά ομάδα θεραπείας για Hs766T και SU.86.86, αριθμοί που παρατίθενται για ΜΙΑ PaCa-2): i) TH-302 (η = 9), ii) Hydralazine (n = 7 ), iii) TH-302 + Hydralazine (n = 7) και iv) Saline (έλεγχος, η = 10). Οι αγωγές χορηγήθηκαν ως ενέσεις ip σε ζώα un-αναισθησία. Οι δόσεις ήταν 50 mg /kg TH-302 σε 200 μL αλατούχο διάλυμα για κάθε ζώο σε ομάδες Ι και ΙΙΙ, 10 mg /kg υδραλαζίνη σε 100 μι φυσιολογικό ορό ανά ζώο [29] σε ομάδες II και III, και 200 ​​μL αλατούχο για την ομάδα IV . Ομάδα ΙΙΙ έλαβε υδραλαζίνη 30 λεπτά πριν από τη χορήγηση του TH-302. Κατά τη διάρκεια ταυτόχρονη χορήγηση της δόσης των υδραλαζίνη και TH-302, υδραλαζίνη εγχύθηκε ip αμέσως πριν TH-302. Όλα τα σχέδια θεραπείας χορηγήθηκαν qdx5 για δύο ταυτόχρονες εβδομάδες. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα με τη χρήση ηλεκτρονικών δαγκάνες για τη διάρκεια του πειράματος.

επεξεργασία των ιστών και ανοσοϊστοχημεία

Κατά την ολοκλήρωση των

in vivo μελέτες

, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι όγκοι αποκόπηκαν. Οι όγκοι μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για περαιτέρω επεξεργασία. Η χρώση για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) διεξήχθη επί 4 μm τομές. Ανοσοϊστοχημική χρώση (IHC) ολοκληρώθηκε στο Tissue πυρήνα Moffitt χρησιμοποιώντας Res IHC Omni0UltraMap HRP XT Discovery XT μονάδα χρώσης (Ventana Medical Systems Inc.). ανάλυση IHC ολοκληρώθηκε για CD31 (Abcam ab28364) και ακτίνη των λείων μυών [SMA (Abcam ab32575)]. Τα πλακίδια σαρώθηκαν με το Aperio ScanScope XT (Vista, CA), και θετική ανάλυση pixel διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό Aperio Genie v1. Εν συντομία, ο αλγόριθμος μετρούμενη ένταση χρώσης σε ολόκληρη την περιοχή του όγκου και ταξινομείται τον αριθμό των εικονοστοιχείων που περιέχουν χρωματισμένο ιστού. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως επί τοις εκατό θετικότητα, η οποία υπολογίστηκε ως ο αριθμός των θετικών pixels διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των pixel πολλαπλασιασμένο επί 100.

Ανάλυση Δεδομένων

Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism v6. 02 (GraphPad Software Inc.). Στατιστικά διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t μη ζευγαρωμένο 2-tailed Student με διόρθωση του Welch. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SEM.

Ηθική Δήλωση

Όλες οι διαδικασίες ήταν, σύμφωνα με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των εργαστηριακών ζώων Πόρων (1996), το Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας, και εγκρίθηκε από η Επιτροπή Φροντίδα και Χρήση Θεσμικών ζώων, Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα στο πλαίσιο του εγκεκριμένου πρωτοκόλλου R4033. Ανοσοκατασταλμένα ποντίκια που στεγάζεται σε ένα καθαρό εγκατάσταση με ειδικούς όρους, που περιλαμβάνουν HEPA φιλτράρεται αεριζόμενα συστήματα κλουβιών, κυψελωτό κρεβάτι, κυψελωτό στέγαση, αυτόκαυστο νερό, ακτινοβολείται ειδικές διαδικασίες αλλαγή κλουβί φαγητό και. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 εισπνοή αν οι όγκοι συνέβαλαν στην αύξηση του & gt? 20% στο σωματικό βάρος σε σύγκριση με τους μάρτυρες κατά την ίδια χρονική στιγμή, ή ποντίκια παρουσίασαν a & gt? Απώλεια 10% του σωματικού βάρους, ένας όγκος μετράται μεγαλύτερο από 2000 mm

3, ή ποντίκια δείχνουν σημάδια της διάχυτης νόσου, όπως η πνευμονική μετάσταση υποδεικνύεται από δύσκολες δυσκολία στην αναπνοή.

