Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία που σχετίζονται με τον καρκίνο των θανάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες. Η πρόγνωση παραμένει θλιβερή με μικρή πρόοδο στην θεραπεία. Η μετφορμίνη είναι ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία του διαβήτη τύπου II. Πρόσφατα επιδημιολογικά δεδομένα αποκάλυψαν ότι από του στόματος χορήγηση της μετφορμίνης συσχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του παγκρέατος, γεγονός που υποδηλώνει το δυναμικό του ως ένα νέο φάρμακο για την ασθένεια αυτή. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει το

in vitro

αντικαρκινική δράση της μετφορμίνης, αλλά οι συνήθως χρησιμοποιούνται συγκεντρώσεις ήταν πολύ υψηλότερες από ό, τι η

in vivo

συγκεντρώσεις πλάσματος και ιστών επιτυγχάνεται με τις συνιστώμενες θεραπευτικές δόσεις μετφορμίνης, και της χαμηλής Οι συγκεντρώσεις της μετφορμίνης είχε μικρή επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Εξετάσαμε την επίδραση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος και διαπίστωσε ότι αυτά ανέστειλε επιλεκτικά τον πολλαπλασιασμό των CD133

+ αλλά δεν CD24

+ CD44

+ κυττάρων

+ ESA. Εξετάσαμε επίσης την επίδραση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης στην κυτταρική εισβολή και

in vivo

σχηματισμό όγκων, αποδεικνύοντας

in vitro

και

in vivo

αντικαρκινική δράση. Η μετφορμίνη σχετίστηκε με μείωση της φωσφο-ΕΚΚ και φωσφο-mTOR ανεξάρτητο της φωσφορυλίωσης Akt και ΑΜΡΚ. CD133

+ τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα θεωρείται ότι είναι καρκίνος βλαστικά κύτταρα που συμβάλλουν στην επανάληψη, μετάσταση και η αντίσταση στην ανοσοενισχυτικό θεραπείες για τον καρκίνο του παγκρέατος. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια βάση για συνδυασμό μετφορμίνης με τις τρέχουσες θεραπείες για να βελτιώσει την πρόγνωση της ασθένειας αυτής

Παράθεση:. Gou S, Cui P, Λι Χ, Shi P, Liu Τ, Wang C (2013) χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνη αναστέλλουν εκλεκτικά CD133

+ κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε καρκίνο του παγκρέατος και έχει αντικαρκινική δράση. PLoS ONE 8 (5): e63969. doi: 10.1371 /journal.pone.0063969

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: 10 Φεβρουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 10η του Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2013

Copyright: © 2013 Gou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81001064) (Ιστοσελίδα: https://www.nsfc.gov.cn). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι από τις πιο επιθετικές των στερεών κακοηθειών. Κάθε χρόνο, 43.920 ασθενείς είναι πρόσφατα διαγνωστεί με την ασθένεια, με αποτέλεσμα 37.390 θανάτους ετησίως στις Ηνωμένες Πολιτείες και κάνοντας τον καρκίνο του παγκρέατος η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο σε άνδρες και γυναίκες [1]. Σημειώθηκε μικρή πρόοδος στην θεραπεία και η πρόγνωση παραμένει ζοφερή [2], [3], [4], [5], με ποσοστό επιβίωσης πέντε χρόνια μόνο περίπου 3% και μια μέση επιβίωση λιγότερο από 6 μήνες. Μεταξύ των ασθενών οι οποίοι υποβάλλονται σε δυνητικά θεραπευτική εκτομή, 5 ετής επιβίωση είναι λιγότερο από 24%, λόγω της τοπικής υποτροπής και μετάσταση [1], [6], [7]. Novel θεραπευτικές στρατηγικές, συνεπώς, χρειάζονται επειγόντως για αυτό το εξαιρετικά κακοήθη νόσο.

Η μετφορμίνη είναι ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία του διαβήτη τύπου II. Πρόσφατα, επιδημιολογικά στοιχεία αποκάλυψαν ότι η μετφορμίνη, αλλά όχι άλλα αντιδιαβητικά φάρμακα, μειώνει τη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του παγκρέατος σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη [8], [9]. Είναι ενδιαφέρον, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ του προστατευτικού αποτελέσματος και τα επίπεδα σακχάρου στο αίμα των ασθενών [9]. Ένα προστατευτικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επίσης σε ένα λίπος μοντέλο ογκογένεση χάμστερ του καρκίνου του παγκρέατος με χρήση Ν-nitrosobis- (2-οξοπροπυλ) αμίνη [10]. Αρκετές

in vitro

μελέτες έχουν αποδείξει μια άμεση δράση της μετφορμίνης σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων αυτών του καρκίνου του παγκρέατος [11], [12]. Η μετφορμίνη μπορεί συνεπώς να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος, αν και ο μηχανισμός αντικαρκινική δράση είναι ασαφής.

