Αφηρημένο

ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου επηρεάζονται από τα μακροφάγα του γύρω μικροπεριβάλλον. Για να διερευνηθούν οι επιδράσεις μιας φλεγμονώδους μικροπεριβάλλον του όγκου σχετικά με την ανάπτυξη και την μετάσταση του καρκίνου του προστάτη, η παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο συν-καλλιέργειας των κυττάρων καρκίνου του προστάτη (PCA) με μακροφάγων σχετιζόμενο με τον όγκο (ΤΑΜ) -conditioned μέσου (MCM). MCM προωθείται προστάτη κυττάρων (LNCaP, DU145 και PC-3) την ανάπτυξη, και ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια απέδειξαν επανειλημμένα ότι MCM θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου. MCM τονωθεί επίσης τη μετανάστευση και την εισβολή

in vitro

. Η σωματοστατίνη παράγωγο (smsDX) εξασθένισε σημαντικά την ΤΑΜ-διεγερμένο πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου του προστάτη. Ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε ότι ΝΡ-κΒ υπερεκφράστηκε σε PCa και ΒΡΗ με χρόνιες φλεγμονώδεις δείγματα ιστού και συσχετίστηκε θετικά με διήθηση μακροφάγων. Περαιτέρω διερεύνηση του υποκείμενου μηχανισμού αποκάλυψε ότι ΝΡ-κΒ έπαιξε σημαντικό ρόλο στην διήθηση μακροφάγων. SmsDX ανέστειλε την παρακρινή βρόχο μεταξύ των κυττάρων ΤΑΜ και του προστάτη και μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν δυνητικό θεραπευτικό παράγοντα για την PCA

Παράθεση:. Guo Z, Xing Z, Cheng Χ, Fang Ζ, Jiang C, Su J, et al. (2015) Η σωματοστατίνη Παράγωγος (smsDX) εξασθενεί η TAM-διεγείρει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή του καρκίνου του προστάτη μέσω του NF-κΒ κανονισμού. PLoS ONE 10 (5): e0124292. doi: 10.1371 /journal.pone.0124292

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Ιταλία

Ελήφθη: 30 του Αυγούστου 2014? Αποδεκτές: 12 του Μάρτη του 2015? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30772294). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου που επηρεάζει άνδρες και αποτελεί τη δεύτερη αιτία που σχετίζονται με τη θνησιμότητα του καρκίνου στο δυτικό κόσμο [1]. Η πλειοψηφία του καρκίνου του προστάτη εξελίσσεται από προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία μέσω τοπικά επεμβατικές αδενοκαρκίνωμα σε καρκίνο του ανθεκτικού ευνουχισμό προστάτη (CRPC) [2], η οποία οδηγεί στην υψηλή θνησιμότητα και λίγο θεραπεία είναι αποτελεσματική. Παρά την πολλή έρευνα, η εγγενής μηχανισμός για CRPC είναι ακόμα ασαφής. Πρόσφατα, Zhu et al βρήκαν ότι κυτοκίνες που περιλαμβάνουν IL-1β παράγεται από μακροφάγα συνέβαλαν στην εξέλιξη της CRPC [3].

Τα μακροφάγα είναι συνήθως το πιο άφθονο ανοσία πληθυσμού παρόν στον όγκο μικρο-περιβάλλον [4-6 ]. Πρόσφατα, δύο διαφορετικές καταστάσεις του πολωμένου μακροφάγα έχουν ταυτοποιηθεί: η «κλασική» ενεργοποιείται (M1) και τα «εναλλακτικά» ενεργοποιείται (Μ2) μακροφάγα. Και σήμερα είναι γενικά αποδεκτό ότι ΤΑΜ έχουν φαινότυπο Μ2 και θα μπορούσε να παράγει μια σειρά από κυτοκίνες /χημειοκίνες στο τοπικό μικροπεριβάλλον του όγκου που μπορεί να σχετίζονται με την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου, της αγγειογένεσης και της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη [7-10]. Ωστόσο, η λεπτομερής μηχανισμός παραμένει άγνωστος.

πυρηνικού παράγοντα-κΒ (NF-κΒ) είναι ένα μέλος μιας οικογένειας εκφράζεται παντού παράγοντες μεταγραφής που συμμετέχει σε φλεγμονή, ασυλία και ογκογένεση [11,12]. Είναι ευρέως στα περισσότερα (αν όχι όλα) τα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων μακροφάγων. Και ανώμαλη ενεργοποίηση του έχει επίσης παρατηρηθεί στους περισσότερους όγκους. Πρόσφατα αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι κυτοκίνες (π.χ., IL-1 και TNF) που παράγεται από ΤΑΜ θα μπορούσε να προωθήσει την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ [13,14], τότε προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου, την ογκογένεση, τη μετανάστευση και εισβολή [15,16]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε μακροφάγα θα μπορούσε να επιδεινώσει την αναισθησία στην ινσουλίνη και να επηρεάσουν το μεταβολισμό της γλυκόζης, και εμπλέκει στις μεταβολικές διαταραχές όπως η παχυσαρκία, αντίσταση στην ινσουλίνη, διαβήτη τύπου 2, και αθηροσκλήρυνση [17-19]. Πιστεύεται ότι το ΝΡ-κΒ προάγει την κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση, τουλάχιστον εν μέρει, από την αναδιοργάνωση του μεταβολισμού κυκλωματικούς.

