Abstract

Η βιταμίνη Ε δ-τοκοτριενόλη έχει δειχθεί να έχει αντικαρκινική δραστικότητα, αλλά ο ακριβής μοριακός μηχανισμός με τον οποίο αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων παραμένει ασαφής. Εδώ, αποδείξαμε ότι δ-τοκοτριενόλη εξασκείται κύτταρα σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παγκρεατικού πόρου του καρκίνου (PDCA) χωρίς να επηρεάζει τη φυσιολογική ανθρώπινη παγκρεατικού πόρου ανάπτυξη επιθηλιακών κυττάρων. Δείξαμε επίσης ότι η δ-τοκοτριενόλη επαγόμενη αναστολή ανάπτυξης σημειώθηκε ταυτόχρονα με G

1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την αύξηση της ρ27

Kip1 πυρηνική συσσώρευση. Αυτό το εύρημα είναι σημαντικό θεωρώντας ότι η απώλεια των πυρηνικών p27

έκφραση Kip1 είναι μια καλά εδραιωμένη δυσμενή προγνωστικό παράγοντα στην PDCA. Επιπλέον, δ-τοκοφερόλη αδρανοποιημένο RAF-ΜΕΚ-ERK σηματοδότησης, ένα μονοπάτι που είναι γνωστό ότι καταστέλλει p27

έκφραση Kip1. Για να προσδιορίσετε αν p27

απαιτείται επαγωγής Kip1 για την αναστολή δ-τοκοφερόλη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού PDCA, είμαστε σταθερά σιγήσει η

CDKN1B

γονίδιο, που κωδικοποιεί την p27

Kip1, στα κύτταρα MIAPaCa-2 PDCA και απέδειξαν ότι p27

Kip1 αποσιώπηση σύλληψη κατέστειλε κύκλου κυττάρων που προκαλείται από δ-τοκοφερόλη. Επιπλέον, δ-τοκοφερόλη που προκαλείται p27

έκφραση Kip1 mRNA, αλλά όχι υποβάθμιση των πρωτεϊνών του. p27

γονιδιακή δραστηριότητα υποκινητή Kip1 προκλήθηκε από δ-τοκοφερόλη μέσω της θέσης πρόσδεσης E2F-1 του υποψηφίου και η δραστηριότητα αυτή μετριάζεται από την εξάντληση E2F-1 χρησιμοποιώντας E2F-1 μικρό παρεμβαλλόμενο RNA. Τέλος, παρατηρήθηκε μείωση του πολλαπλασιασμού, με τη μεσολάβηση Ki67 και p27

Kip1 έκφραση από δ-τοκοφερόλη, επιβεβαιώθηκε

in vivo

σε ένα μοντέλο καρκίνου του παγκρέατος γυμνό ξενομοσχεύματος ποντικού. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν έναν νέο μηχανισμό, που εξαρτώνται από την ρ27

επαγωγή Kip1, με την οποία δ-τοκοφερόλη μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PDCA, παρέχοντας μια νέα λογική για p27

Kip1 ως βιοδείκτη για την αποτελεσματικότητα δ-τοκοφερόλη σε παγκρεατικά πρόληψη του καρκίνου και η θεραπεία

Παράθεση:. Hodul PJ, Dong Υ, Husain Κ, Pimiento JM, Chen J, Zhang A, et al. (2013) Η βιταμίνη Ε δ-Tocotrienol Προκαλεί p27

Kip1-dependent cell-Cycle σύλληψης σε κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος μέσω ενός Ε2Ρ-1-εξαρτώμενου μηχανισμού. PLoS ONE 8 (2): e52526. doi: 10.1371 /journal.pone.0052526

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23, Ιούλη του 2012? Αποδεκτές: 15 Νοέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Hodul et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) Κ12 επιχορήγηση Κλινική Μελετητής στην επιχορήγηση Ογκολογίας (σε PJ Hodul) και από επιχορηγήσεις Moffitt Ίδρυμα (Kurtz Ενέχυρο 09-33412-06-01, GI Cancer Research 09-33412-07- 01, και Steinmann Ίδρυμα Οικογένειας 09-33412-08-05). Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το ΝΙΗ επιχορηγήσεις 1R01 CA-129227-01A1, 5RO1 CA-098473-05, ΝΤΑΒΟΣ 69-15099-99-01 (σε MP Malafa), και Bankhead-Coley 08BR-02. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η μελέτη αυτή περιλαμβάνει την πνευματική ιδιοκτησία στην οποία ονομάζονται Μ Malafa και Σ Sebti ως εφευρετών. Δρχ. Malafa και Sebti και το Κέντρο Καρκίνου Moffitt δικαιούνται να λάβουν έσοδα αδειοδότησης από την εκμετάλλευση της εν λόγω πνευματικής ιδιοκτησίας. Μια αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας Ηνωμένες Πολιτείες κατατέθηκε στις 26 Ιουνίου του 2007, που έχει τον τίτλο «Delta-Tocotrienol Θεραπεία και πρόληψη καρκίνου του παγκρέατος» (OTML αριθμό πινακίου 06A069). Η πνευματική ιδιοκτησία που περιλαμβάνονται στην αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας έχει την άδεια να BioGene Life Science, μια εταιρεία με έδρα τη Σιγκαπούρη. Αυτή η άδεια χρήσης παρέχει δικαιώματα BioGene Life Science στην ανακάλυψη Δρ Malafa του. BioGene Life Science είναι μια πλήρως ελεγχόμενη θυγατρική της Νταβός Life Science. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο θανατηφόρες των καρκίνων στις ΗΠΑ, καταλαμβάνοντας την τέταρτη θέση μεταξύ οι κύριες αιτίες των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο [1]. Παρά τις εξελίξεις θεραπεία, το ποσοστό θνησιμότητας για τους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος έχει συνολικά παρέμεινε αμετάβλητη για δεκαετίες. Οι έρευνες για νέες θεραπείες και παράγοντες προφύλαξης είναι σαφώς δικαιολογημένη.

