Αφηρημένο

Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) προάγει την κυτταρική κινητικότητα, εισβολής και της μετάστασης κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και ογκογένεση. Ο μετασχηματισμός του αυξητικού παράγοντα-β (ΤΟΡ-β) μονοπατιού σηματοδότησης είναι ένας βασικός ρυθμιστής του EMT. Πολλές ενδείξεις υποδηλώνουν ότι αυτή η διαδικασία είναι Smad3-εξαρτώμενη. Εδώ δείξαμε ότι η έκθεση του ASPC-1 και Panc-1 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα να ΤΟΡ-β1 οδήγησε σε χαρακτηριστικές μορφολογικές αλλοιώσεις του ΕΜΤ, και ενίσχυση της κυτταρικής κινητικότητας και gemcitabine (Gem) αντίσταση μαζί με ένα άνω ρύθμιση του ΕΜΤ Σημάδια γονιδίων όπως ως βιμεντίνη, Ν-cadherin, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Naringenin (Nar) προς τα κάτω ρυθμισμένα δείκτες EMT έκφραση τόσο του mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης με αναστολή ΤΘΡ-β1 /Smad3 οδού σήματος στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Κατά συνέπεια, Ναρ κατέστειλε την μετανάστευση κυττάρων και εισβολή και να αντιστραφεί η αντοχή τους σε Gem

Παράθεση:. Lou C, Zhang F, Yang Μ, Zhao J, Zeng W, Fang Χ, et al. (2012) Naringenin Μειώσεις της διεισδυτικότητας και τη μετάσταση με ανασταλτική ΤΟΡ-β-Induced Επιθηλιακά να μεσεγχυματικά μετάβαση σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (12): e50956. doi: 10.1371 /journal.pone.0050956

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Φλεβάρη του 2012? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Δεκ 2012

Copyright: © 2012 Lou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών Φύση της Κίνας (81173633), επιχορηγήσεις από το κράτος Βασικά σχέδιο Ανάπτυξης του έργου (2011CB707705), το Ίδρυμα Ερευνών του Υπουργείου Υγείας της επαρχίας Heilongjiang (2010-107) και το Ταμείο εκκίνησης των συνδεδεμένων Τρίτο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Χαρμπίν (JJ2010-15). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια ιδιαίτερα επιθετικός όγκος που χαρακτηρίζεται από νωρίς αιματογενή και λυμφογενή εξάπλωση και υψηλά ποσοστά τοπικής υποτροπής [1]. Η αποτυχία της κλινικής θεραπείας των ασθενών με καρκίνο συχνά αποδίδεται σε αντίσταση στο φάρμακο και μετάσταση όγκου [2]. Ωστόσο, εξακολουθεί να υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία διαθέσιμη για την αναστροφή αντοχής πολυ-φαρμάκου και να αποτρέψει την επιθετικότητα και τη μετάσταση του όγκου του παγκρέατος [3], [4], [5]. Έτσι, μια καλύτερη κατανόηση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα και τη μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη περισσότερο αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγική.

Κατά τα τελευταία αρκετά χρόνια, συσσωρεύοντας ενδείξεις υποδεικνύουν ότι τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου, της μετάστασης και της αντίστασης στα φάρμακα σε διάφορους συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [6], [7], [8]. Αυτή η διαδικασία χαρακτηρίζεται από την απώλεια των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών απόκτησης χαρακτηριστικών [9], [10]. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης EMT, η έκφραση δεικτών μεσεγχυματικών, όπως βιμεντίνη, Ν-cadherin και /ή φιμπρονεκτίνη, είναι αυξημένη, σε συμβόλαιο, ότι επιθηλιακού μορίων προσκόλλησης, συμπεριλαμβανομένου του Ε-καδερίνης ή /και κυτοκερατίνες, μειώνεται. Επιπλέον, τα επιθηλιακά κύτταρα αποκτούν επίσης την αυξημένη δραστικότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs), συμπεριλαμβανομένων των ΜΜΡ2, ΜΜΡ3, ΜΜΡ9, τα οποία συμβάλλουν σε μια επεμβατική και μεταστατικό φαινότυπο [11], [12]. Όπως είναι γνωστό ότι κύτταρο όγκου μετάσταση είναι η κύρια αιτία θανάτου για τους ασθενείς με καρκίνο, ο έλεγχος της διαδικασίας EMT παραμένει προτεραιότητα για παγκρεατικό θεραπεία του καρκίνου.

Προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι ο αυξητικός παράγοντας μεταμόρφωσης β1 (ΤΟΡ- β1) και άλλους παράγοντες ανάπτυξης παίξει καθοριστικό ρόλο στην οδήγηση EMT στην παθογένεση του καρκίνου του παγκρέατος [13], [14], [15]. ΤΟΡ-β υπερέκφραση προωθεί μετάσταση όγκου στο προχωρημένο στάδιο της όγκου [16]. Ανάπτυξη αναστολέων σηματοδότησης ΤΟΡ-β έχει θεωρηθεί ως ένα ελκυστικό τρόπο για την πρόληψη της μετάστασης του όγκου. Επί του παρόντος, έχει αναπτυχθεί ένας αριθμός από ενέσιμες αναστολέων που βασίζονται σε πρωτεΐνη ΤΟΡ-β, περιλαμβανομένων των αντισωμάτων που διασπούν την δέσμευση με τον υποδοχέα ρίζας συνδέσεως ΤΟΡ-β, και τα ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν ΤΟΡ-β1 mRNA [17], [18], [19]. Αναστολείς μικρά μόρια με ένα συγκεκριμένο στόχο σε αυτό το μονοπάτι σηματοδότησης έχουν σημαντικά πλεονεκτήματα σε σταθερότητα και βιοδιαθεσιμότητα σε σύγκριση με μακρομοριακές υποψηφίους. Μέχρι σήμερα, έχουν διάφορους αναστολείς μικρού μορίου έχει αποδειχθεί ότι κατέχουν επιδράσεις αναστολής επί της λειτουργίας του υποδοχέα ΤΟΡ-β [20], [21].

πρόσφατες μελέτες μας έχουν δείξει ότι Naringenin (Ναρ, 4 ‘, 5, 7-τριυδροξυ φλαβανόνη), ένα φυσικό κυρίαρχο φλαβανόνη, ανέστειλε σημαντικά την μεταγραφή του ΤΟΡ-β1 που προκαλείται Smad3, και μείωσε τον δεσμευτικό πιθανότητα του ΤΟΡ-β1 σε ειδικό υποδοχέα του TβRII, αναστέλλοντας έτσι την διμερισμό του υποδοχέα και την επακόλουθη κατάντη μεταγωγή σήματος. Επιπλέον, Nar μπορεί να ενισχύσει το αποτέλεσμα κατά του όγκου δοξορουβικίνης προς Α549 και MCF-7 κύτταρα Caner με επιλεκτική αναστολή της δραστικότητας της αντίστασης που σχετίζεται με πρωτεΐνη πολυφαρμακευτικής αλλά όχι π-γλυκοπρωτεϊνης [22], [23], [24], [25 ]. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης δυνατότητα της στην αγωγή του καρκίνου ως ΤΟΡ-β ανταγωνιστής σηματοδότησης.

Εδώ, προσπαθούμε να αντιμετωπιστούν αν Nar ασκεί αντι-μεταστατικές και αντι-ανθεκτικά επιπτώσεις του στην παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μέσω της πρόληψης του όγκου κύτταρα EMT μέσω προς τα κάτω ρύθμιση της οδού TGF-β /Smad3 σηματοδότησης. Η μελέτη αυτή μπορεί να παρέχουν λογικές εξηγήσεις για την αποτελεσματικότητα κατά του όγκου Nar, καθώς και θεραπευτικά οφέλη σε συνδυασμό Nar με άλλα φάρμακα κατά του καρκίνου.

Αποτελέσματα

Nar αντιστρέφει ΤΟΡ-β1 επαγόμενη αντίσταση στην gemcitabine σε ASPC-1 κύτταρα

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι ASPC-1 και Panc-1 παγκρεατικού καρκίνου κύτταρα ήταν ανθεκτικά σε gemicitabin (Gem) και είχε την ικανότητα να διεισδυτικότητα και τη μετάσταση [26]. Gem είναι μια κοινή χημειοθεραπευτικό φάρμακο για ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος σε κλινικό περιβάλλον. Για να εξεταστεί εάν Nar ενισχύει την ευαισθησία των δύο αυτών κυτταρικών γραμμών σε Gem, προσδιορίσαμε την πιθανή τοξικότητα των κόσμημα για ASPC-1 και κύτταρα 1 Panc-μέσω δοκιμασίας ΜΤΤ σε παρουσία ή απουσία Nar. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και Β, έκθεση των ASPC-1 και Panc-1 κύτταρα να Nar για 72 ώρες οδήγησε σε IC