Αποτελέσματα

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μια μεταβλητή απόκρισης των τριών κυτταρικών σειρών PDAC , Hs766T, ΜΙΑ PaCa-2 και SU.86.86, να TH-302 μονοθεραπεία τόσο

in vitro

και

in vivo

. Θεραπεία των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν κάτω από ανοξικές συνθήκες με TH-302 δείχνουν ότι MIA κύτταρα PaCa-2 είναι το πιο ευαίσθητο (IC

50 = 2,1 ± 0,7 μmol /L)? SU.86.86 ανταποκρίνεται μέτρια (IC

50 = 12 ± 1,2 μmol /L)? και Hs766T η λιγότερο ευαίσθητη (IC

50 = 60 ± 7,5 μmol /L) [21]. Είναι ενδιαφέρον ότι

in vivo

, τα μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου χρησιμοποιώντας τις ίδιες κυτταρικές σειρές δείχνουν διαφορετικές αποκρίσεις σε Th-302 μονοθεραπεία. Hs766T απάντησε ο πιο ευνοϊκά σε Th-302 αγωγή [22], με πλήρη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, ενώ ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι ήταν μέτρια απόκριση [34] και SU.86.86 όγκοι ανθεκτικοί σε Th-302 μονοθεραπεία [33]. Η διαφορική απόκριση των κυττάρων PDAC

in vitro

και

in vivo

τονίζει τη σημασία της υποξικής κλάσματος εντός ενός όγκου για μέγιστη TH-302 αποτελεσματικότητα

in vivo

, όπως SU .86.86 όγκοι είναι άκρως vascularized και καλά οξυγονωμένο, ενώ Hs766T όγκοι έχουν μεγάλες υποξική κλάσματα [19] και μια μετάλλαξη στο γονίδιο FANCG ομολογία εξαρτώμενη επιδιόρθωσης DNA (HDR), το οποίο τα καθιστά πιο ευαίσθητα στην τελεστή Br-IPM [35].

hydralazine και οι «κλέβουν» επίδραση

Από υδραλαζίνη θεραπεία έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι μειώνει τη ροή αίματος στον όγκο

in vivo

[28], υποθέσαμε ότι η υδραλαζίνη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί να αυξήσει παροδικά το υποξικό κλάσμα σε όγκους και την αύξηση της TH-302 αποτελεσματικότητας. Hydralazine έχει επίσης αποδειχθεί ότι αυξάνει οξέωση όγκου [29], το οποίο μπορεί να είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για τον εντοπισμό όγκων εμφανίζουν δράση «κλέβουν» που θα ήταν περισσότερο αποκρίνεται σε θεραπεία συνδυασμού. Για να ελεγχθεί η υπόθεση μας, ποντικοί που φέρουν υποδόρια SU.86.86, ΜΙΑ PaCa-2 ή Hs766T όγκοι αναισθητοποιούνται και το ρΗ του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροηλεκτρόδιο ρΗ. Για τη μέτρηση των μεταβολών του ρΗ που προκύπτουν από τις μεταβολές της ροής του αίματος, οι ποντικοί χορηγήθηκαν 10 mg /kg υδραλαζίνη μέσω ενδοπεριτοναϊκής (ίρ) ένεση. μετρήσεις του ρΗ όγκου ελήφθησαν κάθε 30 λεπτά μετά την αγωγή υδραλαζίνη για τρεις ώρες. Υποθέσαμε ότι οι όγκοι εμφανίζουν το φαινόμενο «κλέβουν» θα αντιμετωπίσουν την αύξηση της οξύτητας του όγκου μετά από θεραπεία υδραλαζίνη. Οι όγκοι ευαίσθητες Hs766T TH-302 (η = 3) παρουσίασαν καμία αλλαγή στο μέσο ρΗ μετά από θεραπεία με υδραλαζίνη (Εικ. 1). TH-302 νεοπλασιών ανθεκτικών SU.86.86 (n = 7), όμως, βιώνουν μια παράδοξη μικρή αύξηση του ρΗ (0,05 μονάδες pH) μετά από θεραπεία με υδραλαζίνη (Εικ. 1). ΜΙΑ PaCa-2 όγκους (η = 4), τα οποία είναι μετρίως αποκρίνεται σε Th-302, εμφάνισαν με συνέπεια μια πραγματική «κλέψει» αποτέλεσμα μετά από θεραπεία υδραλαζίνη, βιώνει μια σημαντική μείωση του pH (- 0,12 μονάδες pH) σε σχέση με SU.86.86 (