In vitro

πειράματα έχουν αποκαλύψει μια δοσοεξαρτώμενη επίδραση της μετφορμίνης στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Τα τυπικά χρησιμοποιούνται συγκεντρώσεις σε τέτοιες μελέτες είναι 5-30 mM, οι οποίες είναι πολύ υψηλότερες από τις συγκεντρώσεις στο πλάσμα και τους ιστούς μετρήθηκε σε άτομα που έχουν λάβει συνιστώμενες θεραπευτικές δόσεις, και λιγότερο από 1 mM μετφορμίνης έχει μικρή επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων [13] , [14].

Εδώ, δείχνουμε ότι χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης έχουν επιδράσεις σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σύμφωνα με την διαφορική έκφραση τους επιφανειακών δεικτών. CD133

+ και CD24

+ CD44

+ ESA

+ κύτταρα θεωρούνται παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα, και ο πολλαπλασιασμός των CD133

+ αλλά δεν CD24

+ CD44

+ + κύτταρα ESA

επιλεκτικά αναστέλλεται από χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης. Μετφορμίνης συσχετίστηκε με μειώσεις της φωσφο-ΕΚΚ και φωσφο-mTOR ανεξάρτητο της φωσφορυλίωσης Akt και ΑΜΡΚ. Αν και χαμηλή συγκέντρωση μετφορμίνη είχε καμία επίδραση επί της πολλαπλασιαστικής ικανότητας των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος σε γενικές γραμμές, τους

in vitro

επεμβατική ικανότητες και

in vivo

καρκίνο του παγκρέατος ανάπτυξη ξενομοσχεύματος ήταν σημαντικά ανέστειλε.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Έχουμε λάβει AsPC-1 και κύτταρα SW1990 από την American Type Culture Collection. AsPC 1-παγκρεατικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος προήλθαν από τον ασκίτη ενός 62-year-old Καυκάσιος γυναίκα ασθενή με παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα? SW1990 παγκρεατικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος προήλθαν από μετάσταση στο σπλήνα ενός 56-year-old Καυκάσιος άνδρας ασθενής με αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος. Και οι δύο τύποι κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS) (Gibco, Billings, ΜΤ) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen) στους 37 ° C με 5% CO

2.

Η κυτταρομετρία ροής

Για την ανίχνευση δείκτη επιφανείας, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ισόρροπο διάλυμα άλατος 100 μL του Hank με 1% FBS (Gibco). Για την απομόνωση του CD133

+ κυττάρων για ανάλυση κηλίδος Western, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ισόρροπο διάλυμα άλατος 100 μL του Hank με 1% FBS. Fc υποδοχέα αναστολέα σύνδεσης (eBioscience, Inc., San Diego, CA) προστέθηκε και το δείγμα επωάστηκε για 5 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από δύο πλύσεις, Anti-CD133 ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) (Biorbyt, Cambridge, UK), αντι-CD24 FITC (eBioscience), αντι-CD44 PE-Cy5 (eBioscience) ή αντι-ESA ΡΕ (eBioscience) προστέθηκε και το δείγμα επωάστηκε για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από δύο πλύσεις, οι αναλογίες των κυττάρων υποπληθυσμού που εκφράζονται οι διαφορετικοί δείκτες επιφάνειας προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) και κυτταρική διαλογή των CD133

+ κυττάρων έγινε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα FACSAria (BD Biosciences) . Side διασποράς και προς τα εμπρός προφίλ σκέδασης χρησιμοποιήθηκαν για την εξάλειψη των δυάδων κυττάρων.

Για την ανάλυση απόπτωσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 48 ώρες με μετφορμίνη (0,2 mM για AsPC-1, 0,1 mM για SW1990) ή χωρίς μετφορμίνη. Πρώτον, τα δείγματα επωάστηκαν με δέσμευση υποδοχέα Fc αναστολέα για 5 λεπτά στους 4 ° C, στη συνέχεια, Anti-CD133 FITC προστέθηκε και το δείγμα επωάστηκε για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από δύο πλύσεις, αννεξίνης V APC και ιωδιούχο προπίδιο επισήμανση διεξήχθη για κυτταρομετρία ροής, η οποία διεξήχθη με τη χρήση ενός κιτ δοκιμασίας αννεξίνης V σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 48 ώρες με μετφορμίνη (0,2 mM για AsPC-1, 0,1 mM για SW1990) ή χωρίς μετφορμίνη. Μετά τον καθορισμό των κυττάρων σε 70% μεθανόλη, προστέθηκε Fc δέσμευσης αναστολέα του υποδοχέα και το δείγμα επωάστηκε για 5 λεπτά στους 4 ° C. Αντι-CD133 FITC προστέθηκε στη συνέχεια και το δείγμα επωάστηκε για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από δύο πλύσεις, το δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΚΝάση και εκτίθεται σε ιωδιούχο προπίδιο για κυτταρομετρία ροής.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας CCK-8 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα και καλλιεργήθηκαν σε 100 μL DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά από 24 ώρες, τα σπαρμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,02, 0,05, 0,10, 0,20 ή 0,50 mM μετφορμίνη προστίθεται στο μέσο καλλιέργειας, ή δεν έλαβαν μετφορμίνη. Στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία, το μέσο αλλάχθηκε για 110 μL DMEM με CCK-8 αντιδραστήριο και τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες. Η απορρόφηση μετρήθηκε για κάθε φρέαρ σε μήκος κύματος 450 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη αυτόματης μικροπλάκας.

Growth καμπύλη

Πρώτον, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ άνευ ορού για 12 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια αποσπάστηκαν με τρυψινοποίηση και επιστρώθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS με μετφορμίνη (0,2 mM για AsPC-1, 0,1 mM για SW1990) ή χωρίς μετφορμίνη σε συγκέντρωση 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο. Ο αριθμός των κυττάρων εκτιμήθηκε ακόλουθη θρυψινοποίηση? δείγματα κυττάρων μετρήθηκαν σε αιμοκυτταρόμετρο σε διαστήματα 24 ωρών. Τα αποτελέσματα χαράσσονται ως μια καμπύλη ανάπτυξης.

Κυττάρων εισβολή δοκιμασία

Μια δοκιμασία κυττάρων εισβολή πραγματοποιήθηκε σε ένα 24 φρεατίων Transwell θάλαμο (Corning, Inc., Corning, ΝΥ). Πρώτον, το ένθετο πόρου από πολυανθρακικό μεμβράνη 8 μm επικαλύφθηκε με 100 μι Matrigel (BD Biosciences). Πριν διεξήχθη η δοκιμασία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη (0,2 mM για AsPC-1, 0,1 mM για SW1990) για 48 ώρες ή δεν δίνεται μετφορμίνη. Οι θάλαμοι στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων? 1 × 10

4 κύτταρα σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 0,2% FBS απλώθηκαν σε κάθε άνω θάλαμο, και DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS με μετφορμίνη (0,2 mM για AsPC-1, 0,1 mM για SW1990) ή χωρίς μετφορμίνη προστέθηκε σε τα κάτω θαλάμους. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 48 ώρες, τα κύτταρα που είχαν εισβάλει στην αντίθετη πλευρά της επιφάνειας της μεμβράνης βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες.

Ξενομοσχεύματος πείραμα

Γυναίκα

nu

/

nu

ποντίκια ελήφθησαν από το Πειραματικό Κέντρο ζώων του Νοσοκομείου Ένωσης, Wuhan, Κίνα. Για κάθε πείραμα, τα ποντίκια κατανεμήθηκαν τυχαία σε ίσες ομάδες (τέσσερεις ποντικοί ανά ομάδα) που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή ή υπέστησαν αγωγή με μετφορμίνη. Για τις ομάδες έλαβαν 800 mg /L μετφορμίνης αραιώθηκε στο πόσιμο νερό τους κάθε μέρα κατά τη διάρκεια του πειράματος? 72 ώρες αργότερα, το σύνολο του πληθυσμού του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα εγχύθηκαν στο δεξί πλευρό του κάθε ποντικού. Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε 3 ημέρες μετά την αρχική ένεση όγκου και του όγκου (V) υπολογίστηκε σύμφωνα με V = (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Νοσοκομείου Ένωσης, Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (Αριθμός Άδειας: 2009-096).

κηλίδωση Western

Η κυτταρομετρία ροής ταξινομημένο κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA, 1 mM PMSF, 1 mM Να

3νο

4, και 1 χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης για 3 λεπτά σε πάγο. Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε στα 14.000 χ g για 15 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για κηλίδωση Western. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης έβρασαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (Beyotime, Jiangsu, Κίνα), αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση επί 8% γέλες SDS-πολυακρυλαμιδίου, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Οι μεμβράνες ανιχνεύτηκαν για όλη τη νύχτα στους 4 ° C με AMPKα, φωσφο-AMPKα (Thr172), Akt, φωσφο-Akt (Thr308), Erk1 /2, φωσφο-ΕΚΚ (Thr202 /Tyr204), mTOR, και φωσφο-mTOR (Ser2448) πρωτογενή αντίσωμα (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ), με β-ακτίνη (Cell Signaling) ως ο έλεγχος. Συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου IgG (Beyotime) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών. Τέλος, ανοσοανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας υποστρώματα χημιφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech).

Στατιστική ανάλυση

Για κυτταρομετρία ροής και δοκιμασίες κυτταρικής εισβολής, τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Το πείραμα ξενομόσχευμα διεξήχθη εις τετραπλούν. Για προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων και καμπύλες αύξησης, τα πειράματα διεξήχθησαν σε εξάρια. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση, αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης και στη συνέχεια συγκρίνονται μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιώντας unpaired Student του

t-τεστ

. Ένα όριο σημασία του

P

& lt? Χρησιμοποιήθηκε 0.05. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση SPSS V.11 στατιστικού λογισμικού (SPSS, Inc.).

Αποτελέσματα

Οι χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης δεν αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

Για να διερευνήσουν η επίδραση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία CCK-8 χρησιμοποιώντας AsPC-1 και SW1990 κύτταρα. Η μετφορμίνη έχει δειχθεί ότι έχουν μικρή επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του παγκρέατος σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, στις παρούσες κύτταρα μελέτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,01-0,2 mM μετφορμίνη για 72 ώρες, αλλά η επιβίωσή τους δεν ανεστάλη.

AsPC-1 και SW1990 κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης για 72 ώρες και οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκαν με CCK-8 δοκιμασίας. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε σχέση με τον έλεγχο. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην βιώσιμων κυττάρων παρατηρήθηκε μεταξύ των κυττάρων σε επεξεργασία με χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης (≤0.5 mM) και τους ελέγχους. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

Η

Χαμηλές συγκεντρώσεις μετφορμίνης μειωμένη αναλογία CD133

+ κύτταρα

Για να διερευνηθεί η επίδραση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης στον πολλαπλασιασμό των διαφόρων υποπληθυσμών παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων, πραγματοποιήσαμε μια κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας χρησιμοποιώντας AsPC-1 και SW1990 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,01-0,2 mM μετφορμίνη για 72 ώρες και η έκφραση τους επιφανειακών δεικτών που αναλύθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, χαμηλές συγκεντρώσεις μετφορμίνης μειώθηκε CD133

+ κυττάρων σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, αλλά δεν επηρέασε CD24

+, CD44

+, ESA

+ ή CD24

+ CD44

+ ESA

+ κύτταρα (CD24

+ CD44

+ ESA

+ κύτταρα δεν είναι ανιχνεύσιμα μεταξύ AsPC-1 κύτταρα).

AsPC-1 και SW1990 κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές οι συγκεντρώσεις της μετφορμίνης για 72 ώρες και οι αναλογίες των κυττάρων που εκφράζουν διαφορετικές επιφανειακές σημάνσεις προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως οι αναλογίες των διαφόρων υποπληθυσμών των κυττάρων. Οι αναλογίες των CD24

+, CD44

+, ESA

+ και CD24

+ CD44

+ ESA

+ κύτταρα (ανιχνεύσιμα μόνο σε κύτταρα SW1990) δεν είχαν μεταβληθεί από τη θεραπεία με χαμηλές συγκεντρώσεις μετφορμίνης (≤0.2 mM). Η αναλογία των CD133

+ κυττάρων μειώθηκε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο? 0.2 mM μετφορμίνη για AsPC-1 κύτταρα και 0,1 mM μετφορμίνη για τα κύτταρα SW1990 μειώθηκε το ποσοστό των CD133

+ κυττάρων κατά το ήμισυ. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

*

P

& lt? 0,05 (Σε σύγκριση με τον έλεγχο)

Η

Χαμηλές συγκεντρώσεις μετφορμίνης ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των CD133

+ κυττάρων από την G1 /S σύλληψη

για να διερευνηθεί η επίδραση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης επί του πολλαπλασιασμού των CD133

+ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, AsPC-1 και τα κύτταρα SW1990 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,2 mM ή 0,1 mM μετφορμίνη, αντίστοιχα. Οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν κάθε 24 ώρες και κυτταρομετρία ροής διεξήχθη για τον προσδιορισμό των αριθμών και των αναλογιών των CD133

+ και CD133

– κύτταρα στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, ο πολλαπλασιασμός των CD133

+ κυττάρων ήταν επιλεκτικά αναστέλλεται. ανάλυση απόπτωση και κυτταρικό κύκλο διεξήχθησαν 48 ώρες αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μετφορμίνη (0,2 mM για AsPC-1, 0,1 mM για SW1990) ή χωρίς μετφορμίνη? Αυτές οι χαμηλές συγκεντρώσεις επαγόμενη απόπτωση σε κανένα CD133

+ ούτε CD133

+ κύτταρα, αλλά ο κυτταρικός κύκλος του CD133

+ κυττάρων επηρεάζεται από την αγωγή. Χαμηλή συγκέντρωση μετφορμίνη αύξησαν το ποσοστό του CD133

+ κύτταρα σε G0 /G1 φάση και μειωμένη εκείνη των κυττάρων στη φάση S σημαντικά. Το CD133

– δεν επηρεάστηκε του κυτταρικού κύκλου (σχ. 4)

Α, καμπύλες ανάπτυξης για τον καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα επεξεργασμένα με χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης.. AsPC-1 και SW1990 κύτταρα επωάστηκαν με 0,2 mM ή 0,1 mM μετφορμίνη, αντίστοιχα, και οι αριθμοί τους μετρήθηκαν σε κάθε χρονικό σημείο. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως η αύξηση φορές σε σχέση προς 0 h. Β, Επίδραση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης στο ποσοστό των

+ κύτταρα CD133. AsPC-1 και SW1990 κύτταρα επωάστηκαν με 0,2 mM ή 0,1 mM μετφορμίνη, αντίστοιχα, και το ποσοστό των CD133

+ κυττάρων προσδιορίστηκε σε κάθε χρονικό σημείο. Το ποσοστό των CD133

+ κυττάρων μειώθηκε σταδιακά. C, καμπύλες ανάπτυξης για CD133

+ και CD133

– παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε επεξεργασία με χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης. Ο συνολικός αριθμός των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων και οι αναλογίες του CD133

+ και CD133

– κύτταρα προσδιορίστηκαν σε κάθε χρονικό σημείο. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως η αύξηση φορές σε σχέση προς 0 h. Ο πολλαπλασιασμός των CD133

+ κυττάρων ήταν επιλεκτικά αναστέλλεται. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

