Abstract

Κυττάρων εισβολή μέσα από ένα πυκνό τρισδιάστατη (3D) μήτρα πιστεύεται ότι εξαρτώνται από την ικανότητα των κυττάρων να παράγουν τις δυνάμεις έλξης. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ρόλου της κυτταρικής έλξεις κατά τη διάρκεια της εισβολής σε 3D, παρουσιάζουμε μια τεχνική για τη μέτρηση της ελαστικής ενέργεια παραμορφώσεως αποθηκεύονται στη μήτρα λόγω των παραμορφώσεων έλξη που προκαλείται. Οι παραμορφώσεις μήτρα γύρω από ένα κύτταρο μετρήθηκαν με παρακολούθηση των 3D θέσεις των φθοριζόντων σφαιριδίων σφιχτά ενσωματωμένα στη μήτρα. Οι θέσεις χάντρα υπηρέτησε ως κόμβοι για ένα πεπερασμένο tessellation στοιχείο. Από το στέλεχος σε κάθε στοιχείο και την γνωστή ελαστικότητα της μήτρας, υπολογίσαμε την τοπική ενέργεια παραμορφώσεως στη μήτρα που περιβάλλει το κύτταρο. Εφαρμόσαμε την τεχνική για τη μέτρηση της ενέργειας παραμόρφωσης των ιδιαίτερα επεμβατική MDA-MB-231 καρκινώματος μαστού και Α-125 κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα σε πηκτώματα κολλαγόνου. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με την ενέργεια που παράγεται από το στέλεχος μη-επεμβατική MCF-7 μαστού και Α-549 κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα κύτταρα συρρικνώθηκε τοπικά την μήτρα. Μεταστατικών κυττάρων του μαστού και καρκινώματος πνεύμονα εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με συσταλτικότητα μη επεμβατική κύτταρα. Υψηλότερες συσταλτικότητα, ωστόσο, δεν ήταν καθολικά συνδέονται με υψηλότερες διεισδυτικότητα. Για παράδειγμα, μη επεμβατική κύτταρα καρκινώματος αιδοίου Α-431 ήταν οι πιο συσταλτική κύτταρα μεταξύ όλων των κυτταρικών σειρών που δοκιμάστηκαν. Ως ένα καθολικό χαρακτηριστικό, ωστόσο, βρήκαμε ότι τα κύτταρα επεμβατική υποτίθεται ένα επίμηκες ατρακτοειδόμορφα μορφολογία σε αντίθεση με ένα πιο σφαιρικό σχήμα του μη-μεταστατικών κυττάρων. Κατά συνέπεια, η κατανομή του στελέχους ενεργειακής πυκνότητας γύρω μεταστατικών κυττάρων ακολουθείται πρότυπα αυξημένη πολυπλοκότητα και ανισοτροπία. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι δεν είναι τόσο το μέγεθος της γενιάς έλξης αλλά κατευθυντικότητα τους είναι σημαντική για τον καρκίνο των κυττάρων εισβολής

Παράθεση:. Koch TM, Münster S, Bonakdar Ν, Butler JP, Fabry Β (2012) 3D έλξης Δυνάμεις σε καρκινικές κυτταρικές εισβολή. PLoS ONE 7 (3): e33476. doi: 10.1371 /journal.pone.0033476

Επιμέλεια: Χάρης Mellor, Πανεπιστήμιο του Μπρίστολ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 7 Ιουλ 2011? Αποδεκτές: 15 Φεβρουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 30, Μάρτη 2012

Copyright: © 2012 Koch et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το ακόλουθο κείμενο: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FA336 /2-1? Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας – Εμβιομηχανική Έρευνας Συνεργασίες ΝΙΗ-BRP: HL65960. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μετανάστευση κυττάρων διαμέσου μιας μήτρας του συνδετικού ιστού είναι ένα σημαντικό μέρος της κανονικής φυσιολογικής λειτουργίας, για παράδειγμα κατά τη διάρκεια της επούλωσης τραύματος, αλλά είναι επίσης ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της ανώμαλης συμπεριφοράς φαίνεται στο καρκινικό κύτταρο εισβολή μέσω του συνδετικού ιστού. Η μετανάστευση κυττάρων σε επίπεδες μήτρες 2D, όπως σε μια κοινή πλαστική δίσκο καλλιέργειας ιστού, έχει περιγραφεί ως μια κυκλική διαδικασία που περιλαμβάνει την πόλωση, σχηματισμός προεξοχή που βρίσκονται στην αιχμή, παραγωγή έλξη από μηχανήματα ACTO-μυοσίνης των κυττάρων, και την οπισθοχώρηση στο οπίσθιο άκρο του κυττάρου [1]. Αδρανειακή και ιξώδη δυνάμεις οπισθέλκουσας είναι αμελητέες, και οι κυτταρικές έλξεις χρειάζονται μόνο για τη διάδοση των κυττάρων και για την υπέρβαση συγκολλητικές δυνάμεις διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη.

Η κυτταρική μετανάστευση μέσα από ένα πυκνό δίκτυο 3D πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας, σε αντίθεση με 2D μετανάστευση, είναι δυνατή μόνο όταν το κύτταρο παράγει επαρκή έλξεις για να ξεπεραστεί η στερεοχημική παρεμπόδιση του περιβάλλοντα χώρου [2]. Η ταχύτητα μετανάστευσης των κυττάρων σε μια μήτρα 3D συσχετίζεται με τις μέγιστες μετατοπίσεις μήτρας, τα οποία είναι ενδεικτικά των δυνάμεων έλξης ότι αυτά τα κύτταρα ασκούν [3]. Τα κύτταρα στα οποία αναστέλλεται ACTO-μυοσίνης συστολή δεν είναι σε θέση να μεταναστεύσει διαμέσου πυκνή 3D μήτρες [4]. Τα ευρήματα αυτά οδηγούν στην υπόθεση ότι τα καρκινικά κύτταρα που παράγουν υψηλής έλξεις είναι πιο επεμβατική από κύτταρα με χαμηλότερο έλξεις. Στη μελέτη αυτή παρουσιάζουμε μία μέθοδο με την οποία μπορούν να ποσοτικοποιηθούν αυτές οι έλξεις, και έχουμε ελέγξει την υπόθεση αυτή σε διαφορετικά επεμβατική κυτταρικές σειρές καρκινώματος.