50 (συγκέντρωση αναστολής αύξησης κατά 50%) τιμές από 347 ± 13,6 μΜ και 541 ± 11,9 μΜ, αντίστοιχα. Nar ελαφρώς ενισχυμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέχρι 100 μΜ. Επιπλέον, μετρήθηκε η κυτταρική βιωσιμότητα μετά από 24 h προ-επεξεργασία 50 μΜ Ναρ, που ακολουθείται από 72 ώρες αγωγή με διαφορετικές συγκεντρώσεις Gem σε ASPC-1 κύτταρα. Το IC

50 τιμές ήταν 5,3 ± 0,4 μΜ για Gem μόνο και 2,6 ± 0,4 μΜ για Gem παρουσία Ναρ, υποδεικνύοντας Nar αυξάνει σημαντικά την κυτταροτοξικότητα της Gem να ASPC-1 κυττάρων (Σχήμα 2Α). Όπως οδού σήματος ΤΟΡ-β παίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της αντίστασης των καρκινικών κυττάρων στη χημειοθεραπεία, εξετάσαμε τις επιδράσεις της Nar στην κυτταροτοξικότητα των Gem στα κύτταρα διεγερμένα με ΤΟΡ-β1. Όπως αναμενόταν, ο ΤΟΡ-β1 διέγερση ενισχυμένη ASPC-1 κύτταρα αντίσταση σε Gem σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (IC

50 & gt? 10 μΜ έναντι 5.3 ± 0.4 μΜ Σχήμα 2Β). προηγούμενες μελέτες μας έχουν ήδη αποδείξει ότι Nar μείωσε σημαντικά το επίπεδο ΤΟΡ-β1 στον ορό σε επαγόμενες από τη βλεομυκίνη μοντέλο ινών των πνευμόνων, και κατά συνέπεια, αποτρέπεται η μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα [22]. Ως εκ τούτου, μπορούμε να υποθέσουμε ότι Ναρ μπορεί να έχει την ικανότητα να αντιστρέψει TGF-β1 που προκαλείται από την αντίσταση των κυττάρων ASPC-1 σε Gem. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα για να δοκιμαστεί η ιδέα. Τα κύτταρα προ-θεραπεία με 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 για 24 ώρες, ακολουθούμενη από διάφορες συγκεντρώσεις Gem παρουσία ή απουσία 50 μΜ Nar για 72 ώρες, η βιωσιμότητα ανιχνεύθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η προσθήκη του ΤΟΡ-β1 αύξησε την αντίσταση του ASPC-1 κύτταρο να Gem ενώ Nar ανέστρεψε την ανθεκτικότητα ΤΟΡ-β1 που προκαλείται. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο TGF-β1 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αντίσταση καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτική φάρμακα όπως Gem.

(Α) ASPC-1 ή (Β) Panc-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Nar για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάστηκαν με ΜΤΤ. Δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SD (

n

= 4) από ξεχωριστά πειράματα σημεία. IC50 πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS.

Η

(Α) 50 μΜ Nar προεπεξεργασία επί 24 ώρες, που ακολουθείται από το κτένισμα με διαφορετικές Gem δόση για 72 ώρες σε κύτταρα ASPC-1. (Β) Η προ-θεραπεία με 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 για 24 ώρες, ακολουθούμενη από κατεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις Gem παρουσία ή απουσία 50 μΜ Nar για την επόμενη 72 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει την μέση ± SD (

n

= 4) από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.005

Η

Nar καταστέλλει ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μετανάστευση και εισβολή του Panc-1 και ASPC-1 κύτταρα

επόμενο καθοριστεί αν Ναρ μπορούν να αναστείλουν TGF-β επαγόμενη EMT, το οποίο συνδέει επίσης με την κυτταρική κινητικότητα. Όπως ήταν αναμενόμενο, μορφολογικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης επαφής κυττάρου-κυττάρου και διασταύρωση, το δημιούργησε ίνα και τους τύπους βελόνα ψευδή πόδια, παρατηρήθηκαν αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β1 για 30 ώρες (Σχήμα 3Ε), υποδεικνύοντας εμφάνιση EMT. Επιπλέον, μια επουλωτική των πληγών δοκιμασία διεξήχθη, το αποτέλεσμα έδειξε ότι η θεραπεία του Panc-1 κύτταρα με ΤΟΡ-β1 για 36 ώρες οδήγησε σε περίπου 80% κλείσιμο του τραύματος (Σχήμα 3AJ) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3Ag), υποδεικνύοντας ότι TGF-β1 σημαντικά επιταχυνόμενη διαδικασία EMT. Ωστόσο, η θεραπεία με 50 μΜ ή 100 μΜ Nar για 36 ώρες ή 72 ώρες ανέστειλε σημαντικά την ΤΟΡ-β1-επαγόμενο κυτταρικό μορφολογικές αλλαγές και το κλείσιμο της πληγής (Εικόνα 3Akl

vs

j? Σχήμα 3Aqr

vs

σ). Επιπλέον, εν απουσία TGF-β1, η θεραπεία με 50 μΜ ή 100 μΜ Nar για 72 ώρες εμποδίζεται επίσης σημαντικά το 60% περίπου των κυττάρων του τραύματος κλείσιμο (Σχήμα 3Ano

π.ισχ.

M). Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι τα ενδογενή ή εξωγενή TGF-β1 ενισχύει αποτελεσματικά Panc-1 κύτταρα μετανάστευση αλλά Ναρ μπορεί να αντιστρέψει τη διαδικασία αυτή. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε κύτταρα ASPC-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) επούλωσης τραυμάτων δοκιμασία, Panc-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 80% συρροή. Οι μονοστιβάδες τέμνεται με ένα ρύγχος πιπέτας στην κεντρική περιοχή της καλλιέργειας. ΤΟΡ-β1 και Nar προστέθηκε όπως υποδεικνύεται φορές. Ελήφθησαν φωτογραφίες χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (μεγέθυνση κατά χ 100) αμέσως μετά την τομή και μετά από 36 ώρες και 72 ώρες της θεραπείας. (Β και Γ) προσδιορισμό εισβολή Transwell (Β για ASPC-1 κύτταρα και C για Panc-1cells). Σε Matrigel επικαλυμμένα ενθέτου κυτταρικής καλλιέργειας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. Τα κύτταρα που είχαν εισβάλει στην κατώτερη επιφάνεια του φίλτρου χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και φωτογραφήθηκαν. δοκιμασίες μετανάστευσης (D) Transwell. Σε μη επικαλυμμένα με Matrigel ενθέτου κυτταρικής καλλιέργειας, για τον ποσοτικό προσδιορισμό της μετανάστευσης, τα χρωματισμένα κύτταρα λύθηκαν σε DMSO και η απορρόφηση τους μετρήθηκε. (Ε) Cell υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 για 30 ώρες, το φαινόμενο της ΕΜΤ παρατηρήθηκε από μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων. Αυτά τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.005

Η

Επίσης, εξετάσαμε τις επιδράσεις της Ναρ για TGF-β1 που προκαλείται από την εισβολή και τη μετανάστευση στην ASPC-1 και Panc-1 κύτταρα χρησιμοποιώντας Transwell προσδιορισμούς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία ΤΟΡ-β1 ενισχυμένη σημαντικά την ικανότητα του ASPC-1 (Σχήμα 3BD

vs

α) και Panc-1 κύτταρα (Σχήμα 3Cj

vs

ζ) διασχίζουν τη μήτρα βασικής μεμβράνης . Panc-1 κύτταρα παρουσίασαν περισσότερο επιθετική επεμβατική δραστικότητα από ASPC-1 κύτταρα ανταποκρίνονται σε ΤΟΡ-β1 διέγερση (Σχήμα 3Cj

π.ισχ.

Σχήμα 3BD). Είναι ενδιαφέρον, 50 μΜ Nar ανέστειλε σημαντικά την ικανότητα του επεμβατική ASPC-1 (Σχήμα 3ββ

vs

α) και Panc-1 κύτταρα (Σχ. 3C h.

vs

g) απουσία ή παρουσία ΤΟΡ-β1 (Σχήμα 3Β e

vs

d?. Σχήμα 3Ck

vs

j), 100 μΜ του Nar έδειξε εντονότερη ανασταλτική επίδραση από 50 μΜ Nar σε αυτές τις δύο κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 3BC

vs

bf

vs

e & amp? Σχήμα 3Ci

vs

hl

vs

k). Σε Transwell δοκιμασία μεταναστεύουν, να ποσοτικοποιηθούν οι μεταναστεύσει κύτταρα, διαλύσαμε τα κύτταρα και στη συνέχεια χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες σε DMSO. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης (Σχήμα 3D). Στο σύνολό τους, παρέχουμε ισχυρές ενδείξεις ότι Nar μπορεί αναστέλλουν ισχυρά και τα βασικά και εξωγενούς ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μετανάστευση και εισβολή σε ASPC-1 και Panc-1 κύτταρα.