Η

Α, Επίδραση της χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης στην απόπτωση σε καρκίνο του παγκρέατος. AsPC-1 και SW1990 κύτταρα επωάστηκαν με 0,2 mM ή 0,1 mM μετφορμίνη, αντίστοιχα, για 72 ώρες και οι αναλογίες των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των κατεργασμένων κυττάρων και των ελέγχων. Β, Επίδραση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης επί του κυτταρικού κύκλου σε καρκίνο του παγκρέατος. AsPC-1 και SW1990 κύτταρα επωάστηκαν με 0,2 mM ή 0,1 mM μετφορμίνη, αντίστοιχα, για 72 ώρες και οι αναλογίες των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Η μείωση των συνολικών κυττάρων φάσης S και μια αύξηση της G0 /G1 φάση προτείνουν G1 /S σύλληψη στο CD133

+ κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

*

P

& lt?. 0.05

Η

Χαμηλές συγκεντρώσεις μετφορμίνης ανέστειλε την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

δοκιμασία Μια Transwell διεξήχθη για να εξετάσει την επίδραση της χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης επί του παγκρέατος εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Η θεραπεία με μετφορμίνη (0,2 mM για AsPC-1, 0,1 mM για SW1990) μείωσε τον αριθμό των κυττάρων που εισέβαλαν στην αντίθετη πλευρά της μεμβράνης του θαλάμου Transwell σε σύγκριση με κύτταρα που δεν έλαβαν μετφορμίνη (Εικ. 5Β), το οποίο υποδηλώνει ότι η χαμηλή συγκέντρωση μετφορμίνη αναστέλλει την επεμβατική ικανότητα των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

Επίδραση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης σε εισβολή σε καρκίνο του παγκρέατος. AsPC-1 και SW1990 κύτταρα επωάστηκαν με 0,2 mM ή 0,1 mM μετφορμίνη, αντίστοιχα, για 72 ώρες και η κυτταρική εισβολή προσδιορίσθηκε με δοκιμασία Transwell. Χαμηλές συγκεντρώσεις μετφορμίνης μείωσε την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

*

P

& lt?. 0.05

Η

από του στόματος χορήγηση της μετφορμίνης ανέστειλε παγκρέατος ανάπτυξη ξενομοσχευμάτων καρκίνου in vivo

Για να διερευνηθεί η επίδραση της χαμηλής δόσης μετφορμίνης σε καρκίνο του παγκρέατος

in vivo

, ξενομόσχευμα πειράματα χρησιμοποιώντας το

nu

/

nu

ποντίκια διεξήχθησαν. Για τους ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη, η ποσότητα του φαρμάκου αραιώνεται στο πόσιμο νερό τους ήταν ισοδύναμη με μία ανθρώπινη δόση των 20 mg /kg με κανονικοποίηση προς την επιφανειακή περιοχή? η συγκέντρωση της μετφορμίνης στα ποντίκια πλάσμα ήταν περίπου 0,02 mM. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 18 (κύτταρα AsPC-1) ή 24 (SW1990 κύτταρα) ημέρες μετά την ένεση με καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος (5 × 10

6 για AsPC-1 κύτταρα, 1 × 10

7 για τα κύτταρα SW1990) . Η ανάπτυξη του παγκρεατικού ξενομοσχεύματα καρκίνου ανεστάλη σημαντικά με θεραπεία με μετφορμίνη (Εικ. 6).

Α, ξενομοσχεύματος κατά τη θυσία. Οκτώ εκατό χιλιοστόγραμμα ανά λίτρο της μετφορμίνης αραιώθηκε στο πόσιμο νερό του

ηυ

/

ηυ ποντικούς

72 ώρες πριν από την έγχυση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 18 ή 24 ημέρες μετά την εμφύτευση. Ξενομοσχεύματα από ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με από του στόματος μετφορμίνη ήταν πολύ μικρότερες από εκείνες από μη επεξεργασμένες ποντικούς. Β, Επίδραση της από του στόματος χορήγηση της μετφορμίνης επί της ανάπτυξης ξενομοσχευμάτων. Οκτώ εκατό χιλιοστόγραμμα ανά λίτρο της μετφορμίνης αραιώθηκε στο πόσιμο νερό του

ηυ

/

ηυ ποντικούς

72 ώρες πριν από την έγχυση των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε 3 ημέρες μετά την ένεση του όγκου και του όγκου (V) υπολογίστηκε σύμφωνα με V = (μήκος Χ πλάτος

2) /2. ανάπτυξη ξενομοσχεύματος αναστάλθηκε σημαντικά με από του στόματος χορήγηση της μετφορμίνης. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

*

P

& lt?. 0.05

Η

Χαμηλές συγκεντρώσεις μετφορμίνης ανέστειλε φωσφορυλίωση της mTOR ανεξάρτητες της φωσφορυλίωσης Akt και AMPK στο CD133

+ κύτταρα

για να εντοπίσει πιθανές μοριακή καθοριστικούς παράγοντες των επιπτώσεων της μετφορμίνης για CD133

+ κύτταρα, αξιολογήσαμε την ενεργοποίηση της ΑΜΡΚ, Erk, και Akt – τρεις κινάσες που ενδεχομένως εμπλέκονται σε αυτά τα αποτελέσματα. mTOR, το οποίο φωσφορυλιώνεται από AMPK, Erk, και Akt, αξιολογήθηκε επίσης. Μετά τη θεραπεία με μετφορμίνη για 4 h (0,2 mM για AsPC-1, 0,1 mM για SW1990), οι μειώσεις της φωσφο-ΕΚΚ και φωσφο-mTOR παρατηρήθηκαν σε CD133

+ κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει μια απαίτηση για την αναστολή της ERK και mTOR με η δράση του πολλαπλασιασμού της μετφορμίνης. Καμία σημαντική αλλαγή της φωσφο-AMPKα παρατηρήθηκε, ενώ φωσφο-Ακί αυξήθηκε μετά από θεραπεία με μετφορμίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ανασταλτική δράση της μετφορμίνης επί mTOR ήταν ανεξάρτητη της ΑΜΡΚ και φωσφορυλίωσης Akt (Εικ. 7).

παγκρέατος καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μετφορμίνη για 4 h (0,2 mM για AsPC-1, 0,1 mM για SW1990) και CD133

+ κύτταρα ταξινομήθηκαν με κυτομετρία ροής. Έκφραση των AMPKα, Akt, Erk1 /2, και mTOR και φωσφορυλίωση CD133

+ κύτταρα εκτιμήθηκαν με κηλίδωση Western και τα αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ V.1.46r (National Institutes of Health). Σημαντικές μειώσεις του φωσφο-ERK1 /2 και η έκφραση φωσφο-mTOR και σημαντική αύξηση της έκφρασης φωσφο-Ακί παρατηρήθηκαν στα κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με μετφορμίνη. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση.

*

P

& lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Η μετφορμίνη μειώνει την ηπατική παραγωγή της γλυκόζης και αυξάνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη και τη χρησιμοποίηση της γλυκόζης από τους μυς και λιποκύτταρα, με αποτέλεσμα μειώθηκαν insulinemia και βελτίωση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη σε διαβητικούς ασθενείς. Είναι η πιο συχνά συνταγογραφείται αντιδιαβητικό φάρμακο για το διαβήτη τύπου II [15] και χρησιμοποιείται επίσης για άλλες ασθένειες που χαρακτηρίζουν την αντίσταση στην ινσουλίνη, συμπεριλαμβανομένου του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών [16], μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος [17] και της πρόωρης εφηβείας [18] . Πρόσφατα, έχει κερδίσει την προσοχή για πιθανή αποτελεσματικότητα του ως αντικαρκινικό φάρμακο. Στην πρωτοποριακή εργασία, Evans et al. καταδεικνύεται για πρώτη φορά το 2005, ότι η λήψη μετφορμίνη μπορεί να σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου σε ασθενείς με διαβήτη τύπου II [19]. Το 2009, μια μελέτη ελέγχου υπόθεση εστιάζοντας στην επίδραση των αντιδιαβητικών θεραπειών για τον κίνδυνο καρκίνου του παγκρέατος, δόθηκε στη δημοσιότητα από τους Li et al. και απέδειξε ότι η μετφορμίνη μείωσε σημαντικά τον κίνδυνο του καρκίνου του παγκρέατος, με μια αναλογία πιθανοτήτων 0,38 [9]. Η αποτελεσματικότητα της μετφορμίνης στη μείωση της συχνότητας εμφάνισης του καρκίνου του παγκρέατος έχει υποστηριχθεί από άλλους επιδημιολογικές και ζωικές μελέτες [8], [10].

Αν και αντιδιαβητικά μηχανισμός μετφορμίνη δράσης της παραμένει αβέβαιη, η ενεργοποίηση του ΑΜΡ-ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κινάσης (ΑΜΡΚ) έχει γίνει ευρέως αποδεκτή ως ένα πιθανό μηχανισμό. ΑΜΡΚ είναι ένα σημαντικό ένζυμο που εμπλέκεται στη σηματοδότηση της ινσουλίνης, το μεταβολισμό της γλυκόζης και των λιπών, και την παραγωγή γλυκόζης από τα κύτταρα του ήπατος. Πολλές κυτταρικές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην ΑΜΡΚ και τα μόρια που σχετίζονται και έχουν αποκαλύψει μια αντικαρκινική δράση της μετφορμίνης

in vitro

[12], [20], [21]. Μια πρόσφατη μελέτη κατέδειξε επίσης την αντικαρκινική δράση της μετφορμίνης επί του καρκίνου του παγκρέατος βλαστικά κύτταρα [13]. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα περισσότερα από αυτά τα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις της μετφορμίνης (τυπικά 5-30 mM) που είναι πολύ υψηλότερες από τις συνιστώμενες θεραπευτικές δόσεις για κλινική χρήση. Όταν οι συγκεντρώσεις μειώθηκαν στην ίδια σειρά όπως αυτό που βρέθηκε στο πλάσμα και στους ιστούς των ατόμων που λαμβάνουν θεραπευτικές δόσεις, δεν παρατηρήθηκε αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος δεν αναστέλλεται από λιγότερο από 0,5 mM μετφορμίνη

Οι περισσότεροι όγκοι, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος, είναι ετερογενείς.? Δηλαδή, αυτά περιλαμβάνουν κύτταρα ποικίλης φαινοτυπική και βιολογικές ιδιότητες. Η υπόθεση καρκίνος βλαστικών κυττάρων υποδηλώνει ότι μόνο ένα μικρό υποπληθυσμό κυττάρων, που ορίζεται ως καρκίνος βλαστικά κύτταρα, έχει τη δυνατότητα να προκαλέσουν όλα τα είδη κυττάρων που βρίσκονται σε ένα συγκεκριμένο δείγμα του καρκίνου. Καρκινικά βλαστικά κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση, την ανάπτυξη, την εισβολή, μετάσταση, την επανάληψη και την αντίσταση σε επικουρική θεραπεία του καρκίνου [22], [23]. Ως εκ τούτου, υποψιαζόμαστε ότι οι χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης μπορεί να επηρεάσει παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα και τα καρκινικά κύτταρα μη-βλαστικών διαφορετικό τρόπο, πράγμα που θα μπορούσε να εξηγήσει το φάρμακο είναι

in vivo

αντικαρκινική δράση και η ασυνέπεια των

in vitro

και

in vivo

αποτελέσματα. Επειδή έχουν CD133

+ και CD24

+ CD44

+ ESA

+ κύτταρα έχουν τεκμηριωθεί ότι είναι παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα [24], [25], [26], προσδιορίσαμε την επίδραση της χαμηλής Οι συγκεντρώσεις της μετφορμίνης σε αυτές τις υποπληθυσμών, επιδεικνύοντας μια μειωμένη αναλογία CD133

+ κύτταρα. Λαμβάνοντας υπόψη τη μικρή επίδραση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος σε γενικές γραμμές, μπορεί να συναχθεί ότι η διάδοση των CD133

+ κύτταρα, αλλά όχι CD24

+, CD44

+, ESA

+ ή CD24

+ CD44

+ ESA

+ κύτταρα, επιλεκτικά αναστέλλεται. Hermann et al. έδειξαν ότι CD133

+ και CD24

+ CD44

+ κυττάρων

+ ESA επικαλύπτονται, αλλά δεν ήταν ίδια σε κύτταρα L3.6pl που προέρχονται από την Κόλο 357 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [25]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι CD133

+ κύτταρα αλλά όχι CD24

+ CD44

+ ESA

+ κύτταρα είναι ανιχνεύσιμα μεταξύ των κυττάρων AsPC-1. Όσο για τα κύτταρα SW1990, CD24

+ CD44

+ ESA

+ κύτταρα, τα οποία αντιπροσώπευαν το 5,46% του συνόλου των κυττάρων, ήταν αναίσθητη στη μετφορμίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα βιολογικά χαρακτηριστικά του CD133

+ και CD24

+ CD44

+ ESA

+ κύτταρα διαφέρουν. Έχουμε καθορίζεται περαιτέρω το ποσοστό των CD133

+ κυττάρων κάθε 24 ώρες για 5 ημέρες μετά τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων με χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης και παράγονται καμπύλες ανάπτυξης για τις δύο CD133

+ και CD133

– κύτταρα. Η επιλεκτική αναστολή της CD133

+ κυττάρων ήταν σαφής. Συσσωρευμένα

in vitro

στοιχεία δείχνουν ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης μπορεί να εξασκήσει μια αντικαρκινική δράση με την επαγωγή απόπτωσης ή /και διακοπή κύκλου κυττάρου, αλλά υπάρχουν λίγες δημοσιευμένα στοιχεία για χαμηλές συγκεντρώσεις. Έτσι, διερευνήθηκε επίσης η επίδραση της χαμηλής συγκέντρωσης μετφορμίνης επί της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου. Η απόπτωση, η οποία έχει τεκμηριωθεί ότι είναι σημαντικό στην αντικαρκινική δράση της μετφορμίνης, προκλήθηκε σε ούτε CD133

+ ούτε CD133

– κύτταρα. G1 /S σύλληψη προκλήθηκε στο CD133

+ αλλά όχι στο CD133

– κύτταρα. G1 /S σύλληψη μπορεί έτσι να διαδραματίσει καίριο ρόλο στην επιλεκτική αναστολή της

+ κύτταρα CD133.

Στη συνέχεια, διενεργήθηκε

in vitro

και

in vivo πειράματα για να

επαληθεύει την αντικαρκινική δράση των χαμηλών συγκεντρώσεων της μετφορμίνης σε καρκίνο του παγκρέατος. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη για 72 ώρες χρησιμοποιήθηκαν για προσδιορισμούς κυτταρικής εισβολής επειδή η θεραπεία μείωσε την αναλογία του CD133

+ κύτταρα κατά το ήμισυ. Η μετφορμίνη αραιώνεται στο πόσιμο νερό του

nu

/

nu

ποντίκια 72 ώρες πριν από το πείραμα ξενομόσχευμα να επιτευχθεί μια σταθερή συγκέντρωση στο πλάσμα σύμφωνα με τη φαρμακοκινητική της μετφορμίνης [27]. Τόσο η in vitro δοκιμασία εισβολής και την in vivo εξέταση ξενομοσχεύματος υποστηρίζει την αντικαρκινική δράση της χαμηλής μετφορμίνης συγκέντρωση. Οι διαφορές των όγκων του όγκου SW1990 ξενομόσχευμα δεν ήταν στατιστικά σημαντική την ημέρα 21 (