έλξεις των κυττάρων 2D μπορεί να μετρηθεί με την παρατήρηση των μετατοπίσεων των σφαιριδίων ενσωματωμένων σε μια επίπεδη ευέλικτο υπόστρωμα γέλης κατά την οποία τα κύτταρα καλλιεργούνται. Μαθηματικά, αυτό είναι ένα κακώς θέτει πρόβλημα για το οποίο έχουν αναπτυχθεί επιτυχώς διάφορες προσεγγίσεις [5]. Πρόωρη προσεγγίσεις ανεστραμμένη τη σχέση μεταξύ των μετακινήσεων και έλξεις ενός κυττάρου σε μια ημι-άπειρο ελαστικό halfspace χρησιμοποιώντας νομιμοποίησης [6] ή Fourier [7] μεθόδους. Αυτές οι προσεγγίσεις πρόσφατα εξευγενισμένα να αντιπροσωπεύουν ένα πεπερασμένο πάχος του ελαστικού υποστρώματος [8], [9], [10], για τη βελτίωση της χωρικής ανάλυσης [11], και να περιλαμβάνουν συστατικά έλξη κάθετα προς το υπόστρωμα [12].

Χάντρες μπορεί επίσης να διασπείρεται σε συστήματα κυτταρικής καλλιέργειας 3D για την εκτίμηση κυτταρικής συσταλτικότητας κατά τη μετανάστευση [13], [14]. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, έλξεις 3D κυττάρων και τη χωροταξική κατανομή τους μετρήθηκαν πρόσφατα για πρώτη φορά από την επέκταση των ιδεών της μικροσκοπίας 2D έλξης στην τρίτη διάσταση [15]. Αυτή η νέα μέθοδος είναι τεχνικά και υπολογιστικά εμπλεκόμενους, ωστόσο, και απαιτεί ένα συνθετικό πολυμερές gel με γραμμικές ελαστικές ιδιότητες ως μήτρα 3D. Εδώ παρουσιάζουμε μια μέθοδο για την ποσοτικοποίηση 3D συσταλτικότητα των κυττάρων σε σχεδόν οποιοδήποτε δίκτυο βιοπολυμερές χρησιμοποιώντας ένα τυπικό μικροσκόπιο φθορισμού. Η μέθοδος είναι υπολογιστικά αποδοτική και ισχυρή κατά του θορύβου μέτρησης. Αντί του υπολογισμού της πλήρους 3D χάρτη έλξη του κυττάρου, μετράμε την ενέργεια παραμορφώσεως και κατανομή πυκνότητας της στον 3D εξωκυττάριας μήτρας γύρω απομονωμένα κύτταρα. Η μέθοδος αυτή δίνει ένα βαθμωτό μέτρο για τη συνολική κυτταρική συσταλτικότητα. Ο πηγαίος κώδικας όλων των απαραίτητων προγραμμάτων για την εκτέλεση των μετρήσεων που προβλέπονται για τη Στήριξη S1 Πληροφορίες αρχείου.

Έχουμε χρησιμοποιήσει αυτή τη μέθοδο για να συγκριθεί η συσταλτικότητα των πολλών καρκινικών κυτταρικών σειρών με διαφορετικές ικανότητες για να εισβάλει ένα πυκνό δίκτυο κολλαγόνου. Δείχνουμε ότι η υψηλή συσταλτικότητα απαιτείται αλλά δεν επαρκεί για την εισβολή μέσα από ένα πυκνό δίκτυο 3D? ορισμένοι μη επεμβατική τα καρκινικά κύτταρα μπορούν επίσης να δημιουργήσουν υψηλής συσταλτικές δυνάμεις, αλλά δεν έχουν την ικανότητα να κατευθύνει αυτές τις δυνάμεις τους για να οδηγήσουν τη μετακίνησή τους.

Αποτελέσματα

Μέτρηση του στελέχους της ενέργειας

Για να μετρήσετε η ενέργεια παραμορφώσεως που τα κύτταρα δαπανήσει να παραμορφώνεται τρισδιάστατα περιβάλλον τους, τα κύτταρα είτε ενσωματωμένα εντός μονομερούς κολλαγόνου πριν από τον πολυμερισμό, ή καλλιεργούνται σε μια επιφάνεια πήγματος κολλαγόνου και στη συνέχεια αφέθηκε να εισβάλουν αυθόρμητα εντός της μάζας του κολλαγόνου. Κάτω από αμφότερες τις συνθήκες, τα κύτταρα απλώνονται και εκτείνονται μέσα στην πορώδη δομή του κολλαγόνου και ασκούν δυνάμεις έλξης που παραμορφώνουν το πήκτωμα. Η ενέργεια που δαπανάται έτσι αποθηκεύεται ως ελαστική ενέργεια παραμορφώσεως στα πηκτώματα. Με τη μέτρηση της παραμόρφωσης των πηγμάτων κολλαγόνου, είναι δυνατόν να υπολογιστεί η ενέργεια παραμόρφωσης, εάν είναι γνωστές οι ελαστικές μηχανικές ιδιότητες της μήτρας κολλαγόνου.

Οι παραμορφώσεις Gel προσδιορίζεται από τη μέτρηση των θέσεων των σφαιριδίων φθορίζοντα δείκτη που είναι ενσωματωμένα σε όλη την γέλη. Καταγράφουμε οπτικές τομές κάθε 2 μm σε όλο το πάχος (-500 μm) των γελών (Ταινία S1). Χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο διαφορά-με-παρεμβολή, μπορούμε να επιλύσουμε μετατοπίσεις χάντρα με ανάλυση υπο-pixel (Υποστήριξη Πληροφορίες Κείμενο S1). Η ακρίβεια της μέτρησης μετατόπισης για Ø 1 μm χάντρες σε μεγέθυνση 10x είναι 22 nm στο επίπεδο xy και 130 nm μήκος του οπτικού άξονα.

Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιούμε ανασυσταθέν τζελ κολλαγόνου που σχηματίζονται αυθόρμητα κατά τη διάρκεια της αυτο συνοδοί δίκτυα οπτικών ινών κολλαγόνου (Εικ. S1a). Σε συγκέντρωση κολλαγόνου 2,4 mg /ml, τα δίκτυα αυτά σχηματίζουν μια πορώδη δομή με μέσο μέγεθος πόρου 1,3 μm [16]. Σε μια κλίμακα μήκους μεγαλύτερη από 10 μm, η μορφολογία του δικτύου μπορούν να θεωρηθούν ως ομοιογενής και ισότροπα [16]. Η μέση απόσταση μεταξύ των ενσωματωμένων φθορίζοντα σφαιρίδια είναι ~ 24 μm (Σχ. S1b), το οποίο είναι πολύ μεγαλύτερο από το μέγεθος πόρου, έτσι ώστε μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε μια προσέγγιση συνεχές για να περιγράψει τις μηχανικές ιδιότητες του δικτύου κολλαγόνου. Για μια επικύρωση αυτής της προσέγγισης δείτε Υποστήριξη Πληροφοριών Κειμένου S1 (εικ. S8, S9). Οι μετρήσεις με ροόμετρο κώνου-πλάκας αποκάλυψε μια κυρίως ελαστική απόκριση του δικτύου κολλαγόνου (Εικ. S1d). γελών κολλαγόνου παρουσιάζουν επίσης μη γραμμική συμπεριφορά με εξέχοντα στέλεχος ακαμψίας (Σχ. S1c), αλλά για τα στελέχη της έως και 5%, οι ιδιότητες του υλικού μπορεί να προσεγγιστεί από μια γραμμική ελαστική συμπεριφορά με ένα μέτρο διάτμησης

G

του 118 Pa. Παρατηρούμε αυτή την προσέγγιση στη συζήτηση.

το στέλεχος της ενέργειας των κυττάρων σε πηκτώματα κολλαγόνου υπολογίζεται από μετατοπίσεις χάντρα μεταξύ του παραμορφωμένου και μη παραμορφωμένη κατάσταση των γελών. Η μη παραμορφωμένη, δύναμη-ελεύθερη κατάσταση του κολλαγόνου λαμβάνεται με επεξεργασία των κυττάρων με 4 μΜ κυτοχαλασίνη D, που διαταράσσει την κυτταροσκελετού της ακτίνης και καταστέλλει την παραγωγή ισχύος (Ταινία S2). Οι θέσεις χάντρα της μη παραμορφωμένη τζελ που χρησιμοποιείται για tessellating το εξωκυτταρικό μικροπεριβάλλον και να χρησιμεύσει ως ακραίους κόμβους του τετραεδρική πεπερασμένων στοιχείων (Εικ. S3). Οι μετατοπίσεις σφαιρίδιο στη συνέχεια να οδηγήσει σε ένα στέλεχος ενέργειας σε κάθε πεπερασμένο στοιχείο. Το στέλεχος της ενέργειας ενός στοιχείου, να εξομαλύνονται από τον όγκο των στοιχείων, δίνει το στέλεχος ενεργειακή πυκνότητα (Υποστήριξη Πληροφορίες Κείμενο S1).

Αυτή η μέθοδος που απορρέουν του υλικού στέλεχος από tessellation του μετριέται θέσεις είναι ευαίσθητα στο θόρυβο μέτρησης, και θα πρέπει να ληφθεί μέριμνα για να καταστείλει τις εισφορές τους στα αποτελέσματα στέλεχος ενέργειας. Το αποτέλεσμα αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το στέλεχος ενέργειας είναι μια τετραγωνική συνάρτηση του πεδίου μετατόπισης. Ως εκ τούτου, η αναμενόμενη τιμή των εισφορών θόρυβος είναι μη μηδενική, ακόμη και αν ο θόρυβος κυμαίνεται γύρω στο μηδέν. Εσφαλμένη ενέργειες στέλεχος από το θόρυβο μπορεί να αποφευχθεί σε μεγάλο βαθμό από τον εντοπισμό και την εξάλειψη των τετραεδρική στοιχεία που είναι επίπεδη, με την έννοια του επίπεδου σχεδόν εκφυλισμό (Εικ. S4, S5), και αφαιρώντας μια προσδιοριστεί πειραματικά στέλεχος της ενεργειακής βάσης που προκαλείται από τον θόρυβο μετατόπισης σφαιριδίων (Εικ . S6 και δικαιολογητικά στοιχεία κειμένου S1).

Η ενεργειακή πυκνότητα στέλεχος διανέμεται σε πολύπλοκα σχήματα στον όγκο που περιβάλλει το κύτταρο (Σχ. 1). Σε γενικές γραμμές, η πυκνότητα ενέργειας είναι στέλεχος υψηλότερη σε στενή γειτνίαση με το κύτταρο, ιδίως κοντά στους πόλους των κυττάρων, και πέφτει γρήγορα σε αμελητέα επίπεδα σε όλες τις κατευθύνσεις μακριά από το κύτταρο. Η συνολική ενέργεια παραμορφώσεως επιτυγχάνεται με την ενσωμάτωση της πυκνότητας ενέργειας παραμόρφωσης πάνω από ένα μεγάλο όγκο γύρω από το κύτταρο. Η μέθοδος μας περιλαμβάνει την ίδια την ένταση των κυττάρων, αν υποτεθεί ότι έχει ένα μέτρο ελαστικότητας παρόμοια με εκείνη της εξωκυττάριας μήτρας. – παρατηρούμε αυτή την υπόθεση σε Συζήτηση

Το στέλεχος ενεργειακή πυκνότητα γύρω από ένα επίμηκες καρκίνωμα του μαστού MDA-MB-231 κύτταρο ενσωματωμένο ~ 400 μm βαθιά σε ένα πήκτωμα κολλαγόνου. Μια ισοεπιφάνεια του στελέχους της ενέργειας εμφανίζεται με περικοπές αναμένεται να τις συντονίζουν αεροπλάνα όπως υποδεικνύεται από τα διαφανή αεροπλάνα. Η πυκνότητα ενέργειας είναι στέλεχος υψηλότερη σε στενή γειτνίαση με τους πόλους των κυττάρων και αποσυντίθεται ταχέως σε όλες τις κατευθύνσεις μακριά από το κύτταρο. Ενσωμάτωση του στελέχους της ενεργειακής πυκνότητας δίνει τη συνολική ενέργεια παραμόρφωσης και ήταν 3,7 PJ σε αυτό το παράδειγμα. Το μπαρ κλίμακα είναι 50 μm.