σ

& lt? 0.007) και Hs766T (

σ

& lt?. 0,05) (Σχήμα 1). Αν και υπήρχε ετερογένεια μεταξύ των δειγμάτων όγκου, κάθε δείγμα δοκιμάζεται ανταποκρίθηκαν παρόμοια με τις άλλες όγκους εντός κοόρτεις τους, όπως αποδεικνύεται από την παρατήρηση της ενιαίας μέγιστη ζώο αλλαγή, το μέσο της μέγιστης απόκρισης από κάθε ζώο κατά τη διάρκεια του πειράματος και η μέση μεταβολή στο ρΗ για κάθε μία ζώο για κάθε χρονικό σημείο που μετράται (Εικ. 1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η χορήγηση του υδραλαζίνη οδηγούν σε μειωμένη αιμάτωση σε ΜΙΑ PaCa-2 όγκους, αλλά δεν επηρέασε αιμάτωση είτε Hs766T ή SU.86.86 όγκων.

Ποντίκια που φέρουν υποδόριους SU.86.86 (n = 7), Hs766T (n = 3) ή ΜΙΑ PaCa-2 (n = 4) οι όγκοι πλευρό αναισθητοποιήθηκαν και ελήφθησαν μετρήσεις του ρΗ του όγκου. Ένα ηλεκτρόδιο αναφοράς εισήχθη κάτω από το δέρμα του ποντικού σε μία θέση μη-όγκου, ενώ το ηλεκτρόδιο ρΗ εισήχθη έως 1,3 cm μέσα στο κέντρο του κάθε όγκου. Λήφθηκαν δύο μετρήσεις σε κάθε χρονικό σημείο και ο μέσος όρος. Μετά την αρχική μέτρηση του ρΗ, στους ποντικούς χορηγήθηκε 10 mg /kg υδραλαζίνη μέσω ΙΡ ένεσης. Tumor ρΗ μετρήθηκε για 3 ώρες μετά τη θεραπεία. Τα στοιχεία που καταγράφονται αντιπροσωπεύει τη μέση μέγιστη μεταβολή σε κάθε ομάδα, η μέση μεταβολή του pH για κάθε ομάδα και η μεταβολή του pH ενιαίο μέγιστο των ζώων σε κάθε ομάδα. Τα δεδομένα αναφέρονται ως η μέση μεταβολή του ρΗ ± SEM. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.007