Η σωματοστατίνη (SMS) είναι ένα όξινο πολυπεπτίδιο, το οποίο είναι ευρέως κατανεμημένο σε όλη του κεντρικού νευρικού συστήματος, διαφορετικές περιφερειακές ιστούς και όργανα. Διαθέτει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων στις ενδοκρινικές, φλεγμονή και όγκων. παράγωγο SMS (smsDX) βασίζεται σε φυσικά sms14, και θα μπορούσε να συνδεθεί με τις πέντε υποτύπους υποδοχέα σωματοστατίνης (SSTR) [20]. Προηγούμενη έρευνα μας έχει βρεθεί smsDX θα μπορούσε να προωθήσει την απόπτωση, καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [21]. Και αρκετές μελέτες έδειξαν υποδοχέα σωματοστατίνης ήταν παρούσα σε μακροφάγα, SMS και αναλόγου της θα μπορούσε να ρυθμίζουν τη λειτουργία των μακροφάγων [22-24]. Ωστόσο, ο μηχανισμός παραμένει ασαφής. Η σωματοστατίνη και το ανάλογο της έχουν αναφερθεί σε πολλές μελέτες για την καταστολή της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ [25,26]. Ωστόσο, αν smsDX μπορεί να ρυθμίσει NF-κΒ στον καρκίνο του προστάτη παραμένει άγνωστη.

Η παρούσα μελέτη αξιολόγησε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του NF-κΒ και TAM διείσδυση στον καρκίνο του προστάτη (PCA), καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) και καλοήθη υπερπλασία του προστάτη με χρόνια φλεγμονή δείγματα μέσω ανοσοϊστοχημείας. Για την προσομοίωση της μικροπεριβάλλον του όγκου, ένα μοντέλο συν-καλλιέργεια κυττάρων προστάτη (LNCaP, DU145 και PC-3) με την TAM-ρυθμισμένο μέσο (MCM) ιδρύθηκαν

in vitro

. MCM προήγαγαν τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων προστάτη, και αυτό θα μπορούσε προσομοίωση να ανασταλεί από smsDX. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι η NF-κΒ έπαιξε ζωτικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία, και μπορούν να συμμετέχουν σε ένα αυτοκρινή /παρακρινή βρόχο μεταξύ ΤΑΜ και τα κύτταρα του προστάτη. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι μια φλεγμονώδης μικροπεριβάλλον προωθεί προστάτη εξέλιξη, και ότι smsDX μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα βοηθητικό φάρμακο για τον καρκίνο του προστάτη, εξαιτίας των πιθανών αντι-φλεγμονώδη ρόλο του.

Αποτελέσματα

έκφραση Ρ65 συσχετίζεται θετικά με στρατολόγηση μακροφάγων σε ανθρώπινους ιστούς προστάτη

Ανοσολογικά χρώση για την P65 υπομονάδα του ΝΡ-κΒ εκτιμήθηκε στο δείγμα του 24 προστάτη, 12 ΒΡΗ με χρόνια φλεγμονή και 33 δείγματα ΒΡΗ. Όταν η έκταση της χρώσης σε όλα τα δείγματα ιστού ποσοτικοποιήθηκε σχετικά με την κλίμακα + 0-3, παρατηρήσαμε μια διαβαθμισμένη αύξηση μεταξύ των ιστών ΒΡΗ, ΒΡΗ με χρόνια φλεγμονή δείγματα, και PCa. Κανένας από τους ιστούς ΒΡΗ χρωματίστηκαν ως 3+, και 87,8% παρουσίασαν 0+ ή 1+ χρώση. Η ποσότητα της χρώσης στην ΒΡΗ με χρόνια φλεγμονή δείγματα ήταν ενδιάμεσος, με το 75% των δειγμάτων που εμφανίζουν 1+ ή 2+ χρώση και 25% εμφανίζουν 3+. Σε αντίθεση, όλα τα δείγματα καρκίνου του ήταν 2+ έως 3+ (37,5 και 62,5%, αντίστοιχα), όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. Επιπρόσθετα, μόνο ασθενή χρώση Ρ65 παρατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα σε ιστούς ΒΡΗ, χρώση Ρ65 παρατηρήθηκε σε τόσο το κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα του όγκου και φλεγμονωδών κυττάρων.

η

Για να εκτιμηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ Ρ65 και διήθηση των μακροφάγων σε ανθρώπινους ιστούς του προστάτη, μη χρωματισμένα τμήματα ανοσοσημασμένων με CD68. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1, CD68-θετικά κύτταρα και Ρ65 είχαν εκφράζονται συντονισμένα σε μέτρια έως υψηλά επίπεδα σε ΒΡΗ με χρόνια φλεγμονή και τον καρκίνο του προστάτη αλλοιώσεις. Αντίθετα, ελάχιστη χρώση CD68 παρατηρήθηκε για ΒΡΗ. Επιπλέον, η πλειοψηφία των CD68-θετικών κυττάρων παρουσίασαν μορφολογικά χαρακτηριστικά των μακροφάγων. Ως εκ τούτου, η έκφραση Ρ65 συσχετίστηκε θετικά με μακροφάγων πυκνότητα.

