Abstract

Ο που περιγράφεται πρόσφατα transcriptomic αλλαγή σε ένα πρόγραμμα μίτωσης σε ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) υποδηλώνει ότι μιτωτικό πρωτεΐνες μπορούν να απευθύνονται ορθολογικά σε αυτό το θανατηφόρο στάδιο της νόσου. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε προς τα πάνω ρύθμιση της μίτωσης φάσης στο επίπεδο πρωτεΐνης σε ομάδα μας από 51 κλινικές CRPC περιπτώσεις και βρέθηκε centrosomal εκτροπές να συμβεί επίσης κατά προτίμηση σε CRPC σύγκριση με ορμόνες ευαίσθητου καρκίνου του προστάτη χωρίς θεραπεία, υψηλής Gleason βαθμού (

P

& lt? 0,0001). Έκφραση των χαρακτηριστικών των CRPC δειγμάτων χημειοθεραπείας ανθεκτικά (n = 25) πραγματοποιήθηκε, και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα δεδομένα από πρωτογενείς είχαν λάβει προηγουμένως χημειοθεραπεία CRPC (n = 10) και ορμόνη-ευαίσθητες περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη (n = 108). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν τον εμπλουτισμό των γονιδίων μίτωση φάσης και μονοπάτια, με την εξέλιξη τόσο ευνουχισμό ανθεκτικά και χημειοθεραπεία ανθεκτική νόσο. Η μιτωτική κεντρομερίδιο σχετιζόμενη κινεσίνης (MCAK) αναγνωρίστηκε ως νέο στόχο μίτωση φάσης στον καρκίνο του προστάτη που υπερεκφράζεται σε πολλούς CRPC σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης. Βρήκαμε σύμφωνη γονιδιακή έκφραση MCAK μεταξύ μητρικής μας και CRPC ζεύγη ξενομόσχευμα ποντικού και αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης MCAK με την κλινική εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη σε ένα στάδιο της νόσου ευνουχισμό ανθεκτικά. Νοκ ντάουν της MCAK συνελήφθη την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη που υποδηλώνει τη χρησιμότητά του ως πιθανό θεραπευτικό στόχο

Παράθεση:. Sircar K, Huang Η, Χου L, Liu Υ, Dhillon J, Κόγκντελ D, et al. (2012) Μίτωση Φάση Εμπλουτισμός με Στοιχεία της Μιτωτικά Κεντρόμερο-Associated Μετακίνηση κινε Σαν θεραπευτικός στόχος στο Ευνουχισμός-Resistant καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 7 (2): e31259. doi: 10.1371 /journal.pone.0031259

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 του Ιούλη, 2011? Αποδεκτές: 4 Ιαν 2012? Δημοσιεύθηκε: 17, Φεβρουαρίου, 2012

Copyright: © 2012 Sircar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το χαρτί υποστηρίζεται από θεσμικών κεφαλαίων από το MD Anderson Cancer Center (KS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία. ειδικής θνησιμότητας λόγω καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες [1], με τους περισσότερους θανάτους που συνέβησαν μετά από αποτυχία της θεραπείας αποστέρησης ανδρογόνων, όταν ο όγκος μεγαλώνει καθώς ο ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC), σκοτώνοντας τον ασθενή μέσα σε μια μέση περίοδο 18 μηνών. Docetaxel χημειοθεραπεία με βάση την έχει καθιερωθεί ως το πρότυπο της περίθαλψης σε CRPC, με μια μικρή αλλά σαφής όφελος επιβίωσης [2], [3]. Προσδιορισμός των στόχων για αυτό το τερματικό ευνουχισμό ανθεκτικά και χημειοθεραπεία ανθεκτικά φάση της νόσου έτσι αντιπροσωπεύει μια ανικανοποίητη ανάγκη στον καρκίνο του προστάτη [4], [5].

Μια σημαντική πρόσφατη πρόοδος στον τομέα αυτό ήταν η απόδειξη ότι η ανδρογόνων υποδοχέας ενεργοποιεί μία διακριτή μεταγραφική πρόγραμμα μίτωση φάσεων στο CRPC αλλά όχι σε ορμόνες ευαίσθητο καρκίνο του προστάτη (HSPC) [6], εξηγώντας εν μέρει τη σχετική επιτυχία του docetaxel, ένα αντι-μιτωτικό χημειοθεραπευτικό παράγοντα χρησιμοποιείται για τη θεραπεία CRPC. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν επίσης ότι άλλες πρωτεΐνες μίτωση-φάση μπορεί να είναι δυνητικοί στόχοι για θεραπείες θεραπεία αυτής στάδιο της νόσου.

Επιδιώξαμε πρώτα να επικυρωθεί η προς τα πάνω ρύθμιση της μεταγραφικής πρόγραμμα μίτωση φάσης στο πρωτεϊνικό επίπεδο σε CRPC χρήση κλινικών CRPC και υψηλής ποιότητας περιπτώσεις HSPC. Είμαστε δίπλα σε σύγκριση με τις transcriptomic προφίλ των εντοπισμένων δειγμάτων CRPC που ήταν χημειοθεραπεία-ανθεκτικά με CRPC είχαν λάβει προηγουμένως χημειοθεραπεία όγκους και ορμόνες ευαίσθητο καρκίνους του προστάτη. Ανάλυση μονοπατιού των δεδομένων από τα δείγματα στο σπίτι μας και είναι διαθέσιμη στο κοινό βάσεις δεδομένων που προσδιορίζονται εμπλουτισμός των γονιδίων μίτωσης που σχετίζονται όπως η νόσος προχώρησε τόσο σε ευνουχισμό ανθεκτικό και χημειοθεραπεία ανθεκτικό στάδιο. Η μιτωτική κεντρομερίδιο σχετιζόμενη κινεσίνης (MCAK), του οποίου η γονιδιακή έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά σε πολλαπλούς CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτικά σύνολα δεδομένων, επιλέχθηκε για κλινική και λειτουργική επικύρωση. έκφραση πρωτεΐνης MCAK συσχετίστηκε με κλινική πρόοδο του καρκίνου του προστάτη, και knockdown του συνέλαβε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