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις επιπτώσεις της υδραλαζίνης σε όγκους που παρουσίασαν το αποτέλεσμα «κλέβουν», που χρησιμοποιείται Doppler υπερήχων για τη μέτρηση της ροής του αίματος όγκου παρακάτω επεξεργασία υδραλαζίνη σε ΜΙΑ PaCa-2 όγκους. Πριν από την υδραλαζίνη θεραπεία εικόνων Doppler χρώμα ελήφθησαν απέναντι ΜΙΑ PaCa-2 όγκους (η = 4) για τον εντοπισμό σημαντικών αγγείωσης του όγκου (Σχ. 2Α, αριστερό πάνελ). Χρησιμοποιώντας ένα παλμικού κύματος (PW) Doppler, ροή του αίματος μέσω των αγγείων του όγκου μετρήθηκε πάνω από 30 λεπτά μετά την υδραλαζίνη ip χορήγηση (Σχ. 2Α, δεξί πάνελ). Παρατηρήσαμε μια μείωση της ροής του αίματος εντός 15 λεπτών από την ένεση υδραλαζίνης (Σχ. 2Α, δεξί πάνελ). Ποσοτικοποίηση των στοιχείων αυτών επιβεβαίωσε τη μείωση της ροής του αίματος του όγκου αρχίζοντας 15 λεπτά μετά την υδραλαζίνη ένεση με μια συνεχή πτώση διαμέσου 30 λεπτά (Σχ. 2Β). Η επίδραση της υδραλαζίνης επί της ροής του αίματος μπορεί να παραμείνουν περισσότερο από 30 λεπτά. Για να διερευνηθεί αυτή η πιθανότητα, η ροή του αίματος σε ΜΙΑ PaCa-2 ορθοτοπική παγκρεατικών όγκων (Ν = 3), ένα μοντέλο όγκου που είναι πιο φυσιολογικώς σχετικό, παρακολουθήθηκαν με Doppler υπερήχων για 180 λεπτά. Η ροή του αίματος μειώνεται σε ελάχιστα επίπεδα από 30 λεπτά, υποστηρίζοντας τις παρατηρήσεις του υποδόριου όγκου, αλλά στις ορθοτοπική όγκους, την αιματική ροή παρέμεινε στο επίπεδο αυτό για 90 λεπτά με ανάκτηση λαμβάνει χώρα μεταξύ 90 και 120 λεπτών. Λόγω των ομοιοτήτων στη ροή του αίματος μεταξύ υποδόριας και ορθοτοπική Mia PaCa-2 όγκων, ήμασταν σίγουροι ότι η παρακολούθηση της οξυγόνωσης του όγκου (70 λεπτά), χρησιμοποιώντας ηλεκτρόδια οξυγόνου στον υποδόριο όγκους (Ν = 5) θα είναι μια ακριβής αναπαράσταση. Παρόμοια με τα δεδομένα ηλεκτροδίου pH, τα επίπεδα οξυγόνου του όγκου μειώθηκε μέσα σε 5 λεπτά μετά την υδραλαζίνη, αλλά δεν επιστρέφουν στην αρχική τους κατάσταση εντός του χρονοδιαγράμματος αυτής της μελέτης. Η ετερογένεια παρατηρήθηκε καθώς ο βαθμός μείωσης οξυγόνου ποικίλει (Σχ. 2D).

Ποντικοί που φέρουν ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι αναλύθηκαν με Doppler υπερήχων για την ποσοτικοποίηση της ροής του αίματος του όγκου. Α)

Αριστερά Panel:

όγκοι σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας έγχρωμη απεικόνιση Doppler για τον εντοπισμό μεγάλων αγγείων του όγκου πριν από τη θεραπεία. Το κόκκινο αντιπροσωπεύει τη ροή του αίματος διαμέσου αγγειακό σύστημα του όγκου. Λευκό βέλος σήματα αγγείωσης που επιλέγεται για ανάλυση.

Δεξιά Panel:

Μετά τη χορήγηση υδραλαζίνη, παλμικού κύματος (PW) Doppler χρησιμοποιείται κάθε 5 λεπτά για 30 λεπτά για να ποσοτικοποιηθεί η ροή του αίματος μέσω των αγγείων του όγκου. Εκπρόσωπος διαγράμματα που δείχνουν μια μείωση της ροής του αίματος όγκου μετά υδραλαζίνη θεραπεία. Β) Ποσοτικοποίηση των μεταβολών της ροής του αίματος όγκου σε ΜΙΑ PaCa-2 υποδόριοι όγκοι (n = 4) μετά από θεραπεία υδραλαζίνη. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση ταχύτητα (mm /sec) ± SEM. Γ) Ποσοτικοποίηση των μεταβολών της ροής του αίματος όγκου σε ΜΙΑ PaCa-2 ορθοτοπική παγκρεατικών όγκων (n = 3) μετά από θεραπεία υδραλαζίνη. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση ταχύτητα (mm /sec) ± SEM. Δ) των όγκων οξυγόνωση μετρήθηκε πριν και μετά την υδραλαζίνη χρησιμοποιώντας OxyLite (οξυγόνο) ηλεκτρόδια βελόνας σε υποδόρια ΜΙΑ PaCa-2 όγκους (Ν = 5). Οι μετρήσεις που συλλέγονται την πάροδο του χρόνου σε μία μόνο θέση εντός του όγκου. Πλήρης πειραματικές λεπτομέρειες μπορούν να βρεθούν στην ενότητα μεθόδους. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ρΟ2 (mmHg). Το βέλος σε t = 10 λεπτά δηλοί Ι.Ρ. ένεση του υδραλαζίνης.