(Α) ισχυρή χρώση του ΝΡ-κΒ στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα του προστάτη. (Β) Μέτρια διείσδυση των μακροφάγων στον προστάτη. (C) μέτρια χρώση του ΝΡ-κΒ στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα της προστατίτιδας. (D) Υψηλή διείσδυση μακροφάγων σε χρόνιας προστατίτιδας. (Ε) Ασθενής χρώση του ΝΡ-κΒ στο κυτταρόπλασμα του ΒΡΗ. (F) Ήπια διείσδυση μακροφάγων σε ΒΡΗ. Όλες οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες.

Η

SmsDX ανέστειλε την MCM-προωθείται πολλαπλασιασμό και την αποικία σχηματισμό του προστάτη καρκινικών κυττάρων

Για τη μελέτη των επιπτώσεων της MCM και smsDX στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη, LNCaP, DU145 και PC-3 κύτταρα που εκτίθενται σε χωριστά MCM και smsDX για 24, 48 και 72 ώρες σε μία δοκιμασία CCK-8. Κατά συνέπεια, MCM προώθησε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των LNCaP, DU145 και PC-3 κύτταρα σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο, ενώ θα μπορούσε να αποδυναμώσει smsDX τον αντίκτυπο της MCM στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 2). Η βιωσιμότητα των LNCaP, DU145 και PC-3 κύτταρα αυξήθηκε σε 51,7%, 44,3% και 57,6%, αντίστοιχα, μετά από έκθεση σε MCM για 72 ώρες, ωστόσο, η βιωσιμότητα μειώθηκε στο 44,8%, 44,1% και 41,6%, αντίστοιχα, κατά την smsDX θεραπεία.

Η επίδραση της MCM ή /και smsDX στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε μέσω CCK-8 δοκιμασίας. (Α) κύτταρα LNCaP, (Β) κύτταρα DU145 και (C) PC-3 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με MCM και /ή αγωγή με smsDX για 24, 48 και 96 ώρες. Συγκαλλιέργεια με MCM προώθησε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, ότι κρίνεται smsdx θα μπορούσε να μετριάσει σημαντικά αυτή την επιρροή. (Δ) Η επίδραση της MCM και smsDX για σχηματισμό αποικιών. (Ε) Ο αριθμός των αποικιών, που ορίζεται asclusters τουλάχιστον 50 κύτταρα, μετρήθηκε κάτω από μικροσκόπιο. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SD, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

Εξετάσαμε περαιτέρω τις επιπτώσεις της MCM και smsDX στο σχηματισμό αποικιών των κυττάρων του προστάτη. MCM διευκόλυνε δραματικά την σχηματισμό αποικίας των LNCaP, DU145 και PC-3 κύτταρα. Ωστόσο, ο αριθμός των αποικιών μειώθηκε σημαντικά μετά την αγωγή με smsDX όπως φαίνεται στο σχήμα 2 (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01).

Επιδράσεις της MCM και smsDX για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

σε vitro

η

δοκιμασίες Scratch διεξήχθησαν για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της MCM και smsDX για τη μετανάστευση των κυττάρων του προστάτη. Οι δυνατότητες μετανάστευση των LNCaP, DU145 και PC-3 αυξήθηκαν σημαντικά μετά από συν-καλλιέργεια με MCM για 24 h (Σχήμα 3). Για να δοκιμαστεί περαιτέρω η επίδραση της MCM και smsDX στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, transwell δοκιμασία διεξήχθη. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι ο αριθμός των μεταναστευτικών και μεταστατικών κυττάρων που διέρχεται από το φίλτρο αυξήθηκε σημαντικά όταν μακροφάγα καλλιεργήθηκαν στον κάτω θάλαμο (Σχήμα 3) (# Ρ & lt? 0,05, ## Ρ & lt? 0,01). Ωστόσο, smsDX (10 ηΜ) μπορούσε να αναστείλει δραματικά την μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων του προστάτη.

(A, C, E) Συν-καλλιέργεια με MCM ενίσχυσε την κυτταρική μετανάστευση των LNCaP, DU145 και τα κύτταρα PC-3. SmsDX κατέστειλε την επίδραση της MCM. (B, D, F) Η αλλαγή μετανάστευση παρουσιάζεται ως ποσοστό της αρχικής απόστασης μεταξύ των δύο άκρων. (G, Ι, L) μετανάστευση Transwell και δοκιμασία εισβολής του LNCaP, DU145 και PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με MCM ή /και smsDX. (H, J, M) Η LNCaP, DU 145 και PC-3 κύτταρα που μετανάστευσαν με επιτυχία και εισέβαλε μετρήθηκαν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD, * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, # ρ & lt? 0,05, ## ρ & lt?. 0.01

Η

SmsDX αναστέλλει την ανάπτυξη MCM-εξαρτώμενη όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος

Μετά την απόδειξη της αποτελεσματικότητας των smsDX στην αναστολή της βιωσιμότητας του προστάτη κυττάρων και εισβολή

in vitro

, θα διερευνηθεί περαιτέρω το δυναμικό αντικαρκινική δράση της σε ποντίκια. PC-3 κύτταρα (5 × 10

6) ενέθηκαν υποδορίως σε κάθε πλευρά γυμνών ποντικών. Η θεραπεία με MCM αύξησε σημαντικά τον μέσο όγκο του όγκου. Ωστόσο, η ανάπτυξη του όγκου ανεστάλη μετά τη θεραπεία με smsDX στο 1 mg /kg /d (Σχήμα 4) (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01). Επιπλέον, καμία σημαντική τοξικότητα παρατηρήθηκε σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με MCM και smsDX (1 mg /kg /d), όπως αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το βάρος του κάθε ζώου στις 3 ομάδες (Σχήμα 4). Για να διερευνηθεί η έκφραση του ΝΡ-κΒ, καθώς και διείσδυση μακροφάγων

in vivo

, ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε σε τομές παραφίνης από PC-3 ξενομοσχεύματα όγκου από γυμνούς ποντικούς. NF-κΒ και CD68 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με MCM, και συσχετίστηκαν θετικά με τον όγκο του όγκου (Σχήμα 4).