Αποτελέσματα

CRPC όγκων παρουσιάζουν έκφραση πρωτεΐνης επαυξημένης μίτωση φάσης και centrosomal εκτροπές σε σύγκριση με υψηλής ποιότητας HSPC

για να επικυρώσετε την υποτιθέμενη transcriptomic διακόπτη σε ένα πρόγραμμα μίτωσης φάση CRPC σε επίπεδο πρωτεΐνης, χρησιμοποιήσαμε την πυρηνική phosphohistone Η3 ανοσοχρώση ως δείκτη μίτωση-φάσης, όπως ιστόνες φωσφορυλιώνονται στο τέλος της πρόφαση και κορυφές φωσφορυλίωση τους σε μετάφαση [7]. Εξετάσαμε ποσοτικά τμήματα ιστού-μικροσυστοιχιών του HSPC και CRPC με το σύστημα Ariol ανάλυση εικόνας. συστοιχίες ιστών μας περιλαμβάνονται 557 πυρήνες και & gt? 250.000 πυρήνες από 75 κλινικές περιπτώσεις. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν σημαντική αυξητική ρύθμιση των phosphohistone Η3 σε καρκίνωμα του προστάτη ευνουχισμό ανθεκτικά σε σύγκριση με HSPC (Εικόνες 1G-1Ι και Πίνακας S2). Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν ενδείξεις ότι οι πρωτεΐνες μίτωση φάσης υπερεκφράζεται σε CRPC. Σημαντικά, υψηλής ποιότητας ορμόνη ευαίσθητη όγκους με Gleason βαθμούς 4/5 έδειξαν επίσης σημαντικά χαμηλότερη Η3 έκφραση phosphohistone από ευνουχισμό ανθεκτικά όγκους των αδενοκαρκίνωμα ή μικροκυτταρικό καρκίνωμα ιστολογίες (P & lt? 0,0001) (Εικόνες 1G-1J και Πίνακας S2) . Λαμβάνοντας υπόψη τα πολύ διαφορετικά μεταγραφικό προφίλ και πολύ πιο επιθετική κλινική συμπεριφορά της υψηλής Gleason βαθμού (βαθμοί Gleason 4/5) καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με χαμηλό Gleason βαθμού (Gleason βαθμού 3) καρκίνο του προστάτη, τα δεδομένα μας υπογραμμίζει την ιδιαιτερότητα του CRPC από όλες τις ιστολογικές υπότυποι του HSPC

αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). -stained τομές που δείχνουν αδενοκαρκίνωμα ευνουχισμό ανθεκτικά (Α), καρκίνωμα μικρών κυττάρων ευνουχισμό ανθεκτικά (Β), και καρκίνωμα του προστάτη υψηλής ποιότητας ορμόνη-ευαίσθητα ( ΝΤΟ). αδενοκαρκίνωμα ευνουχισμός ανθεκτικά ανοσοχρώση με γάμμα τουμπουλίνης (D) και ρ-ιστόνης Η3 (G). Ο ευνουχισμός ανθεκτικό μικροκυτταρικό καρκίνωμα ανοσοχρώση με γάμμα τουμπουλίνης (Ε) και ρ-ιστόνης Η3 (H). καρκίνωμα του προστάτη υψηλής ποιότητας Hormone-ευαίσθητη ανοσοχρώση με γάμμα τουμπουλίνης (F) και ρ-ιστόνης Η3 (Ι). Οι αστερίσκοι δείχνουν αυξήθηκε σημαντικά επισήμανση για τον δείκτη μίτωση-φάσης π-ιστόνης Η3 (J) και centrosomal δείκτη γάμμα-τουμπουλίνης (Κ) σε καρκίνωμα του προστάτη ευνουχισμό ανθεκτικό σε σύγκριση με το καρκίνωμα του προστάτη υψηλής ποιότητας ορμόνη ευαίσθητη.

Η

στη μελέτη της φάσης μίτωσης, εξετάσαμε επίσης κεντροσωμάτων αφθονία, αφού κεντροσωμάτια αποτελούν βασικούς παράγοντες στην κυτταρική διαίρεση. Gamma τουμπουλίνης, ένας συγκεντρώσεως μικροσωληνίσκων και δείκτη κεντροσωμάτων ενίσχυσης, έδειξαν σημαντικά αυξημένη κυτταροπλασματική σήμανση σε ευνουχισμό ανθεκτική νόσο, σε σύγκριση με HSPC (P & lt? 0.0001) και υψηλής ποιότητας HSPC (P = 0,008) (Σχήματα 1D-1F και 1K και στον Πίνακα S3). Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με τη γνωστή ρόλο των κεντροσωμάτων ενίσχυσης και της γενετικής αστάθειας στην εξέλιξη άλλων καρκίνων [8], [9], [10], [11].

