Αφηρημένο

Οι κινάσες πρωτεΐνης παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Τα μέρη των αναστολέων της κινάσης έχουν τεθεί σε αγορά και να δείξει πολλά υποσχόμενη κλινικά οφέλη. Εδώ αναφέρουμε την ανακάλυψη ενός νέου μικρού μορίου, καλά ανεκτό, από του στόματος δραστικός αναστολέας της κινάσης, R1498, majorly στόχευση και τις δύο αγγειογόνες και μιτωτική οδοί για τη θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) και γαστρικού καρκίνου (GC). Μια σειρά από βιοχημικές και βασιζόμενες σε κύτταρα ανιχνεύσεις έδειξαν ότι το σύμπλεγμα κινάσης στόχος του R1498 περιλαμβάνονται κινασών Aurora και VEGFR2 et al. R1498 έδειξε μέτρια

in vitro

αναστολής της ανάπτυξης σε ένα πάνελ των καρκινικών κυττάρων με IC50 της σειράς micromole. Η

in vivo

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της R1498 αξιολογήθηκε σε μια ομάδα GC και HCC ξενομοσχευμάτων σε μια παράλληλη σχέση με έναν άλλο sorafenib αναστολέας πολλαπλών κινασών. R1498 είχε ανώτερη αποτελεσματικότητα και την τοξικότητα του προφίλ πάνω sorafenib σε όλα τα μοντέλα της δοκιμής με & gt? 80% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και της υποχώρησης του όγκου σε ορισμένες xenogratfts. Το θεραπευτικό δυναμικό της R1498 τονίστηκε επίσης από την αποτελεσματικότητά του σε τρία ανθρώπινα GC πρωτοπαθούς όγκου που προέρχεται μοντέλα ξένου μοσχεύματος με ρυθμό υποχώρησης του όγκου 10-30%. R1498 αποδείχθηκε ότι αναστέλλει ενεργά την Aurora Μια δραστηριότητα

in vivo

, και να μειώσει την αγγείωση των όγκων. Επιπλέον, R1498 παρουσίασε καλό

in vivo

έκθεση και θεραπευτικό παράθυρο στις μελέτες φάσμα εύρημα φαρμακοκινητική και τη δόση. Διατριβές αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι R1498 είναι ένας ισχυρός, καλά ανεκτή, από του στόματος δραστικός αναστολέας multitarget κινάσης με ένα μοναδικό αντιαγγειογόνο και αντι-πολλαπλασιαστική προφίλ, και να παρέχει ισχυρή εμπιστοσύνη για την περαιτέρω ανάπτυξη για τη θεραπεία HCC και GC

Παράθεση:. Zhang C, Γου Χ, Zhang Μ, Zhu L, Zhao R, Xu D, et al. (2013) μικρό μόριο R1498 ως ένα καλά ανεκτό και από του στόματος δραστικός κινάσης αναστολέα για ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και το γαστρικό θεραπεία του καρκίνου μέσω στόχευσης αγγειογένεση και Μίτωση Pathways. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10.1371 /journal.pone.0065264

Επιμέλεια: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Γαλλία

Ελήφθη: 22 Φεβρουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 23 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Όλοι οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι ή πρώην εργαζομένων της Roche R & amp? D Center (Κίνα), εκτός Taiping Chen. , ο οποίος είναι υπάλληλος της εταιρείας CRO ονομάζεται Crown Bioscience Inc. Πεκίνο, Κίνα. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Οι πρωτεϊνικές κινάσες χρησιμεύουν ως στόχοι για θεραπευτική παρέμβαση σε καρκίνους, το οποίο έχει επικυρωθεί και αποδεικνύεται από η επιτυχημένη και ευρεία εφαρμογή των αναστολέων πρωτεϊνικής κινάσης σε πολλαπλές καρκίνους, είτε ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό σχήματα. Ωστόσο, ως ετερογενής νόσος που προκαλείται από μεταλλάξεις αθροιστικά πολλαπλών γονιδίων μάλλον παρά οδηγείται με ενιαία κινάση μεταλλάκτη, καρκίνοι που κατέχουν καλή ανταπόκριση στη θεραπεία απλού παράγοντα είναι πολύ περιορισμένες. Επιπλέον, η επίκτητη ανθεκτικότητα των όγκων βοηθήσουν τους εαυτούς τους γρήγορα ξεφύγουν από τη χημειοθεραπεία, στη συνέχεια υποτροπιάζουν. Το συγκρότημα ανώμαλης σηματοδότησης σε καρκίνους προσελκύει την ανάπτυξη στρατηγικών που στοχεύουν πολλαπλά βιολογικά μονοπάτια που σχετίζονται με τη βιολογία του όγκου, όπως ο πολλαπλασιασμός, μετάσταση και αντι-απόπτωσης. Μία στρατηγική συνεπάγεται ορθολογική συνδυασμούς φαρμάκων. Για παράδειγμα, ο συνδυασμός του VEGF στοχευμένη μονοκλωνικού αντισώματος με συμβατική χημειοθεραπεία έχει αποδείξει σημαντικό πλεονέκτημα επιβίωσης σε καρκίνους του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα και [1]. Μια άλλη στρατηγική είναι να αναπτύξει τις ενώσεις που καλύπτουν πολλαπλούς μηχανισμούς σε ένα ενιαίο μέσο. Αυτή η προσέγγιση έχει αρκετά δυνητικά πλεονεκτήματα έναντι των στρατηγικών συνδυασμό, συμπεριλαμβανομένου απλότητα της διαδρομής ανάπτυξης, της ταχύτητας στην αγορά, και λιγότερο επικάλυψη των παρενεργειών. Επί του παρόντος, αναστολέας πολλαπλών κινασών sorafenib χρησιμοποιείται ως θεραπεία πρώτης γραμμής για το προχωρημένο και μεταστατικό HCC με τη βελτίωση της διάμεσο χρόνο επιβίωσης από 7,9 μήνες (ομάδα placebo) σε 10,7 μήνες [2]. Ωστόσο, η θεραπεία με sorafenib αποτελέσματα σε στατιστικά σημαντική, αλλά κλινικά ήπια, βελτιώσεις στη συνολική επιβίωση, χρόνος μέχρι την πρόοδο και το ποσοστό ελέγχου της ασθένειας [3]. Εν τω μεταξύ, η παραδοσιακή θεραπεία σισπλατίνη που βασίζεται εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ευρέως σε κλινικές ρυθμίσεις για προηγμένη και μεταστατικών GC. Για HER2 /neu που υπερεκφράζουν γαστρική αδενοκαρκινώματα, trastuzumab σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία παρατείνει τη διάμεση συνολική επιβίωση από 11,1 μήνες (μόνο χημειοθεραπεία) για να 13,8 μήνες [4]. Παρά το γεγονός ότι companioned διαγνωστική μεθοδολογία έχει τεκμηριωθεί σε ασθενείς με στόχο την οθόνη, η τραστουζουμάμπη έχει καμία δραστηριότητα σε ένα μεγάλο υποσύνολο των ασθενών που φέρουν υψηλό επίπεδο HER2 /neu με τον λόγο να εντοπιστούν [5]. Λαμβάνοντας υπόψη την υψηλή θνησιμότητα του HCC και GC και τις τρέχουσες θεραπευτικές αγωγές με περιορισμένο αποτέλεσμα, υπάρχει ακόμα τεράστια ιατρική ανάγκη για τους δύο τύπους καρκίνου.