Εικόνες του γυμνών ποντικών (Α) και των αποκόπηκε όγκους (C) ελήφθησαν από διαφορετικές ομάδες. καμπύλη (Β) Το σωματικό βάρος γυμνών ποντικών που φέρουν PC-3 όγκων σε διαφορετικές ομάδες. (D) Γραφήματα αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των όγκων του όγκου των PC-3 ξενομοσχεύματα αγωγή με MCM ή /και smsDX. (Ε) Η συσχέτιση μεταξύ CD68 και NF-κΒ σε ξενομοσχεύματα όγκων του προστάτη. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± SD, * ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01

Η

SmsDX αναστέλλει την πυρηνική μετατόπιση και ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ που προκαλείται μέσω μακροφάγους θρεπτικό μέσο σε κύτταρα PCa

ΝΡ-κΒ μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα κρίσιμο μηχανιστική σύνδεση μεταξύ της φλεγμονής και του καρκίνου, και ανώμαλη ενεργοποίηση του μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την ογκογένεση, τη μετανάστευση και εισβολή [15,16]. Εμείς παρατηρήθηκε για πρώτη φορά την έκφραση της φωσφορυλιωμένη Ρ65, το οποίο ρυθμίζει την δραστικότητα μεταγραφής NF-κΒ [27,28]. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5, συν-καλλιέργεια με MCM σημαντικά πάνω ρυθμισμένα φωσφορυλιωμένη Ρ65 σε κύτταρα LNCaP, η οποία εκφράζεται εντονότερα όταν αυτά τα κύτταρα επωάστηκαν με MCM για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την επίδραση της smsDX επί ​​της φωσφορυλίωσης του Ρ65. Οι επάνω ρυθμισμένη επίπεδα φωσφορυλίωσης του Ρ65 δευτερεύουσες σε θεραπεία MCM ήταν ουσιαστικά κατασταλεί μέσω smsDX σε τρεις κυτταρικές γραμμές προστάτη (Σχήμα 5).

(Α) Τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ΝΡ-κΒ στα κύτταρα LNCaP μετά την έκθεση σε MCM για διαφορετική διάρκεια. (Β-Δ) Το επίπεδο phosphory και το συνολικό NF-κΒ αναλύθηκαν μέσω western αποτύπωση. Η ποσοτικοποίηση της αναλογίας ρ-ΝΡ-κΒ /ΝΡ-κΒ προσδιορίστηκε με ανάλυση πυκνομετρίας.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω τα αποτελέσματα του MCM και smsDX για την μετατόπιση του ΝΡ-κΒ, κυτοσολικές και πυρηνικών πρωτεϊνών εκχυλίζονται, αντίστοιχα. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι MCM μείωσε την αφθονία του Ρ65 στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων LNCaP (Σχήμα 6). Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα του Ρ65 παρατηρήθηκε στον πυρήνα (Σχήμα 6), υποδεικνύοντας ότι ΝΡ-κΒ ενεργοποιήθηκε. Ωστόσο, η θεραπεία με smsDX για 24 ώρες ανέστειλε δραματικά την επίδραση της MCM στην ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν στην DU145 (Σχήμα 6) και PC-3 κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 6). Τα αποτελέσματα ανοσοφθορισμού στο Σχήμα 7 επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι, παρόμοια με τη δοκιμασία κηλίδος Western, μία αυξηθεί σημαντικά στην πυρηνική συσσώρευση του Ρ65 παρατηρήθηκε μετά από συν-καλλιέργεια με MCM σε κύτταρα LNCaP, και ότι smsDX δραματικά ανέστειλε μετατόπιση Ρ65. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στο μη-3 PC κυτταρικές σειρές (Σχήμα 7) DU145 και.

(A, C, E) Η έκφραση της ρ65 στο κυτταρόπλασμα μειώθηκε μετά συγκαλλιέργεια με MCM, smsDX εξασθενημένο αυτό επίδραση σε LNCaP, DU145 και PC-3 κύτταρα. Α-τουμπουλίνης επιλέχθηκε ως το κυτοσολικό ελέγχου φόρτωσης πρωτεΐνης. (Β, D, F) Συγκαλλιέργεια με MCM αύξησε την έκφραση των πυρηνικών p65, και η θεραπεία με smsDX αποδυνάμωσε την επίδραση της MCM. Οι ιστόνες επελέγησαν ως έλεγχος φόρτωσης πυρηνική πρωτείνη. Η ποσοτικοποίηση του C-p65 /A-τουμπουλίνης και Ν-ρ65 /αναλογία ιστόνης διεξήχθη όπως ανάλυση πυκνομετρίας.