Nar αναστέλλει τη διαδικασία των επιθηλιακών να μεσεγχυματικών μετάβασης ( ΕΜΤ) μειώνοντας έκφραση δεικτών μεσεγχυματικών

Για να ελεγχθεί αν Nar ρυθμίζει την παραγωγή της εξωκυττάριας μήτρας και την έκφραση των γονιδίων δεικτών EMT σε ASPC-1 και Panc-1 κύτταρα παρουσία ή απουσία TGF-β1, διεξήχθη πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση. Οι εκκινητές των δεικτών μεσεγχυματικών φαίνονται στον Πίνακα 1. Ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα σε επεξεργασία με όχημα ή 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 ή 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 συν Nar (50 μΜ, 100 μΜ). Κύτταρα κατεργασμένα με 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 για 24 ώρες οδήγησε σε σημαντική αύξηση των δεικτών EMT mRNAs όπως βιμεντίνη, Ν-cadherin, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Εν τω μεταξύ, βρέθηκε ότι τα επίπεδα του mRNA του ΤΟΡ-β1 επαγόμενη δείκτες EMT ήταν σημαντικά μειωμένες στις Nar επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 4Α, Β, C & amp? D). Για να αξιολογηθεί κατά πόσο οι αλλαγές της Ε-καδερίνης, βιμεντίνη, Ν-cadherin, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 στην έκφραση του γονιδίου συνδέονται επίσης με τις αλλαγές τους στη πρωτεϊνικό επίπεδο, στύπωμα Western διεξήχθη μετά τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 με ή χωρίς 50 μΜ Nar (Σχήμα 4Ε & amp? F). Οι ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο Bio-Rad 620Video Densitometer με ένα πακέτο λογισμικού Analyst 1-Δ για Macintosh. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι Nar μειώθηκε προφανώς τις εκφράσεις του βιμεντίνης, Ν-cadherin, πρωτεΐνες ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9, και αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης, με ή χωρίς θεραπεία ΤΟΡ-β1 (Σχήμα 4G & amp? Η). Επιπλέον, ανιχνεύσαμε επίσης μία ζώνη 68 kDa, δραστική μορφή ΜΜΡ2, και μία ζώνη 72 kDa, τον πρόδρομο του ΜΜΡ2. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι θα μπορούσε να αναστείλει Nar ΤΟΡ-β1 επαγόμενη EMT σε ASPC-1 και Panc-1 κύτταρα.

(Α-Δ) έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών της διαδικασίας ΕΜΤ σε επίπεδο mRNA μετρήθηκε με qRT -PCR. ASPC-1 κύτταρα και Panc-1 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 50 μΜ ή 100 μΜ Nar για 24 ώρες που ακολουθείται από την απουσία ή την παρουσία του ΤΟΡ-β1 για άλλες 24 h (Α: βιμεντίνη, Β: Ν-cadherin, C: ΜΜΡ2, D: MMP9).

# p & lt? 0,05,

## p & lt?. 0.01

π.ισχ

Ελέγχου.

* p & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

π.ισχ

5 ng /ml ΤΟΡ-β1 και μόνο. (Ε και F). Η έκφραση της πρωτεΐνης των δεικτών ΕΜΤ μετρήθηκε με κηλίδα western (F για ASPC-1 κύτταρα και G για Panc-1 κύτταρα). (G και Η) Αξία πυκνομετρική σάρωση χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των αλλαγών των δεικτών μεσεγχυματικών (H για κύτταρα ASPC-1, Ι για Panc-1 κύτταρα). Τα δεδομένα ήταν μέσες τιμές ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Ναρ ασκεί την επίδρασή του στην πορεία του σήματος TGF-β1 με τη ρύθμιση Smad3

Στο κλασικό Smad-εξαρτώμενη μονοπάτια, ΤΟΡ β επαγόμενη ενεργοποίηση του συμπλόκου υποδοχέα οδηγεί σε φωσφορυλίωση των Smad2 και Smad3, σε συνεργασία με Smad4 ως ΤΟΡ-β επαγόμενη ρυθμιστές μεταγραφής. Σε αντίθεση, Smad6 και Smad7 αναστέλλουν την ενεργοποίηση του υποδοχέα Smads ρυθμιζόμενων [27], [28], [29]. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήσαμε RT-PCR για να εξεταστεί η έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της σηματοδότησης ΤΟΡ-β. ASPC-1 και Panc-1 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 50 μΜ ή 100 μΜ Nar για 24 ώρες, ακολουθούμενη από επεξεργασία με ή χωρίς ΤΟΡ-β1 για άλλες 24 ώρες. Τα επίπεδα mRNA του TβRI, TβRII, Smad2, Smad3, Smad4 και Smad7 παρακολουθήθηκαν με RT-PCR και ποσοτικά. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Nar δεν είχε καμία επίδραση επί των επιπέδων mRNA του TβRI, TβRII και Smad2, ακόμη και σε υψηλές συγκεντρώσεις (100 μΜ) (Εικόνα S1). Εντούτοις, επεξεργασμένα με ΤΟΡ-β1, Nar αισθητά κάτω ρυθμισμένα το επίπεδο του mRNA της Smad3 (Σχήμα 5Α & amp? C. λωρίδα 5, 6