Οι μελέτες έχουν δείξει ότι η αυξημένη πρόσληψη διαιτητικών φρούτα, λαχανικά και δημητριακά δημητριακά μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο καρκίνου του παγκρέατος [2], [3], [4]. Τοκοτριενόλες, που βρέθηκαν σε σπόρους δημητριακών, να περιλαμβάνει ένα από τα πιο συναρπαστικό ομάδες των βιοδραστικών ενώσεων κατά του όγκου [5]. Τοκοτριενόλες είναι μια ομάδα τεσσάρων (α-, β-, δ-, γ-) ακόρεστη, φυσικώς ενυπάρχουσες ενώσεις της βιταμίνης Ε που όχι μόνο αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό μιας ποικιλίας ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, και ηπατοκυτταρικό [ ,,,0],6], [7], [8], αλλά επίσης να επιδεικνύει χημειοπροληπτική ιδιότητες [9], [10]. Ωστόσο, το πώς εξασθενούν τοκοτριενόλες πολλαπλασιασμός καρκινικών είναι ελάχιστα κατανοητή.

προηγουμένως αποδειχθεί ότι δ-τοκοτριενόλη επιδεικνύει την πλέον ισχυρή αντικαρκινική δραστικότητα μεταξύ των τεσσάρων ισομορφές τοκοτριενόλη σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [11], [12]. Σε μια συνεχιζόμενη φάσης Ι με κλιμάκωση της δόσης κλινική δοκιμή σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, τα προκαταρκτικά ευρήματα αποκάλυψαν ότι δ-τοκοφερόλη δεν είχε καμία εμφανή τοξικότητα σε ποσοστό μέχρι και 3200 mg /ημέρα, η οποία είναι 5 φορές η προβλεπόμενη βιολογικά ενεργό κλινική δόση [13]. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν την υπόσχεση της δ-τοκοφερόλη για παγκρέατος παρέμβαση του καρκίνου. Για να μεταφράσετε την περαιτέρω αυτά τα ευρήματα στην κλινική, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν σχετικές βιοδεικτών δραστηριότητας δ-τοκοφερόλη για την πρόωρη φάση υποθέσεις με γνώμονα τις κλινικές δοκιμές.

Για το σκοπό αυτό, διερευνήσαμε το πώς δ-τοκοφερόλη αναστέλλει τον καρκίνο του παγκρέατος κυτταρική ανάπτυξη και την εξατομίκευση της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης (CDK) αναστολέα ρ27

Kip1 ως μοριακός στόχος της δ-τοκοτριενόλη. ρ27

Kip1 λειτουργεί ως καταστολέας όγκου από την ικανότητά της να μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. p27

Kip1 είναι μια άτυπη ογκοκατασταλτικό λόγω μεταλλάξεις του γονιδίου της είναι εξαιρετικά σπάνια. Παρ ‘όλα αυτά, τα καρκινικά κύτταρα έχουν εξελιχθεί άλλους μηχανισμούς για την αδρανοποίηση p27

Kip1, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης πρωτεολυτική αποδόμηση και τον αποκλεισμό από τον πυρήνα. Στην πραγματικότητα, ρ27

απώλεια Kip1 έχει συσχετιστεί με παγκρεατική εξέλιξη του καρκίνου και φτωχή πρόγνωση [14], [15], [16], [17]. Εδώ, αναφέρουμε για πρώτη φορά ότι η p27

Kip1 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη δ-τοκοφερόλη που προκαλείται G

1 σύλληψης. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η επαγωγή της p27

Kip1 από δ-τοκοφερόλη συμβαίνει σε επίπεδο μεταγραφής που περιλαμβάνει την ενεργοποίηση E2F-1-μεσολάβηση υποκινητή και την επαγωγή του mRNA.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Καθαρίστηκε δ-τοκοφερόλη αρχικά παρέχονται από το Δρ Barry Tan (Hadley, ΜΑ) (90% δ-τοκοφερόλη και 10% γ-τοκοφερόλη? IC

50: 15-20 μΜ) και στη συνέχεια από το Νταβός ζωής Επιστημών (Σιγκαπούρη) (97% δ-τοκοφερόλη? IC

50: 50 μΜ) διαλύεται σε αιθανόλη ως μητρικό διάλυμα και αραιώνεται μέχρι την απαιτούμενη συγκέντρωση με DMEM

Γραμμές κυττάρων και Πολιτισμού

MIAPaCa-2, SW1990, και BxPC-3 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σε ~ 70% συρροή σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. HPDE6 C7, ένα ανθρώπινο παγκρεατικό πόρο επιθηλιακή κυτταρική γραμμή αθανατοποιηθούν με μεταγωγή με Ε6 /Ε7 γονίδια του HPV-16 (γενναιόδωρα από τον Dr. Ming-Sound Tsao, Πανεπιστήμιο του Τορόντο, Οντάριο, Καναδάς [18]), αναπτύχθηκε σε ελεύθερο ορού μέσο ελεύθερο κερατινοκύτταρα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών (ΠΜΑ) έχει σταθερή έκφραση του p27

Kip1 (+ /+) και p27

Kip1 (- /-) δόθηκαν από τον Dr. ενεχυράζων (Moffitt Κέντρο Καρκίνου) [19], [20] και αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS.

επιμόλυνση και Παραγωγή σταθερών κλώνων

MIAPaCa-2 /shRNA ρ27

Kip1 και MIAPaCa-2 /φορέα δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση κυττάρων MIAPaCa-2 με p27

Kip1 shRNA ήδη κλωνοποιήθηκε στον φορέα pSuperiorRetroPuro (OligoEngine, Seattle, WA), ένα είδος δώρο από τον Dr. J. Chen (Moffitt Κέντρο Καρκίνου) [21]. Επελέγησαν Σταθερό πουρομυκίνη-ανθεκτικών κλώνων. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με Metafectene (Biontex Laboratories, Planegg, Γερμανία), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

siRNA Νοκ ντάουν της p27

Kip1 στο MIAPaCa-2 κύτταρα

Pre-σχεδιασμένα, siRNA να αναστολέα CDK 1Β (ρ27

Kip1, # 118714) και μη ειδική siRNA (# 4611) αγοράστηκαν από την Ambion (Austin, ΤΧ). MIAPaCa-2 κύτταρα απλώθηκαν επί μία νύκτα σε πλάκες 12-φρεατίων χωρίς αντιβιοτικό. Παροδική διαμόλυνση των siRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 5 ηΜ ρ27

Kip1 siRNA ή ελέγχουν siRNA αναμίχθηκε με μέσο Opti-ΜΕΜ (Invitrogen) σε ένα συνολικό όγκο 90 μL και συμπλέκεται τότε με 2 μι Oligofectamine και 8 μλ Opti-ΜΕΜ (συνολικός όγκος του συγκρότημα ήταν 100 μL). Πριν από την επιμόλυνση, παλιό μέσο απορρίφθηκε, τα κύτταρα πλύθηκαν με φρέσκο ​​Ορίί-ΜΕΜ, και 400 μι νωπών Opti-ΜΕΜ τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο πριν από την προσθήκη του συμπλόκου ΡΝΑ-Oligofectamine. Μετά από 8 ώρες, 500 μι ϋΜΕΜ που περιέχει 30% FBS και αντιβιοτικά δεν προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάζονται περαιτέρω επί 40 ώρες. Μετά την επιμόλυνση 40 ωρών, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δ-τοκοτριενόλη για άλλες 24 ώρες και συλλέχθηκαν για ανάλυση trypan blue και στύπωμα Western.

Protein Εκχύλιση και Ανάλυση Western Blot

Τα καλλιεργημένα κύτταρα λύθηκαν σε αντιδραστήριο εκχύλισης πρωτεΐνης θηλαστικού (Pierce, Rockford, IL), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αντίσωμα έναντι p27

Kip1 αγοράστηκε από BD Bioscience (San Jose, CA). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε είτε 5% γάλα σε PBS (ρΗ 7.4) που περιέχει 0.1% Tween 20 ή 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) εντός TBS (ρΗ 7.5) που περιέχει 0.1% Tween 20. Phospho-ειδικά αντισώματα επωάστηκαν σε 2% BSA σε TBS (ρΗ 7.5) που περιέχει 0.1% Tween 20? Όλα τα άλλα αντισώματα αραιώθηκαν σε 5% γάλα σε PBS (ρΗ 7.4) που περιέχει 0.1% Tween 20 όλη τη νύκτα στους 4 ° C. δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας (Jackson ImmunoResearch, West Grove, ΡΑ) διαλύθηκαν σε 5% γάλα σε PBS είτε (ρΗ 7.4) που περιέχει 0.1% Tween 20 ή TBS (ρΗ 7.5) που περιέχει 0.1% Tween 20 σε αραίωση 1:1000 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Western blots οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Pierce). Χρησιμοποιήσαμε μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού β-ακτίνης (κατάλογος # 8H10D10) από την Cell Signaling να διασφαλιστεί η ίση πρωτεΐνη φόρτωση και την έκφραση.

Anchorage-ανεξάρτητες δοκιμασίες Ανάπτυξης

Για προσδιορισμούς μαλακού άγαρ ανάπτυξης, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο εις τριπλούν σε τρυβλία καλλιέργειας 12 φρεατίων σε 0.35% άγαρ πάνω από ένα στρώμα άγαρ 0.6%. Διάφορες συγκεντρώσεις δ-τοκοτριενόλη ή όχημα συμπεριλήφθηκαν στο στρώμα άγαρ 0.3% των κυττάρων. Οι καλλιέργειες τροφοδοτήθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με την ένωση ή εβδομαδιαία όχημα μέχρι αποικίες αναπτύχθηκαν σε ένα κατάλληλο μέγεθος για παρατήρηση (-3-4 εβδομάδες). Οι αποικίες φωτογραφήθηκαν μετά από επώαση με 1 mg /mL ΜΤΤ όλη τη νύχτα και μετρήθηκαν. Η ανάπτυξη των αποικιών δ-τοκοτριενόλη επεξεργασμένο συγκρίθηκε με αποικίες υποστεί αγωγή με έκδοχο (έλεγχος). Τρία ξεχωριστά πειράματα διεξήχθησαν.

FACS και Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Εκθετικά αναπτυσσόμενα παγκρεατικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή σε πλάκες 96 φρεατίων και επωάζονται με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του δ-τοκοτριενόλη ή όχημα για 24-72 ώρες. Τα φρεάτια εξετάστηκαν για την ανάπτυξη των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό με τη χρήση της χρωματομετρικής δοκιμασίας ΜΤΤ. IC

50 αποτελέσματα για κάθε κυτταρική σειρά προσδιορίστηκαν για κάθε 24-ωρη χρονικό σημείο. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, παγκρεατικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή σε πλάκες των 100-mm και έπειτα στερήθηκαν ορού για 48 ώρες για να επιτραπεί ο συγχρονισμός. Μετά από 48 ώρες, το μέσο αναρροφήθηκε και προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο με δ-τοκοτριενόλη (IC

50) ή όχημα για 24 ώρες. Επεξεργασμένα μέσο στη συνέχεια συλλέχθηκε, μονοστιβάδες πλύθηκαν με ψυχρό PBS, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σφαιρίδια κυττάρου συλλέχθηκαν. Τα κυτταρικά ιζήματα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή μεθανόλη, και ξαναπλένεται με PBS για να απομακρυνθεί η μεθανόλη. Μετά επαναιώρηση σε 300-500 μλ PBS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με 20 μg /mL RNase και κυτταρικό DNA χρωματίστηκε με ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /mL) με 3-ωρη επώαση σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. διανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων διαλογής σύστημα (FACS) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Ομοεστιακή Μικροσκοπίας Ανάλυση

επεξεργασμένα κύτταρα MiaPaCa-2 (50000) ανά 250 μΐ 20% FBS-PBS προστέθηκαν σε κάθε υποδοχή cytofunnel και περιστράφηκε στις 570 rpm για 5 λεπτά σε υψηλή επιτάχυνση. Τα πλακίδια απομακρύνθηκαν και ξηραίνεται στον αέρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, πλύθηκαν τρεις φορές με 1Χ PBS με ανατάραξη επί 5 λεπτά /πλύση, και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά σε 0.5% Triton Χ-100 για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα αποκλείστηκαν με 2% PBS-BSA (100 μL) για 30 λεπτά, και ρ27

Kip1 αντίσωμα (1 :500) αραίωση παρασκευάστηκε σε 2% BSA εφαρμόστηκε απευθείας. Τα πλακίδια επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε κλειστό υγρό θάλαμο. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με 1Χ PBS με ανατάραξη επί 5 λεπτά /πλύση. Δευτερεύον αντίσωμα (Alexa Fluor 594) σε PBS (1:500) παρασκευάστηκε και προστέθηκε σε σταθεροποιημένα κύτταρα. Τα πλακίδια επωάστηκαν και πάλι για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε κλειστό υγρό θάλαμο και κατόπιν πλύθηκαν τρεις φορές με 1Χ PBS για 5 λεπτά /πλύση. Vectashield (50 μL) με DAPI προστέθηκε, και εφαρμόστηκαν καλυπτρίδες. Μετά από επώαση στους 4 ° C σε συνθήκες σκότους, διαφάνειες εξετάστηκαν κάτω από ένα συνεστιακό μικροσκόπιο.

Κυτοσολικά και πυρηνική πρωτεΐνη Εξόρυξη

Οι πρωτεΐνες εξήχθησαν χρησιμοποιώντας NE-PER Πυρηνικής Φυσικής και σετ αντιδραστηρίων εκχύλισης Cytoplasmic (Pierce ). Επεξεργασμένα κύτταρα MIAPaCa-2 απομονώθηκαν ως 20 μι συσσωρευμένος όγκος κυττάρων (40 mg) σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρου 1.5-mL με 5 λεπτά φυγοκέντρηση στα 500 χ g. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε, τα κυτταρικά ιζήματα ξηράνθηκαν και προστέθηκε περιέχει αναστολείς πρωτεάσης παγωμένο CER-1 (200 μL). Οι σωλήνες στροβιλίζονται έντονα για 15 δευτερόλεπτα και επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, παγωμένο CERII (11 μL) προστέθηκε σε σωλήνες που στροβιλίστηκαν για 5 δευτερόλεπτα και επωάστηκαν σε πάγο για 1 λεπτό, στροβιλίζεται και πάλι για 5 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στα 14.000 χ g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο (εκχύλισμα κυτταρολύματος) μεταφέρθηκε σε φρέσκο ​​προ-ψύξη σωλήνες και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Εμείς επαναιωρήθηκε το αδιάλυτο σφαιρίδιο που περιέχει πυρήνες σε 100 μι παγωμένου NER περιέχει αναστολείς πρωτεάσης. Οι σωλήνες περιδινήθηκαν για 15 δευτερόλεπτα και διατηρήθηκε επί πάγου για 10 λεπτά. Αυτό το στάδιο επαναλήφθηκε τέσσερις φορές (40 λεπτά). Οι σωλήνες υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 14,000 χ g για 10 λεπτά, και το υπερκείμενο (πυρηνικό εκχύλισμα) μεταφέρθηκε σε προ-ψύξη σωλήνες και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C.

Luciferase Assay Reporter

MIAPaCa-2 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο. Κάθε καλά μετασκευάστηκε την επόμενη ημέρα με 2 μg του p27

πλασμίδιο Kip1 λουσιφεράσης (full-length p27

Kip1-1609, διαφορετικές μεταλλάξεις «διαγραφή 5 του p27 ποντικιού

Kip1 υποστηρικτής αναφοράς της λουσιφεράσης, ή pGL- 3 cDNA βάση άδειο φορέα? όλα τα πλασμίδια που παρέχονται από τον Dr. Pledger) μαζί με siRNA E2F-1 ή μη στόχους siRNA (Santa Cruz). Metafectene χρησιμοποιήθηκε ως αντιδραστηρίου επιμόλυνσης, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την αγωγή δ-τοκοτριενόλη (IC

50 50 μΜ). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε με το κιτ σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega). Για την ομαλοποίηση της αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης, 200 ng Renilla reniformis λουσιφεράσης πλασμίδιο έκφρασης (PRL-ΤΚ φορέα, Promega) συμπεριλήφθηκε στην μορφομετατροπή.