Η

(Α) Συν-καλλιέργεια με MCM προώθησε σημαντικά την πυρηνική συσσώρευση της ρ65 σε LNCaP κύτταρα. Η θεραπεία με smsDX ανέστειλε p65 πυρηνική μετατόπιση. (Β και Γ) Η έκφραση και η μετατόπιση του p65 μετά από έκθεση σε MCM και θεραπεία με smsDX σε DU145 και τα κύτταρα 3 PC-αντίστοιχα, αναλύθηκαν μέσω ανοσοφθορισμού.

Η

Συζήτηση

η παρουσία των λευκοκυττάρων εντός των όγκων παρατηρήθηκε για πρώτη φορά τον 19ο αιώνα από τον Rudolf Virchow, η παρατήρηση αυτή παρείχε την πρώτη ένδειξη ενός συνδέσμου μεταξύ της φλεγμονής και του καρκίνου [29]. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει πρόσφατα ότι τα μακροφάγα αντιπροσωπεύουν ένα κύριο συστατικό του διηθήματος λευκοκυττάρων ξενιστή στην πλειοψηφία των κακοηθών όγκων [30]. Ωστόσο, η κλινική σημασία της ΤΑΜ διεισδύει στον καρκίνο του προστάτη παραμένει αμφιλεγόμενη. Kiran el al ανέφεραν ότι ο μέσος αριθμός των ΤΑΜ ήταν υψηλότερη σε καρκίνο του προστάτη σε σχέση με καλοήθη ιστό [31], ενώ Norio et al ανέφεραν το αντίθετο αποτέλεσμα [32]. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε αυξημένη διείσδυση μακροφάγων στον καρκίνο του προστάτη και ΒΗΡ με χρόνια φλεγμονή σε σύγκριση με καλοήθη ιστό. Αυξημένη διείσδυση ΤΑΜ έχει επίσης αναφερθεί ότι συνδέεται με την κακή εξέλιξη προστάτη [33]. Ως εκ τούτου, ΤΑΜ μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πιθανή προγνωστικός δείκτης του καρκίνου του προστάτη. Ορισμένες προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης αποκάλυψε ότι M2 πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1 μπορεί να προάγει την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή και μετάσταση [34,35]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι ΤΑΜ-όπως μακροφάγων M2 τύπου αύξησε την μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Επιπλέον, MCM προώθησε την ογκογονικότητα των PC-3 κύτταρα σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια. Επιπλέον, η χορήγηση του smsDX εξασθένισε τη μεταναστευτική και επεμβατική δυναμικό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη που διεγείρεται από μακροφάγα Μ2 τύπου.

Παρατηρήσαμε επίσης ότι η έκφραση του ΝΡ-κΒ σε PCa και ΒΡΗ με χρόνια φλεγμονή δείγματα ήταν σημαντικά υψηλότερη εκείνου στο ΒΡΗ, αυτή η έκφραση συσχετίστηκε θετικά με διήθηση μακροφάγων. Ως εκ τούτου, επικεντρώθηκε στο ρόλο του ΝΡ-κΒ σε αυτή τη διαδικασία. Πυρηνικός παράγοντας-κΒ (NF-κΒ) είναι ένας επαγώγιμος διμερής παράγοντας μεταγραφής που ανήκει στην οικογένεια Rel /NF-κΒ. Η υπερ-έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν τους παράγοντες ΚεΙΑ /ΝΡ-κΒ έχει παρατηρηθεί σε πολλούς όγκους [36-39] και η απορύθμιση του ΝΡ-κΒ πιστεύεται ότι προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την κινητικότητα, την εισβολή και τη μετάσταση στους περισσότερους όγκους, συμπεριλαμβανομένων του προστάτη καρκίνο [40,41]. ΝΡ-κΒ θεωρείται ότι είναι ένα σημαντικό μοριακό παραγωγός της φλεγμονής και μπορεί να προωθήσει ανοσία με τον έλεγχο της έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στη φλεγμονή [42]. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι τα μακροφάγα ενεργοποιούνται ΝΡ-κΒ σε PCa. Αυτό οδήγησε στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη κύτταρα μετά από συν-καλλιέργεια με MCM. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου, κυτοκίνες από ΤΑΜ θα μπορούσε να ενεργοποιήσει ΝΡ-κΒ σε κύτταρα όγκου, προωθώντας έτσι την ογκογένεση. καρκινικά κύτταρα με τη σειρά τους εκφράζουν CSF-1 και μπορεί περαιτέρω να τονώσει και να προσλάβει μακροφάγα [43]. Ως εκ τούτου, υπάρχει ένα παρακρινή βρόχο εντός ΤΑΜ με ενισχυμένη την εξέλιξη του όγκου. Και NF-κΒ παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη δράση αυτού του βρόχου.