π.ισχ

2). Σε περίπτωση απουσίας του ΤΟΡ-β1, 50 μΜ Nar είχε μόνο μια σχετικά μικρή επιρροή στην Smad3 mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 5Α & amp? C. λωρίδα 3, 4

vs

1), αλλά 100 μΜ Nar προφανώς μειώθηκε το επίπεδο της πρωτεΐνης Smad3 (Σχήμα 5Fab. λωρίδα 6

vs

1). Αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι Nar ρυθμίζουν προς τα κάτω το επίπεδο της πρωτεΐνης Smad3 ανεξάρτητος του ΤΟΡ-β1. Στην οδό σηματοδότησης ΤΟΡ-β, η φωσφορυλίωση της Smad3 από TβRII είναι ένα βασικό βήμα για την μεταγωγή σήματος. Γι ‘αυτό, εξετάστηκε αν Ναρ μπορεί να αναστείλει επαγόμενη φωσφορυλίωση TGF-β1 της Smad3. Βρήκαμε ΤΟΡ-β1 προκάλεσε μια σημαντική αύξηση στο επίπεδο της φωσφο-Smad3 ενώ Nar μείωσε σημαντικά ΤΟΡ-β1-επαγόμενη φωσφορυλίωση της Smad3, τα οποία επίδραση μπορεί να σχετίζεται με το μειωμένο επίπεδο πρωτεΐνης Smad3 επάγεται από Nar. Επιπλέον, αυτή η ανασταλτική επίδραση του Nar ήταν παράλληλη με δοσολογίες του χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ASPC-1 και Panc-1 κύτταρα. (Σχήμα 5F α & amp? Β)

Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 50 μΜ και 100 μΜ ή 10 Nar μΜ και 20 μΜ SB431542 για 24 ώρες πριν, με ή χωρίς προσθήκη 5 ng ΤΟΡ-β1 /ml για 24 ώρες επώαση για RT-PCR ή 36 ώρες επώαση για western blot. (Α και Β, Ε) Το επίπεδο του mRNA του TβRI, TβRII, Smad2, Smad3 και Smad7 προσδιορίστηκαν με RT-PCR (Α για ASPC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με Nar, Β για Panc-1 κύτταρα επεξεργασμένα με Nar, Ε για Panc -1 κύτταρα κατεργασμένα με SB431542, το αποτέλεσμα ήταν παρόμοιο για κύτταρα ASPC-1, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). (Γ και Δ) Αξία πυκνομετρική σάρωση χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των αλλαγών του mRNA της Smad3 και Smad7 (C για ASPC-1 κύτταρα και D για Panc-1 κύτταρα επεξεργασμένα με Nar). (F και G) Το επίπεδο του ρ-Smad3 μετρήθηκε με western blot. (F. Α για ASPC-1 κύτταρα και F. b για Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με Nar, G για Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με SB431542, το αποτέλεσμα ήταν παρόμοιο για κύτταρα ASPC-1, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα δεδομένα μέσα ± SD για τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

Για να καταδειχθεί περαιτέρω ο ρόλος του μειορύθμιση της Smad3 στην ανασταλτική επίδραση της Nar επί TGF-β1 μεσολάβηση φαινότυπο όπως η μετανάστευση, εξετάζουμε εάν η εξωγενής υπερέκφραση της Smad3 μπορεί να αντιστρέψει την ανασταλτική δράση του Ναρ. Κατασκευάσαμε τον φορέα έκφρασης GFP-Smad3 χρησιμοποιώντας πλήρους μήκους ανθρώπινο θραύσμα Smad3 από τον φορέα pCMV5B-Smad3 [38] συνδέθηκε εντός του κατασκευάσματος GFP-C1 (Clonetech). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της Nar για τη μετανάστευση των Panc-1 κύτταρα επιμολυσμένα με GFP-Smad3 και πλασμίδιο ελέγχου GFP-C1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο Smad3 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης αυξήθηκαν σημαντικά στις GFP-Smad3-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με GFP-C1-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 6C & amp? D), ενώ 100 μΜ Nar μειώθηκε αποτελεσματικά την έκφραση Smad3 τόσο στο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης στο GFP-C1-επιμολυσμένα κύτταρα, αλλά απέτυχε να μειώσει σημαντικά την έκφραση του Smad3 σε GFP-Smad3-επιμολυσμένα κύτταρα στην παρούσα του ΤΟΡ-β1. Σημαντικά, transwell δοκιμασία μετανάστευσης (Σχήμα 6 Α & amp? Β) έδειξε ότι 100 μΜ Nar προφανώς ανέστειλε ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μετανάστευση σε GFP-C1-επιμολυσμένα κύτταρα (ρ & lt? 0,01), ενώ εξωγενή υπερέκφραση Smad3 εξασθένισε σημαντικά την ανασταλτική δράση του Nar επί TGF-β1 επαγόμενη μετανάστευση. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Nar μπορεί ειδικώς αναστέλλουν την ενδογενή έκφραση της Smad3 και στη συνέχεια μειώνει την φωσφορυλίωση της Smad3, έτσι, ρυθμίζει προς τα κάτω ΤΟΡ-β1 επαγόμενη μεταγωγή σήματος.