Η

ενέργεια παραμόρφωσης των επεμβατικών και μη επεμβατικών κύτταρα καρκινώματος

Για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι τα κύτταρα διηθητικού καρκινώματος παράγουν υψηλότερες έλξεις σε σύγκριση με μη-επεμβατική κύτταρα, μετρήσαμε την ενέργεια παραμόρφωσης 3D μεταστατικών κυττάρων (Α-125 πνεύμονα και MDA-MB-231 κύτταρα καρκινώματος του μαστού), και μη-μεταστατικών κυττάρων (Α-549 πνεύμονα, MCF-7 μαστού και Α-431 κύτταρα καρκινώματος αιδοίου (ATCC -LGC-Promochem, Wesel, Γερμανία)). Η διεισδυτικότητα αυτών των κυτταρικών σειρών προσδιορίστηκε με σπορά των κυττάρων σε ένα παχύ γέλη κολλαγόνου και επιτρέποντάς τους να εισβάλουν στα πηκτώματα. Μετά από τρεις ημέρες, μετρήσαμε τα προφίλ εισβολή ως χωρική κατανομή της πυκνότητας κυττάρων σε διάφορα βάθη γέλη [17]. Τα περισσότερα κύτταρα από τις μη επεμβατικές κυτταρικές σειρές δεν ήταν σε θέση να εισβάλουν στο μεγαλύτερο μέρος του πήγματος κολλαγόνου, και τα λίγα κύτταρα τα οποία είχαν εισβάλει παρέμεινε κοντά στην επιφάνεια (Εικ. 2α). Μεταστατικών κυττάρων, σε αντίθεση, ήταν σε θέση να εισβάλουν βαθιά μέσα στα πηκτώματα

α (σχήμα 2α).:. Εισβολή προφίλ των Α-125 και Α-549 πνεύμονα, MDA-MB-231 και MCF-7 μαστού και Α-431 κύτταρα καρκινώματος αιδοίου. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν επί της επιφάνειας του γελών κολλαγόνου και αφέθηκε να εξαπλωθεί και να εισβάλουν για 3 ημέρες. Το προφίλ εισβολή εναντίον βάθη gel περιγράφει την αθροιστική πιθανότητα της εύρεσης ενός κυττάρου κάτω από ένα συγκεκριμένο βάθος. Διηθητική κύτταρα χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να εισβάλει βαθιά στα πηκτώματα. b: ενέργεια παραμόρφωσης του μη επεμβατική και επεμβατική κύτταρα καρκινώματος. Επεμβατική πνεύμονα (n = 36) και του μαστού (η = 33) των κυττάρων καρκινώματος παράγουν σημαντικά υψηλότερες ενέργειες στέλεχος σε σύγκριση με μη επεμβατικές πνεύμονα (n = 49) και κύτταρα του μαστού (η = 31) καρκίνωμα. Μη επεμβατική κύτταρα καρκινώματος αιδοίου (n = 35), όμως, παράγει την μεγαλύτερη ενέργεια παραμόρφωσης του όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχ. S10). c: ανισοτροπίας του σχήματος των κυττάρων. Μη επεμβατική κύτταρα είναι σημαντικά πιο στρογγυλεμένο σε σύγκριση με επεμβατικές κύτταρα. d: ανισοτροπία του ενεργειακής πυκνότητας στέλεχος είναι σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με επεμβατική μη επεμβατική κύτταρα. Επειδή η ενέργεια και ανισοτροπίας τιμές στέλεχος από διαφορετικά κύτταρα ακολουθούν μια λογαριθμική-κανονική κατανομή (Υποστήριξη Πληροφορίες Κείμενο S1, Σχ. S10, S11, S12), η γεωμετρική μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα γεωμετρική φαίνονται στο Σχ. b-d.

Η

Για μετρήσεις στέλεχος ενέργεια, τα κύτταρα ενσωματώνονται στα πηκτώματα πριν από τον πολυμερισμό, και επιλέχθηκαν απομονωμένα κύτταρα στην κεντρική περιοχή του πήγματος για τις μετρήσεις. Αμφότερες οι επεμβατικές πνεύμονα και καρκινώματος μαστού κύτταρα που δημιουργούνται σημαντικά υψηλότερες έλξεις 3D από μη επεμβατική πνεύμονα και καρκινώματος μαστού κύτταρα, όπως αντανακλάται στο σημαντικά υψηλότερο στέλεχος ενέργεια αυτών των κυττάρων (Σχ. 2β). Υψηλή συσταλτικότητα, ωστόσο, δεν σχετίζονται πάντα με τις κυτταρικές διεισδυτικότητα. Βρήκαμε ότι η μη επεμβατική Α-431 κύτταρα καρκινώματος αιδοίου ήταν εκπληκτικά συσταλτικές (Σχ. 2β). Επιπλέον, κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα επεμβατική ήταν 4 φορές πιο συσταλτικές από επεμβατικές κύτταρα καρκινώματος του μαστού, αλλά ήταν λιγότερο επεμβατική (Εικ. 2α).

σημειωθεί ότι επεμβατική κύτταρα καρκινώματος τόσο από τον πνεύμονα και του στήθους είχαν μια επιμήκη άξονα-όπως μορφολογία, ενώ οι μη επεμβατικές κύτταρα είχαν ένα σχήμα στρογγυλεμένο (Σχ. 3a-e). Εμείς ποσοτικοποιηθεί κυτταρικό σχήμα ανισοτροπία από την αναλογία της μέγιστης προς την ελάχιστη ιδιοτιμές των δεύτερων στιγμές του κυττάρου περιγράμματος. Μία τιμή 1 αντιστοιχεί σε ένα κυκλικό σχήμα, και αυξάνοντας τις τιμές σε πιο επίμηκες σχήμα. Διηθητική κυτταρικές γραμμές έδειξαν μία σημαντικά υψηλότερη σχήμα κύτταρο ανισοτροπία σε σύγκριση με μη επεμβατικές κύτταρα (Σχ 2β.)

a-e:. Μετατόπιση πεδία (προβάλλεται στο επίπεδο ΧΥ, κανονικοποιημένη προς τις μεγαλύτερες μετατοπίσεις) γύρω επεμβατική και μη επεμβατική κύτταρα καρκινώματος. Μη επεμβατική κύτταρα συρρικνωθεί τα τζελ πιο ισοτροπικά. Μεταστατικών κυττάρων παράγουν πεδία εξαιρετικά ανισότροπο μετατόπιση με μεγάλου κυβισμού στους πόλους κύτταρο και μία περιοχή συγκριτικά μικρές μετατοπίσεις κοντά στο κέντρο του κυττάρου. f-j: πεδία 3D μετατόπιση των ίδιων κυττάρων, όπως φαίνεται σε μια-e. k-o: Στέλεχος ενεργειακή πυκνότητα γύρω από τα ίδια κύτταρα όπως δείχνεται στο Α-Ε. Ένα κλειστό ισοεπιφάνεια της πυκνότητας ενέργειας παραμόρφωσης (30% της μέγιστης τιμής) εμφανίζεται με περικοπές αναμένεται να τις συντονίζουν αεροπλάνα. Η πυκνότητα στέλεχος ενέργεια διανέμεται πιο ισοτροπικά γύρω από μη-επεμβατική κύτταρα με σχεδόν σφαιρικό isosurfaces, και διανέμεται πιο ανισότροπα γύρω επεμβατική κύτταρα με πολύπλοκα σχήματα ισοεπιφάνεια.