Προς τα πάνω ρύθμιση της μιτωτικής συσκευής CRPC όγκους με την εξέλιξη στην αντίσταση ευνουχισμό και την αντίσταση χημειοθεραπεία

macrodissected καρκινικά κύτταρα που ήταν ο ευνουχισμός ανθεκτικά και χημειοθεραπεία ανθεκτικά εντοπισμένη μη μεταστατικό κατεψυγμένα χειρουργική δείγματα από 20 μοναδικά τους ασθενείς και πέντε ξενομοσχεύματα που προέρχονται από αυτά (Πίνακας S1). Transcriptomic προφίλ του ολικού RNA διεξήχθη σε αυτά τα δείγματα όγκων και πέντε καλοήθη δείγματα προστάτη που χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση των δεδομένων εκφράσεως μας. συστοιχία ανεπεξέργαστα δεδομένα μας υποβάλλεται σε GEO (GSE 33.277). Καθώς τα δεδομένα μας προήλθαν από αμφότερες τερματικό ευνουχισμό ανθεκτικά και ντοσεταξέλη χημειοθεραπεία νεοπλασιών ανθεκτικών, συγκρίναμε το προφίλ έκφρασης του mRNA από αυτά τα δείγματα με εκείνη των δειγμάτων από τα προηγούμενα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. Συγκεκριμένα, σε σύγκριση με τα δεδομένα μας με τα στοιχεία της δημόσιας έκφρασης των γονιδίων που προέρχονται από μη επεξεργασμένο HSPC (GSE 21032, n = 108) και είχαν λάβει προηγουμένως χημειοθεραπεία CRPC (GSE 6811, n = 10). Τέτοιες μετα-αναλύσεις της πρόκλησης δεδομένων των πολυάριθμων μεταβλητών που μπορούν να επηρεάσουν την ένταση του σήματος υβριδισμού. Για μια πιο αξιόπιστη σύγκριση, επιλέξαμε συγκεκριμένα σύνολα δεδομένων των εντοπισμένων, μη μεταστατικό HSPC και είχαν λάβει προηγουμένως χημειοθεραπεία CRPC δείγματα που είχαν ομαλοποιηθεί με στοιχεία από ομαδοποιημένα δείγματα καλοήθη προστάτη ή όπου παρέχονται δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από καλοήθη δείγματα προστάτη που επιτρέπεται τέτοια κανονικοποίηση . Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε υπερέκφραση των γονιδίων μίτωση φάσης και μονοπάτια σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα δείγματα HSPC από το σύνολο δεδομένων Memorial Sloan Kettering, (GSE 21032). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [6], αλλά χρησιμοποιούν ανεξάρτητους σύνολα δεδομένων και μεθοδολογιών.

Το Πανεπιστήμιο του Τόκιο σύνολο δεδομένων (GSE 6811) είναι ένας από τους πολύ λίγους που περιλαμβάνει CRPC είχαν λάβει προηγουμένως χημειοθεραπεία δείγματα. Σημασία των μικροσυστοιχιών ανάλυση (SAM) συγκρίνοντας την CRPC είχαν λάβει προηγουμένως χημειοθεραπεία ομάδα με CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτική ομάδα μας εντόπισε δύο ενημερωτικές σύνολα γονιδίων που αποτελούνταν από 2.490 ρυθμίζεται προς τα πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένη 2.121 γονίδια στη χημειοθεραπεία ανθεκτική ομάδα. ανάλυση Pathway αυτών των δύο συνόλων γονιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Ingenuity Pathway ανάλυση έδειξε ότι διάφοροι οδοί ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου ήταν σημαντικά εμπλουτισμένο στο απορυθμίζεται σετ γονίδιο (Σχήμα 2Α). Ειδικότερα, η χημειοθεραπεία ανθεκτική ομάδα παρουσίασε σημαντική υπερέκφραση του μίτωσης εμπλέκεται οδού (Σχήμα 2Β), σε σύγκριση με την χημειοθεραπεία αφελή ομάδα (Σχήμα S1). Επιπλέον, επικαλύπτονται ανάλυση αυτών των δύο συνόλων γονιδίων, όπως αξιολογείται από μια υπεργεωμετρική μοντέλο διανομής (Σχήμα 2C) χρησιμοποιώντας μίτωση φάσης (Μ-φάση) γονιδίων που λαμβάνονται από τη βάση δεδομένων MSigDB (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb /index.jsp), παρουσίασαν σημαντική επικάλυψη με μόνο εκείνα τα γονίδια που ρυθμίζεται στον χημειοθεραπεία ανθεκτική ομάδα (n = 27?

P

= 5.0 × 10

-7). Τα γονίδια μειωτικά στη χημειοθεραπεία ανθεκτικά ομάδα δεν επικαλύπτονται σημαντικά με τα γονίδια της φάσης-Μ (n = 9?

P

= 0,416). Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται από την ανάλυση του γονιδίου που εμπλουτισμού (GSEA? https://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp, Έκδοση 3.7), η οποία έδειξε ότι το σύνολο του γονιδίου Μ-φάση σημαντικά εμπλουτισμένο σε χημειοθεραπεία ανθεκτικό ομάδας σε μια ψευδή ρυθμό ανακάλυψης (FDR) του & lt? 10% (Σχήμα 2D). Αυτές οι αναλύσεις δείχνουν ότι τα γονίδια και τις οδούς που σχετίζονται με την μίτωση μπορεί να εμπλέκεται στη διαμεσολάβηση αντίσταση χημειοθεραπεία.

(Α) οδούς ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου απορυθμίζεται σημαντικά στο CRPC ομάδα χημειοθεραπεία ανθεκτικά (ΤΧ) σε σύγκριση με την CRPC χημειοθεραπεία -naïve ομάδα. (Β) Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση. (IPA) της απορυθμίζεται σετ γονιδίων καταδεικνύει ότι η κανονική οδός της μιτωτικής ρόλους του πόλο-όπως κινάση συνδέεται σημαντικά με την CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτική ομάδα (

P

= 0,004). Η

P

αξία υπολογίζεται με την ακριβή δοκιμή του Fisher. Τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα άνω στο CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτική ομάδα και εμπλέκονται σε αυτή την οδό είναι χρωματική κωδικοποίηση με κόκκινο χρώμα. Τα άλλα γονίδια που περιλαμβάνονται σε αυτή την οδό, αλλά δεν είναι στο απορυθμίζεται σετ γονίδιο που αναφέρεται στο λευκό. (Βλέπε κείμενο για την ταυτοποίηση των upreguated γονιδίου που σε λεπτομέρειες). (Γ) Σημαντικές επικάλυψη του ρυθμίζεται αυξητικά γονιδίου που καθορίζεται στην CRPC χημειοθεραπεία νεοπλασιών ανθεκτικών με την M-φάση (n = 27,

P

= 5.00E-7) σε σύγκριση με την κατιούσα ρύθμιση σετ γονίδιο (n = 9,

P

= 0,416). (Δ) GSEA έδειξε ότι το Μ-φάσης ήταν σημαντικά εμπλουτισμένο στο CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτική ομάδα σε FDR & lt?. 10%

Η

Μιτωτικά κεντρομερίδιο που σχετίζονται με κινεσίνη συνδέεται με την εξέλιξη στην αντίσταση της θεραπείας, ενώ η αποσιώπηση της αναστέλλει τον καρκίνο του προστάτη κυτταρική ανάπτυξη

Εξέταση των ειδικώς μεταβάλλεται ρυθμιστικές μιτωτική σε transcriptomic δεδομένα μας μας οδήγησε να αναγνωριστούν γονίδια που κωδικοποιούν για την μιτωτική κινεσίνη οικογένεια πρωτεϊνών κινητήρα ως αυξορρυθμίζεται CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτικά δείγματα. Αυτές οι μιτωτικές κινεσίνες επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω σε δύο άλλες μεγάλες CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτικά σύνολα δεδομένων από το Πανεπιστήμιο του Michigan (GDS 1439) και το Memorial Sloan Kettering, (GSE 21032). Έχουμε επιλέξει την μιτωτική κεντρομερίδιο σχετιζόμενη κινεσίνης (MCAK) ως στόχος στον καρκίνο του προστάτη, επειδή ήταν νέα και δεν υπήρχε σημαντική υπερέκφραση του γονιδίου MCAK (

P

= 1.55 × 10

-15) σε εντοπισμένες CRPC από το σύνολο δεδομένων MD Anderson Κέντρο καρκίνου σε σύγκριση με ευαίσθητα ορμόνη περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη (n = 108) από το σύνολο δεδομένων Memorial Sloan Kettering, (GSE 21032). MCAK επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω με την εξέλιξη σε μεταστατικές CRPC μέσα στην ομάδα Memorial Sloan-Kettering, (

P

= 3,73 × 10

-10) (Εικόνα S2). Επιπλέον, βρήκαμε σύμφωνη έκφραση MCAK τόσο ανθρώπινο μητρικό όγκων CRPC μας και ποντικού ξενομοσχεύματα που προέρχονται από αυτούς τους όγκους (

r = 0,428

) όπως φαίνεται στο Σχήμα S3. Εμείς στη συνέχεια μετρήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης MCAK με ανοσοϊστοχημική ανάλυση των μικροσυστοιχιών ιστού των ανεξάρτητων ορμόνης-ευαίσθητο (n = 38) και ο ευνουχισμός ανθεκτικά (n = 51) περιπτώσεις. Βρήκαμε κυτταροπλασματική χρώση MCAK να σχετίζεται σημαντικά με την κλινική εξέλιξη σε ευνουχισμό ανθεκτική νόσο (P & lt? 0,0001). (Σχήματα 3Α-D και Πίνακας S4)

MCAK-ανοσοχρωματίστηκε τμήματα του αδενοκαρκινώματος ευνουχισμό ανθεκτικά (Α) , καρκίνωμα ευνουχισμός ανθεκτικά μικρών κυττάρων (Β), και καρκίνωμα του προστάτη ορμόνη-ευαίσθητη (C). Δ) Σημαντικά αυξημένη επισήμανσης για την μιτωτική κεντρομερίδιο-πρωτεΐνης που συνδέεται με MCAK με την εξέλιξη σε CRPC, σημειώνονται με αστερίσκο.

Η

Για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της να χτυπήσει κάτω MCAK στην HSPC και CRPC, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές ομάδες μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) ειδικά για MCAK να φιμώσουν την έκφρασή της στην ορμόνη ευαίσθητη LNCaP και τον ευνουχισμό ανθεκτικά είχαν λάβει προηγουμένως χημειοθεραπεία του καρκίνου κυτταρικές σειρές C4-2B προστάτη. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές CRPC και HSPC έδειξαν άφθονη έκφραση εγγενή πρωτεΐνη MCAK και αμφότεροι έδειξαν αναστολή της ανάπτυξης μετά από 3 ημέρες MCAK knockdown με την πρώτη siRNA (SI-MCAK # 1) όπως εκτιμήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήμα 4Α-Δ) (C4-2B : 3 δ, P = 5,45 × 10

-7? 4 d, P = 4,85 × 10

-10? 5 d, P = 3,78 × 10

-8? LNCaP: 3 δ, P = 1,43 × 10

-3? 4 d, P = 3,86 × 10

-5? 5 d, P = 1,48 × 10

-5). Παρόμοια αποτελέσματα από το δεύτερο σετ siRNA (si-MCAK # 2) που φαίνεται στο Σχήμα S4.