Η

Ιστολογική αξιολόγηση PDAC αγγείωσης

δείγματα όγκων από κάθε κυτταρική σειρά αναλύθηκαν ιστολογικά για να χαρακτηρίσει το αγγειακό σύστημα. CD31 και λείου μυός ακτίνη (SMA) είναι δύο κοινές όγκου αγγείωση ανοσοϊστοχημεία (IHC) δείκτες που προσδιορίζουν την παρουσία (CD31), και η ωριμότητα και τον τόνο (SMA) του αγγειακού συστήματος. Όγκοι με σημαντική αγγείωση που είναι τονική δεν θα αναμενόταν να παρουσιάζουν το φαινόμενο «κλέψει», όπως το αγγειακό σύστημα του όγκου θα διαστέλλονται σε συντονισμό με τις συστημικές επιδράσεις της θεραπείας υδραλαζίνη. Χρησιμοποιώντας θετική ανάλυση pixel, έχουμε ποσοτικά το ποσοστό των Hs766T, SU.86.86 και ΜΙΑ PaCa-2 όγκους που περιείχαν CD31 και χρώση SMA. Συνεπής με τα προηγούμενα αποτελέσματα, SU.86.86 όγκους είχαν σημαντικά περισσότερο CD31 (

ρ

& lt? 0,05) (Εικ. 3Α-Β) χρώση από είτε Hs766T ή ΜΙΑ PaCa-2, και σημαντικά πιο SMA (

ρ

& lt?. 0.005) από ό, τι ΜΙΑ PaCa-2 καρκινικά δείγματα (σχήμα 3Α, C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι SU.86.86 όγκοι είναι καλή αγγείωση με ώριμα αγγεία που θα αναμενόταν να διαστέλλονται σε απόκριση υδραλαζίνη θεραπεία. ΜΙΑ PaCa-2 και Hs766T όγκοι είχαν παρόμοιες ποσότητες χρώσης CD31 (Σχ. 3Α-Β). ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι είχαν το λιγότερο ποσό SMA χρώσης μεταξύ των τριών όγκων που δοκιμάστηκαν (Σχ. 3Α, C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΜΙΑ PaCa-2 αγγειακό σύστημα είναι ανώριμο και ατονική. Όπως ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι εμφανίζονται μειωμένη ροή του όγκου του αίματος (Σχ. 2) και μια επακόλουθη μείωση του ρΗ του όγκου (Εικ. 1), συμπεραίνουμε ότι ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι παρουσιάζουν την επίδραση «κλέβουν» λόγω των ανώριμων αγγείωσης του όγκου.

Hs766T, ΜΙΑ PaCa-2 και SU.86.86 όγκοι σταθερής και ενσωματωμένα σε παραφίνη στο πλαίσιο της προετοιμασίας για τη χρώση IHC για τους δείκτες αγγείωση του όγκου, CD31 και SMA. Α) Εκπρόσωπος εικόνες των όγκων χρωματίστηκαν με CD31 και SMA. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 100 μm. Θετική η ανάλυση pixel της Β) CD31 και Γ) χρώση SMA σε όλη την περιοχή του όγκου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως% θετικότητα [(Θετικό εικονοστοιχεία /σύνολο pixels) × 100] ± SEM. *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.005

Η

Hydralazine βελτιώνει TH-302 δραστηριότητας in vivo

Για να ελέγξετε τη μονοθεραπεία TH-302 και συνδυαστική θεραπεία με υδραλαζίνη για κάθε κελί γραμμή ξενομοσχεύματος, ποντίκια εμφυτεύθηκαν υποδόρια Hs766T, SU.86.86 ή ΜΙΑ PaCa-2 όγκους πλευρά, και ζεύγος αντιστοίχιση σε τέσσερις ομάδες: χωρίς θεραπεία (αλατούχο διάλυμα), TH-302 μόνο (50 mg /kg ΙΡ), υδραλαζίνη μόνο (10 mg /kg ΙΡ) και TH-302 θεραπεία συνδυασμού /υδραλαζίνη. Σε θεραπεία συνδυασμού, TH-302 χορηγήθηκε 30 λεπτά μετά τη χορήγηση υδραλαζίνη, καθώς αυτό φαίνεται να είναι ο χρόνος της μέγιστης επίδρασης επί αιμάτωσης μετά υδραλαζίνη. Όλες οι ομάδες υποβλήθηκαν σε θεραπεία για δύο κύκλους 5 διαδοχικές αγωγές που ακολουθείται από 2 ημέρες μακριά, και οι όγκοι των όγκων παρακολουθήθηκαν με ηλεκτρονικό παχύμετρο κατά τη διάρκεια της μελέτης. Όγκου ελέγχου έντασης από μονοθεραπεία ή θεραπεία συνδυασμού TH-302 θεωρήθηκε χάνονται όταν οι όγκοι έφτασαν τα 1000 mm

3, η οποία περιγράφεται λεπτομερώς στο καμπύλες Kaplan Meier. Όπως αναμενόταν, η ανάπτυξη του όγκου Hs766T αναστάλθηκε πλήρως με μονοθεραπεία TH-302 (Σχ. 4Α-Β), η ανάπτυξη του όγκου SU.86.86 ήταν ανεπηρέαστη από TH-302 μονοθεραπεία (Σχ. 4C-D) και ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι ανταποκρίθηκαν μέτρια έως θεραπεία (Εικ. 4Ε-F). Η συνδυασμένη θεραπεία του υδραλαζίνη ακολουθούμενη από χορήγηση TH-302 δεν είχε καμία ευεργετική επίδραση στον έλεγχο του όγκου του όγκου σε ποντικούς που φέρουν Hs766T ή όγκοι SU.86.86 σε σχέση με ομάδες που έλαβαν θεραπεία με TH-302 μονοθεραπεία. Σημαντικά, κανένα από αυτά τα μοντέλα όγκων εμφάνισε το φαινόμενο «κλέβουν» μετά τη χορήγηση υδραλαζίνη (Εικ. 1). ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι ανταποκρίνονται μέτρια έως TH-302 μονοθεραπεία (Σχ. 4Ε-F) και παρουσίασαν αύξηση σε οξέωση των όγκων λόγω της μειωμένης ροής αίματος όγκου μετά από αγωγή υδραλαζίνη (Εικ. 1). Ποντικοί που φέρουν ΜΙΑ PaCa-2 όγκοι εμφάνισαν μέτρια περαιτέρω μείωση στην ανάπτυξη του όγκου του όγκου όταν θεραπεύτηκαν με TH-302 θεραπεία συνδυασμού /υδραλαζίνη σε σύγκριση με τη μονοθεραπεία TH-302 (Σχ. 4Ε-F). Παρά την τάση για μείωση της ανάπτυξης του όγκου μεταξύ TH-302 θεραπεία συνδυασμού /υδραλαζίνη και μονοθεραπεία TH-302, στατιστικές αναλύσεις των καμπυλών ανάπτυξης δείχνουν ότι οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

σ

& lt? 0,08). Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε δύο ακόμη φορές με παρόμοια αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε όλες τις περιπτώσεις, ΜΙΑ PaCa-2 όγκους που έλαβαν θεραπεία συνδυασμού είχαν μειωμένη ανάπτυξη, αλλά δεν ήταν σημαντικά χαμηλότερη (ρ = 0.08) σε σχέση με εκείνη της ομάδας μονοθεραπείας TH-302. Συνδυάζοντας στοιχεία από όλα τα πειράματα δεν άλλαξε τα επίπεδα σημαντικότητας.

Ποντίκια που φέρει υποδόρια Hs766T (n = 9 ανά ομάδα), SU.86.86 (n = 9 ανά ομάδα) ή ΜΙΑ PaCa-2 (οι αριθμοί αναφέρονται σε παρένθεση για κάθε ομάδα θεραπείας) όγκοι ήταν ζεύγος αντιστοίχιση σε 4 ομάδες: αλατούχο ελέγχου (n = 10), TH-302 μόνο (n = 9), υδραλαζίνη μόνο (n = 7), και TH-302 + υδραλαζίνη (n = 7 ).