Η σωματοστατίνη και τα ανάλογά της είναι νευροενδοκρινούς ορμόνες και αντιπροσωπεύουν σημαντικοί μεσολαβητές μεταξύ του νευρικού και του ανοσοποιητικού συστήματος. Μας και άλλες ομάδες έχουν βρει ότι αυτές οι ορμόνες μπορούν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό και εισβολή διαφόρων τύπων όγκων [21,44]. Πιο πρόσφατα, σημαντικά πειραματικά δεδομένα έχουν δείξει ότι τα ανάλογα SMS εμφανίζουν αντι-φλεγμονώδη δράση, λόγω ανασταλτική δράση τους επί της έκκρισης ΤΝΡ-α, IL-8 και IL-1β [45,46]. Ωστόσο, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν έχουν υπάρξει μελέτες σχετικά με τις επιδράσεις των αναλόγων SMS για την έκφραση της NF-κΒ και βιολογική συμπεριφορά των κυττάρων του προστάτη σε μια φλεγμονώδη μικροπεριβάλλον. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι smsDX εξασθενημένο ουσιαστικά την μακροφάγων διαμεσολαβείται διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του προστάτη και εισβολή από την αναστολή της έκφρασης και της δραστηριότητας του ΝΡ-κΒ

in vitro

και

in vivo

. έχουν σωματοστατίνη υποτύπων υποδοχέα 1 και 2 έχουν ανιχνευθεί σε ανθρώπινα μακροφάγα [22], και ανοσοδραστικό σωματοστατίνη έχει ανιχνευθεί στο κυτταρόπλασμα των μακροφάγων. Ως εκ τούτου, εμείς εικάζουν ότι smsDX μπορούσε να δεσμεύει με SSTR1 ή 2 στην επιφάνεια των μακροφάγων και να σπάσει το παρακρινή βρόχο μεταξύ του όγκου και της φλεγμονώδους μικροπεριβάλλον, ανακουφίζοντας έτσι την μακροφάγων διεγείρεται εξέλιξης της προστάτη.

Πρόσφατα, μεταβολικές διαταραχές συμπεριλαμβανομένης της παχυσαρκίας, του διαβήτη τύπου 2, και η αθηροσκλήρωση έχουν ιστολογικά θεωρηθεί ως η χρόνια χαμηλού βαθμού φλεγμονή με σημαντική διείσδυση μακροφάγων [47,48]. έχουν μακροφάγα έχουν παρατηρηθεί να είναι σε στενή γειτνίαση με μεταβολικές κύτταρα και παρατηρήθηκαν να έχουν μια εκτεταμένη μεταγραφική υπογραφή που ρυθμίζεται το μεταβολισμό του adipocytessuch ως πυροσταφυλική καρβοξυλάση, PPAR-γ, απολιποπρωτεΐνη C1, κλπ. [18] Σε παχύσαρκα άτομα, η ενέργεια πλεόνασμα ή προϊόντα που προέρχονται από τα μακροφάγα μπορεί να ενεργοποιήσει NF-κΒ, την περαιτέρω ενεργοποίηση των μακροφάγων προσλήψεις, την ενεργοποίηση και την έναρξη και διατήρηση μιας φλεγμονώδους αντίδρασης που τελικά οδηγεί σε αντίσταση στην ινσουλίνη [18]. Εκτός από την επιδείνωση περιφερική αναισθησία στην ινσουλίνη, NF-κΒ μπορεί επίσης να επηρεάσει το μεταβολισμό της γλυκόζης και μιτοχονδριακή αναπνοή, η οποία είναι σημαντική για την κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση [49]. προηγούμενη μελέτη μας ανέφερε ότι smsDX μπορούν να επηρεάσουν τον κυτταρικό μεταβολισμό και τη λειτουργία των μιτοχονδρίων των κυττάρων του προστάτη. Ως εκ τούτου, εμείς εικάζουν ότι smsDX μπορεί να μετριάσει την επίδραση της MCM στα κύτταρα του προστάτη μέσω της δράσης κατά τον κυτταρικό μεταβολισμό εκτός από την αντι-φλεγμονής.

Στο σύνολό τους, η μελέτη μας δείχνει ότι η TAM μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη και την εξέλιξη του προστάτη, και ότι smsDX εξασθενεί αυτό το αποτέλεσμα με τα κάτω ρύθμιση NF-κΒ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι smsDX μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό φάρμακο για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα ανθρώπινα δείγματα ελήφθησαν κατά τη διάρκεια της θεραπευτικής χειρουργικής επέμβασης. Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των δειγμάτων πάνω στα ράφια μετά την παθολογική διάγνωση. Εμείς τηλεφώνησε όλους τους ασθενείς και λαμβάνεται προφορικά ενημερωμένη συγκατάθεση. Αυτό είναι ειδικά εγκριθεί από το Νοσοκομείο Επιτροπή Qilu του Shan Dong Πανεπιστημίου για τα Ανθρώπινα πειράματα. Όλα τα ζωικά φροντίδα και πειραματικά πρωτόκολλα συμμορφωθεί με τους κανόνες διαχείρισης των Ζώων του Υπουργείου Υγείας της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας (έγγραφο 55, 2001). Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν στο Key Εργαστήριο Καρδιαγγειακής αναδιαμόρφωση και Λειτουργία Έρευνας στο Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Shandong. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Νοσοκομείο Επιτροπή Qilu του Shan Dong Πανεπιστημίου για τα ανθρώπινα πειράματα και από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων του Πανεπιστημίου Shandong.

Ασθενείς και δείγματα

Ένα σύνολο των 24 ασθενών που διαγιγνώσκονται με προστάτη και 45 ασθενείς που διαγιγνώσκονται με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη αντιμετωπίζονται στο Χειρουργικής Τμήμα Ουρολογίας, Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Shandong μεταξύ Οκτώβριο του 2010 και τον Ιούλιο του 2012 είχαν εγγραφεί στη μελέτη αυτή. Εντός τούτου, δεκαέξι από τους ασθενείς προστάτη υποβλήθηκαν σε διορθικό προστάτη βιοψία, και 8 ασθενείς υποβλήθηκαν σε διουρηθρική εκτομή του προστάτη. Δώδεκα από 45 καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (BPH) ασθενείς διαγνώστηκαν με ιστολογική χρόνια προστάτη φλεγμονή. Οι κλινικές παραμέτρους και παθολογικών ταξινομήσεων που παρουσιάζονται και συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Καμία από ασθενείς είχαν λάβει προεγχειρητική επικουρική θεραπεία. Η διάγνωση της κάθε περίπτωσης επιβεβαιώθηκε από δύο παθολόγους.

προστάτη κυτταρικές σειρές και κυτταρικής καλλιέργειας

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη (LNCaP, DU145 και PC-3) και ΤΗΡ-1 κύτταρα αγοράστηκαν από η Culture Collection Τύπος της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Becasue ΤΑΜ αποτελεί διακριτή M2-πολωμένο πληθυσμός μακροφάγων [50], ΤΗΡ-1 μονοκύτταρα διαφοροποιούνται σε μακροφάγα σε μέσα RPMI που περιέχει 5 ng /ml φορβόλη 12-μυριστική 13-οξική (Sigma Chemical Co., St. Louis, ΜΟ) για 48 ώρες σύμφωνα με προηγουμένως καθιερωμένα πρωτόκολλα [51]. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα καλλιέργειας ήταν αποστειρώθηκε με διήθηση και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι να είναι έτοιμο για χρήση.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [52]. Εν συντομία ιστούς παραφίνης αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν. Μετά ανάκτηση αντιγόνου, όλα τα δείγματα εξετέθησαν σε πρωτογενές αντίσωμα (CD68 1:50, Ρ65 1: 100) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) όλη τη νύκτα στους 4 ° C, και στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με βιοτίνη για 30 λεπτά στους 37 ° C, που ακολουθείται από σύμπλοκο υπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτινυλιωμένης για 20 λεπτά στους 37 ° C. Χρώση εκτελέστηκε με 3,3N-διαμινοβενζιδίνη tertrahydrochloride και αιμάτινης. Το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης αξιολογήθηκε σύμφωνα με το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων του όγκου και την ένταση χρώσης από δύο παθολόγους όπως περιγράφηκε προηγουμένως [53]. Εν συντομία, το ποσοστό των θετικών χρώση βαθμολογήθηκε ως 0 (0-9%, αρνητική), 1 (10% -25%, σποραδική), 2 (26% -50%, εστιακή) ή 3 (51% -100%, διάχυτο), και η ένταση ως 0 (καμία χρώση), 1 (ασθενής χρώση, ορατό σε μεγάλη μεγέθυνση), 2 (μέτρια χρώση, ορατό σε χαμηλή μεγέθυνση) και 3 (σκούρο χρώση, εντυπωσιακά θετικά σε χαμηλή μεγέθυνση). Η συνολική βαθμολογία ανοσοχρώση υπολογίστηκε με την τιμή της βαθμολογίας τοις εκατό θετικότητας × βαθμολογία ένταση χρώσης, που κυμαίνονταν από 0 έως 9. Το επίπεδο πρωτεϊνικής έκφρασης ορίστηκε ως εξής: «0+» (αρνητικό, το σκορ 0), «1+» ( ασθενώς θετική, σκορ 1-3), «2+» (θετική, σκορ 4-6), και «3+» (έντονα θετικές, score7-9).

δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας

η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε μέσω δοκιμασίας CCK8. Εν συντομία, LNCaP (6 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο), DU145 (4 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) και PC-3 (4 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) κύτταρα σε 200 μΙ μέσον σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων. Μετά από 12 ώρες για προσκόλληση, το μέσο αντικαταστάθηκε με ρυθμισμένο μέσο από τα μακροφάγα με /χωρίς smsDX (10 ηΜ). Μετά από 24-72 ώρες, τα καλλιεργημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΐ κυτταρικού Μετρώντας kit-8 (Dojindo, Japan) και επωάστηκαν στους 37 ° C για επιπλέον 4 ώρες σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευής. Η απορρόφηση προσδιορίστηκε στα 450 nm.

Clone δοκιμασία σχηματισμού

LNCaP, DU145 και PC-3 κύτταρα σε πυκνότητα 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε 6- φρεατίων. Μετά από επώαση όλη τη νύκτα ρυθμισμένο μέσο με /χωρίς smsDX (10 ηΜ) προστέθηκε στο μέσο, ​​και τα κύτταρα επωάστηκαν σε 5% CO

2 και 37 ° C για δύο έως τρεις εβδομάδες. Όταν ορατό κλώνοι που σχηματίζονται στις πλάκες, τα κύτταρα πλύθηκαν των κλώνων με PBS και σταθεροποιήθηκαν με προψυγμένο μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 20 λεπτά. Οι αποικίες που περιέχουν περισσότερο από 50 κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Ο ρυθμός σχηματισμού κλώνος = (ο αριθμός κλώνου /ο αριθμός των ενοφθαλμισμό των κυττάρων) χ 100%.

In vitro

μηδέν δοκιμασία

κύτταρα προστάτη σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλακών. Μετά από επώαση για 24 ώρες, κάθε φρεάτιο με το χέρι έξυσε με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ, πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και επωάζονται με ρυθμισμένο μέσο με /χωρίς 10 ηΜ smsDX. Εικόνες ελήφθησαν και πάλι μετά από 24 ώρες. Η απόσταση μεταξύ δύο άκρων κυττάρου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

Transwell δοκιμασία εισβολής

δοκιμασίας Transwell εισβολή διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [54]. Εν συντομία, ένα σύνολο από 5 × 10

4 κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό προστέθηκαν στα άνω θαλάμους του συστήματος transwell (24 φρεάτια, 8-mm μέγεθος πόρου? Corning Costar, Lowell, MA, USA) επικαλυμμένα με 2 mg /ml Matrigel (BD Biosciences). ΤΑΜ-ρυθμισμένο μέσο με /χωρίς 10 ηΜ smsDX συνέχεια προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά από 24 ώρες, τα μη εισέβαλαν κύτταρα στον άνω θάλαμο ήπια απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα ενώ τα κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια σταθεροποιήθηκαν με προψυχθέν μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 1% ηωσίνη. Τουλάχιστον δέκα πεδία κάθε θαλάμου επιλέχθηκαν τυχαία και τα κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

Για δοκιμασία μετανάστευσης, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε άνω θαλάμους χωρίς επιστρωμένο Matrigel. Το υπόλοιπο του ποσοτικού προσδιορισμού έγινε όπως την δοκιμασία εισβολή Transwell. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια μετρήθηκαν επίσης σε τουλάχιστον δέκα πεδία τυχαία, τότε ο αριθμός των κυττάρων αναλύθηκε στατιστικώς.

ανοσοφθορισμού

δοκιμασία

κύτταρα προστάτη επιστρώθηκαν επί φιβρονεκτίνης-επικαλυμμένο γυαλί καλυπτρίδες. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε προψυγμένο μεθανόλη και διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100. Τα σταθερά κύτταρα προεπωάστηκαν σε 1,5% φυσιολογικό ορό κατσίκας και επωάζονται περαιτέρω όλη τη νύχτα με ένα πρωτεύον αντίσωμα έναντι Ρ65 (1: 100 αραίωση) στους 4 ° C. Μετά την επώαση με αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού συζευγμένο με φλουορεσκεΐνη αιγός στους 37 ° C, οι καλυπτρίδες ήταν τοποθετημένα σε πλακίδια με Permafluor Υδατικό. Ο φθορισμός παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Zeiss Axioplan Universal.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης 1%. Για να απομονωθεί κυτταροπλασματική συστατικού από την πυρηνική ένα, τα κύτταρα του προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα κιτ εκχύλισης πυρηνική πρωτείνη (Beyotime Biotechnology, Wuhan, Κίνα) και φυγοκεντρήθηκαν στις 3400 στροφές ανά λεπτό για 10 λεπτά στους 4 ° C. Οι κυτταροπλασματικές και πυρηνική συστατικά στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών από κάθε δείγμα διαχωρίστηκαν μέσω SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF χρησιμοποιώντας μια υγρή συσκευή μεταφοράς (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες στη συνέχεια εκτίθενται στα δευτερεύοντα αντισώματα σημασμένη με υπεροξειδάση αρμορακίας (1: 2000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και δραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Amersham, Pittsburg, ΡΑ). Τα επίπεδα πρωτεΐνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

Tumor μοντέλο ξενομοσχεύματος

παθογόνων-free 4-5 εβδομάδων BALB /c γυμνά ποντίκια (βάρους 19 ± 2 g, SPF βαθμού, SCXK2011 πιστοποιητικό -0012) αγοράστηκαν από το Τμήμα Εργαστηρίου Επιστήμης Ζωικής Παραγωγής στο Πανεπιστήμιο του Πεκίνου (Πεκίνο, Κίνα). Ένα σύνολο 5 × 10

6 του PC-3 κύτταρα συλλέχθηκαν, αναμίχθηκαν με Matrigel και ενέθηκαν υποδόρια στο πλευρό γυμνών ποντικών. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (5 ανά ομάδα). Οι ποντικοί έλαβαν από MCM, με ή χωρίς smsDX σε δόση 1 mg /kg /d μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης για 4 εβδομάδες με εβδομαδιαία παρακολούθηση του μεγέθους και του σώματος του όγκου βάρους, ενώ οι ποντικοί ελέγχου έλαβαν τον ίδιο όγκο φυσιολογικού ορού. Όλα τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με τη χρήση νατριούχου πεντοβαρβιτάλης 8 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων και οι όγκοι συλλέχθηκαν.

Στατιστική ανάλυση

Δεδομένα κυρίως παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. πακέτο λογισμικού SPSS (έκδοση 13.0? SPSS, Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις. Σημαντικές διαφορές μεταξύ των τιμών θεραπείας και ελέγχου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο-tailed t-test ή μονόδρομη ανάλυση του Student διακύμανσης, όταν ενδείκνυται. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά όταν ρ & lt? 0.05. Κάθε μεταβλητή δοκιμάστηκε δύο φορές και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Ευχαριστίες

American Journal ειδικοί επεξεργαστείτε αυτό το χειρόγραφο.