Α) κηλίδα Western επιβεβαιώνει νοκ ντάουν της MCAK από 1 si-MCAK #. Λύματα ολόκληρων κυττάρων από κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με SI-ελέγχου (C) ή si-MCAK # 1 (Μ) συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση, όπως υποδεικνύεται. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) προσδιορισμό της ανάπτυξης ΜΤΤ κυττάρων. LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία το ίδιο όπως στο Α), και μετά από μια διαμόλυνση 24 h, 4000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων (n = 10 για κάθε ομάδα) και η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη σε 24 h διάστημα. C) κηλίδα Western επιβεβαιώνει νοκ ντάουν της MCAK με si-MCAK # 1. Λύματα ολόκληρων κυττάρων από κύτταρα επιμολυσμένα με C4-2B SI-ελέγχου (C) ή si-MCAK # 1 (Μ) συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση, όπως υποδεικνύεται. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Δ) δοκιμασία ανάπτυξης ΜΤΤ κυττάρων. C4-2B κύτταρα επιμολύνθηκαν με SI-ελέγχου και SI-MCAK # 1, αντίστοιχα. Μετά την επιμόλυνση 24 h, 4000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων και επωάστηκαν για διαφορετικές χρονικές περιόδους, όπως υποδεικνύεται, ακολουθούμενη από την ανάλυση ΜΤΤ (n = 10 για κάθε ομάδα).

Η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, έχουμε επεκτείνει τα ευρήματα των Wang et al [6] με την επικύρωση, σε επίπεδο πρωτεΐνης, η transcriptomic μετάβαση σε ένα πρόγραμμα μίτωσης σε ένα ανεξάρτητο σύνολο CRPC κλινικών δειγμάτων και δείχνει ότι οι διαφορές μεταξύ των ανθεκτικών ευνουχισμό και χωρίς θεραπεία ορμονικής καρκίνους του προστάτη ευαίσθητα διατηρείται ακόμη και κατά τη σύγκριση υψηλής Gleason καρκίνων του βαθμού του προστάτη. Αυτό είναι ένα σημαντικό εύρημα, δεδομένων των διαφορετικών transcriptomic προγράμματα δει σε καρκίνους του προστάτη με χαμηλή και υψηλή βαθμολογία Gleason [12] που απεικονίζουν δραματικά διαφορετικές κλινική συμπεριφορά τους. Δείξαμε επίσης centrosomal εκτροπές να συμβούν κατά προτίμηση σε CRPC, σύμφωνα με την ανώμαλη κυτταρική διαίρεση που παρατηρείται σε άλλες προχωρημένους καρκίνους. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι CRPC είναι βιολογικά διακριτή και όχι απλώς μια επέκταση των ευαίσθητων υψηλής ποιότητας ορμόνη καρκίνο του προστάτη, παρά τις ιστολογικές ομοιότητες και της τάσης τους για κλινική επιθετικότητα.

Με τη σύγκριση transcriptomic προφίλ των CRPC χειρουργικά δείγματα που ήταν είχαν λάβει προηγουμένως χημειοθεραπεία με CRPC δεδομένα χημειοθεραπεία ανθεκτικά μας βρήκαμε εμπλουτισμό των πρωτεϊνών μιτωτικής φάσης και μονοπάτια στη χημειοθεραπεία ανθεκτικά όγκους. Μεταξύ των γονιδίων που σχετίζονται με την μίτωση-, επιλέξαμε την μιτωτική κινεσίνη οικογένεια πρωτεϊνών με κινητήρα για περαιτέρω μελέτη-ιδίως MCAK, η οποία δεν έχει προηγουμένως μελετηθεί σε καρκίνο του προστάτη. Η μιτωτική κινεσίνες είναι γνωστό ότι παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της συσκευής μιτωτικής ατράκτου κατά την κυτταρική διαίρεση. Εμπλέκονται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ρυθμίζονται από κινάση aurora-Β [13]. Η εξέλιξη της πνεύμονα, του εγκεφάλου, και του παχέος εντέρου [14] [15] έχει συσχετισθεί με την επαυξημένη έκφραση κινεσίνης, ενώ η αναστολή του έχει ως αποτέλεσμα την διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση μίτωσης [16], [17]. Μιτωτική κεντρομερίδιο που σχετίζονται με κινεσίνη είναι άφθονη σε κεντροσωμάτια, αποπολυμερίζει μικροσωληνίσκους, και μεσολαβεί η μετάβαση από προμεταφασικά σε μετάφαση [18], μεταξύ άλλων βασικές λειτουργίες που σχετίζονται με κατάλληλο διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων [19] κατά την κυτταρική διαίρεση. Η υπερέκφραση μιτωτικών κινεσινών, τα οποία υποτίθεται ότι δρα αντιμετώπιση της σταθεροποίησης των μικροσωληνίσκων επίδραση του ταξανίου χημειοθεραπείας με βάση, έχει συνδεθεί με δοκεταξέλη αντίσταση στον καρκίνο του μαστού [20], και MCAK υπερέκφραση έχουν αιτιολογικά σχετίζεται με αντίσταση paclitaxel [21].

Στόχευση μιτωτικής κινεσίνες έτσι αναδύεται ως μια ελκυστική μορφή θεραπείας σε καρκίνους που είναι ανθεκτικοί σε χημειοθεραπείες ταξάνη βάση που δρουν επί της μιτωτικής ατράκτου, δεδομένου ότι η αναστολή της κινεσίνη πρωτεϊνών κινητήρα δεν στοχεύει άμεσα μικροσωληνίσκους. Επιπλέον, οι μιτωτικές κινεσίνες δεν εκφράζονται από τους νευρώνες [22] και είναι φτωχοί υποστρώματα για το Ρ-γλυκοπρωτεΐνης αντλία εκροής [23], οι οποίες οδηγούν σε νευροτοξικότητα και πολυφαρμάκου αντίσταση περιορισμού δόσεως docetaxel του. Ως εκ τούτου, μιτωτική αναστολή κινεσίνης υποτίθεται για να προκαλέσει μίτωση ειδικά σύλληψη του κυτταρικού κύκλου που μπορεί να συμπληρώσει την τρέχουσα χημειοθεραπευτικά πρωτόκολλα με λιγότερες παρενέργειες [18].

Διαφορετικές μιτωτικές κινεσίνες εξυπηρετούν συγκεκριμένες λειτουργίες, καθώς και το ρόλο αυτών των πρωτεϊνών στο του καρκίνου του προστάτη έχει μόνο διερευνηθεί σε σχέση με την πιο καθιερωμένη μέλος αυτής της οικογένειας, κινεσίνη πρωτεΐνης ατράκτου (KIF11 /Eg5), του οποίου η σίγηση έχει δειχθεί ότι αναστέλλει την ανάπτυξη του LNCaP και κυττάρων PC3 γραμμές

in vitro

και

in vivo

[24], [25]. Πρώιμη φάση κλινικών δοκιμών σε ασθενείς που χρησιμοποιούν CRPC τον αναστολέα Eg5 πρώτης γενεάς, ispinesib, είχαν περιορισμένη επιτυχία [26] [27]. Ωστόσο, Eg5 αναστολείς νεότερη γενιάς έχουν αναφερθεί ότι εμφανίζουν μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα

in vitro

[28], και μια τρίτη κλινική δοκιμή επί του παρόντος την πρόσληψη των ασθενών από ένα φάσμα κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη ανθεκτικού ευνουχισμό (# NCT01065025) .

συνοπτικά, δείξαμε εμπλουτισμό των οδών μίτωση φάσης και πρωτεΐνες όπως ο καρκίνος του προστάτη εξελίσσεται σε τόσο ευνουχισμό-ανθεκτικό και ανθεκτικό σε χημειοθεραπεία κατάσταση. Εξετάσαμε το ρόλο της MCAK για πρώτη φορά στον καρκίνο του προστάτη και έδειξε ότι η έκφραση MCAK συσχετίζεται με την κλινική εξέλιξη της ασθένειας αυτής. Επιπλέον, δείξαμε αναστολή της ανάπτυξης στην MCAK-σιγήσει ευνουχισμό ανθεκτικά κυττάρων του προστάτη γραμμές. Μαζί, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι MCAK είναι λειτουργικά σημαντικών πρωτεϊνών στο τερματικό καρκίνο του προστάτη. Παρακολούθηση μελέτες με βάση την παρούσα έκθεση θα πρέπει να περιλαμβάνει τη χρήση συνθετικών αναστολέων που κατευθύνονται έναντι MCAK (π.χ., δίπλωμα ευρεσιτεχνίας # 7.294.640, Merck) σε προκλινικά μοντέλα και σε μελλοντικές κλινικές δοκιμές του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

δείγματα ιστού καρκίνου του προστάτη ευνουχισμό ανθεκτικά ορμόνη ευαίσθητη και ελήφθησαν με την έγκριση από το από τα θεσμικά διοικητικά συμβούλια αναθεώρηση του Πανεπιστημίου του Τέξας MD Anderson Κέντρο καρκίνου (Χιούστον, Τέξας) και το Πανεπιστήμιο McGill (Montreal, QC, Καναδάς). Τα δείγματα ιστών που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη MDA προστάτη 79, MDA προστάτη 117-9, MDA προστάτη 124, MDA προστάτη 130, MDA προστάτη 149-1, και MDA προστάτη 180-30 ξενομοσχεύματα προήλθαν από δείγματα όγκου των χειρουργικών δειγμάτων (cystoprostatectomy, ριζική προστατεκτομή , ή πυελική exenteration) μιας προοδευτικής πρωτογενούς ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη. Γραπτή συγκατάθεση είχαν ληφθεί από ασθενείς πριν από την απόκτηση του δείγματος, και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από MD Anderson του σκάφους θεσμική αξιολόγηση, συμπεριλαμβανομένης της έγκρισης από την επιτροπή φροντίδα των ζώων και τη χρήση. Οι αριθμοί πρωτοκόλλου εργαστήριο που καλύπτει τη χρήση αυτών των δειγμάτων είναι MDACC LAB 03-0336 και 09-0213 LAB.

Τα δείγματα ασθενούς ιστού

μοριακά προφίλ ιστοί που προέρχονται από δείγματα κατεψυγμένων όγκων MD Anderson από ασθενείς με ευνουχισμό-και χημειοθεραπεία ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (n = 20) και από καλοήθη προστατική ελέγχους ιστού (η = 5). Τα δείγματα ευνουχισμό ανθεκτικά χημειοθεραπεία ανθεκτικά ελήφθησαν από cystoprostatectomies διάσωσης ή πυελικό exenterations. Ποντικού ξενομοσχεύματα που προέρχονται από πέντε από αυτές τις 20 όγκων δείχνει αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας αξιολογήθηκαν επίσης. Τα κλινικά δεδομένα των γονιδίωμά προφίλ δειγμάτων που περιλαμβάνονται στον πίνακα S1. Τέσσερις μικροσυστοιχίες ιστών χρησιμοποιείται για την επικύρωση γονιδιακά δεδομένα και αποτελούνταν από δείγματα φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη από 58 ασθενείς με HSPC και 51 ασθενείς με CRPC.

Έκφραση προφίλ και ανάλυση

mRNA όγκου έκφραση ήταν εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια ανθρώπινη ολόκληρου γονιδιώματος kit ολιγονουκλεοτίδιο μικροσυστοιχιών από Agilent (prod # G4112F) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. CRPC δεδομένα μας ομαλοποιήθηκε με τις τιμές έκφρασης των γονιδίων μέση από πέντε καλοήθη δείγματα προστάτη για να βρείτε απορυθμίζεται ή μειωτικά γονιδίων χρησιμοποιώντας μια αναλογία τιμή log & gt? 0.3 ως το cut-off για ενημερωτικούς γονίδια που υπάρχουν σε περισσότερα από τα δύο τρίτα των περιπτώσεων. Συγκρίναμε την έκφραση μας προφίλ δεδομένα στο Πανεπιστήμιο του Michigan (GDS 1439), Πανεπιστήμιο του Τόκιο (GSE 6811), και το Memorial Sloan Kettering, (GSE 21032) σύνολα δεδομένων. Για αυτά τα σύνολα δεδομένων, ομαλοποίηση εκτελέστηκε κατά την εσωτερική τους ελέγχους (καλοήθης δείγματα).

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Πρότυπο 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB) ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις μικροσυστοιχίες ιστού πραγματοποιήθηκαν με Dako Autostainer Plus (Dako) χρησιμοποιώντας ένα αντι-ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα MCAK (Abgent AT2621a) σε αραίωση 1:50, ένα φωσφο-histoneH3 αντίσωμα (Santa Cruz SC-8656) σε αραίωση 1:100, και ένα γ-τουμπουλίνης αντίσωμα (Abcam AB27074) σε 1:400 αραίωση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Η χρώση για γ-τουμπουλίνης και MCAK αξιολογήθηκε με το χέρι με την ανάθεση ενός τοις εκατό θετική αξία σε κάθε περίπτωση, με βάση το συνολικό ανοσοϊστοχημική επισήμανση όλων των πυρήνων ιστού που ανήκουν σε αυτή την περίπτωση.

Αυτοματοποιημένη ανάλυση εικόνας

Η phosphohistone Η3-θετικοί πυρήνες ποσοτικά αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένη ανάλυση εικόνας με Ariol λογισμικού από την Applied Imaging (Genetix Ltd.). Μια παραγγελία, αυτοματοποιημένο αλγόριθμο πυρηνική ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας το Ariol λογισμικό παρασκευάστηκε με βάση χρωματικές παραλλαγές του καφέ λεκέδες στα DAB-θετικών κυττάρων σε σχέση με το αρνητικό υπόβαθρο των πυρηνικών αιματοξυλίνη για την επίτευξη ενός τοις εκατό θετικό ανά προ-επιλεγμένη περιοχή της αντιπροσώπευσης σε κάθε διαφάνεια .

Κυτταροκαλλιέργεια

C4-2B κύτταρα κατατεθεί στο MD Anderson αναπτύχθηκαν μετά σειριακή διέλευση των κυττάρων LNCaP σε ευνουχισμένους ξενιστές όταν τα κύτταρα δεν ήταν πλέον ανταποκρίνεται σε ανδρογόνα χειραγώγησης σε ζώα (PMID: 8168083 ). LNCaP κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό στους 37 ° C με μία ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Ξενομοσχεύματος μελέτες

Τα δείγματα ιστών που χρησιμοποιούνται για την αναπτύξει το MDA προστάτη 79, MDA προστάτη 117-9, MDA προστάτη 124, MDA προστάτη 130 και MDA προστάτη 149-1 ξενομοσχεύματα ήταν υπολειμματική ιστούς από χειρουργική εκτομή (cystoprostatectomy ή πυελικό exenteration) της προοδευτικής πρωτογενούς CRPC. Μικρά κομμάτια του όγκου εμφυτεύθηκαν σε υποδόριους θύλακες της 6- έως 8 εβδομάδων αρσενικά ποντίκια CB17 SCID (Charles River Laboratories). Οι όγκοι αναπτύχθηκαν μέσα σε 6 μήνες και διατηρήθηκαν στα ποντίκια, καθώς τα κύτταρα δεν θα μπορούσαν να αναπτυχθούν

in vitro

. Οι μέθοδοι πέρασμα και επεξεργασία των όγκων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι ίδιες με εκείνες που αναφέρθηκαν προηγουμένως (PMID: 18618013).

siRNA διαμόλυνση

Το LNCaP ή C4-2B κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων σε πυκνότητα 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS κάτω από κανονικές συνθήκες καλλιέργειας ιστού. Μετά από 20-24 ώρες επώασης, siRNA διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο LipofectamineRNAiMax από την Invitrogen (Invitrogen, Cat # 56532) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δύο σύνολα SI-MCAK siRNA χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα. si-MCAK # 1 αγοράστηκε από Ambion (Ambion, cat # 4390824) και το si-MCAK # 2 αγοράστηκε από Dharmacon (Chicago, IL, USA, cat # L-004955-00). Η Οικουμενική Αρνητικός μάρτυρας # 1 siRNA από Sigma (cat # SIC-001) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Η τελική συγκέντρωση του siRNA ήταν 50 ηΜ.

Western ανάλυση κηλίδος

μονοκλωνικό αντίσωμα

MCAK ελήφθη από Abgent (cat # AT2621a) και αμφότερα β-ακτίνης (cat # sc-1616) και β-τουμπουλίνης (cat # sc-9104) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράφεται [31]. Εν συντομία, κυτταρικά εκχυλίσματα που περιέχουν 30 μg πρωτεΐνης αναλύθηκαν με 10% SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, μεταφέρθηκε σε μεμβράνες Hybond ECL νιτροκυτταρίνης (Amersham Pharmacia Biotech) ή μεμβράνες φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (Cat # IPVH20200) από την Millipore (Millipore Corporation, cat. # IPVH20200) , μπλοκαριστεί σε 5% άπαχο γάλα σε 1 χ Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα συν 0,05% Tween-20 (ρΗ 8.0) και ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε συγκεντρώσεις 1:1000 για MCAK και 1:2500 για β-ακτίνη ή β-τουμπουλίνης. Τα δευτερεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις 1:10,000. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας Υπόστρωμα (Prod # 34708) ή SuperSignal West Femto μέγιστη ευαισθησία Υπόστρωμα (Prod # 34096) από την Pierce (Pierce Chemical, Rockford, IL, USA).