(Α) δοκιμασία μετανάστευσης Transwell, σε μη Matrigel- επικαλυμμένο ενθέτου κυτταρικής καλλιέργειας, Panc-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με GFP-Smad3 ή GFP-C1 πλασμίδιο για 6 ώρες, στη συνέχεια πλένονται, άλλαξε σε πλήρες DMEM με 0.1% DMSO, 100 μΜ Nar για 24 ώρες, στη συνέχεια έκθεση σε 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 ή ο συνδυασμός των 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 και 100 μΜ Nar για επόμενες 24 ώρες. Όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα κύτταρα που είχαν εισβάλει στην κατώτερη επιφάνεια του φίλτρου χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και φωτογραφήθηκαν. δοκιμασίες μετανάστευσης (Β) Transwell. Σε μη επικαλυμμένα με Matrigel ενθέτου κυτταρικής καλλιέργειας, για τον ποσοτικό προσδιορισμό της μετανάστευσης, τα χρωματισμένα κύτταρα λύθηκαν σε DMSO και η απορρόφηση τους μετρήθηκε. Αυτά τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01. *** P & lt? 0.005. (Γ) και (Δ) κύτταρα Panc-1 επιμολύνθηκαν με GFP-Smad3 ή GFP-C1 πλασμίδιο για 6 ώρες, στη συνέχεια πλύθηκε, άλλαξε σε πλήρες μέσο, ​​100 μΜ Nar για 24 ώρες, στη συνέχεια έκθεση σε 5 ng /ml ΤΟΡ- β1 ή ο συνδυασμός των 5 ng /ml ΤΟΡ-β1 και 100 μΜ Nar για επόμενες 24 ώρες για qRT-PCR (C) ή Western blot (D).

η

από την άλλη πλευρά, SB- 431.542, ένας πολύ γνωστός ειδικός αναστολέας της TβRI, έχει δειχθεί ότι αναστέλλει την φωσφορυλίωση της Smad2 /Smad3 [30]. Στη μελέτη μας, SB-431542 απέτυχε να επηρεάσει την έκφραση του mRNA της Smad3 και Smad7 (Σχήμα 5Ε), αλλά μείωσε την φωσφορυλίωση της Smad3 σε Panc-1 κύτταρα (Σχήμα 5G). Το παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επίσης σε ASPC-1 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι Nar έχει ένα διαφορετικό μηχανισμό από SB-431542 για την αναστολή της ΤΟΡ-β μεσολάβηση βιολογικές επιδράσεις. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι Ναρ ασκεί την επίδρασή του στην πορεία του σήματος TGF-β1, κυρίως μέσω ρύθμισης προς τα κάτω Smad3.

Συζήτηση

EMT προωθεί καρκινικά κύτταρα μετανάστευση και την επεμβατική από την τοποθεσία προέλευσης και διάχυση στο μακρινό ιστούς και όργανα, και επίσης μεσολαβεί καρκινικά κύτταρα αναπτύσσουν αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Αυτή η διαδικασία ενεργοποιείται τόσο από την αυτοκρινή και παρακρινή τα σήματα του ΤΟΡ-β. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι ο ΤΟΡ-β μόνοι ή σε συνδυασμό με άλλους αυξητικούς παράγοντες όπως EGF παίζει ζωτικό ρόλο στη διαμεσολάβηση EMT σε πολλούς κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παγκρέατος [31], [32]. Έτσι ρύθμιση οδού σήματος ΤΟΡ-β είναι αποτελεσματική στρατηγική για τον έλεγχο της εξέλιξης του καρκίνου.

Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι Nar αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος να Gem παρουσία ή απουσία TGF-β1. ΤΟΡ-β1 ενίσχυσε σημαντικά την αντίσταση του ASPC-1 κύτταρα να Gem αλλά Nar αντιστράφηκε πλήρως ΤΟΡ-β1 επαγόμενη αντίσταση, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να μπλοκάρει Nar ΤΟΡ-β1 διαμεσολάβηση μεταγωγής σήματος. Αυτό το εύρημα ήταν επίσης σε καλή συμφωνία με προηγούμενες αναφορές μας ότι Nar έχει ικανότητες για να αναστέλλουν την έκκριση ΤΟΡ-β1 και να μειώνουν τη δέσμευση πιθανότητα του ΤΟΡ-β1 σε ειδικό υποδοχέα του TβRII [22], [23]. Μία από προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι Nar ενισχυμένη αντικαρκινική δράση της δοξορουβικίνης σε Α549 και MCF-7 κύτταρα Caner με επιλεκτική ρύθμιση οδούς εκροής φαρμάκου [25]. Άλλοι ερευνητές διαπίστωσαν επίσης ότι Nar έδειξε υψηλή antineoplasic δραστηριότητες κατά της κλασικής υπογραμμή MDR που προέρχονται από το γαστρικό (EPG85-257), του παγκρέατος (EPP85-181), και του παχέος εντέρου (ΗΤ-29) καρκινώματα κυτταρικές σειρές καρκίνου, καθώς και άλλα που προέρχονται πολυανθεκτική κυτταρικές γραμμές [33]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι μπορεί να υπάρχει μια σχέση μεταξύ της οδού σήματος ΤΟΡ-β1 και τα μονοπάτια αντοχής πολυφαρμάκου, η οποία πρέπει να διερευνηθεί στο μέλλον.

Επιπλέον, Nar ανέστειλε σημαντικά ΤΟΡ-β1 επαγόμενη EMT μειώνοντας την έκφραση του βιμεντίνη, Ν-cadherin, ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 τόσο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Στη συνέχεια εξετάστηκε /Smads έκφραση γονιδίων σήμα που σχετίζεται μονοπάτι ΤΟΡ-β στα ASPC-1 και Panc-1cells, και βρήκαν ότι Nar ειδικά κάτω-ρυθμισμένη έκφραση Smad3 σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές και εξωγενή έκφραση του Smad3 θα μπορούσαν να παρακάμπτουν αποτελεσματικά την ανασταλτική δράση του Nar επί TGF-β1 που προκαλείται φαινότυπο EMT όπως η μετανάστευση. Άλλοι ερευνητές ανέφεραν ότι Smad ουμπικουιτίνωση ρυθμιστικούς παράγοντες (Στρουμφάκια) που προκαλείται Smad3 ουμπικουιτίνωση για αποτέλεσμα την υποβάθμιση του πρωτεασώματος στη διακοπή του σχηματισμού της Smad3 συγκροτήματα για να απενεργοποιήσετε TGF-β μεταγωγής [34] σηματοδότησης. Στη μελέτη μας, τα αποτελέσματα της Ναρ μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης Smad3 μπορεί να είναι ανεξάρτητη από TGF-β1, το οποίο ακριβής μηχανισμός παραμένει ασαφής. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν σαφώς ότι Ναρ εμποδίζει τη διαδικασία EMT των καρκινικών κυττάρων από τα κάτω ρύθμιση της μεταγωγής TGF-β /Smad3 σηματοδότησης. Αυτό το εύρημα παρέχει μια λογική εξήγηση γιατί Nar έχει ευνοϊκές κατά των όγκων μεταστατική αποτελεσματικότητα in vivo με ελαφρά τοξικότητα σε κύτταρα όγκου in vitro [22], [35]. SB-431542 [36], ένα μικρό μοριακό αναστολέα του TβIR, είχε δειχθεί ότι αναστέλλει ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT με τη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης του Smad2 /3 σε κύτταρα όγκου, η οποία είναι συνεπής με τα αποτελέσματα μας. Η διαφορά μεταξύ Ναρ και SB-431542 στη ρύθμιση του TGF-β /Smads σήμα μονοπάτι δείχνει ότι μπορεί να έχουν διαφορετικές βιολειτουργίες.

Εν κατακλείδι, Ναρ καταστέλλει τη μετανάστευση, την εισβολή και την αντίσταση Gem των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα αναστέλλοντας TGF-β /Smad3 μεσολάβηση EMT. Τα ευρήματα αποκαλύπτουν ότι Ναρ μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα νέο δυναμικό μέσο για την πρόληψη της εξέλιξης του όγκου και των μεταστάσεων για κλινικές εφαρμογές.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά