Αφηρημένο

Ιστορικό

Η χρόνια φλεγμονή σχετίζεται με ελκώδη κολίτιδα προδιαθέτει τα άτομα σε αυξημένο τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου. Ο σκοπός αυτών των μελετών ήταν να προσδιορίσει microRNAs που έκτροπα ρυθμίζονται κατά τη διάρκεια της φλεγμονής και μπορεί να συμμετέχει στο μετασχηματισμό του παχέος επιθηλιακών κυττάρων στην φλεγμονώδη ρύθμιση.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε χρησιμοποιήσει ποσοτική PCR συστοιχίες να συγκρίνετε microRNA (miRNA) έκφραση σε όγκους και τον έλεγχο του παχέος επιθηλιακά κύτταρα που απομονώνονται από το περιφερικό παχύ έντερο του χρόνια φλεγμονή ποντίκια και APC

Min /+ ποντίκια. στατιστικές προκειμένου Rank χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό διαφορικά ρυθμιζόμενη miRNAs σε όγκους που προέκυψαν λόγω της χρόνιας φλεγμονής και /ή να βλαστικής σειράς μετάλλαξης APC. εντοπίστηκαν οκτώ υψηλής miRNAs προτεραιότητας: miR-215, miR-137, miR-708, miR-31, και miR-135b εκφράστηκαν διαφορικά σε όγκους APC και miR-215, miR-133a, miR-467d, miR-218, miR-708, miR-31, και miR-135b σε όγκους κολίτιδα σχετιζόμενη. Τέσσερα από αυτά (miR-215, miR-708, miR-31, και miR-135b) ήταν κοινές για τους δύο τύπους όγκων, και απορύθμιση αυτών των miRNAs επιβεβαιώθηκε σε ένα ανεξάρτητο σύνολο του δείγματος. πρόβλεψη Target και ανάλυση μονοπάτι δείχνει ότι αυτές οι microRNAs, στο σύνολό τους, ρυθμίζουν μονοπάτια που σχετίζονται με ΜΑΡΚ, ΡΙ3Κ, WNT, και ΤΟΡ-β, τα οποία είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην μεταμόρφωση σηματοδότησης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι αυτές οι τέσσερις miRNAs απορυθμίζεται σε κάποιο πολύ πρώιμο στάδιο στο μετασχηματισμό του παχέος επιθηλιακών κυττάρων. Αυτή η απόκριση δεν εξαρτάται από το μηχανισμό για την έναρξη του μετασχηματισμού (φλεγμονή έναντι βλαστικής σειράς μετάλλαξη), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι miRNAs που έχουμε εντοπίσει είναι πιθανό να ρυθμίζουν κρίσιμα μονοπάτια σηματοδότησης που είναι κεντρικής σημασίας για πρώιμα γεγονότα στον μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων του κόλου.

Παράθεση: Necela BM, Carr JM, Asmann YW, Thompson ΕΑ (2011) διαφορική έκφραση των Τα microRNAs σε όγκους από χρόνια φλεγμονή ή Γενετική (APC

Min /+) Μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (4): e18501. doi: 10.1371 /journal.pone.0018501

Επιμέλεια: Ηλιάνα Σαούλ Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de καρκίνο, Βραζιλία

Ελήφθη: 31 Γενάρη του 2011? Δεκτές: 1 Μαρτίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Απριλίου του 2011

Copyright: © 2011 Necela et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από ένα βραβείο CCFA εξέλιξη της σταδιοδρομίας προς BMN. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι μία κατηγορία των μικρών μη κωδικοποιητικής RNAs από 19 έως 22 νουκλεοτίδια εμπλακεί σε μια σειρά σημαντικών κυτταρικών διεργασιών, όπως η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, φλεγμονή, και αντιδράσεις στρες [ ,,,0],1] – [8]. Οι Τα microRNAs γενικά πιστεύεται ότι λειτουργούν μέσω δέσμευσης του 3’UTR των mRNA στόχου και είτε αναστέλλοντας τη μετάφραση ή σε ορισμένες περιπτώσεις επάγουν αποικοδόμηση mRNA [3], [9]. Bioinformatic μελέτες δείχνουν ότι miRNAs μπορούν να ρυθμίζουν το ένα τρίτο του μεταγραφικό [10], [11]. Λόγω της τάσης τους να ρυθμίζουν πολλές διαδικασίες και τα γονίδια-στόχους, δεν αποτελεί έκπληξη ότι παρεκκλίνουσα έκφραση miRNAs έχει συνδεθεί με πολλές παθολογικές καταστάσεις όπως το άσθμα, ο διαβήτης, τα νεφρά, τις νευροεκφυλιστικές, και καρδιαγγειακή νόσο. Ειδικότερα, η διαφορική έκφραση miRNA έχει εμπλακεί σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του θυρεοειδούς, των πνευμόνων, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του.

Μέχρι σήμερα, πάνω από δώδεκα μελέτες έχουν αναφέρει μια ένωση του παρεκκλίνουσα έκφραση miRNA στον καρκίνο του παχέος εντέρου [ ,,,0],12] – [31]. Έκφραση των miRNAs σε όγκους του παχέος εντέρου μπορεί να επηρεάζεται από πολυάριθμους κλινικοπαθολογική μεταβλητές όπως είναι ο βαθμός του όγκου και την τοποθεσία, την κατάσταση μετάλλαξης (p53, APC, MSI) [32] – [36], και η κυτταρική περιεκτικότητα (

δηλαδή

φλεγμονώδη κύτταρα ) καθώς και προ και αναλυτικές μεταβλητές όπως μέθοδο εκχύλισης, στερέωση, και επιλογή των αναλυτικών πλατφόρμας (αλληλουχία, qPCR, ή microarray). Ως αποτέλεσμα αυτών των μεταβλητών, δεν υπάρχει ομοφωνία σχετικά με την οποία miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε όγκους του παχέος εντέρου. Παρ ‘όλα αυτά, μερικές microRNAs έχουν προκύψει με συνέπεια ως απορυθμίζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Μεταξύ αυτών, miR-31 είναι σταθερά ρυθμισμένη προς τα πάνω [12] – [17], [20], [22], [23], [25] και microRNA clusters miR-143 /-145 [18], [21] – [ ,,,0],23], [37] – [40] και miR-194 /-215 [18], [21] – [23], [37], [38], [41] προς τα κάτω σε καρκίνο του παχέος εντέρου. MicroRNA -31 έχει συνδεθεί με την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [42], [43]. Τα microRNAs -192 και -215 αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και διεγείρει διακοπή κύκλου κυττάρου σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο [37], [44], [45]. Ομοίως, miR-143 και miR-145 αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων, με τη δράση αυτή, εν μέρει, οφείλεται στην μέσω της αναστολής των γονιδίων-στόχων, όπως Dnmt3a, IRS-1, YES1, STAT1 και FLI1 [21], [46] – [ ,,,0],50].