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ απορρόφηση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με είτε ελέγχου siRNA (si-έλεγχος) ή MCAK siRNA (si-MCAK) θρυψινοποιήθηκαν από τα πιάτα στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και 4000 κύτταρα σε 200 μλ πλήρους μέσου σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων ( n = 10). Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες στο πλήρες μέσο, ​​και η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη σε διαστήματα 24 ώρες στη συνέχεια. Μετά από 2,5 ώρες επώασης με 50 μΜ αντιδραστήριο ΜΤΤ σε κανονικές συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων, τα φρεάτια εκκενώθηκαν με αναρρόφηση κενού, και 200 ​​μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 590 nm με αναγνώστη μικροπλακός. (MRX? Danatech Laboratory)

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος +/- S.D. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση

t-test

και το Wilcoxon rank-sum test του Student. Οι διαφορές στα μέσα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα δύο-ουρά

t-test

, υποθέτοντας άνισες διακυμάνσεις. Μια Ρ value≤0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. μονοπάτια

Μίτωση δεν συνδέονται με την κατιούσα ρύθμιση του γονιδίου που σε CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτική νόσο. Εφευρετικότητα Διαδρομή Ανάλυση (IPA) της μειωτικά σετ γονιδίων δείχνει ότι η κανονική οδός της μιτωτικής ρόλους του πόλο-όπως κινάση δεν σχετίζεται σημαντικά με την CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτική ομάδα (

P

= 0,16). Η

P

αξία υπολογίζεται με την ακριβή δοκιμή του Fisher. Τα γονίδια που είναι μειωτικά στο CRPC χημειοθεραπεία ανθεκτική ομάδα και εμπλέκονται σε αυτή την οδό είναι χρωματικά κωδικοποιημένες στο πράσινο. Τα άλλα γονίδια που περιλαμβάνονται σε αυτή την οδό, αλλά δεν περιλαμβάνονται στο σετ ρυθμίζεται προς τα κάτω γονιδίου αναφέρεται στο λευκό

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s001

(TIF)

Εικόνα S2.

Αυξημένα επίπεδα μεταγραφής MCAK με την εξέλιξη σε CRPC. (Α) MCAK δείχνει transcriptomic ρύθμιση προς τα πάνω σε εντοπισμένες CRPC (

P

= 1,55 × 10

-15) και (Β) μεταστατικό CRPC (

P

= 3,73 × 10

– 10) σε σύγκριση με HSPC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Συμφωνία της γονιδιακής έκφρασης MCAK μεταξύ CRPC ξενομοσχευμάτων ποντικού (MDA-79, MDA-117, MDA-130, MDA-149) και το αντίστοιχο ανθρώπινο μητρικό όγκους τους (

r

= 0,428).

doi: 10.1371 /journal.pone.0031259.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4. αναστολή

ανάπτυξη των LNCaP και C4-2B κύτταρα από si-MCAK # 2. Α) κηλίδα Western επιβεβαιώνει νοκ ντάουν της MCAK από si-MCAK # 2. Λύματα ολόκληρων κυττάρων από κύτταρα επιμολυσμένα με LNCAP SI-ελέγχου (C) ή si-MCAK # 2 (Μ) συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση, όπως υποδεικνύεται. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) ΜΤΤ δοκιμασίες ανάπτυξης κυττάρου. LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία το ίδιο όπως στο Α), και μετά από μία διαμόλυνση 24 ώρες, 4.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-φρεατίων (n = 6 για κάθε ομάδα) και ακολουθείται από ανάλυση ΜΤΤ. C) κηλίδα Western επιβεβαιώνει νοκ ντάουν της MCAK με si-MCAK # 2. Λύματα ολόκληρων κυττάρων από κύτταρα επιμολυσμένα με C4-2B SI-ελέγχου (C) ή si-MCAK # 2 (Μ) συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση, όπως υποδεικνύεται. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. * Υποδηλώνει μη-ειδικές ζώνες. Δ) δοκιμασίες ανάπτυξης ΜΤΤ κυττάρων. C4-2B κύτταρα επιμολύνθηκαν με SI-ελέγχου και SI-MCAK # 2, αντίστοιχα. Μετά την επιμόλυνση 24 h, 4000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων και επωάστηκαν για διαφορετικές χρονικές περιόδους, όπως υποδεικνύεται, ακολουθούμενη από την ανάλυση ΜΤΤ (n = 5 για κάθε ομάδα)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s004

(ΔΕΘ)

πίνακα S1.

Συντομογραφίες: CXPX – cystoprostatectomy? PE – πυελική exenteration? Διουρηθρική προστατεκτομή – διουρηθρική εκτομή? TAB – συνολικό αποκλεισμό των ανδρογόνων (lupron + Casodex)? LHRH – lupron? ORCH – διμερή ορχεκτομή? XRT – ακτινοθεραπεία. * Συστατικό Μικρές καρκίνωμα κυττάρων προφίλ από ένα μικτό ιστολογία μικρό κελί /όγκου αδενοκαρκινώματος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s005

(DOC)

Πίνακας S2.