Η

σχήμα κυψέλης ανισοτροπία συνοδεύεται από μια κατανομή ανισότροπο της κυτταρική έλξεις και στέλεχος της ενέργειας γύρω από το κύτταρο (Σχ. 2γ). Εμείς ποσοτικά το στέλεχος ενέργεια ανισοτροπίας πάλι από την αναλογία της μέγιστης προς την ελάχιστη ιδιοτιμές των δεύτερων στιγμών της πυκνότητας ενέργειας παραμόρφωσης γύρω από ένα κύτταρο. Το στέλεχος ενέργειας διανεμήθηκαν περισσότερα ανισότροπα γύρω επεμβατική κύτταρα ενώ οι μη επεμβατικές κύτταρα προσβλήθηκαν από τη γέλη πάνω ισότροπα προς όλες τις κατευθύνσεις.

Η περαιτέρω κατανόηση του ρόλου της ανισότροπης κατανομής της δύναμης κατά τη διάρκεια των κυττάρων καρκίνωμα εισβολής μπορεί να αποκτηθεί με το συνδυασμό του στελέχους της ενέργειας μετρήσεις πυκνότητας με την εγγραφή time-lapse. Επεμβατική MDA-MB-231 κύτταρα καρκινώματος μαστού προσαρμόσουν συσταλτική τους μέλη (Σχ. 4β) σε συνεννόηση με μετανάστευσή τους μέσω της γέλης. Time-lapse εικόνες από έναν εκπρόσωπο των κυττάρων δείχνουν ότι αλλαγές κατεύθυνσης στην τοπική πυκνότητα ενέργειας παραμόρφωσης προηγούνται της αλλαγής προς την κατεύθυνση της μετανάστευσης (Σχήμα 4g-j? Βλ. Σχ S15, S16 και S17 και Movie S4 για πλήρες σύνολο δεδομένων.). Μια αντίθεση σύνολο στοιχεία δείχνουν μια μέτρηση time-lapse ενός εξαιρετικά συσταλτικής αλλά μη επεμβατική κυττάρων καρκίνωμα του αιδοίου. συσταλτικές συμπεριφορά του κυττάρου (Εικ. 4α) δεν είναι επίσης στατική, αν και οι διακυμάνσεις είναι μικρότερες σε σχέση με επεμβατικές κύτταρα (Σχ. 4β). Είναι σημαντικό, ωστόσο, το κύτταρο δεν είναι σε θέση να δημιουργήσει μια διανομή ανισότροπο των έλξεις και στελέχους της ενέργειας για παρατεταμένες χρονικές περιόδους (Σχήμα 4c-f? Βλ. Σχ S13, S14 και Movie S3 για πλήρες σύνολο δεδομένων.), Και ως εκ τούτου το καθαρό μετακίνηση του κυττάρου είναι αμελητέα (Υποστηρικτικά Πληροφορίες Κείμενο S1)

α:. Χρονική πορεία της συνολικής ενέργειας διάτασης γύρω από ένα κύτταρο μη διηθητικό καρκίνωμα αιδοίου (α-431) σε ένα 3D γέλη κολλαγόνου. Η αναφορά μηδενικής ενέργειας μετρήθηκε μετά κυτοχαλασίνη D-επαγόμενη απελευθέρωση ένταση. Η συνολική στέλεχος ενέργειας κυμαίνεται από περίπου ± 25% γύρω από μια υψηλή μέση τιμή. b: Χρονική πορεία της συνολικής ενέργειας διάτασης γύρω από ένα επεμβατική κύτταρο καρκινώματος του μαστού (MDA-MD-231) σε ένα 3D γέλη κολλαγόνου. Το στέλεχος ενέργειας παρουσιάζει μεγάλες διακυμάνσεις από περίπου ± 50% γύρω από τη μέση. c-j: Χρονοσειρές φωτεινού εικόνες ενός κυττάρου μη διηθητικό καρκίνωμα αιδοίου (Α-431) (C-F) και ένα επεμβατική MDA-MB-231 κυττάρων καρκινώματος μαστού (ζ-ι) σε ένα 3D γέλη κολλαγόνου. Επάλληλα είναι περιγράμματος γραμμές δείχνουν σχετικές μεταβολές στην ενεργειακή πυκνότητα του στελέχους μεταξύ δύο διαδοχικών βαθμίδων χρόνο. Μπλε χρώματα υποδεικνύουν περιοχές όπου ένταση χαλάρωσε μεταξύ διαδοχικών βημάτων τη φορά, και κόκκινο χρώμα υποδεικνύει τις περιοχές όπου είναι αυξημένη ένταση. Το σχήμα των κυττάρων σκιαγραφείται στο λευκό για λόγους σαφήνειας. Σκούρο μπλε βέλη δείχνουν την κατεύθυνση της κίνησης των κυττάρων ανάμεσα στα δύο χρονικά βήματα (βλ. S13, S14, S15, S16, S17 και και Ταινίες S3 και S4 για περισσότερες λεπτομέρειες).

Η

Συζήτηση

Η ενέργεια παραμορφώσεως που τα κύτταρα ασκούν στο περιβάλλον τους είναι μια ισχυρή μέτρο βαθμωτό των κυττάρων έλξεις σε μια βιοπολυμερή μήτρα 3D, όπως μια γέλη κολλαγόνου. Η μέθοδος είναι υπολογιστικά αποδοτική? η ανάλυση των περίπου 10.000 χάντρα μετατοπίσεις μεταξύ δύο διαδοχικών εικόνων στοίβες, μαζί με την αξιολόγηση του προκύπτοντος χάρτη πυκνότητας ενέργειας παραμόρφωσης διαρκεί μόνο λίγα λεπτά σε ένα πρότυπο επιτραπέζιο υπολογιστή. Επιπλέον, η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα σε οποιοδήποτε μικροσκόπιο φθορισμού με ένα μηχανοκίνητο z-εστίασης.