Η αγγειογένεση θεραπεία του καρκίνου που βασίζεται συμπεριλαμβανομένων των αντι VEGFR-2-αντισώματος, μικρά μόρια έναντι VEGFR -2 σηματοδότηση [6], [7], και VEGFR χιμαιρική πρωτεΐνη [8], έχει αποδειχθεί ότι είναι μια αποτελεσματική στρατηγική για την θεραπεία πολλών τύπων καρκίνου. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα των κινασών αναστολείς sunitinib και sorafenib θα μέρει να αποδοθεί στην σηματοδότηση του VEGF αποκλεισμού [9]. Ωστόσο, ένας αριθμός ασθενών είναι εγγενώς ανθεκτικοί ή αναπτύσσουν αντίσταση σε αντι-αντι-αγγειογόνου θεραπείας μετά από αρκετούς κύκλους θεραπείας [10], [11]. Έτσι, οι κλινικές δοκιμές που συνδυάζουν αναστολείς της αγγειογένεσης και φάρμακα με εναλλακτικό μηχανισμό δράσης αναμένεται να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα ή ξεπεραστεί η αντίσταση στη αντιαγγειογενετικές θεραπεία [12]. Έχει ευρέως αποδεκτό ότι η υπερέκφραση του aurora κινασών σε διάφορους καρκίνους εμπλέκεται στη διαδικασία της ογκογένεσης [13], [14]. αναστολέας κινάσης Aurora VX-680 ήταν σε θέση να αναστέλλουν αποτελεσματικά την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων

in vitro

και

in vivo

, και στη συνέχεια τέθηκε σε κλινικές δοκιμές, που υποδηλώνει ότι οι κινάσες Aurora είναι druggable στόχων [15] .

με βάση τα σωρευτικά αποδεικτικά στοιχεία της αγγειογένεσης και κινασών Aurora στον καρκίνο και θεραπευτική αξία τους αποδεικνύεται από τις βιολογικές και αναστολέων μικρών μορίων, ανακαλύψαμε ένα αναστολέα της κινάσης, R1498, η οποία επηρέασε σημαντικά τα βασικά μονοπάτια της αγγειογένεσης και μίτωσις. R1498 έχει μοναδικό προφίλ αναστολής κινάσης, υψηλής δραστικότητας, και καλές φαρμακοκινητικές και τοξικοκινητικές προφίλ, όλα αυτά υποστηρίζουν την περαιτέρω κλινικής ανάπτυξης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η χρήση και η φροντίδα των πειραματόζωων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά φροντίδα και Χρήση (IACUC), Roche R & amp? D Center (Κίνα). Crown Bioscience, μια εταιρεία παροχής υπηρεσιών CRO δεσμευτεί για την προστασία της ιδιωτικής ζωής των ασθενών και να ακολουθήσει όλες τις ηθικές αρχές για τα παράγωγα ασθενή υλικά, τα οποία συλλέγονται φρέσκα απορρίπτονται ανθρώπινα νεοπλασματικά δείγματα, με IRB (τοπική ισοδύναμο επιτροπή νοσοκομείο) την έγκριση και τις απαιτήσεις συγκατάθεση του ασθενούς. Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC, USA, ή Σαγκάη Ινστιτούτα Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών

Ενώσεις

R1498 (καθαρότητα & gt? 98%). Συντέθηκε από τη Roche R & ? D Center (Κίνα). Για ενζυματικές δοκιμασίες και

in vitro

κυτταρικούς προσδιορισμούς, R1498 διαλύθηκαν σε DMSO ως διάλυμα αποθέματος 0,01 mol /L. Για τις μελέτες σε ζώα, R1498 διαλύθηκε σε 1% Klucel EF /0.1% πολυσορβικό 80 /0.09% μεθυλοπαραμπέν /προπυλοπαραμπέν 0,01% νερό, το διάλυμα παρασκευάζεται σε εβδομαδιαία βάση. Sorafenib συντέθηκε από τη Roche R & amp? D Center (Κίνα) και διαλύθηκε στο Cremophor ΕΕ /αιθανόλη (50:50, Sigma) για να παρασκευαστεί ένα διάλυμα 5 mg /ml απόθεμα, φύλλο τυλιγμένο, και φυλάξτε το σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτό το αποθεματικό διάλυμα παρασκευάστηκε προσφάτως κάθε 3 ημέρες. Τελικές λύσεις δοσολογίας παρασκευάστηκαν την ημέρα της χρήσης με αραίωση του μητρικού διαλύματος με αποστειρωμένο νερό.

τηλέφωνα Γραμμές

Όλες οι κυτταρικές σειρές από την American Τυπικό Συλλογή Center (ATCC) και τράπεζα κυττάρων, Σαγκάη Ινστιτούτα Βιοχημείας και Κυτταρικής βιολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα στο μέσο ανάπτυξης συστήσει από τους πωλητές και υποβάλλεται σε

in vitro

δοκιμασίες μεταξύ των διόδων 8~15 , οι κυτταρικές σειρές για μελέτες σε ζώα ήταν μεταξύ διόδων 5~10. Ανθρώπινα ομφάλια φλεβικά ενδοθηλιακά κυττάρων (HUVEC) ελήφθησαν από Allcells (Emeryville, CA) διατηρήθηκε σε EGM-2 (Lonza, της Allendale, NJ) με συμπληρώματα ενδοθηλιακής κυτταρικής ανάπτυξης και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Κάθε κυτταρική γραμμή σπάρθηκε σε μια πλάκα καλλιέργειας ιστού 96-φρεατίων (Corning, ΝΥ) σε μία προκαθορισμένη πυκνότητα σε 180 μί πλήρες μέσο, ​​η οποία επισυνάπτεται όλη τη νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με την ένωση για ένα άλλο 72 h. Στη συνέχεια, το μέσο απορρίφθηκε και αντικαταστάθηκε με 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) σε πλήρες μέσο, ​​στη συνέχεια, οι πλάκες επωάστηκαν για άλλες 2 ώρες. Η OD

450 μετρήθηκε με SpectraMAX 190 φασματοφωτόμετρο (MDS, Sunnyvale, CA). Μια απορρόφηση φόντο του OD

κενό αφαιρέθηκε από όλα τα φρεάτια. Τότε το ποσοστό αναστολής (IR) προσδιορίστηκε με ακόλουθο τύπο:. IR (%) = (OD

DMSO-OD

ένωση) /OD

DMSO × 100%

Στην επαγόμενη από VEGF δοκιμασία πολλαπλασιασμού HUVEC, τα HUVECs αιωρούνται σε 170 μλ EGM-2 με 0,5% FBS σπάρθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Αφού τα κύτταρα συνδέονται, 10 μL 1 μg /ml ανασυνδυασμένη ανθρώπινη VEGF 165 (R &? Συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μαζί με την ένωση διαλύματα 20 μΐ που παρασκευάστηκε σε EGM-2 με 0,5% FBS. Η δοκιμασία CCK-8 όπως παραπάνω χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων.

Κινάσης Δοκιμασίες

Η συγγένεια των R1498 κατά 402 κινασών προσδιορίστηκε με KINOMEScan® (Ambit Biosciences, San Diego, CA) και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως τιμές σταθερά διαστάσεως (Kd) [16]. Η αναστολή στη δραστικότητα της κινάσης των κινασών Aurora και VEGFR2 χαρακτηρίστηκε περαιτέρω με δοκιμασίες δραστικότητας κινάσης Ζ ‘-Lyte υπό αντίστοιχες συγκεντρώσεις ΑΤΡ.

HUVEC Tube Δοκιμασία Σχηματισμού

δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα HUVEC διεξήχθη όπως αναφερθεί στο παρελθόν [17]. Εν συντομία, Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) αποψύχθηκε στους 4 ° C για 3~4 h. προστέθηκαν 100 μΙ υγρό Matrigel ™ να προ-ψυχθέν 96 φρεατίων πλάκα καλλιέργειας ιστού, και η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C, 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα για 1 ώρα για να στερεοποιηθεί Matrigel ™. Το HUVECs καλλιεργήθηκαν σε EGM-2 με 0,5% FBS όλη τη νύκτα, και εμβολιάστηκαν σε 90 μί EGM-2 με 0,5% FBS σε πυκνότητα 2,2 × 10

5 κύτταρα /ml για την Matrigel ™ επικαλυμμένη πλάκα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την ένωση ή ισοδύναμη ποσότητα DMSO. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C, 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα για 7 ώρες, στη συνέχεια, η μορφολογία των κυττάρων συλλήφθηκε με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (IX71, Όλυμπος, Αμβούργο, Γερμανία).

Western Blot

κυτταρόλυμα παρασκευάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ και ποσοτικοποιήθηκε με την μέθοδο δικιγχονινικού οξέος (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Τριάντα μικρογραμμάρια πρωτεΐνης ανά δείγμα φορτώθηκε σε 4~12% NuPAGE® Novex SDS γέλη (Invitrogen). Η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε από μια συσκευή ξηρής κηλίδωσης iBlot® (Invitrogen) σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά από αποκλεισμό της μη ειδικής πρόσδεσης με TBS /Tween20 (0,1%) (TBS /T) που περιείχε 5% γάλα χωρίς λιπαρά για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, η μεμβράνη επωάστηκε σε φωσφο-Aurora Α (Thr288) (C39D8) μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού ( Cell Signaling Technology, CST # 3079, Beverly, ΜΑ) ή φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser10) κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα (CST # 9701) (1:1000 εντός TBS /T που περιέχει 3% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA), και ήπια ανακινήθηκε σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Η μεμβράνη πλύθηκε με TBS /T τρεις φορές για να απομακρυνθεί το μη δεσμευμένο αντίσωμα, στη συνέχεια επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα (HRP-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG ή αίγας αντι-κουνελιού IgG, 1:10000, KangChen Biotech, Σαγκάη, Κίνα) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, αντίστοιχα. οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με ένα κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Pierce, Rockford, IL).