RT-PCR Ανάλυση

MIAPaCa-2 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δ-τοκοτριενόλη (IC

50 50 μΜ) ή φορέα (ως ελέγχου) επί 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης 1Χ, και το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας Allprep RNA kit /πρωτεΐνης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen, Valencia, CA). Αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ SuperScript III (Invitrogen). Τα ακόλουθα εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές, αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν για την αντίδραση PCR: για ρ27

Kip1, 5′-TAACCCGGGACTTGGAGAAG και 5′-GCTTCTTGGGCGTCTGCTC να ενισχυθεί ένα 450-bp προϊόν? για ακτίνη, 5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCT και 5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC να ενισχυθεί ένα 353-bp προϊόν. Για την αποφυγή overamplification, ρ27

επίπεδα έκφρασης του mRNA Kip1 προσδιορίστηκαν με RT-PCR σε διαφορετικές κύκλων ενίσχυσης (20, 25, 30, και 40 κύκλοι PCR) και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα σε κύκλο 40 παρουσιάζεται.

Σύνθεση Πρωτεΐνης κυκλοεξαμίδη μπλοκ

Μετά από 12 ώρες θεραπείας δ-τοκοφερόλη (IC

50 50 μΜ), δ-τοκοφερόλη απομακρύνθηκε με ξέπλυμα MIAPaCa -2 κύτταρα τρεις φορές με PBS? κυκλοεξαμίδιο (40 μg /mL) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει την πρωτεϊνική σύνθεση. p27

Kip1 ποσοστό του κύκλου εργασιών εξετάστηκε από κηλίδα Western.

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση Ζώων Εργαστηρίου του National Institutes of Health. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (Application 2805). Δραστηριότητα

Anti-όγκου σε Nude Mouse μοντέλο ξενομοσχεύματος

Χρησιμοποιήσαμε θηλυκών αθυμικών γυμνών (nu /ηυ), 5-6 εβδομάδων (Charles River, Wilmington, ΜΑ), για μελέτες σε ζώα μας. Τα ζώα διατηρούνται σε κλουβιά καθαρά περιορίζεται σε 4 ποντίκια ανά κλουβί. Οι ποντικοί φροντίζονται με άφθονη τροφή και νερό και εξετάζονται σε καθημερινή βάση. Αν οι όγκοι παρενέβαινε με βάδιση, προκάλεσε σημάδια της απώλειας βάρους & gt? 10%, προκάλεσε αναπνευστική δυσχέρεια, ή μεγάλωσε για να & gt?. 2 εκατοστά σε μέγεθος, τα ποντίκια με ευθανασία από την έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του διοξειδίου του άνθρακα

κύτταρα MIAPaCa-2 συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS (1 χ 10

6 κύτταρα /50 μL) και ένας ίσος όγκος Matrigel (BD Biosciences). Δείγματα κυττάρων (100 μΙ) στη συνέχεια εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά. Μόλις οι όγκοι που επιτεύχθηκε μεταξύ 250 και 300 mm

3, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες των 10 και δοσολογήθηκαν από του στόματος καθετηριασμό με 0,1 mL του οχήματος (καθαρισμένο ελαιόλαδο) ή δ-τοκοτριενόλη (100 mg /kg) ημερησίως για 3 εβδομάδες. Οι όγκοι των όγκων προσδιορίζεται δύο φορές την εβδομάδα από τη μέτρηση του μήκους (

l

) και το πλάτος (

w

) και από τον υπολογισμό του όγκου: V = (

l

+

w

) /2 × (

l

×

w

) × 0,5236. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ του ελέγχου και της μεταχείρισης των ζώων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας

t-test

.

Η ανοσοϊστοχημεία Φοιτητών και Slide ποσοτικοποίηση

Οι όγκοι από τα πειράματα ξενομοσχεύματος μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, pH 7,2 . Μετά τη σταθεροποίηση, τα δείγματα ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε μπλοκ παραφίνης. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (ρ27, ρ-ΜΑΡΚ, και Ki-67) αντισώματα που δημιουργούνται κατά των αντίστοιχων αντιγόνων ανθρώπινης προέλευσης σε τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη. Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε σε Ventana BenchMark XT (Tucson, ΑΖ) αυτοματοποιημένη χρώσης slide, χρησιμοποιώντας 4-μm πάχους τομές παραφίνης από κάθε μία από τις αντιπροσωπευτικές τμήματα του όγκου που επιλέγεται. Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και επωάστηκαν με 3% Η