Η μέθοδος βασίζεται σε διάφορες απλοποιώντας υποθέσεις. Πρώτον, έχουμε παραμελήσει την ινώδη δομή του δικτύου της γέλης κολλαγόνου και περιγράφουν ως ένα συνεχές. Οι παραμορφώσεις Gel δειγματοληψία στις θέσεις χάντρα, και το πεδίο στέλεχος μεταξύ των σφαιριδίων υπολογίζεται από μια τρι-γραμμική παρεμβολή. Κατά την κλίμακα μήκους ενός μέσου διαχωρισμού χάντρα 24 μm (Εικ. S1b), η προσέγγιση αυτή είναι μια καλή προσέγγιση, αλλά υποτιμά την πραγματική στέλεχος ενέργειας (Εικ. S7).

Δεύτερον, υποθέτουμε γραμμικές ιδιότητες ελαστικό υλικό και να αγνοήσει το στέλεχος ακαμψίας απάντηση της μήτρας. Αυτό οδηγεί σε υποεκτίμηση της απόλυτης ενέργειας στέλεχος ιδίως για υψηλά συσταλτικές κυττάρων σε εξαιρετικά μη-γραμμική μήτρες. Αυτό δεν είναι ένα εγγενές μειονέκτημα της μεθόδου μας, όμως. Η γραμμική μήτρα δυσκαμψία του κολλαγόνου μπορεί εύκολα να αντικατασταθεί από ένα μη-γραμμικό συστατική μοντέλο για τις πηκτές κολλαγόνου (Υποστηρικτικά Πληροφορίες κειμένου S1). Εναλλακτικά, το γραμμικό καθεστώς του ινώδους δικτύων βιοπολυμερούς μπορεί να επεκταθεί με την προσθήκη μιας υδρογέλης [18].

Τρίτον, οι μηχανικές ιδιότητες του κυττάρου θεωρείται ότι είναι η ίδια με την περιβάλλουσα γέλη κολλαγόνου, και το στέλεχος ενέργεια υπολογίζεται πάνω σε ολόκληρο τον όγκο, δηλαδή του κολλαγόνου που περιβάλλει το κύτταρο και τον όγκο που καταλαμβάνεται από το ίδιο το κύτταρο. Ωστόσο, δεδομένου ότι ο όγκος των κυττάρων είναι μικρό – συνήθως λιγότερο από 3 τετραεδρική στοιχεία – το προκύπτον σφάλμα είναι αμελητέα

Μια εγγενής περιορισμός των προσδιορισμών πρόσφυσης 3D είναι ότι τα κύτταρα μπορεί να υποβαθμίσει τοπικά, συνθέσει, και τη διασύνδεση του εξωκυτταρική μήτρα και. έτσι μεταβάλλει τις μηχανικές ιδιότητες της μήτρας. Για την ελαχιστοποίηση της παγκόσμιας αναδιαμόρφωση μήτρας, αναμίξαμε μόνο ένα μικρό αριθμό κυττάρων με την γέλη πριν από τον πολυμερισμό. Οποιεσδήποτε τοπικές αλλαγές στη μήτρα μηχανικές ιδιότητες μπορούν στη συνέχεια να υποτεθεί ευλόγως να περιορίζεται σε έναν όγκο γύρω από το κύτταρο που είναι μικρή σε σύγκριση με τον τυπικό όγκο gel με υψηλή πίεση πυκνότητες ενέργειας.

Αν και η τεχνική μας δεν μπορεί να δώσει μια λεπτομερή έλξης χάρτης πάνω από την επιφάνεια του κυττάρου, προσφέρει αρκετά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με πρόσφατα ανεπτυγμένες προσεγγίσεις. Η κατανομή του στελέχους ενεργειακής πυκνότητας έχει επιλυθεί με επαρκή χωρική ανάλυση για τη διάκριση περιοχές υψηλής και χαμηλής συσταλτικότητα κατά μήκος του σχήματος του κυττάρου. Μαζί με το πεδίο των μετατοπίσεων, αυτή είναι επαρκείς πληροφορίες σχετικά με 3D κυτταρικής συσταλτικότητας για πολλές βιολογικές ερωτήσεις. Επιπλέον, η κατανομή στέλεχος ενέργειας μπορεί να ενσωματωθεί πάνω από τον όγκο της μήτρας που περιβάλλει το κύτταρο να αποκτήσει μια ενιαία, βαθμωτό και βιολογικά σχετικό μέτρο της κυτταρικής συσταλτικότητας – τη συνολική ενέργεια παραμόρφωσης. Το πιο σημαντικό, η τεχνική μας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση 3D κυτταρικής συσταλτικότητας σε οποιοδήποτε δίκτυο βιοπολυμερούς. Εάν το δίκτυο βιοπολυμερούς είναι μη-γραμμική αλλά μια γραμμική προσέγγιση χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό του στελέχους της ενέργειας, θα υπάρξει αναπόφευκτα κάποια σφάλμα στο στέλεχος πυκνότητες ενέργειας σε εκείνες τις περιοχές όπου το κύτταρο-προκαλούμενη στέλεχος φθάσουν στην μη γραμμική καθεστώς. Ωστόσο, αυτό το σφάλμα δεν είναι εκφυλιστικές με την έννοια ότι αυτό συμβαίνει μόνο μια φορά σε κάθε χωρική θέση ενός στοιχείου και δεν διαδίδονται προς γειτονικών στοιχείων (όπως είναι η περίπτωση με έλξεις που είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε μακρινές μετατοπίσεις και μήτρα μη γραμμικότητες).

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι επεμβατική κύτταρα ασκούν σημαντικές δυνάμεις στο περιβάλλον τους. Η ενέργεια που εξασκείται από το στέλεχος MDA-MB-231 κύτταρα καρκινώματος μαστού σε ένα μαλακό (118 Ρα) 3D γέλη ήταν περίπου 10 φορές υψηλότερες από τις τιμές που έχουν μετρηθεί για κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί δύσκαμπτος (4,8 kPa) πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου [17]. Αυτό είναι εκπληκτικό, όπως πολλούς τύπους κυττάρων γίνονται πιο συσταλτική σχετικά πιο σκληρή μήτρες [19]. Υποθέτουμε ότι η διάσταση της περιβάλλουσας μήτρας μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο για την ικανότητα των κυττάρων να παράγουν έλξεις.

Μεγάλες δυνάμεις συστολής, ωστόσο, δεν είναι επαρκής για την κυτταρική εισβολή. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η μη επεμβατική κύτταρα καρκινώματος είναι σε θέση να παράγει πολύ υψηλές ενέργειες στέλεχος. Για την αποτελεσματική εισβολή κυττάρων, είναι σημαντικό ότι οι κυτταρικές έλξεις χρησιμοποιούνται αποτελεσματικά κατευθύνοντας τους κατά μήκος μιας συγκεκριμένης διαδρομής μετανάστευσης. Σύμφωνα με αυτή την άποψη, βρήκαμε ότι το σχήμα των κυττάρων και η κατανομή της ενεργειακής πυκνότητας στελέχους είναι άκρως ανισότροπο σε επεμβατικές κύτταρα, αλλά σχεδόν ισοτροπική σε μη επεμβατικές κύτταρα. Η σύνδεση μεταξύ ανισότροπο σχήμα του κυττάρου και επεμβατική συμπεριφορά έχει περιγραφεί προηγουμένως στα κύτταρα μετά επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση [20], και έχει υποτεθεί ότι ο μηχανισμός για την αυξημένη διεισδυτικότητα σε αυτά τα κύτταρα είναι μία κατανομή δύναμης ανισοτροπικού [21] και το αποτέλεσμα των χωροχρονικών συντονισμό της προεξοχής, κατάσχεση, γενιά πρόσφυση, και απελευθέρωση [22], [23]. Τα ευρήματα που παρουσιάζονται εδώ υποστηρίζουν την άποψη αυτή και τονίζουν την σημασία του σχήματος ανισοτροπίας και της πολικότητας σε κύτταρα που μεταναστεύουν. Η τεχνική μας προσφέρει ένα εργαλείο για τη μελέτη αυτών των διαδικασιών σε ένα 3D περιβάλλον.

Μέθοδοι

Τρισδιάστατο

δοκιμασία κολλαγόνου

ουρά αρουραίων κολλαγόνο (κολλαγόνο R, Serva, Heidelberg, Γερμανία ) και βόειο κολλαγόνο του δέρματος (κολλαγόνο G, Biochrom, Βερολίνο, Γερμανία) αναμείχθηκαν σε αναλογία 1:01. Στη συνέχεια προστέθηκε 10% κατ ‘όγκο του όξινου ανθρακικού νατρίου (23 mg /ml), πορτοκάλι φθορίζοντα σφαιρίδια latex με 1 μm διάμετρο (FluoSpheres®, Invitrogen, F8820) και 10% κατ’ όγκο 10 × DMEM (Biochrom). Το διάλυμα εξουδετερώθηκε με 1Ν υδροξείδιο του νατρίου. Περίπου 2.000 κύτταρα αναμίχθηκαν σε διάλυμα κολλαγόνου 1,2 ml και προστίθεται σε ένα δίσκο καλλιέργειας 35 mm. Το διάλυμα πολυμερίζεται εις 37 ° C, 95% υγρασία και 5% CO

2 για 1 ώρα. Πολυμερισμένο γελών κολλαγόνου είχε πάχος περίπου 500 μm.

οπτικές τομές

Για την ποσοτικοποίηση 3D παραμόρφωση γέλη, έχουμε επανειλημμένα καταγράφονται σε ίση απόσταση τμήματα οπτικού z (2 μm χώρια) διαμέσου ολόκληρου του πάχους γέλη χρησιμοποιώντας ένα μηχανοκίνητα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (DMI6000B, 20 × στόχο, NA = 0.4, 0.5 × βίντεο ζεύκτη, Leica Microsystems, Γερμανία) εξοπλισμένο με μια κάμερα CCD (ORCA ER, Hamamatsu Photonics, Γερμανία). Το μικροσκόπιο ήταν επιπλέον εφοδιασμένο με παραγγελία στάδιο επώασης για τη διατήρηση των κυττάρων σε 37 ° C, υψηλή υγρασία και

2 5% CO. Η διαδικασία μέτρησης ήταν αυτοματοποιημένη με προσαρμοσμένο λογισμικό. Για να προσδιοριστεί η παραμόρφωση των γελών κολλαγόνου, τουλάχιστον δύο στοίβες εικόνα καταγράφηκαν. Η πρώτη στοίβα εικόνα αντιστοιχεί στην παραμορφωμένη κατάσταση της γέλης. Η δεύτερη στοίβα εικόνα καταγράφηκε μετά από τα κύτταρα σε αγωγή για τουλάχιστον 10 λεπτά με κυτοχαλασίνη D (4 μΜ) για να διαταράξει την κυτταροσκελετού ακτίνης και να ληφθεί η δύναμη-free, μη παραμορφωμένη κατάσταση του πήγματος.

θέσεις 3D χάντρες

Το 3D μετατόπιση του κάθε σφαιριδίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα 3D διαφορά-με-παρεμβολή αλγόριθμο που εφαρμόζεται στις δύο στοίβες εικόνα. Οι θέσεις χάντρα στην πρώτη στοίβα εικόνα προσδιορίζονται με ένα απλό κατώφλι έντασης. Ένα subvolume του 4,5 μm × 4,5 μm × 14.0 μm στη x-, γ και ζ-διεύθυνση ακολούθως αποκόπηκε γύρω από κάθε σφαιρίδιο. Η θέση του ίδιου σφαιριδίου στη δεύτερη στοίβα εικόνα προσδιορίστηκε στη συνέχεια με τη μετατόπιση της subvolume από την πρώτη στοίβα σχέση με το δεύτερο στοίβα μέχρι ελαχιστοποιήθηκαν οι τετραγωνισμένες διαφορές των εντάσεων pixel (Εικ. S2). ακρίβεια υπο-pixel επιτεύχθηκε με τρι-γραμμική παρεμβολή των εντάσεων pixel. Με τη μέθοδο αυτή, οι 3D μετατοπίσεις των σφαιριδίων μπορεί να μετρηθεί με ακρίβεια 22 nm στην x- και y- κατεύθυνση, και 130 nm στην κατεύθυνση Ζ.

Μέτρηση του στελέχους ενέργειας

Για να υπολογίσετε ένα συνεχές πεδίο στέλεχος από τις θέσεις διακριτών σφαιριδίων και μετατοπίσεις τους, χρησιμοποιούμε μια πεπερασμένη προσέγγιση στοιχείο της γέλης όπου οι θέσεις χάντρα χρησιμεύσει ως κόμβους της γραμμικής τετραεδρική στοιχείων. Η πεπερασμένων στοιχείων ελήφθη με Delaunay tessellation. Οι μετατοπίσεις κόμβος στη συνέχεια δόθηκε από τις μετατοπίσεις χάντρα ανάμεσα σε δύο στοίβες εικόνα. Κάθε στοιχείο ανατέθηκε με ισοτροπικό γραμμικές ιδιότητες ελαστικό υλικό (μέτρο διάτμησης 118 Pa, λόγος Poisson του 0,35). Το στέλεχος ενέργεια του κάθε στοιχείου στη συνέχεια υπολογίστηκε ως προϊόν της μήτρας ακαμψίας με τα στοιχεία μετατόπισης (Υποστηρικτικά Πληροφορίες κειμένου S1).

θόρυβος εξάλειψη

Το στέλεχος υπολογισμού της ενέργειας από τα δεδομένα μετατόπιση είναι ευαίσθητος στο θόρυβο της μέτρησης, αλλά έχει μόνο ένα προσθετικό αποτέλεσμα που μπορεί να διορθωθεί σε μεγάλο βαθμό με απλή αφαίρεση. Ο βαθμός στον οποίο επηρεάζεται ένα άτομο τετραεδρικού στοιχείο εξαρτάται από τον όγκο του και το σχήμα του. Όσο μικρότερη είναι η στοιχείο και το πιο επίπεδο σχήμα του, τόσο πιο επιρρεπής είναι να πλαστή ενέργεια παραμορφώσεως αποτελέσματα. Το σχήμα ενός στοιχείου μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με ένα κατάλληλο μέτρο σχήμα. Εδώ χρησιμοποιούμε μια αναλογία όγκου στοιχείου προς το άθροισμα των μηκών κυβικά άκρη του. Κανονικοποιούνται, αυτή η τιμή κυμαίνεται από 0 (που αντιστοιχεί σε μέγιστο βαθμό εκφυλισμένων στοιχεία) έως 1 (της αξίας μιας τακτικής τετράεδρο με όλες τις 6 άκρες ίσου μήκους). Στοιχεία με συντελεστή σχήματος μικρότερο από 0,5 είναι δυσανάλογα ευαίσθητα στο εκτόπισμα του θορύβου και επομένως αποκλείονται από τον υπολογισμό. Τα κενά στον τομέα της πυκνότητας ενέργειας παραμόρφωσης από τα εν λόγω στοιχεία που έλειπαν συμπληρώθηκε από τον κοντινότερο γείτονά παρεμβολή. Το στέλεχος ενέργεια σφάλματος των υπολοίπων στοιχείων μπορεί να υπολογιστεί από τη γνώση των σφαλμάτων μετατόπισης και αφαιρείται από τα αποτελέσματα.

εισβολή των καρκινικών κυττάρων

δοκιμασία

γελών κολλαγόνου παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, αλλά χωρίς η ενσωμάτωση φθοριζόντων σφαιριδίων. 25.000 κύτταρα σπάρθηκαν στην κορυφή του πλέγματος κολλαγόνου και καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες. Σε αυτό το χρονικό διάστημα, οι διαφορές στην ικανότητα εισβολής των κυττάρων ήταν σαφώς ορατή. Μετά στερέωση με διάλυμα γλουταραλδεΰδης 2,5% εντός PBS και Hoechst χρώση 33.342 πυρήνες, ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν και το βάθος εισβολή τους προσδιορίστηκαν σε 50 μη-επικαλυπτόμενα οπτικά πεδία γύρω από το κέντρο των πηκτωμάτων. Η μέτρηση αυτή ήταν αυτοματοποιημένη από custom-made λογισμικό που εντοπίζει τους πυρήνες των κυττάρων σε στοίβες των εικόνων που έχουν εγγραφεί σε 2 μm διάστημα σε όλο το πάχος των πηκτών.

σχήμα κυψέλης ανισοτροπία

Για την ποσοτικοποίηση των κυττάρων σχήμα χρησιμοποιήσαμε μία ανάλυση των δευτερολέπτων στιγμές στο 2D προβολές του κυττάρου. Κάθε κύτταρο περιγράφηκε χειροκίνητα με ένα κλειστό πολύγωνο στην αντίθεση εικόνας φάση κατά την ζ-θέση από τις μεγαλύτερες ευκρίνεια, όπως ορίζεται από ένα μέτρο κλίση Τενενμπάουμ [24]. Το κλειστό πολύγωνο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει μια δυαδική εικόνα του κυττάρου,. Μια μήτρα της δεύτερης στιγμές μπορεί στη συνέχεια να υπολογιστεί ως, όπου τα χ και γ συντεταγμένες pixel με κέντρο στο κέντρο μάζας του. Cellular ανισοτροπία σχήματος ορίζεται από το λόγο της μέγιστης προς ελάχιστη ιδιοτιμή της. Ένα ολοστρόγγυλο κύτταρο θα έχει έτσι μια τιμή ανισοτροπίας της 1, και η αύξηση τιμές υποδηλώνουν ολοένα και ανισότροπα σχήματα όπως επιμήκη άξονα-όπως μορφές.

ανισοτροπίας του στελέχους της ενέργειας

κατανομή πυκνότητας

Για να χαρακτηρίζουν την ανισοτροπία της κατανομής στελέχους ενεργειακή πυκνότητα γύρω από ένα κύτταρο, υπολογίζουμε τις δευτερόλεπτα στιγμές της ενεργειακής πυκνότητας στέλεχος όπως, όπου το Χ-, γ- καιζ-συντεταγμένες επικεντρώνονται στο κέντρο μάζας της πυκνότητας στελέχους ενέργειας. Ο δείκτης ανισοτροπίας της κατανομής πυκνότητας στελέχους ενέργεια στη συνέχεια ορίζεται ως ο λόγος της μέγιστης προς ελάχιστη ιδιοτιμή των δεύτερων στιγμές. Έτσι, μια τέλεια ισοτροπική κατανομή του στελέχους πυκνότητα ενέργειας θα οδηγήσει σε τιμή 1, και αυξάνοντας τις τιμές του δείκτη αυτού είναι ενδεικτικές κατανομές με την αύξηση της ανισοτροπίας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Ιδιότητες τζελ κολλαγόνου. α) το τμήμα Ομοεστιακή μέσω ενός τζελ κολλαγόνου. β) Κατανομή των αποστάσεων χάντρα-χάντρα. γ) Στρες-στέλεχος σχέση του δικτύου κολλαγόνου μετρήθηκε σε ένα ρεόμετρο κώνου-πλάκας κατά τη διάρκεια μιας ράμπας στέλεχος (ταχύτητα: 1% /s). Η συμπεριφορά είναι περίπου γραμμική για στελέχη κάτω από 5%? δ) Απόκριση συχνότητας μετρήθηκε σε ρεόμετρο κώνου-πλάκας. Το πλάτος της ημιτονοειδούς ταλαντώσεων ήταν 5%. Το μέτρο αποθηκεύσεως G ‘είναι 118 Ρα σε μία συχνότητα f του 1 Hz.