Μία κλινική μεταβλητή που δεν έχει αντιμετωπιστεί επαρκώς είναι η φλεγμονώδης κατάσταση του όγκου του παχέος εντέρου. Μια άμεση σχέση μεταξύ της φλεγμονής και του καρκίνου έχει εδραιωθεί, με ΝΡκΒ αναδύεται ως ένα βασικό παράγοντα [51], [52]. Η φλεγμονή πιστεύεται όχι μόνο για να μεταβάλλει και να προωθήσει το μικροπεριβάλλον του όγκου, αλλά η ίδια, μπορεί να οδηγήσει άμεσα σε ογκογένεση. Οι ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα, μια χρόνια, υποτροπιάζουσα φλεγμονή του παχέος εντέρου, έχουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου. Μια πρόσφατη μετα-ανάλυση αποκάλυψε πιθανότητες του καρκίνου του παχέος εντέρου στην ελκώδη κολίτιδα από 2% μετά από 10 χρόνια, 8% μετά από 20 χρόνια, και 18% μετά από 30 χρόνια της νόσου [53]. Ένας πιθανός μηχανισμός με τον οποίο φλεγμονώδη μονοπάτια μπορούν να επηρεάσουν το μετασχηματισμό είναι μέσω της απορρύθμισης των miRNAs. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι miRNAs είναι ικανά να ρυθμίζουν φλεγμονώδεις διαδικασίες και απορρυθμισμένη σε διάφορες φλεγμονώδεις ασθένειες [54]. Πρόσφατα, απορύθμιση της microRNAs έχει παρατηρηθεί σε ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα [55], [56]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για την λειτουργική συνέπεια της απορρύθμισης των miRNAs κατά την διάρκεια χρόνιας κολίτιδας σε επιθηλιακά κύτταρα, και ακόμη λιγότερο στην ογκογένεση. Αν και περιορισμένη, αυτές οι μελέτες παρέχουν την precident ότι η απορρύθμιση ενός υποσυνόλου microRNAs κατά τη χρόνια κολίτιδα μπορεί να σχετίζεται με νεοπλασματικές και μεταπλαστικών μεταπλασίας μετασχηματισμού. Για το σκοπό αυτό, microRNAs μπορεί να είναι χρήσιμη βιοδείκτες να βοηθήσει στην πρόβλεψη του κινδύνου για κακοήθεια σε ασθενείς με μακροχρόνια ενεργή νόσο.

Οι μελέτες που περιγράφονται κατωτέρω έγιναν για να αρχίσει να ελεγχθεί η υπόθεση ότι ένα υποσύνολο των microRNAs είναι απορυθμίζεται στο εντερικού επιθηλίου κατά τη διάρκεια της κολίτιδας και συμβάλλουν στην καρκινογένεση. Μετρήσαμε miRNAs με ποσοτική συστοιχίες TaqMan χαμηλής πυκνότητας PCR χρησιμοποιώντας RNA που εκχυλίζεται από επιθηλιακά κύτταρα του κόλου ποντικών που επάγεται με οξεία θειική δεξτράνη κολίτιδα (AC), χρόνια κολίτιδα (CC), κολίτιδα σχετιζόμενη όγκων του παχέος εντέρου (CAC), και οι όγκοι του παχέος εντέρου σε APC

Min /+ ποντίκια. Εντοπίσαμε διαφορική έκφραση των miRNAs κοινή και μοναδική για κάθε κατάσταση της νόσου. Συγκεκριμένα, αποδεικνύουν ότι ένα υποσύνολο των miRNAs είναι απορυθμισμένη στους δύο όγκους τόσο φλεγμονωδών και γενετική προέλευση. Αυτά τα miRNAs έχουν τη δυνατότητα να ελέγχει και τα δύο αντι-ογκογόνο και pro-ογκογόνο μεταγραφικό δίκτυα, επηρεάζοντας έτσι ογκογόνο αποτέλεσμα.

Αποτελέσματα

Σύγκριση αναλυτικών μοντέλων που χρησιμοποιούν την οξεία κολίτιδα (AC) δείγματα

η ποσοτικοποίηση της έκφρασης miRNA σε δείγματα ιστού περιπλέκεται από το γεγονός ότι το ένα δεν έχει προφανή άμεση μέσα για τον εντοπισμό κατάλληλων ενδογενή στοιχεία ελέγχου που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κανονικοποίηση των δεδομένων έκφρασης και διόρθωση των διαφορών στην ποσότητα του RNA που αναλύθηκαν ή την αποτελεσματικότητα του miRNA μετατροπή εκχύλιση ή cDNA σε δείγματα από διαφορετικούς ιστούς. Αυτό το πιθανό πρόβλημα είναι ιδιαίτερα οξύ στις μελέτες, όπως αυτές που θα περιγραφούν παρακάτω στην οποία αναλαμβάνουμε να συγκρίνετε miRNA αφθονία σε ιστούς που προέρχονται από ποντίκια διαφόρων ηλικιών, δίαιτες, φλεγμονώδης κατάσταση, και το φορτίο του όγκου. Ως εκ τούτου, διεξάγεται ένα πιλοτικό πείραμα για τη σύγκριση διαφορετικών αναλυτικών εργαλείων και στατιστικών μοντέλων για τον εντοπισμό διαφορικά ρυθμιζόμενη miRNAs στα επιθηλιακά κύτταρα του κόλου. Για το σκοπό αυτό εξάγεται miRNAs από παρασκευάσματα των επιθηλιακών κυττάρων από το περιφερικό παχύ έντερο του ελέγχου C57BL /6J ποντίκια και ποντίκια που είχαν εκτεθεί σε 3,5% DSS στο πόσιμο νερό για τέσσερις ημέρες. Ιστολογικά, τα άνω και κάτω τελεία από τον έλεγχο και DSS-ποντίκια με αγωγή ήταν αδιάκριτοι, χωρίς ενδείξεις βλάβης φραγμού, κρύπτη απώλεια, ή εισβολή από κύτταρα του ανοσοποιητικού. Παρά το γεγονός ότι αυτοί οι ιστοί αποτελούν επίσημα μια προ-φλεγμονώδης κατάσταση, τα δείγματα θα πρέπει να οριστεί AC (οξεία κολίτιδα) στη συζήτηση που θα ακολουθήσει, ενώ οι έλεγχοι θα πρέπει να αναγνωρίζονται ως Con.

Εμείς που χρησιμοποιούνται συστοιχίες AB TaqMan για τη μέτρηση της αφθονίας από 384 miRNAs σε δείγματα AC και Con, που εκφράζεται ως κρίσιμα όρια (Ct) για κάθε ανιχνευτή miRNA. Τρεις αναλυτικές προσεγγίσεις συγκρίθηκαν. Η απλούστερη από αυτές ήταν στατιστικά τάξη τάξη. Κάθε miRNA σε ένα δεδομένο δείγμα δύναμης κατετάγη στην αναλογική ένδειξη των miRNA αφθονίας (τιμή Ct). Ανιχνευτές που βαθμολογήθηκαν ως «μη ανιχνεύσιμα» αποδόθηκαν τιμές Ct 40, και όλα τα miRNAs με Ct = 40 είχαν ανατεθεί με τον ίδιο βαθμό μέσα σε ένα δείγμα. Ένα t-test (υποθέτοντας άνισες διακύμανσης) στη συνέχεια διεξάγεται για να συγκρίνουν τις αναθέσεις σειρά κατάταξης των miRNAs σε δύο διαφορετικές ομάδες του δείγματος, έτσι ώστε να εντοπιστούν miRNAs της οποίας η μέση τάξη μεγέθους της έκφρασης αλλάξει σημαντικά ως αποτέλεσμα της θεραπείας. Η δεύτερη αναλυτική προσέγγιση εμπλέκεται μια απλή διάμεση ομαλοποίηση των δειγμάτων, που ακολουθείται από ένα t-test (υποθέτοντας άνισες διακύμανση) για να συγκρίνουν τιμές Ct μεταξύ Con και δείγματα AC. Η διαφορική έκφραση εκφράζεται ως ΔCt (συντομογραφία DCt), το οποίο αντιπροσωπεύει (meanCtMed_Norm_AC) – (meanCtMed_Norm_Con). Η τρίτη μέθοδος που χρησιμοποιείται το πακέτο Integromics Statminer, η οποία χρησιμοποιεί ένα εμπειρικό Bayesian εφαρμογή Limma με βάση για τον υπολογισμό μιας hyperparamter οποίο με τη σειρά που χρησιμοποιείται για να ρυθμίζει τη διακύμανση και να αυξήσει τους βαθμούς ελευθερίας μεταξύ των δειγμάτων. Το πακέτο Statminer υπολογίζει επίσης διακύμανση μεταξύ ορίζονται από το χρήστη ενδογενή ελέγχους και εντοπίζει εκείνες με τη μικρότερη διακύμανση σε όλα τα δείγματα. Το πακέτο Statminer επιτρέπει σε πολλούς ενδογενείς ελέγχων που πρέπει να χρησιμοποιηθεί για την ομαλοποίηση του συνόλου δεδομένων. Στην περίπτωσή μας οι λιγότερο παραλλαγή ενδογενή έλεγχοι ήταν sno135 και miR-25, και αυτά χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Διαφορική έκφραση εκφράζεται ως ΔΔCt (συντομογραφία DDCt), το οποίο αντιπροσωπεύει (meanΔCtLimma_SM_Tumor) – (meanΔCtLimma_SM_Con) Έτσι, σε σύγκριση με ένα σχετικά απλό μοντέλο στο οποίο δεν έγινε καμία προσπάθεια για να εξομαλύνει τα δεδομένα (στατιστικές σειρά κατάταξης, συντομογραφία Rnk_Diff), μια απλή μέση κανονικοποίηση μοντέλο (Med_Norm), καθώς και μια πιο περίπλοκη εμπειρική Bayesian μοντέλο που χρησιμοποιείται για πολλαπλές ενδογενείς ελέγχους για την κανονικοποίηση των δεδομένων (Limma_SM).

μια σύγκριση των αλλαγών στη σειρά κατάταξης των μεμονωμένων miRNAs (Κατάταξη Διαφορά AC-Con) και η αλλαγή log2 φορές από διάμεση κανονικοποιημένα δεδομένα [Μέσος κανονικοποιημένη DCT (AC-Con)] δείχνεται στο Σχήμα 1Α, ενώ μια παρόμοια σύγκριση της αλλαγής φορές log2 μετά Limma κανονικοποίηση να sno135 και miR-25 [DDCt (AC-Con)] είναι φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Οι κατανομές είναι προφανώς σχεδόν ταυτόσημα, όπως υποδεικνύεται από Spearman συντελεστές βαθμό συσχέτισης 0,8324 και 0,8328 για τα Σχήματα 1Α και Β, αντίστοιχα. Αυτή η ομοιότητα αποτελέσματα από κοντά την ταυτότητα των δεδομένων έκφρασης που υπολογίζεται από την μέση κανονικοποιημένη και Limma-κανονικοποιημένα δεδομένα (Εικόνα 1Γ, Spearman συντελεστής συσχέτισης βαθμού = 0,9996). Η παρατήρηση ότι δύο πολύ διαφορετικά πρωτόκολλα εξομάλυνσης απέδωσε ουσιαστικά ταυτόσημα αποτελέσματα πιθανώς υποδεικνύει ότι υπάρχει πολύ μικρή διακύμανση, είτε αναλυτικά είτε βιολογικά, μεταξύ των δειγμάτων μας.

Αλλαγές στη σειρά κατάταξης, που ορίζεται ως μέση κατάταξη σε δείγματα AC μείον σημαίνει κατάταξη σε δείγματα Con, σχεδιάζονται κατά τιμές DCT (σημαίνει Ct_AC μείον σημαίνει Ct_Con) του πίνακα Α ή DDCt (μέση DCt_AC μείον σημαίνει DCt_Con) στον πίνακα Β Limma οι κανονικοποιημένες DDCt τιμές για μεμονωμένες miRNAs συναρτήσει του διάμεσου κανονικοποιημένες τιμές DCt στον πίνακα Γ . διαφορικά εκφράζονται miRNAs διηθούνται σε P & lt? 0.01 και η κατάταξη αλλαγή τάξης ≥10 ή αλλαγή φορές log2 ≥1.0. Επικάλυψη μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs που προσδιορίζονται από τις στατιστικές σειρά κατάταξης (Rnk_Diff), t-test χρησιμοποιώντας μέση κανονικοποιημένα δεδομένα (Med_Norm), ή η εφαρμογή Statminer του Limma (Limma_SM) παρουσιάζεται στον Πίνακα Δ

Η

Χρήση αυτές οι τρεις προσεγγίσεις εντοπίσαμε 193 miRNAs που βαθμολογήθηκαν ως σημαντικά διαφορετικές (P≤0.01) σε μία ή περισσότερες από τις αναλύσεις (που αναφέρονται στον πίνακα S1). Εμείς που επιβάλλονται πρόσθετα φίλτρα διαφορά βαθμού ≥ (± 10) και P≤0.01 για τον εντοπισμό 73 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs από τις στατιστικές σειρά κατάταξης. Όταν διηθείται σε change≥ log2 φορές (± 1,0) και P≤0.01 εντοπίσαμε 130 miRNAs που εκφράζονται διαφορικά στο μέσο κανονικοποιημένη ανάλυση και 134 miRNAs που εκφράζονται διαφορικά με ανάλυση Limma. Ένα διάγραμμα Venn επικάλυψης μεταξύ αυτών των miRNAs παρουσιάζεται στο Σχήμα 1D. Κάπως προς έκπληξή μας, υπήρχαν μόνο 51 miRNAs που πληρούσε όλες τις προϋποθέσεις για όλα τα μοντέλα. Ένα τρισδιάστατο συσχέτιση συγκρίνοντας διαφορά βαθμού, DCT (διάμεσος κανονικοποίηση) και DDCt (Limma ομαλοποίηση) αποκάλυψε ένα 3-διαστάσεων συντελεστή συσχέτισης 1,00 για αυτά τα 51 δείγματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα miRNAs αντιπροσωπεύουν υψηλοί στόχοι πιθανότητας που είναι πιθανό να παίζουν κάποιο ρόλο στα πολύ πρώιμα στάδια της φλεγμονής. (Αυτά τα miRNAs προσδιορίζονται με έντονους χαρακτήρες στον πίνακα S1.) Τόσο μέση εξομάλυνση και Limma απέδωσε σημαντικό αριθμό των ακραίων τιμών, ενώ τάξη προκειμένου στατιστική ανάλυση εμφάνισε σχεδόν πλήρη επικάλυψη με τουλάχιστον ένα από τα άλλα μοντέλα (Εικ. 1D).

το συμπέρασμά μας από αυτήν την αρχική σύγκριση τριών διαφορετικών μεθόδων κανονικοποίησης είναι ότι όλες δίνουν πολύ παρόμοια αποτελέσματα, από την άποψη της σχετικής αφθονίας miRNA, σε ένα σύνολο δεδομένων με λίγο αναλυτική ή βιολογική διακύμανση εντός του ελέγχου και πειραματικών ομάδων. Τα διαφορετικά στατιστικά μοντέλα δίνουν σημαντικά διαφορετικές τιμές p, η οποία είναι πιθανόν να οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στο μικρό αριθμό των δειγμάτων που συμπεριλήφθηκαν σε αυτή την ανάλυση, καθώς και η χρήση του μετριάστηκε διακύμανσης (Limma) έναντι απεριόριστου διακύμανσης (t-test). Συνολικά οι στατιστικές σειρά κατάταξης λειτουργεί τουλάχιστον εξίσου καλά είτε των κανονικοποιημένων μοντέλων, τείνει να είναι πιο συντηρητική από την άποψη του αριθμού των διαφορικά ρυθμιζόμενης miRNAs, και έχει τα πρόσθετα πλεονεκτήματα ότι δεν απαιτεί τη γνώση των κατάλληλων ενδογενούς ελέγχων και δεν κάνει υποθέσεις σχετικά με ίσες ποσότητες RNA ή ίση απόδοση εκχύλισης miRNA ή μετατροπή cDNA από δείγμα σε δείγμα. Γι ‘αυτό επέλεξε να προχωρήσει με τις αναλύσεις μας, χρησιμοποιώντας στατιστικές σειρά κατάταξης για τον εντοπισμό διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Ωστόσο, οι αλλαγές στη σειρά κατάταξης δεν είναι κατατοπιστική σε όρους απόλυτης (ή, ακριβέστερα, αναλογική) αφθονία miRNA, έτσι ώστε να επικαλείται Limma να υπολογίζουν κανονικοποιημένες αφθονία, που εκφράζεται ως DDCt, το οποίο αντιστοιχεί σε -log2 φορές αλλαγή ρυθμίζεται σύμφωνα με sno135b /miR-25 .

Ταυτοποίηση διαφορικά εκφραζόμενων miRNAs σε πειραματικά μοντέλα κολίτιδας που σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου και την οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση coli

Χρησιμοποιήσαμε συστοιχίες AB TaqMan miRNA για τη μέτρηση της αφθονίας των 384 miRNAs σε όγκους που απομονώνονται από περιφερικό παχύ έντερο του APC

Min /+ ποντίκια (APC όγκοι) και οι όγκοι που σχηματίζονται στα άπω παχύ έντερο του χρόνια φλεγμονή ποντίκια (όγκοι CAC). Η APC

Min /+ ποντίκια συνταξιούχος κτηνοτρόφων, 120d από την ηλικία, και διατηρείται σε τροφή υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά δημιουργού. CAC όγκοι απομονώθηκαν από ποντίκια που είχαν υποβληθεί σε 12 γύρους της φλεγμονής χαμηλού επιπέδου, που προκαλείται από DSS, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Ως δείγματα ελέγχου, απομονώσαμε τα επιθηλιακά κύτταρα από τα παρακείμενα, αμέτοχος επιθηλίου από APC

Min /+ (έλεγχος APC) ή χρόνια φλεγμονή (έλεγχος CC) ποντίκια. στατιστικές σειρά κατάταξης χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό υποψήφιων διαφορικά εκφρασμένων miRNAs στην APC και όγκους CAC. (Οι τιμές Ct Raw για αυτά τα δείγματα δίδεται στον πίνακα S2.)

Οι τιμές Ct όλων των miRNAs σε επιμέρους όγκους και δείγματα ελέγχου προσδιορίστηκαν και δύναμη κατατάσσεται ως περιγράφεται ανωτέρω και η t-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει miRNAs της οποίας η μέση τάξη ήταν σημαντικά διαφορετική σε ελέγχους και όγκους. Οι μέσες παραγγελίες κατάταξη για ατομική miRNAs από τον έλεγχο της APC και οι όγκοι APC εμφανίζεται στο Σχήμα 2Α. Υπήρξε, σε γενικές γραμμές, μια καλή αντιστοιχία μεταξύ σειρά κατάταξης των miRNA αφθονία στον έλεγχο της APC και τα δείγματα όγκων APC (Spearman Rank Παραγγελία συντελεστής συσχέτισης = 0.973, p = 2.0E

-07), ωστόσο 10 miRNAs (εμφανίζονται ως κόκκινα σύμβολα ) έπεσε έξω από τα διαστήματα πρόβλεψης 95% (εμφανίζεται ως παράλληλες γραμμές στο Σχ. 2Α).

η μέση παραγγελίες κατάταξη των miRNA αφθονίας (με βάση τιμές Ct) προσδιορίστηκαν για όγκους από τα άπω παχύ έντερο ή αμέτοχος δίπλα άπω παχέος εντέρου επιθηλιακά κύτταρα (Πίνακας Α). SigmaStat χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό διαστημάτων εμπιστοσύνης 95% για αυτά τα δεδομένα (παράλληλες συνεχείς γραμμές) και ανιχνευτές miRNA που έπεσαν έξω από αυτά τα χρονικά διαστήματα είναι γεμάτη με κόκκινο χρώμα. Ομοίως, σε σύγκριση rank διάταξη της έκφρασης miRNAs από όγκους που σχηματίζονται στα περιφερικά παχύ έντερο του χρόνια φλεγμονή ποντικούς (CAC) και στο μη εμπλεκόμενο, χρόνια φλεγμονή του παχέος άπω παρασκευασμάτων επιθηλιακού κυττάρου (έλεγχοι CC), όπως φαίνεται στο ανιχνευτές Πίνακα Β microRNA ότι έπεσε έξω από τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% είναι γεμάτη με κόκκινο χρώμα.

η

το σχήμα 2Β συγκρίνει παραγγελίες κατάταξη της αφθονίας των miRNAs μετριέται σε CCcontrol και CACtumors δείγματα. Όπως και με τα δείγματα APC, υπήρχε μια γενικά υψηλή αντιστοιχία μεταξύ σειρά κατάταξης αφθονία των miRNAs σε αυτά τα δείγματα (συντελεστής συσχέτισης Spearman Rank Παραγγελία = 0.970, p & lt? 2.0E

-07). Ωστόσο, 10 miRNAs (κόκκινο σύμβολα) έπεσε έξω από τα διαστήματα 95% πρόβλεψης (Σχ. 2Β), υποδεικνύοντας ότι οι τάξεις αυτών των miRNAs ήταν διαφορετικές σε ελέγχους και όγκους, συνεπής με υψηλή πιθανότητα ότι αυτά τα miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά. Είναι η εμπειρία μας ότι πολύ μεγάλες αλλαγές στην miRNA αφθονία (όπως αποδεικνύεται στην περίπτωση αυτή από τις μεγάλες διαφορές σειρά κατάταξης) είναι περιστασιακά έχει συσχετισθεί με άτυπα κινητική της ενίσχυσης των πολύ χαμηλών miRNAs αφθονία. Ως εκ τούτου, επιθεωρούνται οπτικά τις καμπύλες ενίσχυσης qPCR για καθένα από τα miRNAs σε κάθε δείγμα και να εξαλειφθούν αυτά για τα οποία κινητική ενίσχυση λογαριθμική-γραμμική (1ct /κύκλο) δεν έλαβαν. Αυτό το βήμα επιμέλεια μείωσε τον αριθμό των μεγάλη πιθανότητα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs σε όγκους APC έως 5 και του αριθμού τέτοιων miRNAs σε όγκους CAC έως 7. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, δύο miRNAs είχαν κατασταλεί σε APC όγκους (MIR-215 και miR-137 ), σε σύγκριση με το παρακείμενο επιθήλιο έλεγχο, ενώ 3 miRNAs προκλήθηκαν (miR-708, miR-31, miR-135b). Μόνο 1 miRNA είχε κατασταλεί σε CAC όγκους σε σύγκριση με τον έλεγχο της χρόνια φλεγμονή του επιθηλίου (miR-215), ενώ 6 miRNAs προκλήθηκαν σε CAC όγκους (miR-133a, miR-467d, miR-218, miR-31, miR-135b). Τρεις miRNAs προκλήθηκαν τόσο APC και τα δείγματα CAC (miR-31, miR-135b, και miR-708) και 1 miRNA είχε κατασταλεί τόσο APC και τα δείγματα CAC (miR-215). Επιπλέον, 1 miRNA ήταν μοναδικά κατασταλεί σε APC όγκους (miR-137), και 3 miRNAs ήταν μοναδικά προκλήθηκε σε CAC όγκους (miR-133a, miR-467d, και miR-218). Ως εκ τούτου, οι 8 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs στον Πίνακα 1 επιλέχθηκαν για επικύρωση.

Η

Αν και οι στατιστικές σειρά κατάταξης είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για miRNAs τον ορισμό που εκφράζονται διαφορικά, μια πιο ποσοτική προσέγγιση είναι απαραίτητη για να καθοριστεί το μέγεθος της η απόκριση σε κάθε δεδομένη σύγκριση. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε την εφαρμογή Statminer των Limma να πραγματοποιήσει εξομάλυνση και περιληπτική παρουσίαση των δεδομένων έκφρασης σειρά TaqMan. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3 ως log 2 μετασχηματισμό των φορές αλλαγή για κάθε μία από τις 8 miRNAs εστίασης, όπου Fold Change = – [μέσος όρος (DCtTumor-DCtControl)]. Ρ-τιμές υπολογίστηκαν για κάθε σύγκριση με τη χρήση του Limma εμπειρική Bayesian εφαρμογή του t-test για σύγκριση κανονικοποιημένες τιμές (DCT) για όγκους και τους ελέγχους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, όλα τα υποψήφια miRNAs επέδειξε μεγάλο, στατιστικά σημαντικές διαφορές στην έκφραση σε όγκους APC (Σχ. 3Α) και CAC (Σχ. 3Β), σε σχέση με τον έλεγχο δειγμάτων.

microRNA αφθονία στις τέσσερις διαφορετικές δείγμα ομάδες ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Statminer και sno135 /miR-25 ως ενδογενή ελέγχους. έλεγχοι APC κανονικοποιήθηκαν στην APC όγκους (Πίνακας Α) και των ελέγχων CC να CAC όγκους (Πίνακας Β). Η αφθονία του κάθε ένα από τα 8 υποψήφιο miRNAs αναπαρίσταται ως αλλαγή log2 φορές (μέση τιμή Ct όγκου – μέση έλεγχο Ct) και p-τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το Limma εμπειρική Bayesian εφαρμογή του μετριάστηκε t-test

Η

Χρησιμοποιήσαμε εναύσματα μετατροπή συμβατικών cDNA TaqMan και αντιδραστήρια για την επιβεβαίωση qPCR διαφορική έκφραση των τεσσάρων miRNAs που παρουσίασαν κοινή ρυθμιστική αποκρίσεις στα δείγματα όγκων CAC και APC που χρησιμοποιήθηκε στην αρχική multiplex ανάλυση qPCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, καταστολή του miR-215 επιβεβαιώθηκε σε δύο δείγματα όγκου CAC και APC, ενώ επαγωγή miR-708, miR-31, και miR-135b επιβεβαιώθηκε παρομοίως σε όγκους των δύο προελεύσεων. Έχουμε ετοιμάσει μια επιπλέον σύνολο ελέγχων και των όγκων τόσο από χρόνιες κολίτιδα και ποντίκια APC και μετράται η αφθονία των miR-215, miR-708, miR-31, και miR-135b. Το Σχήμα 5 δείχνει ότι εντός του πειραματικού σφάλματος, τα αποτελέσματα που προβλέπεται από την σειρά κατάταξης στατιστικές αναλύσεις επικυρώθηκαν με ανεξάρτητο κοόρτη δείγμα.

Τα δείγματα RNA που αναλύθηκαν στα Σχήματα 2 και 3 μετατρέπονται σε cDNA χρησιμοποιώντας μεμονωμένες Taqman φουρκέτα RT εκκινητές, σε αντίθεση με την καθολική μίγμα εκκινητή που χρησιμοποιείται για τους πίνακες TaqMan. Έτσι διαφορετικά παρασκευάσματα cDNA παρασκευάστηκαν και προσδιορίστηκαν για miRNA αφθονία σε δείγματα APC (Πίνακας Α) και των δειγμάτων CAC (Πίνακας Β). MicroRNA αφθονία ομαλοποιήθηκε με sno135 και p-τιμές που υπολογίζονται με το πρωτόκολλο Statminer Limma. Τα δεδομένα για κάθε miRNA έχουν βαθμονομηθεί για την έκφραση (2ε-DCt) στο σχετικό δείγμα ελέγχου. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και την τυπική απόκλιση για κάθε miRNA, η = 4. * υποδηλώνει ρ-τιμή & lt?. 0.05

Η

Το RNA παρασκευάζεται από ένα ανεξάρτητο σύνολο των όγκων APC (n = 9) και τους ελέγχους ( n = 9) (Πίνακας Α) ή όγκους CAC (n = 4) και τους ελέγχους (η = 8) (Πίνακας Β). MicroRNA αφθονία μετρήθηκε με Taqman microRNA συγκεκριμένο στέλεχος PCR και κανονικοποιούνται με sno135. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Statminer και βαθμονομείται για έκφραση των μεμονωμένων miRNAs στα δείγματα ελέγχου. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή και την τυπική απόκλιση. * Υποδηλώνει p-value & lt?. 0.05

Η

έκφραση Focus miRNA σε πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου του ανθρώπου

Το πρότυπο της έκφρασης των miRNAs 8 εστίασης που παρατίθενται στον Πίνακα 1 συνεπάγεται ότι ορισμένες ή όλες τις Αυτά τα miRNAs μπορεί να παίζει έναν πιθανό ρόλο στην αιτιολογία των αδενωμάτων πρώιμο στάδιο που σχηματίζονται στα APC

Min /+ ποντίκια και /ή ποντίκια που έχουν υποβληθεί σε πειραματική χρόνια κολίτιδα. Μια έρευνα της βιβλιογραφίας δείχνει ότι ορισμένες από αυτές τις επικεντρώνονται miRNAs έχουν προηγουμένως αναφερθεί ότι εκφράζεται διαφορικά σε πρωτογενείς ανθρώπινους καρκίνους κόλου, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Τα microRNAs miR-31 και miR-135b έχουν αναφερθεί ότι επάγονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου, παρόμοια με η απάντηση που έχουμε παρατηρήσει σε όγκους πρώιμο στάδιο σε χρόνια φλεγμονή ή APC

Min /+ ποντίκια. Ομοίως, παρατηρήσαμε ρύθμιση προς τα κάτω του miR-215 σε όγκους και των δύο τύπων, και προς τα κάτω ρύθμιση του miR-133a στο CAC αλλά όχι APC όγκους. Και τα δύο αυτά miRNAs αναφέρθηκε ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινους καρκίνους του παχέος εντέρου [18], [21] – [23], [37]. Οι αναλύσεις μας δείχνουν ότι τα είδη αυτά miRNA που προκαλείται από πολύ νωρίς στο μετασχηματισμό και ίσως επηρεάσουν την πορεία που είναι κεντρικής σημασίας για τις διαδικασίες που είναι ανεξάρτητες από τον μηχανισμό πυροδότησης σηματοδότησης.

Η

Ανάλυση των πιθανών στόχων miRNA και λειτουργεί στις αρχές του όγκοι στάδιο

Αρκετές διαφορετικές αλγόριθμοι έχουν αναπτυχθεί για την πρόβλεψη των στόχων miRNA, με βάση διαφορετικές παραμέτρους για την αξιολόγηση συμπληρωματικά των αλληλουχιών σπόρων miRNA σε αλληλουχίες εντός του 3 ‘αμετάφραστες περιοχές των mRNA [10], [57] – [59 ]. Αν και αυτές οι αναλύσεις είναι πολύ από το τέλειο όσον αφορά την προβλεπτική ικανότητα, παραμένουν τα μόνα διαθέσιμα εργαλεία για την πρόβλεψη στόχων των miRNAs, και η έξοδος αυτών των αναλύσεων είναι χρήσιμη για την πρόβλεψη της υποθετικής συνδέσεις μεταξύ των miRNAs, στοχευμένες μονοπάτια, και βιολογικές λειτουργίες. Από διαφορετικών αλγορίθμων συχνά δώσουν διαφορετικά αποτελέσματα, χρησιμοποιήσαμε PicTar, μικρόκοσμος TargetScan και DianaT να δημιουργήσετε λίστες των πιθανών στόχων για κάθε ένα από τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Εμείς που περιλαμβάνονται στους καταλόγους αυτούς μόνον τους στόχους που διατηρούνται σε ποντικού και ανθρώπου μεταγραφές, και οι επιμέρους προβλέψεις συνενώθηκαν για να σχηματίσουν ένα κύριο κατάλογο των υποθετικών στόχων για τις τέσσερις miRNAs. Αυτή η λίστα στη συνέχεια αντιπαραβάλλονται με τα στοιχεία των μικροσυστοιχιών από απομονωμένα παχέος επιθηλιακά κύτταρα ποντικού άπω [60], και οι στόχοι που δεν βαθμολογήθηκαν ως «Παρόν» σε αυτά τα κύτταρα είχαν εξαλειφθεί. Τα επιμέλεια λίστες χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για την πρόβλεψη της οδού.

Εμείς επικεντρώθηκε στις 4 miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε πρώιμες βλάβες στάδιο τόσο της γενετικής και της φλεγμονώδους αιτιολογίας (miR-215, miR-31, miR-708, το miR -135b). Χρησιμοποιώντας τα φίλτρα που περιγράφηκαν ανωτέρω, προσδιορίσαμε 527 δυνητικών mRNAs στόχο που εκφράστηκαν σε κολικά επιθηλιακά κύτταρα ποντικού άπω. γονιδιακή ανάλυση οντολογία (Πίνακας 3) προσδιορίζονται Καρκίνου ως την κορυφαία βιολογική λειτουργία που σχετίζεται με αυτό το σετ γονιδίων, με 130 από τους στόχους 527 που συνδέονται με τον καρκίνο, μέσω των όρων GO (p-value φάσμα 5.86E

-05 με 2.87E

-02). GO όρων που συνδέονται με γονιδιακής έκφρασης αναδειχθεί ως η κορυφαία Μοριακής και Κυτταρικής Λειτουργίας, με 131 στόχους που συνδέονται με αυτήν την κατηγορία (p-value φάσμα 5.78E

-11 με 2.87E

-02). Η κορυφή λειτουργία Τοχ ήταν ΤΟΡ-β Σηματοδοσίας (p = 5.2E

-04, με 9/77 συστατικά σηματοδότησης που προσδιορίζονται ως πιθανοί στόχοι). Τα υπόλοιπα στατιστικά σημαντικές λειτουργίες Τοχ συνδέονταν με πυρηνικούς υποδοχείς που έχουν μελετηθεί εκτενώς στο πλαίσιο του κόλου επιθηλιακών κυττάρων φυσιολογίας και παθολογίας, συμπεριλαμβανομένων TR /RXR, VDR /RXR, και FXR /RXR.

Η

Αυτές οι υποθετικές λειτουργίες GO προβλέπουν μια ισχυρή σύνδεση μεταξύ των τεσσάρων διαφορικά εκφρασμένων miRNAs και το μετασχηματισμό του παχέος επιθηλιακών κυττάρων. Αυτή η υποθετική σύνδεση τονίζεται από τα στοιχεία που δείχνονται στο Σχήμα 6, στην οποία υποθετικό στόχοι miRNA (φαίνεται στο πράσινο) επιστρώνονται πάνω στα βασίζεται στη γνώση (Ingenuity) Molecular Mechanisms of Cancer κανονικού μονοπατιού (p = 1.14E

-06, 28 προβλέψει στόχους /372 συστατικά οδού). Κρίσιμες λειτουργίες σηματοδότησης της μεμβράνης που σχετίζονται με την Ras /MAPK, PI3K, και WNT /β-κατενίνης εκπροσωπούν τους δυνητικούς μηχανιστική σχέση μεταξύ αυτών των miRNAs και μετασχηματισμού, ενώ η πυρηνική λειτουργίες που συνδέονται με την RB /E2F ελέγχου προκύψουν ως πιθανοί μεσολαβητές έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Τέλος, όπως προκύπτει από την ανάλυση GO λειτουργίας Tox, TGF-β /ΒΜΡ σηματοδότηση /SMAD έχει ορισθεί ως μια πολύ σημαντική πιθανή σχέση μεταξύ αυτών των τεσσάρων miRNAs και το μετασχηματισμό του παχέος επιθηλιακών κυττάρων.

στόχων Υποθετικά mRNA για το 4 miRNAs εστίαση συντάχθηκαν χρησιμοποιώντας PicTar, μικρόκοσμος TargetScan, και βάσεις δεδομένων DianaT. Προβλεπόμενη στόχοι επικαλύπτονται σε γκρι για την εφευρετικότητα Μοριακοί μηχανισμοί του Καρκίνου κανονικής οδού.

Η

Συζήτηση

κεντρικός στόχος μας ήταν να συγκρίνει την έκφραση των miRNAs σε όγκους του παχέος εντέρου που οφείλονται σε χρόνια φλεγμονή και μεταλλάξεις βλαστικής σε συστήματα μοντέλο. Ήταν σαφές από νωρίς ότι η εξομάλυνση των δεδομένων θα είναι ένα ζήτημα, δεδομένου ότι ήμασταν συγκρίνοντας πολύ διαφορετικές καταστάσεις ιστού (

π.χ.

, χρόνια φλεγμονή ποντίκια σε πρότυπη εργαστηριακή τροφή έναντι ηλικίας τους κτηνοτρόφους για την υψηλή σε λιπαρά διατροφή.)? και δεν υπάρχουν καθιερωμένα αντικειμενικά κριτήρια για τον προσδιορισμό κατάλληλων ενδογενούς ελέγχου για την εξομάλυνση της έκφρασης των miRNAs υπό αυτές τις συνθήκες (Για μια επισκόπηση του θέματος, βλέπε [61]). πρώτος στόχος μας ήταν, επομένως, να χρησιμοποιήσει ένα ανεξάρτητο σύνολο του δείγματος για να συγκρίνετε διαφορετικά μοντέλα για την εξομάλυνση. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν άπω επιθηλιακά κύτταρα του κόλου από τον έλεγχο και την οξεία φλεγμονή των ιστών, χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό μοντέλο DSS οξεία κολίτιδα. Εξετάσαμε ένα πρώιμο, προ-φλεγμονώδη, κατάσταση, πριν από την ανιχνεύσιμη απώλεια ιστολογικών ακεραιότητας του περιφερικού κολονικό επιθήλιο, σκέφτεται να ελαχιστοποιούνται οι μεταβολές στην έκφραση miRNA που μπορεί να σχετίζονται με τη μαζική διήθηση των ανοσοκυττάρων. Χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές αναλυτικές προσεγγίσεις εντοπίσαμε 51 miRNA στόχους υψηλής προτεραιότητας που είναι πιθανό να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης σε επιθηλιακά κύτταρα στα πολύ πρώιμα στάδια του DSS που προκαλείται φλεγμονή. Παρά το γεγονός ότι τα ευρήματα αυτά αποτελούν, με τις γνώσεις μας, η πρώτη λεπτομερής έκθεση της διαφορικής έκφρασης των miRNAs σε αυτό το μοντέλο κολίτιδας, δεν έχουμε αναλύσει περαιτέρω τα δεδομένα αυτά. Μάλλον θα χρησιμοποιηθούν αυτά τα δεδομένα για να επικυρώσετε την επιλογή μας των στατιστικών σειρά κατάταξης για τον εντοπισμό διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Αυτή η αναλυτική προσέγγιση δεν απαιτεί αναγνώριση των κατάλληλων εσωτερικών ελέγχων και είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για την ανάλυση των σχετικά μικρών ομάδων δειγμάτων, δεδομένου ότι καμία υπόθεση δεν απαιτούνται περίπου ίση RNA φόρτωση ή την αποτελεσματικότητα της εκχύλισης των miRNAs ή μετατροπής cDNA από πολύ διαφορετικά είδη ιστών [62 ]. Σε γενικές γραμμές, οι διαφορές σειρά κατάταξης που παρατηρήσαμε συσχετίζονται καλά με αναλογικό αφθονία miRNA, που εκφράζεται ως DCT της διάμεσο κανονικοποιημένα δεδομένα ή DDCt στην sno135 /miR-25 κανονικοποιημένη (Statminer) αναλύσεις. Ωστόσο, οι τιμές p ανατεθεί από τα διάφορα στατιστικά μοντέλα διέφεραν σημαντικά, λόγω τουλάχιστον εν μέρει στο μικρό μέγεθος του δείγματος και η χρήση του μετριάστηκε (Limma εμπειρική Bayesian) έναντι απεριόριστου (t-test) προσεγγίσεις για την εκτίμηση της διακύμανσης. Δεδομένου ότι κάθε στατιστικό μοντέλο είναι πιθανό να σπάσει με μικρά σύνολα δειγμάτων, έχουμε εκλεγεί για να χρησιμοποιεί τα απλούστερα, πιο συντηρητική προσέγγιση: στατιστικές σειρά κατάταξης. Χρησιμοποιήσαμε Statminer κανονικοποίηση (κατά sno135 και miR-25) για να εξαγάγετε σχετική αφθονία των miRNAs.

στατιστικά στοιχεία προκειμένου κατάταξη χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει 8 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs σε όγκους που σχηματίζονται στα άπω παχύ έντερο του APC

Min /+ ποντίκια και χρόνια φλεγμονή ποντίκια. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι όγκοι αυτοί είναι κυρίως αδενωμάτων και έτσι αντιπροσωπεύουν ένα πολύ πρώιμο στάδιο μετασχηματισμού. Θα πρέπει επίσης να τονίσουμε ότι αυτά τα 8 miRNAs αντιπροσωπεύουν μόνο τα πιο εμφανή, και ως εκ τούτου πιθανόν η πιο επαναλήψιμη, αλλαγές στην έκφραση των miRNAs σε αυτά τα δείγματα.