2O

2 για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης. Μετά αντιγόνο αποκάλυψη που χρησιμοποιούν ιδιόκτητη λύση CC1 για 60 λεπτά σε απευθείας σύνδεση (στάνταρ) στους 100 ° C, οι τομές επωάστηκαν με αντισώματα για την p27 (Kip 1, cloneSX53G8) (ιδιόκτητο αραίωση, Cell Marque, Rocklin, CA) και Ki-67 (ιδιόκτητο αραίωση, Ventana, Tucson, AZ). Οι χρόνοι επώασης ήταν 32 λεπτά για το ρ27 και Ki-67, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) (αρ 4376, κυτταρική σηματοδότηση, Danvers, ΜΑ.) Χρησιμοποιήθηκε σε ένα 1: συγκέντρωση 200 σε PSS διαλύτες (Ventana) και επωάστηκαν για 32 λεπτά. Το δευτερεύον αντίσωμα αντι-κουνελιού Ventana χρησιμοποιήθηκε για 20 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια υποβάλλονται σε μπλοκ βιοτίνη χρησιμοποιώντας μία ενδογενή κιτ βιοτίνης Ventana (Ventana). Οι τομές επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα επισημασμένο με βιοτίνη και στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση για 30 λεπτά το καθένα (ϋΑΚΟ Diagnostics). Ένα διάλυμα 3,3′-τετραϋδροχλωρική διαμινοβενζιδένιο (Sigma, St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο ακολουθούμενο από αζίδιο του νατρίου και 20 μί H

20

2 σε 100 ml Tris-HCl (50 μΜ, ρΗ 7,6). Μετά φως επίχρωση με αιματοξυλίνη Harris », οι τομές εξετάστηκαν κάτω από οπτικό μικροσκόπιο.

Αξιολόγηση από τους λεκέδες

Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της p27, π-ΜΑΡΚ, και πρωτεΐνες Ki-67 προσδιορίστηκαν ως το προϊόν του ανοσοχρώση ένταση και τοις εκατό των κυττάρων χρωματίζονται. Αυτά βαθμολογήθηκαν σε μια κλίμακα 0-3, με 3 να είναι μέγιστη. Η ανοσοχρώση ένταση βαθμολογήθηκε με καμία χρώση είναι 0, το φως χρώση ως 1, μέτρια χρώση ως 2, και τα βαρέα χρώση ως 3. Η επί τοις εκατό του κυττάρου βάφτηκαν μετρήθηκε χωρίς ανιχνεύσιμη χρώση ως 0, 1-33% ως 1, 34- 66% ως 2, και 67-100% ως 3. το τελικό αποτέλεσμα IHC ήταν το προϊόν του ποσοστού των κυττάρων που βάφονται βαθμολογία πολλαπλασιάζεται με το σκορ ένταση, επιτρέποντας μία μέγιστη βαθμολογία 9 και μια ελάχιστη βαθμολογία 0.

Στατιστική ανάλυση

δεδομένα, εκφράζονται ως μέσοι ± SEM, αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο t-τεστ ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), όπου ενδείκνυται. Χρησιμοποιήσαμε GraphPad Prism έκδοση 5.04 για τις αναλύσεις μας. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

δ-Tocotrienol Αναστέλλει Anchorage-Dependent την ανάπτυξη και την Ανεξάρτητη κυττάρων και προκαλεί G

1 σύλληψης σε παγκρεατικά κύτταρα καρκίνου

Τα αποτελέσματα του δ-τοκοτριενόλη (1Α) επί της ανάπτυξης κυττάρου σε MIAPaCa-2, BxPC-3, και SW1990 ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εξετάστηκαν με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2- υλ) -2,5-δοκιμασία διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ) τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0-50 μΜ δ-τοκοτριενόλη για 24, 48 και 72 ώρες. Τα αποτελέσματα του δ-τοκοτριενόλη αξιολογήθηκαν επίσης στη μη μετασχηματισμένα ανθρώπινα παγκρεατικού πόρου επιθηλιακή κυτταρική γραμμή HPDE6 C7 για να αποκλειστούν πιθανές κυτταροτοξικά αποτελέσματα του δ-τοκοτριενόλη σε μη νεοπλασματικά κύτταρα. θεραπεία δ-Tocotrienol ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό εξαρτάται από την αγκύρωση τόσο σε χρόνο και τη συγκέντρωση τρόπο που εξαρτάται σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος (Σχήμα 1Β)? Ωστόσο, δεν ανασταλτικά αποτελέσματα σημαντική ανάπτυξη παρατηρήθηκαν σε κύτταρα HPDE6 C7. δ-Tocotrienol θεραπεία επίσης σχηματισμό ανέστειλε σημαντικά αποικία στην MIAPaCa-2 κύτταρα που αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ από 2,5 μΜ (

P

= 0,02) (Εικόνα 1Γ).

Α, Χημική δομές τοκοτριενόλες. Β, δ-τοκοτριενόλη αναστέλλει επιλεκτικά τον πολλαπλασιασμό των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. HPDE6 C7 και τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές MIAPaCa2, BxPC3, και SW1990 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του δ-τοκοτριενόλη ή όχημα και αναλύθηκε με ΜΤΤ σε 24, 48, και 72 ώρες. Τα αποτελέσματα επιδεικνύουν επιλεκτική αναστολή της παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. C, δ-τοκοτριενόλη αναστέλλει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη μετασχηματισμένων MIAPaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα. Αριθμός αποικιών ομαλοποιήθηκε και σε σύγκριση με το όχημα. * Συγκέντρωση στην οποία αρχίζει η στατιστική σημαντικότητα. D, τα αποτελέσματα του δ-τοκοτριενόλη για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Ο καρκίνος του παγκρέατος και κύτταρα HPDE6 C7 επωάστηκαν με την παρουσία δ-τοκοτριενόλη (IC

50) (γκρι) ή όχημα (μαύρο) ως έλεγχο επί 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για τον προσδιορισμό της κατανομής του κυτταρικού κύκλου με ανάλυση FACS μετά από χρώση των κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο. Κάθε ανάλυση αντιπροσωπεύει μέσο ± SD 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. δ-Tocotrienol αναστέλλει G

1-προς-S εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου εκλεκτικά σε μετασχηματισμένα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές.