ανοσοφθορισμού

κύτταρα εμβολιάζονται σε θάλαμο πλάκες μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με 0,15% Triton-X100 σε TBS και αποκλείστηκε σε 3% BSA σε TBS /T. Τα πρωτογενή αντισώματα (φωσφο-Aurora Α (Thr288) (CST # 3097), φωσφο -Histone Η3 (Ser10) (CST # 9701) και MPM2 (αντι-φωσφο-Ser /Thr-Pro) Millipore # 05-368) επωάστηκαν με διαφάνειες σε ένα υγρό θάλαμο στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα δευτερεύοντα αντισώματα Alexa Fluor® 488 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (H + L) ή Alexa Fluor® 594 κατσίκας αντι-ποντικού IgG (H + L) (Invitrogen) εφαρμόστηκαν αντίστοιχα, για μία ώρα μετά τα πλακίδια πλύθηκαν με TBS επιμελώς. Μετά την αφαίρεση των μη δεσμευμένων αντισωμάτων, τα πλακίδια ξηράνθηκαν και τοποθετημένα με μέσο ϋΑΚΟ antifide στερέωσης. Οι εικόνες συλλήφθηκαν με IX71 υπό κατάλληλες φίλτρα διέγερσης και εκπομπής.

Κυτταρομετρία Ροής

περιεχόμενο DNA μετρήθηκε με ένα κυτταρόμετρο FACS-Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) και η κατανομή του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

τουμπουλίνης

in vitro

πολυμερισμός δοκιμασία

In vitro

δοκιμασία πολυμερισμού τουμπουλίνης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18 ]

Ενιαίου Δόση Φαρμακοκινητική (SDPK) Μελέτη

Η χρήση και τη φροντίδα των πειραματόζωων εγκρίθηκε από Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή χρήσης, Roche R & amp?. D Center (Κίνα). Αρσενικοί γυμνοί ποντικοί (σωματικό βάρος: 19 έως 24 g) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη SDPK. Πριν από τη φαρμακοκινητική μελέτη, τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε ομάδες δειγματοληψίας (3 ζώα ανά χρονικό σημείο). Δέκα επιπλέον ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για συλλέγονται κενό πλάσμα για τις καμπύλες βαθμονόμησης. Οι ποντικοί νήστεψαν όλη τη νύχτα πριν από του στόματος χορήγηση.

Δείγματα αίματος συλλέχθηκαν με οπισθο-κογχική παρακέντηση πριν από τη δόση και 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8 και 24 ώρες μετά τη δόση. Τα δείγματα πλάσματος και η σύνθεση της δόσης φυλάχθηκαν στους -20 ° C μέχρι την βιοανάλυση. Το σύστημα συλλογής και ελέγχου των δεδομένων δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας Analyst 1.4 του λογισμικού από την ΑΒΙ Inc. Οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα κάτω από το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ = 1 ng /mL) ορίζεται ως μηδέν. Η φαρμακοκινητική ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μη διαμερισματικές μονάδες ανάλυσης σε WinNonlin Professional V5.2 (Pharsight, USA) .Η βιοδιαθεσιμότητα υπολογίστηκε ως Ρ (%) = (Δόση

iv × AUC

po (0-∞)) /(Δόση

po × AUC

iv (0-∞)) * 100%. Για αρουραίους, σκύλους και SDPK μαϊμού, τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν από σφαγίτιδα φλέβα παρακέντηση.

Ξενομοσχεύματος Αποτελεσματικότητα Μελέτη με γραμμές κυττάρων και των ασθενών Προέρχεται όγκοι

Η χρήση και τη φροντίδα των πειραματόζωων εγκρίθηκε από ιδρυματική φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης, Roche R & amp? D Center (Κίνα). Τα κύτταρα όγκου εμβολιάσθηκαν στο δεξί πλευρό του BALB /C

ηυ /ηυ

θηλυκών γυμνών ποντικών (5~6 εβδομάδα, 16~18 g, που λαμβάνεται από σινο-βρετανική SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Shanghai, Κίνα) σε βέλτιστη πυκνότητα με βάση τη μελέτη επικύρωσης in-house μας. Μετά ο όγκος καθορίστηκε και έφθασε 100~150 mm

3, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε δέκα ποντίκια ανά ομάδα και έλαβαν θεραπεία σύμφωνα με το χρονοδιάγραμμα. Η ανάπτυξη του όγκου καταγράφηκε τρεις φορές την εβδομάδα με τη μέτρηση του μήκους (L) και το πλάτος (W) με παχύμετρο, και υπολογίζεται ως όγκος του όγκου (TV, mm

3) = 0,5 * L * W * W (mm) . Η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου υπολογίστηκε ως TGI% = (1- (μέσος όγκος του όγκου της ομάδας αγωγής κατά την πρώτη ημέρα-μέσο όγκο του όγκου της ομάδας αγωγής στο τέλος ημέρες) /(μέσος όγκος όγκου της ομάδας ελέγχου στην πρώτη ημέρα-μέσος όγκος όγκου της ομάδας ελέγχου στο τέλος ημέρα)) × 100%. Η υποχώρηση του όγκου των μεμονωμένων ποντικών ορίσθηκε -. Ο όγκος του όγκου στο τέλος ήταν μικρότερος από τον όγκο του όγκου κατά την έναρξη της θεραπείας

Σε ανθρώπινα μοντέλα πρωτογενούς όγκου, φρέσκο ​​ανθρώπινο γαστρικό ιστούς όγκων ήταν άμεσα εμφυτεύθηκαν σε μη παχύσαρκους διαβητικά και σοβαρή συνδυασμένη ανοσολογική ανεπάρκεια (NOD-SCID) μέσα σε 5 ώρες μετά τη χειρουργική επέμβαση με 5 mm

3 τεμάχια για τη δημιουργία μοντέλων πρωτογενούς ξενομοσχεύματος όγκου. Κάθε μοντέλο όγκου επιβεβαιώθηκε από τουλάχιστον τρεις σειριακές

in vivo

περάσματα για να αποδείξει τη σταθερότητα μεταμόσχευση. Όγκοι από διόδους 4-7 υποδορίως εμβολιάσθηκαν με τροκάρ μέσα δεξιά πλευρές του BALB /C ηυ /ηυ θηλυκών γυμνών ποντικών (5~6 εβδομάδα, 16~18 g). Η θεραπεία ξεκίνησε όταν ο όγκος του όγκου έφθασε 100~150 mm

3. Το πρωτόκολλο μέτρησης του όγκου και της λειτουργίας ήταν η ίδια όπως κυτταρική γραμμή που προέρχεται μοντέλο όγκου.

Η ανοσοϊστοχημεία

Οι διαφάνειες ιστού 8 μm τομές παραφίνης του όγκου που παρασκευάζεται από όγκο του

in vivo

αποτελεσματικότητα μελέτες θερμάνθηκαν σε ξηρό κλίβανο στους 60 ° C για 1 ώρα, στη συνέχεια απαλλάχθηκαν από την παραφίνη και υδρολύεται από την Leica Autostainer XL ST5010 σε θερμοκρασία δωματίου. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη στους 95~99 ° C σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού (0.01 Μ, ρΗ 6.0) θερμαίνεται από ένα ιατρικό μικροκυμάτων στους 92-98 ° C για 5 λεπτά, στη συνέχεια ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, το αντιδραστήριο υπεροξειδάσης-αποκλειστές (DAKO, DK-2600, Glostrup Δανία) εφαρμόστηκε για τη σβέση της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Οι πλάκες επωάστηκαν σε αποκλεισμό ορό για 20 λεπτά, στη συνέχεια καλύπτονται από 100 μL φωσφο-Aurora Α (Thr288) (C39D8) mAb κουνελιού (CST # 3079, 1:200 εντός TBS /T) ή κουνέλι αντι-ανθρώπινο πολυκλωνικό αντίσωμα CD31 ( Santa Cruz Biotech, sc-8306, Santa Cruz, CA, USA? 1:200 εντός TBS /T) στους 4 ° C όλη τη νύκτα, στη συνέχεια επωάζονται σε 100 μι ϋΑΚΟ Envision + /HRP, κουνέλι /ποντικό αφού πλυθεί καλά με TBS. Εκατό μικρολίτρα του υποστρώματος-χρωμογόνου διαλύματος (DAB) εφαρμόστηκαν στις πλάκες και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Οι πλάκες ξεπλύθηκαν απαλά με νερό της βρύσης για 15 λεπτά. Αντίχρωση και αφυδάτωση πραγματοποιήθηκε με XL ST5010 σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι πλάκες τοποθετούνται με μέσο στερέωσης Permount (Fisher Scientific, Miami, FL).

Δόση Σειρά ενημέρωσης και μελέτης Τοξικοκινητικής

Δόση φάσμα εύρημα και τοξικοκινητική μελέτη διεξήχθη σε αρουραίους και Beagle σκυλιά που βασίζονται στο

in vitro

μεταβολίτες αναγνώρισης. Αρουραίοι Wistar (αρσενικοί: 3, θηλυκό 3 σε κάθε ομάδα, από Vital River, Beijing, Κίνα) υποβλήθηκαν σε νηστεία όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια έλαβαν τα είδη ελέγχου ως 0, 6,25, 50 και 100 mg /kg δύο φορές την ημέρα ανά στόματος καθετηριασμό για 14 Ημέρα- συνεχή αγωγή. παρατήρηση κινητικότητας εφαρμόστηκε σε καθημερινή βάση για να βρείτε τη μέγιστη ανεκτική δόση για τα ζώα. Τα ζώα θυσιάστηκαν για d14, και η ακόλουθη παρατήρηση τοξικολογίας διεξήχθησαν συμπεριλαμβανομένων των αλλαγών του σωματικού βάρους, κλινική παρατήρηση, νεκροψία, η χημεία αιματολογίας και ιστοπαθολογία. Την ημέρα 1 και την ημέρα 14, δείγματα αίματος ελήφθησαν μέσω σφαγίτιδα φλέβα παρακέντηση από όλα τα ζώα (εάν ζωντανός, χρησιμοποιώντας σωλήνες EDTA-K2). Τα δείγματα αναμίχθηκαν ήπια και τοποθετήθηκε σε θρυμματισμένο πάγο υγρή μέχρι τη φυγοκέντρηση, η οποία πραγματοποιήθηκε αμέσως. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση για περίπου 15 λεπτά στους 4 ° C 2.700 rpm. Το προκύπτον πλάσμα διαχωρίστηκε, μεταφέρθηκε σε μοναδικά σημασμένα σαφής σωλήνες πολυπροπυλενίου και καταψύχθηκε αμέσως πάνω από στερεό διοξείδιο του άνθρακα (ξηρός πάγος) μέχρι μεταφέρθηκαν σε περίπου -80 ° C. Κάθε ζώο αφαίμαξη στα ακόλουθα χρονικά σημεία: περίπου 5 λεπτά, 15 λεπτά, 30 λεπτά, 1, 2, 4, 8 και 24 ώρες μετά την πρώτη δόση την συγκεκριμένη ημέρα. Οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου στο πλάσμα προσδιορίστηκαν με LC-MS /MS. Η φαρμακοκινητική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό WinNonlin (Version 5.2, Pharsight Corporation, CA, USA), και οι φαρμακοκινητικές παράμετροι υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μη-διαμερισματική μέθοδο μοντέλο.

Beagle σκύλων (περίπου 8-10 μήνες, από Πεκίνο Μάρσαλ Βιοτεχνολογία Co Ltd., Πεκίνο, Κίνα) υποβλήθηκαν στο πρωτόκολλο της μελέτης, όπως περιγράφεται παραπάνω. Κάθε ομάδα έχει ένα αρσενικό και ένα θηλυκό σκυλί, οι δοσολογίες των υπό εξέταση αντικειμένου ήταν: 0, 1, 7,5 και 15 mg /kg, αντίστοιχα. Η χρήση και τη φροντίδα των πειραματόζωων εγκρίθηκε από Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης, Roche R & amp?. D Center (Κίνα)

Ανάλυση Δεδομένων και Στατιστικά

Ανεξάρτητα t test χρησιμοποιήθηκε για συνεχή δεδομένα ανάλυση, και χ2 test εφαρμόστηκε σε κατηγορικά δεδομένα. Τα δεδομένα θεωρούνται σημαντικές όταν οι τιμές ρ ήταν & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

1. Χαρακτηρισμός R1498 ως ένας αναστολέας πολλαπλών κινασών

Pyrazolobenzodiazepine αναλογικό R1498, με ικρίωμα βασίζεται στην σύντηξη ενός βενζοδιαζεπίνης και του δακτυλίου πυραζόλης (Σχήμα 1Α), προηγουμένως ταυτοποιήθηκε ότι είναι ένα ασθενές εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 2 (CDK2) αναστολέα [19]. Αυτό το μόριο έδειξε την φύση ενός αναστολέας πολλαπλών κινασών όταν αναλύσαμε την βιβλιοθήκη αναστολέα κινάσης. Το προφίλ αναστολής κινάσης του R1498 (1 μΜ) που χαρακτηρίσθηκε μέσω KINOMEScan® σε συγκέντρωση ΑΤΡ γύρω από την Km του κάθε κινάσης. Το ποσοστό αναστολής της R1498 είναι πάνω από το 80% έναντι 39 κινασών από 402 κινασών, συμπεριλαμβανομένων των 359 κινάσες άγριου τύπου και 43 μεταλλάγματα κινάσης (Σχήμα S1). Οι σταθερές διάστασης (Kd) 39 κινασών hit κατόπιν προσδιορίστηκαν και τα κινάσες με Kd & lt? 0.2 μΜ δείχνεται στο Σχήμα 1Β. Οι περισσότερες από τις πιθανές επιτυχίες ανήκουν στην τυροσινικής κινάσης (ΤΚ) της οικογένειας και της οικογένειας AGC. Επιπλέον, δοκιμασία Z-Lyte διεξήχθη για περαιτέρω προσδιορισμό της δραστικότητας αναστολής της κινάσης του R1498. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι IC50s του R1498 ήταν 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 ηΜ έναντι VEGFR2, κινάσης Aurora Α και Β, αντίστοιχα (Σχήμα 1 C). Στη συνέχεια, η μελέτη μας εστιάστηκε στην αντι-αγγειογενετική και αντι-μιτωτική μονοπάτια που πλήττονται majorly από R1498

(Α) Χημική δομή του R1498.? (Β) R1498 υποβλήθηκε KINOMEScan® και τα πιο ισχυρά χτυπήματα με Kd & lt? Τα 0,2 μΜ εμφανίζονται? Η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση? (Γ) R1498 δοκιμάστηκε σε προσδιορισμούς κινάσης Z-Lyte συμπεριλαμβανομένων VEGFR2, Aurora Α και Β, η καμπύλη δόσης-απόκρισης φάνηκε και μέσες τιμές IC50 από τρία ανεξάρτητα πειράματα υποδεικνύεται. (Δ) Η

in vitro δραστικότητα

ανάπτυξη κατά του όγκου R498 αναλύθηκε στις 16 κυτταρικές σειρές που περιλαμβάνουν HCC, GC και NPC. Δεδομένα από τριπλούς ανεξάρτητες δοκιμασίες παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση.

Η

Ένα πάνελ των κυτταρικών γραμμών 16 του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του ηπατοκαρκινώματος, γαστρικό καρκίνο και ρινοφαρυγγικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η

σε vitro

αντι-πολλαπλασιασμό ικανότητα του R1498. Οι περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές είναι εγκατεστημένοι από τις ασιατικές καρκίνους, όπως οι ασιατικές διαδεδομένη καρκίνοι είναι η εστίασή μας. Η ηπατοκαρκινώματος και γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή πάνελ ήταν πιο ευαίσθητα στη θεραπεία R1498 από ρινοφαρυγγικό καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η συνολική μέση IC50s ήταν 7,81, 7,55 και 30,07 μΜ, που αντιστοιχούν σε epatocellular καρκίνωμα, γαστρικό καρκίνο, και ρινοφαρυγγικού κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, αντίστοιχα. Η ευαισθησία των κυτταρικών σειρών που προέρχονται από ασιατικές πληθυσμού (BEL-7402, QGY-7701 και QGY-7703) ήταν συγκρίσιμη με την ευαισθησία των Hep3B που ήταν από Καυκάσου (Σχήμα 1D).

2. R1498 Αναστέλλει κινασών Aurora και προκαλεί κυτταρικού κύκλου σύλληψης

Aurora αναστολή της κινάσης από R1498 οπτικοποιήθηκε με ανοσοφθορισμό σε γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή SGC-7901. Άμεσες θέσεις φωσφορυλίωσης φωσφο-κινάσης Aurora Α (T288) και φωσφο-ιστόνης Η3 (S10) χρησιμοποιήθηκαν για να δείξει την δραστηριότητα κινάσης της Aurora Α και Β, αντίστοιχα [20], [21]. Φωσφο-Ser /Thr-Pro Μιτωτικά πρωτεΐνη μονοκλωνικό # 2 (MPM2) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης μιτωτικής (κόκκινο) για κύτταρα μιτωτική επισήμανσης. Α (T288) φωσφορυλίωση κινάσης Aurora εμφανίζεται στην κεντροσώματος μιτωτικών κυττάρων (πράσινο). Αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ MR1498 για 24 ώρες, το Aurora Α T288 πράσινο εστίες σε μιτωτικά κύτταρα έγινε ασθενέστερη ή εξαφανίστηκαν (Εικόνα 2Α, άνω πάνελ), δείχνοντας ότι η δραστηριότητα κινάσης Aurora Α μειώθηκε κατά την αγωγή R1498. Η φωσφορυλίωση ιστόνης Η3 (S10) εντοπίζεται κυρίως στις κεντρομερίδια μιτωτικών κυττάρων. Αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με R1498, η φωσφο-ιστόνης Η3 (S10) μειώθηκε απότομα (πράσινο). Αυτή η παρατήρηση προτείνει ότι η δραστηριότητα της κινάσης Aurora Β μειώθηκε επίσης προς τα κάτω κατά την αγωγή R1498. Τα αποτελέσματα από ανοσοφθορισμού επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η φωσφορυλίωση της φωσφο-κινάσης Aurora Α (T288) και φωσφο-ιστόνης Η3 (S10) μειώθηκε σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε οξεία θεραπεία με R1498.

(Α) SGC-7901 γαστρικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ R1498 για 24 ώρες, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για φωσφο-Aurora Α (T288) (πράσινο), MPM2 (κόκκινο) και DNA (μπλε). MPM2 χρησιμοποιήθηκε για να εντοπίσετε τα μιτωτικά κύτταρα. Φωτεινό πράσινο εστίες επισήμανε από λευκό αιχμές βελών αναφέρεται το υψηλό επίπεδο της φωσφο-Aurora Α (T288) στο κεντρομερίδιο (άνω πάνελ). R1498 αγωγή SGC-7901 γαστρικά καρκινικά κύτταρα όπως παραπάνω χρωματίστηκαν για φωσφο-ιστόνης Η3 (Η10) (πράσινο), MPM2 (κόκκινο) και DNA (μπλε) (κάτω πίνακας). Αντιπροσωπευτικά εικόνες από 2 ανεξάρτητες αναλύσεις φαίνεται. (Β) R1498 αγωγή SGC-7901 κύτταρα ως ανωτέρω υπεβλήθη ανάλυση DNA με κυτταρομετρία ροής μέσω χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Τα ιστογράμματα αναλύθηκαν περαιτέρω με ΜΟϋΡΙΤ 3,0 για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα με περιεχόμενο DNA πάνω από 4Ν (& gt? 4Ν) σημαίνει ανευπλοειδίας που προκαλείται από endoduplication. Τα αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα από 3 ανεξάρτητες δοκιμασίες που φαίνεται. (C) SGC-7901 συγχρονίζεται με νοκοδαζόλη (300 ηΜ) για 12 ώρες υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του R1498, τότε λύθηκαν και υποβλήθηκαν για Western Blot με τα αντίστοιχα αντισώματα. (D)

vitro

δοκιμασία πολυμερισμού τουμπουλίνης Σε έγινε με R1498 και ντοσεταξέλη, και το OD340 μετρήθηκε και καταγράφηκε σε ένα χρονικό διάστημα που παρήλθε τρόπο. Τα αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα από 2 ανεξάρτητες αναλύσεις φαίνεται.

Η

Η αναστολή των κινασών Aurora Α και Β παράγει διαφορετικές φαινοτυπικές αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο. Καταστολή της Aurora Α σύλληψης επάγεται φάση του κυτταρικού κύκλου G2 [22], ενώ η αναστολή κινάσης Aurora σε Β έχει αναφερθεί ότι προκαλεί πολυπλοειδία σε κύτταρα λόγω endoduplication χωρίς την κυτοκίνηση [15]. Αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ R1498, τόσο SGC-7901 (γαστρικό καρκινικό κύτταρο) και BEL-7402 (κυτταρική ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα) έδειξαν G2 /M σύλληψη και συσσώρευση των πολυπλοειδών κύτταρα φάσης. Για BEL-7402, τα κύτταρα διανομή στην G2 /M φάσεων αυξήθηκε από 25,6% σε 57,0%, εν τω μεταξύ, τα κύτταρα με & gt? 4 περιεχόμενο Ν DNA αυξήθηκε από 6,7% σε 17,6%. SGC-7901 ήταν πιο ευαίσθητη, με το G2 /M του πληθυσμού αυξήθηκε από 25,2% σε 75,5%, και πολυπλοειδών κυττάρων αυξήθηκε από 3,1% σε 21,6% (Σχήμα 2C). Μικροσωληνίσκων σταθεροποιητή (για παράδειγμα ταξόλη) και αποσταθεροποιητικού (για παράδειγμα κολχικίνη) θα προκαλέσει G2 /M φάση σύλληψης, καθώς και. Για να καταλάβουμε αν R1498 είναι ένα μικροσωληνίσκων στοχευμένη αντιδραστήριο,

vitro

δοκιμασία πολυμερισμού τουμπουλίνης πραγματοποιήθηκε. Τα δεδομένα έδειξαν ότι R1498 ούτε σταθεροποιηθεί ούτε αποσταθεροποίησε τον πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων ακόμη και κάτω από υψηλή συγκέντρωση R1498 (40 μΜ)

in vitro

(Σχήμα 2D), γεγονός που υποδηλώνει ότι η G2 του κυτταρικού κύκλου /Μ σύλληψης δεν προκλήθηκε από διαταραχές μικροσωληνίσκων κυτταροσκελετού. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι R1498 ανέστειλε την κινασών Aurora Α και Β σε κύτταρα και παρήγαγε τις φαινοτυπικές αλλαγές στα κύτταρα.

3. R1498 ανταγωνίζεται τη αγγειογένεση πρόοδο των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων

Η αγγειογένεση προετοιμαστεί με έκκριση του αγγειογόνου παράγοντα ανάπτυξης από κύτταρα όγκου, και στη συνέχεια, τα ενδοθηλιακά κύτταρα πολλαπλασιάζονται, μεταναστεύουν και σωλήνες μορφή σκάφος στις απαντήσεις προς την διέγερση VEGF. Για να αντιμετωπιστεί η εξειδίκευση του ανταγωνισμού του R1498 ανάπτυξης ενδοθηλιακών κυττάρων που διεγείρεται από VEGF, τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) εκτέθηκαν σε δύο διαφορετικά ερεθίσματα, VEGF και FBS, υπό την θεραπεία του R1498 για 72 ώρες. Κάτω από τις συνθήκες καλλιέργειας που περιέχει VEGF ή FBS, HUVECs έδειξε διαφορετική απάντηση στο R1498. Οι IC50s ήταν 89 και 2064 ηΜ για VEGF και FBS, αντίστοιχα? αυτοί πρότειναν ότι R1498 ανταγωνίστηκε την αύξηση HUVEC οδηγείται από VEGF πιο ισχυρή από ό, τι με FBS (Σχήμα 3Α). Στην δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα HUVEC, μετά από 8 ώρες έκθεσης σε R1498, HUVECs σχηματίζονται λιγότερα άθικτα ματιών σωλήνας από DMSO αγωγή ομάδες (Σχήμα 3Β). R1498 δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των HUVEC υπό αυτόν τον όρο θεραπεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) HUVECs καλλιεργημένα σε 10% FBS, ή 0,5% FBS με VEGF 165 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες R1498 για 72 ώρες, και κατόπιν αναλύθηκαν για τελικό σημείο πολλαπλασιασμό. Οι καμπύλες προσαρμόστηκαν με Graphpad Prism5.0. Οι τρεις ανεξάρτητες δοκιμασίες διεξήχθησαν σε εις τριπλούν και τα IC50 υποδείχθηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση? (Β) HUVECs που καλλιεργούνται επί Matrigel ™ υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 μΜ R1498 ή ισοδύναμο DMSO για 8 ώρες. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από 2 ανεξάρτητες αναλύσεις φαίνεται.

Η

4. R1498 καταστέλλει την ανάπτυξη των ανθρωπίνων ξενομοσχευμάτων καρκίνου

Οι φαρμακοκινητικές ιδιότητες με εφάπαξ δόση R1498 στο προσδιορίστηκαν πολλαπλά είδη. Ο χρόνος ημίσειας ζωής (Τ1 /2) και από του στόματος βιοδιαθεσιμότητα (Προφορική BA%) ευνοεί περαιτέρω την αποτελεσματικότητα μελέτη σε γυμνό ποντίκι (Πίνακας S1) με δύο φορές την ημέρα το χρονοδιάγραμμα καθετήρα από το στόμα. Ένα πάνελ ξενομοσχευμάτων συμπεριλαμβανομένων των Ασιατικών γαστρικό καρκίνο, ηπατοκαρκινώματος και ρινοφαρυγγικού καρκίνου χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση μεταξύ R1498 και ενός άλλου sorafenib αναστολέας πολλαπλών κινασών (Σχήμα 4, Πίνακας S2). Sorafenib έχει εγκριθεί ως θεραπεία πρώτης γραμμής για ηπατοκαρκινώματος [2], και είναι σε κλινική δοκιμή για τη συνδυαστική θεραπεία για προχωρημένο καρκίνο του στομάχου [23]. Η παράλληλη σύγκριση αποτελείτο από αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, υποχώρηση και το σωματικό βάρος του ζώου αλλαγές με τη δοσολογία των 25 mg /kg, δύο φορές την ημέρα από το στόμα. Σε όλες τις ελεγχόμενες ξενομοσχευμάτων, R1498 έδειξε καλύτερο ποσοστό αναστολής της ανάπτυξης του όγκου (TGI%) επί του sorafenib. Για ηπατοκαρκινώματος, η TGI% των R1498 είναι 10-19% περισσότερο από ό, τι TGI% του sorafenib, για τον καρκίνο του στομάχου, του 2-12% πάνω από TGI% του sorafenib. Ο ρυθμός παλινδρόμησης του όγκου ενσωματώθηκε επίσης ως άλλο θεραπευτικό τελικό σημείο. Στο πάνελ ηπατοκαρκινώματος, υποχώρηση του όγκου παρατηρήθηκε σε BEL-7402 μοντέλο, 8/10 (80%) τα ζώα είχαν παλινδρόμησης στην ομάδα R1498, ενώ 1/10 (10%) ζώο είχε παλινδρόμησης στην ομάδα του sorafenib (Σχήμα 4, BEL-7402) . Για γαστρικό πάνελ καρκίνο, MGC-803 και SGC-7901 ξενομοσχευμάτων είχαν το ίδιο ποσοστό οπισθοδρόμηση σε απόκριση στα άρθρα δοκιμής: 5/10 (50%) για R1498, και 2/10 (20%) για sorafenib (Σχήμα 4, SGC -7901? και Πίνακας S2). Με βάση τα τελικά σημεία αποτελεσματικότητας από όλες τις 7 δοκιμασμένα πρότυπα, R1498 έχει καλύτερη αποτελεσματικότητα από sorafenib κάτω από το ίδιο πρόγραμμα θεραπείας. Επιπλέον, R1498 έδειξε καλή αποτελεσματικότητα σε μία ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα ξενομόσχευμα, η TGI% του R1498 (90%, 25 mg /kg, δύο φορές την ημέρα, ανά στοματική σίτιση) ήταν ανώτερο έναντι των τυπικών του προσεχτικά κυκλοφωσφαμίδη (60%, κάθε 10 ημέρες, ενδοπεριτοναϊκή ένεση) (Σχήμα 4, CNE-2). Οι αλλαγές του σωματικού βάρους που καταγράφηκαν σε όλα τα μοντέλα για τη σύγκριση της τοξικότητας έδειξαν ότι το γυμνό ποντίκι έδειξε πιο ανεκτή για R1498 όλη τη διάρκεια της θεραπείας σε BEL-7402, ΓΓΕ-7901 και μοντέλα CNE-2, αν και αύξηση του σωματικού βάρους μειώθηκε ελαφρά σε 10 ημέρες μετά αγωγή (Σχήμα 4, Πίνακας S2).