P

= 0,062) ή την ημέρα 24 (

P

= 0,055). Αυτό μπορεί να οφείλεται στο μικρό μέγεθος δείγματος. Λαμβάνοντας υπόψη τη μικρή επίδραση της μετφορμίνης στον πολλαπλασιασμό των CD133

– κύτταρα και το βασικό ρόλο των καρκινικών βλαστοκυττάρων στην εξέλιξη του όγκου, την εισβολή και τη μετάσταση [28], [29], θα πρότεινα ότι η επιλεκτική αναστολή της CD133

+ κυττάρων συμβάλλει σημαντικά στην in vitro και in vivo αντικαρκινική δράση της μετφορμίνης.

Αξιολογήσαμε επόμενο την έκφραση των μορίων που μπορούν να καθορίσουν την αντικαρκινική δράση της μετφορμίνης επί CD133

+ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Η ενεργοποίηση του mTOR ρυθμίζεται από αυξητικούς παράγοντες και θρεπτικά συστατικά, και ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη μέσω ελέγχου mRNA μετάφραση, ριβοσωμάτων βιογένεση, αυτοφαγία, και το μεταβολισμό [30]. Πολλές στόχοι του mTOR κινάσης υπερεκφράζεται ή μεταλλάσσεται σε καρκίνο, η οποία συσχετίζεται με την πρόοδο του καρκίνου, δυσμενείς πρόγνωση, και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [31]. Τα τελευταία χρόνια, mTOR βρέθηκε να παίζουν σημαντικούς ρόλους στη διατήρηση βλαστικών κυττάρων του καρκίνου [32], [33]. Ως εκ τούτου, mTOR έχει θεωρηθεί ότι είναι ένας θεραπευτικός στόχος στον καρκίνο που μπορεί να στοχεύονται από τη μετφορμίνη [34], [35]. Μία ανασταλτική δράση της μετφορμίνης για την φωσφορυλίωση της mTOR, η οποία έχει αναφερθεί σε καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων του καρκίνου του παγκρέατος [36], [37], παρατηρήθηκε σε CD133

+ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε αυτή τη μελέτη. Παρά το γεγονός ότι η μετφορμίνη έχει τεκμηριωθεί για να επάγει την ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, δεν παρατηρήθηκε το φαινόμενο αυτό, το οποίο μπορεί να οφείλεται στη χαμηλή συγκέντρωση της μετφορμίνης που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη [36]. Erk και Akt είναι δύο άλλους μεσολαβητές του mTOR σε καρκινικά κύτταρα. Μετάλλαξη του K-Ras, το κυρίαρχο μετάλλαξη στο καρκίνο του παγκρέατος, οδηγεί σε ανώμαλη ενεργοποίηση του Erk σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, τα οποία με τη σειρά της οδηγεί σε ενεργοποίηση του mTOR [38]. Δείξαμε συμφωνία της ανασταλτικής δράσης της μετφορμίνης σε Erk και mTOR στην CD133

+ κύτταρα, τα οποία μας οδηγεί να προτείνουμε ότι Erk εξαρτάται κατάργηση της ενεργοποίησης του mTOR παίζει σημαντικό ρόλο στην αντικαρκινική δράση της μετφορμίνης. Πρόσφατα, μια παρόμοια εκλεκτική ανασταλτική δράση της μετφορμίνης επί CD133

+ καρκινικά κύτταρα οφείλεται σε μετφορμίνη επαγόμενη αναστολή της Akt τεκμηριώθηκε σε γλοιοβλάστωμα [39]. Αντίθετα, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επαγόμενη από τη μετφορμίνη ενεργοποίηση της Akt σε CD133

+ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Εμείς διστακτικά προτείνουν ότι δύο μηχανισμοί μπορούν να συμβάλλουν στην ενεργοποίηση της Akt σε CD133

+ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Πρώτον, η μετφορμίνη προκαλεί επανέκφραση του miR-200 σε παγκρεατικού καρκίνου [13]. FOG2 καταστέλλει PI3K με τη δέσμευση της υπομονάδας p85α και miR-200 ενεργοποιεί το /Akt μονοπατιού σηματοδότησης ΡΙ3Κ από την κατάργηση FOG2 [40]. Δεύτερον, Erk εξαρτώμενη αναστολή του mTOR μπορεί να μεσολαβεί ένα βρόχο ανάδρασης που αυξάνει Akt φωσφορυλίωση [41].

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι χαμηλές συγκεντρώσεις της μετφορμίνης, της ίδιας τάξης με αυτές που μετρήθηκαν στο πλάσμα και τους ιστούς των ατόμων που έχουν λάβει μια συνιστώμενη θεραπευτική δόση της μετφορμίνης, αναστέλλει επιλεκτικά τον πολλαπλασιασμό των CD133

+ παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και έχει αντικαρκινική δράση τόσο

in vitro

και

in vivo

.