Η

δ-Tocotrienol αγωγή είχε επίσης σημαντικό επιλεκτική επίδραση στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, όπως καταδεικνύεται από την αύξηση του ποσοστού των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα αλλά όχι τα κύτταρα HPDE6 C7 στο G

1 φάση (

P

& lt? 0,001 vs.

P

= 0,92) (Σχήμα 1D ). Βρήκαμε ότι τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα συσσωρεύονται στο G

1 φάση σε βάρος της μείωσης του πληθυσμού S-φάσης.

δ-Tocotrienol Προκαλεί ρ27

Kip1 Έκφραση και αναστέλλει RAS-ΜΕΚ -ERK σηματοδοσίας

κανονισμός του ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης, είναι κεντρικής σημασίας για την ικανότητα των ογκογονιδίων για την προώθηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Δύο μεγάλες πορείες συμμετέχει άμεσα στο G

1-προς-S τραβέρσα είναι τα RAS-ενεργοποιημένα RAF-ΜΕΚ-ERK και PI3-ΑΚΤ μονοπάτια. Αυτά τα μονοπάτια επηρεάσει την έκφραση, τη δραστηριότητα, ή υποκυτταρική εντόπιση των βασικών συστατικών της μηχανής του κυτταρικού κύκλου όπως κυκλίνες, CDKs, και αναστολείς CDK, που οδηγεί στην κατάλληλη ενεργοποίηση των παραγόντων E2F-1 μεταγραφή. Αρκετοί παράγοντες έχουν περιγραφεί οι οποίοι ρυθμίζουν την G

1 τραβέρσα και μετάβαση στον S-φάση σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, και ρ27

Kip1 έχει αναφερθεί να αυξηθεί από αυτούς τους παράγοντες [22], [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. Ως εκ τούτου, προσδιορίζεται η κινητική της p27

επίπεδα Kip1 και τη δραστηριότητα της οδού RAF-ΜΕΚ-ΕΚΚ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και στα κύτταρα HPDE6 C7 εκτίθενται σε δ-τοκοφερόλη. Βρήκαμε ότι δ-τοκοτριενόλη αυξήθηκε σημαντικά ρ27

επίπεδα Kip1 από 6 ώρες σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 2Α). Αυτό το αυξημένο επίπεδο διατηρήθηκε και αυξήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές από 48 ώρες και συνδέονται με αντίστοιχες αναστολή της δράσης της ενεργοποιημένης μονοπατιού σηματοδότησης RAF-ΜΕΚ-ΕΚΚ, όπως μετρήθηκε από μειωμένα φωσφορυλιωμένη επίπεδα ΜΕΚ και ERK στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 2Α ). Σε αντίθεση, η ΡΙ3-ΑΚΤ οδού αρχικά επάγεται στις 12 ώρες που ακολουθείται από μετέπειτα αναστολή σε 24 ώρες, όπως μετράται με φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ επίπεδα (Σχήμα 2Α και 2Β). Συνεπής με την επίδραση επί του πολλαπλασιασμού, δ-τοκοτριενόλη κατέστειλε ρ27

επίπεδα Kip1 στην μη μετασχηματισμένα ανθρώπινα παγκρεατικού πόρου κυτταρική γραμμή, HPDE6 C7, και δεν είχε επίδραση επί ΜΕΚ, ERK, ή ΑΚΤ. Δείξαμε επίσης ότι τα αποτελέσματα του δ-τοκοτριενόλη ήταν ειδικά σε κακοήθη κύτταρα, καθώς δ-τοκοτριενόλη δεν προκάλεσε ρ27

επίπεδα Kip1 ή να τροποποιήσει ΜΕΚ, ERK, ή έκφραση της ΑΚΤ στα μη μετασχηματισμένα παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα. Οι μηχανισμοί αυτού χρειάζονται περαιτέρω έρευνα.

Α, του καρκίνου του παγκρέατος και κύτταρα HPDE6 C7 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δ-τοκοφερόλη σε προκαθορισμένα IC

50 για κάθε κυτταρική σειρά. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από 0-48 ώρες συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western για τους στόχους Ras ογκογόνο σηματοδότηση, ΜΕΚ και ERK, και ρ27

Kip1. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. δ-Tocotrienol αναστέλλει επιλεκτικά ΜΑΡ σηματοδότησης κινάσης και αυξάνει p27

έκφραση Kip1 σε μετασχηματισμένα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Β, κύτταρα MIAPaCa-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με δ-τοκοφερόλη σε προκαθορισμένα IC

50. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης από 0-24 ώρες συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδα Western για ΑΚΤ και κατάντη στόχου GSK-3β. C, MIAPaCa-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή δ-τοκοτριενόλη σε FBS για 12 ώρες, και αγνό πυρηνικά και κυτοσολικά κλάσματα απομονώθηκαν. Western blots δείχνουν αυξημένα επίπεδα της ρ27

Kip1 σε κύτταρα κατεργασμένα δ-τοκοτριενόλη με υψηλές συγκεντρώσεις στον πυρήνα. D, ταυτοχρόνως, ολόκληρα κύτταρα βάφτηκαν με ανοσοφθορισμό ρ27

Kip1 αντίσωμα και αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού για ρ27

Kip1 εντοπισμού. δ-Tocotrienol εντοπισμένη ρ27

Kip1 στον πυρήνα παρόμοια με την κατάσταση ασιτίας, ενώ τα κύτταρα από ορό αγωγή έδειξε ίσα επίπεδα ρ27

Kip1 στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα. Ε, δ-τοκοτριενόλη (DT3) καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων των κυττάρων MIAPaCa-2 παρουσία της προστιθέμενης μεβαλονικό οξύ, είναι ο μεταβολίτης της HMG-CoA αναγωγάσης. κύτταρα MIAPaCa-2 (σε πλάκες 96-φρεατίων) υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με δ-τοκοτριενόλη ή λοβαστατίνη υπό την απουσία ή παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του μεβαλονικού. αποτελέσματα ΜΤΤ αποδεικνύουν ότι mevalonate διασώζει τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης της λοβαστατίνη, αλλά όχι εκείνη του δ-τοκοφερόλη. Στο Ε, οι γραμμές 1 και 7 δεν είχε καμία δ-τοκοφερόλη (DT3) ή λοβαστατίνη.

Η

Εκτός από τη διαφοροποίηση των επιπέδων έκφρασης του, υποκυτταρικός εντοπισμός είναι επίσης σημαντικό διέπουν p27

λειτουργία Kip1. Για να δράσει ως αναστολέας του κυτταρικού κύκλου, ρ27

Kip1 πρέπει να βρίσκονται στον πυρήνα, ενώ κυτταροπλασματική εσφαλμένος εντοπισμός του ευνοεί την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και μπορούν να συμβάλλουν σε κυτταρικό μετασχηματισμό [27], [28]. Το Σχήμα 2C δείχνει ότι ρ27

επίπεδα Kip1 αυξάνονται τόσο στην κυτοσολικό και πυρηνικά διαμερίσματα του δ-τοκοτριενόλη επεξεργασμένα MIAPaCa-2 κύτταρα σε σύγκριση με το όχημα. Στο Σχήμα 2Δ, παρατηρήσαμε ρ27

Kip1 κυτταροπλασματική συσσώρευση στο όχημα-επεξεργασμένα κύτταρα MIAPaCa-2 έναντι αυξημένη ρ27

επίπεδα Kip1 στον πυρηνικό διαμέρισμα των αδρανών κυττάρων στερημένων ορού MiaPaCa-2 και δ-τοκοτριενόλη επεξεργασμένο MIAPaCa- 2 κύτταρα. Μερικοί συγγραφείς έχουν προτείνει ότι οι τοκοτριενόλες ρυθμίζουν δραστικότητα της HMG-CoA μέσω μετα-μεταγραφική δράσεις, αναστέλλοντας έτσι φαρνεσυλίωση των κατάντη ογκογόνο στόχων σηματοδότησης, παρόμοια με τα αποτελέσματα της λοβαστατίνης [29], [30], [31]. Για να προσδιορίσετε αν δ-τοκοφερόλη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό μέσω της αναστολής mevalonate οδού, θα αντιμετωπίζονται κύτταρα MIAPaCa-2 με δ-τοκοφερόλη ή λοβαστατίνη και με αυξανόμενες συγκεντρώσεις mevalonate, κατάντη προϊόν της HMG-CoA αναγωγάσης. Η προσθήκη του μεβαλονικού να δ-τοκοτριενόλη επεξεργασμένα κύτταρα δεν οδήγησε σε σημαντική διάσωση από τις ανασταλτικές δράσεις ανάπτυξης του δ-τοκοτριενόλη σε κύτταρα MIAPaCa-2 (Σχήμα 2Ε)? Ωστόσο, η ικανότητα λοβαστατίνη να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό διασώθηκε από mevalonate.

p27

Kip1 απαιτείται για την δ-Tocotrienol-Induced G

1 σύλληψης

Για τον προσδιορισμό του ρόλου των p27

επαγωγή Kip1 στο δ-τοκοφερόλη παγκρέατος αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, που παροδικά μειωμένη p27

έκφραση Kip1 στα κύτταρα MIAPaCa-2 χρησιμοποιώντας p27

Kip1 μικρά RNA παρεμβολής (siRNA? επιβεβαιώθηκε με Western blot). Στις 24 ώρες, η απουσία του ρ27

έκφραση Kip1 σημαντικά ακύρωσε δ-τοκοτριενόλη επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (Σχήμα 3Α). Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα ευρήματα, σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν p27

Kip1 μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) ή φορέα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας κύτταρα MIAPaCa-2. Μειωμένη p27

έκφραση Kip1 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western blot. Η Εικόνα 3Β δείχνει ότι η εξάντληση των ρ27

Kip1 οδήγησε σε αντίσταση στη θεραπεία δ-τοκοτριενόλη. Για να διερευνηθεί κατά πόσο οι παρατηρήσεις αυτές θα μπορούσαν να γενικευθούν πέρα ​​από κύτταρα MIAPaCa-2, αναλύσαμε σταθερή ΠΜΑ [19], [20] που παρουσιάζουν p27

Kip1 knock-out ή κύτταρα άγριου τύπου μετά το δ-τοκοφερόλη θεραπεία. Βρήκαμε ότι η έλλειψη ρ27

Kip1 καθίστανται Οι MEF μερικώς ανθεκτικά σε αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις του δ-τοκοτριενόλη σε αυτή την κυτταρική σειρά (Εικόνα 3C). Μαζί, αυτές οι μελέτες υπογραμμίζουν τη σημασία της p27

Kip1 στο δ-τοκοφερόλη που προκαλείται G

1 σύλληψης και δείχνουν ότι η συμβολή αυτού του αναστολέα CDK δεν είναι κυτταρική σειρά ειδικών.

Α, p27

Kip1 siRNA εξασθενεί δ-τοκοτριενόλη μεσολάβηση καταστολή της ανάπτυξης σε ανθρώπινα MIAPaCa-2 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα.