Αφηρημένο

Latency που σχετίζονται με πεπτίδιο (LAP) – εκφράζουν ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs) είναι σημαντικές για την ανοσολογική αυτο-ανοχή και την ανοσολογική ομοιόσταση. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του LAP στην ανθρώπινη CD4

+ Foxp3

+ Tregs, σχεδιάσαμε μια συγχρονική μελέτη που περιελάμβανε 42 καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) ασθενείς. Οι φαινότυποι, τα σχέδια απελευθέρωσης κυτοκινών, και την ικανότητα καταστολής των Tregs που απομονώνονται από το αίμα και τους ιστούς όγκων περιφερειακών αναλύθηκαν. Βρήκαμε ότι ο πληθυσμός του LAP-θετικών CD4

+ Foxp3

+ Tregs αυξήθηκε σημαντικά στο περιφερικό αίμα και ο καρκίνος ιστούς των ασθενών CRC σε σύγκριση με εκείνη στο περιφερικό αίμα και τους ιστούς του υγιή άτομα. Τόσο LAP

+ και LAP

– Tregs είχε ένα παρόμοιο φαινότυπο τελεστή /μνήμης. Ωστόσο, LAP

+ Tregs εκφράζεται πιο αποτελεσματικά μόρια, περιλαμβανομένου του παράγοντα νέκρωσης των όγκων υποδοχέα ΙΙ, γρανζύμου Β, περφορίνης, Ki67, και CCR5, από LAP τους

– αρνητική ομολόγους. Η in vitro ανοσοκατασταλτική δραστηριότητα του LAP

+ Tregs, που ασκείται μέσω ενός μηχανισμού ανάπτυξης μετασχηματιστικού παράγοντα-β-διαμεσολαβούμενη, ήταν πιο ισχυρό από εκείνο του LAP

– Tregs. Επιπλέον, ο εμπλουτισμός του LAP

+ Treg πληθυσμού σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) των ασθενών CRC συσχετίζονται με μεταστάσεις του καρκίνου. Συμπερασματικά, βρήκαμε ότι η LAP

+ Foxp3

+ CD4

+ κύτταρα Treg αντιπροσώπευε ένα ενεργοποιημένο υποομάδα των Tregs έχει πιο ισχυρή ρυθμιστική δράση σε ασθενείς με CRC. Η αυξημένη συχνότητα των LAP

+ Tregs σε ΜΚΠΑ ασθενών CRC προτείνει δυναμικό ρόλο τους στον έλεγχο της ανοσολογικής απόκρισης σε καρκίνο και παρουσιάζει LAP ως δείκτης του όγκου-ειδικά Tregs στους ασθενείς CRC

Παράθεση:. Mahalingam J , Lin CY, Chiang JM, Su PJ, Chu YY, Lai ΗΥ, et al. (2014) CD4

+ Τ κύτταρα που εκφράζουν συνδέεται με λανθάνουσα κατάσταση πεπτιδίων και Foxp3 είναι ένας Ενεργός υποομάδα των ρυθμιστικών Τ κύτταρα εμπλουτίζονται σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (9): e108554. doi: 10.1371 /journal.pone.0108554

Επιμέλεια: Derya Unutmaz, του Πανεπιστημίου της Νέας Υόρκης, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Απριλίου του 2014? Αποδεκτές: 24, Αυγούστου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 30 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Mahalingam et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC Grant NSC 99-3112-Β-182-011, 97-2314-Β-182Α-027) και CMRPG 380.362, 380.743, 392.087 από Chang Gung Memorial Hospital. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Όλοι οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

Η ανοσοκατασταλτική λειτουργίες ενός εξειδικευμένου υποσυνόλου των Τ κυττάρων είναι ζωτικής σημασίας για το ανοσοποιητικό ρύθμιση. Ρυθμιστικές Τ κύτταρα (Tregs) παίζουν κεντρικό ρόλο στη διατήρηση της περιφερικής αυτοανοχής και του ανοσοποιητικού ομοιόστασης [1] – [3]. Αρκετές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων δείχνουν ότι ο παράγοντας forkhead μεταγραφής (Foxp3) εκφράζοντα CD4

+ Tregs είναι ετερογενείς όσον αφορά την ανάπτυξη και τις λειτουργίες τους. Έτσι, τα φυσικά Tregs αναφέρονται σε CD4

+ Foxp3

+ Tregs του θυμικού προέλευσης, ενώ προκαλείται από Tregs (iTregs) είναι ένας πληθυσμός κυττάρων Τ περιφερειακά μετατραπεί από CD4

+ Foxp3

– Τ κυττάρων [4] – [6]. Huehn et al. ήταν οι πρώτοι που αποδεικνύουν την ύπαρξη διακριτών υποσύνολα Tregs, αφελή Tregs και μνήμης τελεστών Tregs, με βάση την έκφραση του CD103, ενός υποδοχέα του α

E ιντεγκρίνης που καθοδηγεί τα κύτταρα Τ να φλεγμονή χώρων [7]. Η λειτουργία ανοσοτροποποιητική των ενεργοποιημένων ή τελεστή Tregs που σχετίζονται με την έκφραση μιας ποικιλίας μορίων όπως οι υποδοχείς χημοκίνης CCR6 και CCR5, κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων αντιγόνο-4 (CTLA-4), και του όγκου του υποδοχέα παράγοντα νέκρωσης (TNFR) II στη συνέχεια διερευνήθηκε σε χρόνιων φλεγμονωδών ασθενειών, μοσχεύματος έναντι ξενιστή, και όγκους [8] – [15]. Sakaguchi et al. περαιτέρω οριοθετείται το ρόλο του Foxp3

+ CD4

+ Tregs με βάση την έκφραση του CD45RA και Foxp3 και διαιρείται CD4

+ Foxp3

+ Tregs σε τρεις φαινοτυπικά και λειτουργικά διακριτές υποομάδες, δηλαδή μη κατασταλτικός, ανάπαυσης, και ενεργοποιείται Tregs? οι τελευταίες πιστεύεται ότι δρουν ως καταστολείς της ανοσολογικής απόκρισης και μεσολαβητών του ανοσοποιητικού αιμόστασης [16]. Είχαμε προηγουμένως εξέδωσε την εν λόγω ταξινόμηση και διαπίστωσε ότι σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, μόνο το ενεργοποιημένο και όχι τα αφελή Tregs συσσωρεύεται στο σημείο του όγκου, καταστέλλεται τελεστή πολλαπλασιασμού κυττάρων Τ in vitro, και συσχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου [17]. Έχουμε προτείνει ότι, με δεδομένη την απόκλιση κανονιστική δραστηριότητα της ανθρώπινης Tregs, είναι απαραίτητο να διαχωριστούν Foxp3

+ Tregs σε λειτουργικά υποομάδες και να στοχεύσετε ένα συγκεκριμένο υποπληθυσμό Treg, προκειμένου να εξασφαλιστεί η επιτυχής ανοσοθεραπεία.

Ένας αριθμός μελετών έχουν καταδείξει ότι αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF) -β παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανοσοκαταστολή που εξασκείται από Foxp3

+ Tregs [18] – [22]. ΤΟΡ-β σε συνδυασμό με IL-2 επάγει ισχυρά τη διαφοροποίηση των αφελή Tregs σε λειτουργικά Foxp3

+ iTregs [19]. Latency σχετιζόμενη πεπτίδιο (LAP) είναι η Ν-τερματικό προπεπτίδιο της ΤΟΡ-β πρόδρομο ότι μη-ομοιοπολικά συνδέεται προς ΤΟΡ-β, σχηματίζοντας ένα λανθάνων ΤΟΡ-β πολύπλοκες και διευκολύνουν την αποδέσμευση του ΤΟΡ-β1 εντός της εξωκυττάριας μήτρας [23]? Στη συνέχεια, το ενεργοποιημένο ΤΟΡ-β προάγει τη μετατροπή του αφελή Tregs να iTregs και μεσολαβεί Treg σχετιζόμενη ανοσοκαταστολή [24]. LAP εκφράζεται στην κυτταρική μεμβράνη πολλών κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των Tregs, και συμμετέχει στην ανοσολογική ρύθμιση. ΤΟΡ-β-εξαρτώμενη LAP-εκφράζουν Tregs απέδειξαν κατασταλτική ικανότητα σε ποντίκια και ανθρώπους. Έτσι, ένα υποσύνολο του επαγώγιμου LAP-θετικών Foxp3

-CD4

+ Tregs καταστέλλεται αλλεργική φλεγμονή σε ποντικούς [25] – [27]. Gandhi et al. ανέφεραν ότι αυτή η νέα πληθυσμός Treg, που απομονώνονται από ανθρώπινο περιφερικό αίμα, κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό άλλων κυττάρων Τ in vitro, η οποία εν μέρει μεσολαβείται από ΤΟΡ-β και IL-10 [28]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι ο πληθυσμός των CD4

+ LAP

+ κυττάρων αυξήθηκε στο περιφερικό αίμα του ορθοκολικού καρκίνου (CRC) ασθενείς? Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα έδειξαν μια ΤΟΡ-β-εξαρτώμενη κατασταλτικός φαινότυπο [29]. Είναι σημαντικό, παρατηρήσαμε μια μέτρια αύξηση των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κυττάρων σε ασθενείς με CRC, λαμβάνοντας υπόψη ότι οι Tregs σπάνια παρατηρήθηκε σε υγιή άτομα. Chen et al. ληφθεί παρόμοια αποτελέσματα σε μυϊκή πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα (ΕΑΕ), όπου ένα μοναδικό υποσύνολο του LAP που εκφράζουν CD4

+ CD25

+ Tregs εκτίθενται πιο ισχυρή ικανότητα καταστολής από LAP-αρνητικών Tregs [30]. Η ύπαρξη των CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs με κατασταλτική δράση παρατηρήθηκε επίσης σε αυτοάνοσες σύνδρομο της κασιδιάρης ποντίκια [31]. Ωστόσο, σε ανθρώπους, η ανοσορυθμιστική ρόλος του LAP που εκφράζουν CD4

+ Foxp3

+ Tregs δεν χαρακτηρίζεται καλά. Σε αυτή την εργασία, δείξαμε ότι CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Treg πληθυσμού ήταν ελαφρά αυξημένη στο περιφερικό αίμα ασθενών με CRC και παρουσίασε μια ξεχωριστή υποσύνολο των ενεργοποιημένων Tregs που ισχυρά κατασταλεί κύτταρα δράστες μέσω TGF μηχανισμού -β σχετίζονται. Ένα υψηλότερο ποσοστό LAP

+ Tregs συσχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι LAP

+ Tregs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική ανοχή στο CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς

στο σύνολο, 42 ασθενείς CRC και 21 υγιείς δότες που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη. Οι 42 ασθενείς CRC είχαν πρόσφατα διαγνωστεί με τη νόσο και υποβλήθηκαν σε κολεκτομή χωρίς προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή /και ακτινοθεραπεία σε Chang Gung Memorial Hospital, υποκατάστημα Linkou, Taoyuan, Ταϊβάν. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από τους ασθενείς με φλεβοκέντηση πριν την επέμβαση. ανακτήθηκαν ασθενών κλινικά χαρακτηριστικά, καθώς και την παθολογία του όγκου, το στάδιο CRC, και καρκινοεμβρυϊκό επίπεδα αντιγόνου από τα ιατρικά αρχεία.

Τα δείγματα αίματος και ιστού

μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) απομονώθηκαν από FICOLL- Paque Plus πυκνότητα μέθοδος βαθμίδωσης φυγοκέντρησης [12]. Τα λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν επίσης από τις εκτομή δείγματα τόσο του όγκου και μη καρκινικών ιστών. μη καρκινικούς ιστούς επιλέχθηκαν από το περιθώριο εκτομή του δείγματος και επιβεβαιώθηκε ότι είναι μη καρκινικές από παθολογική εξέταση. Οι ιστοί όγκου και μη όγκου λεπτοτεμαχισμένου και συνθλίβονται, επωάστηκαν με 0.1% κολλαγενάση D (Sigma-Aldrich, USA) σε HBSS για 30 λεπτά στους 37 ° C και διηθείται μέσω πλέγματος νάιλον. εναιώρημα ξεχωριστών κυττάρων παρασκευάστηκε με Ficoll (Pharmacia, USA), και τα λευκοκύτταρα διαχωρίστηκαν από την μεσόφαση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29].

Ηθική δήλωση

Υπογραφή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες πριν από την εγγραφή. Το πρωτόκολλο της μελέτης σχεδιάστηκε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας της Διακήρυξης του Ελσίνκι του 2008 και εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Chang Gung Memorial Hospital, Ταϊβάν.

Αντισώματα και αντιδραστήρια

ληφθεί Φρέσκο ανθρώπινα λεμφοκύτταρα υπέστησαν χρώση με τις ακόλουθες φθορίζοντα αντισώματα έναντι επιφανειακών δεικτών ανθρώπινων λευκοκυττάρων: CD4-peridinin-χλωροφύλλη-κυανίνης 5 (PerCP-Cy5.5), CD25-φυκοερυθρίνη (ΡΕ) ή -allophycocyanin (APC), ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη CD45RA-(FITC ), CCR7-ΡΕ, CCR5-FITC, CCR4-ΡΕ-Cy7, CD62L-ΡΕ, Ki67-ΡΕ ή -APC από (BD Biosciences, USA), και LAP (PE και APC) από (R &? D Systems, USA) . Η ενδοκυτταρική χρώση με Foxp3-APC ή -FITC και αντισώματα CTLA-4-APC εκτελέστηκε μετά τη θεραπεία με στερέωση και διαπερατοποίηση ρυθμιστικά (eBiosciences, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ενδοκυτταρική χρώση για γρανζύμου Β, περφορίνη, και ΤΟΡ-β πραγματοποιήθηκε μετά από διέγερση με ΡΜΑ και ιονομυκίνη για 5 ώρες με στοπ Golgi. Τα διεγερμένα κύτταρα ήταν αντιδρά πρώτα με αντισώματα εναντίον του δείκτες επιφάνειας CD4 και LAP, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με ρυθμιστικό Cytofix /Cytoperm (BD Biosciences, USA), και, τέλος, χρωματίστηκαν με ΤΟΡ-β-ΡΕ, γρανζύμου Β-FITC, ή perforin- PE αντισώματα. Η ένταση φθορισμού αναλύθηκε χρησιμοποιώντας BD FACSCalibur (BD Biosciences, Η.Π.Α.) και το λογισμικό FlowJo (Tree Star, USA).

CD4

+ CD25

+ LAP

+ Τ κύτταρα δοκιμασία καταστολή

CD4

+ CD25

+ LAP

+, CD4

+ CD25

+ LAP

-, και CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα από CRC ασθενείς απομονώθηκαν με καθαρότητα πάνω από 90% κατά ταξινόμηση κυττάρων, χρησιμοποιώντας FACS Aria (BD Biosciences, USA). CD4

+ CD25

+ LAP

+ και CD4

+ CD25

+ LAP

– Τ κύτταρα αναμιγνύονται με ανταπόκρισης Τ κυττάρων (CD4

+ CD25

– ) σε αναλογία 1:01 και ενεργοποιημένα με αντι-CD3 και αντι-CD28 για 96 ώρες. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με θυμιδίνη [

3Η] για 16 ώρες μετά την διέγερση.

Στατιστική ανάλυση

Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων εκτιμήθηκαν με Mann-Whitney U test,

t

-test, σε συνδυασμό

t-test

, ή μονόδρομη ANOVA. Οι τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001) θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 5.0 λογισμικό (GraphPad Software, USA).

Αποτελέσματα

Μια ομάδα CD4

+ Foxp3

+ Tregs εκφράζει προτίμηση LAP σε ασθενείς CRC

Θα διερευνηθεί για πρώτη φορά την έκφραση της επιφάνειας LAP για CD4

+ Foxp3

+ Tregs απομονωθεί από ασθενείς CRC. Η αξιοπιστία της χρώσης LAP επιβεβαιώθηκε από μονοκλωνικού μάρτυρα ισοτόπου και ανασυνδυασμένο LAP (rLAP) μονοκλωνικά αντισώματα. (Σχήμα S1) Η σύγκριση μεταξύ των ασθενών CRC και υγιείς δότες (HD) αποκάλυψε ότι η έκφραση LAP σε CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα που απομονώθηκαν από PBMCs ήταν σημαντικά αυξημένη σε ασθενείς με καρκίνο (CRC: 18,8% ± 9,2% vs . HD:. 7,8% ± 3,3%? Εικ 1Α και Β). Επιπροσθέτως, η Εικ 1C δείχνει ότι το ποσοστό των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς όγκων σε σχέση με το μη καρκινικούς ιστούς των ασθενών CRC (12,4% ± 8,8% έναντι 5,5 % ± 3,8%, Ρ = 0,02). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αύξηση του πληθυσμού των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs στο CRC μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση.

(α) το ποσοστό του LAP

+ κυττάρων στον περιφραγμένο CD4

+ Foxp3

+ υποπληθυσμών του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) ασθενείς και υγιείς δότες. Σε σύγκριση με υγιείς δότες, CRC ασθενείς παρουσίασαν αυξημένη συχνότητα LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) και σε ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα (TILs). (ΣΙ). PBMCs από ασθενείς με CRC και υγιών δοτών απομονώθηκαν, και το ποσοστό των LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ Tregs υπολογίστηκε με ανάλυση FACS. Η διαφορά μεταξύ των δειγμάτων αναλύθηκε με το Student

t-test

(*** P & lt? 0.001). (ΝΤΟ). Λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν από όγκου και μη όγκου ιστούς των ασθενών CRC, και το ποσοστό του LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ Τ κυττάρων υπολογίστηκε με ανάλυση FACS. CRC-TILs, ογκο-διηθητικά λεμφοκύτταρα? CRC-Nils, μη-καρκινικά λεμφοκύτταρα ιστού-διείσδυση. Η διαφορά στο ποσοστό των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κύτταρα μεταξύ CRC-ΜΗΔΕΝ και CRC-TIL πληθυσμών αναλύθηκε με το

t

-test (* P & lt Φοιτητής? 0,05 , ** P & lt? 0,01 και *** P & lt?. 0.001)

Η

Ο φαινότυπος των CD4

+ Foxp3

+ Tregs ασθενών CRC αναλύθηκε με βάση την έκφραση της επιφάνειας σημειωτές κύτταρο μνήμης CD45RA και CCR7 (Εικ. 2Α). CD45RA και τα πρότυπα έκφρασης CCR7 έδειξαν ότι και οι δύο LAP

+ και LAP

– υποσύνολα Foxp3

+ CD4

+ Τ κύτταρα είχαν ως επί το πλείστον ένα τελεστή φαινότυπο /μνήμης στο περιφερικό αίμα, καθώς και σε θέσεις όγκου του CRC ασθενείς (Σχ. 2Β) [17]. Έτσι, LAP-θετικά Tregs σε CRC δεν διέφεραν από LAP-αρνητικά αντίστοιχά τους στην έκφραση του φαινοτύπου τελεστή /μνήμης.

PBMC και TIL εναιωρήματα αναλύθηκαν για την έκφραση φαινοτυπικών δεικτών CCR7 και CD45RA να αξιολογήσουν το στάδιο διαφοροποίησης των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κύτταρα. (Α) Dot blot αντιπροσωπεύει ο αφελής (Ν, CD45RA

+ CCR7

+), κεντρική μνήμη (CM, CD45RA

-CCR7

+), μνήμης τελεστές (ΕΜ, CD45RA

– CCR7

-), και τον τερματικό σταθμό τελεστή (ΤΕ, CD45RA

+ CCR7

-) CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs. (Β) στάδια διαφοροποίησης των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs στο περιφερικό αίμα, ιστούς όγκων, και μη-όγκου ιστούς των ασθενών CRC προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± SD ενός ατόμου του δείγματος.

Η

Η αυξημένη έκφραση ενεργοποιημένων Treg που σχετίζονται με δείκτες σε CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κύτταρα

Εξετάσαμε την έκφραση των Treg-μόρια που συνδέονται με την ενεργοποίηση /τελεστή, συμπεριλαμβανομένων των μελών της TNFR σούπερ οικογένεια, γρανζύμου Β, περφορίνης, Ki67, CTLA-4, και Tim-3, σε CD4

+ Foxp3

+ T κύτταρα. Σε σύγκριση με CD4

+ Foxp3

+ LAP

– Τ κύτταρα, CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κύτταρα έδειξαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση του TNFRII, γρανζύμου Β, περφορίνη, Ki67 , και Tim-3 και χαμηλότερη έκφραση του CTLA-4 (Εικ. 3Α). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το CRC, ένα αυξημένο ποσοστό LAP-θετικών CD4

+ Foxp3

+ Tregs έχει ένα ενεργοποιημένο φαινότυπο πολλαπλασιάζονται.

(Α) PBMCs των ασθενών CRC αναλύθηκαν για την έκφραση της σημειωτές Treg TNFR II, γρανζύμου Β, περφορίνη, Ki67, CTLA-4, και Tim-3 με FACS. Το ιστόγραμμα αντιπροσωπεύει την έκφραση των δεικτών Treg σε CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs και CD4

+ Foxp3

+ LAP

– Tregs? η διαφορά έκφραση μεταξύ των πληθυσμών των Τ κυττάρων αναλύθηκε με ζεύγη

t-test

(* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 και *** P & lt? 0.001). (Β) Τυπικό ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των CD62L-, CCR4- και CCR5-θετικών CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs και CD4

+ Foxp3

+ LAP

– Tregs? τα επίπεδα έκφρασης του CD62L, CCR4, και CCR5 συγκρίθηκαν μεταξύ των δύο πληθυσμών Τ κυττάρων. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με ζεύγη

t-test

(* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 και *** P & lt? 0.001).

Η

Αρκετές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων από ποντικού και ανθρώπου μελέτες υποδεικνύουν ότι η έκφραση ορισμένων υποδοχέων χημειοκινών, περιλαμβανομένων CCR4 και CCR5, είναι χαρακτηριστική για ένα ενεργοποιημένο υποομάδα CD4

+ Foxp3

+ Tregs. Η ανάλυση της έκφρασης του CCR4, CCR5, και L-σελεκτίνη (CD62L) έδειξε ότι CD62L ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κυττάρων σε σύγκριση με το LAP τους

– αρνητικό ομολόγους ( μέση ένταση φθορισμού (MFI), 594 ± 41.9 έναντι 684 ± 70,9, P = 0,006)? η έκφραση του CCR4 ήταν παρόμοια, ενώ εκείνο του CCR5 αυξήθηκε σε CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κυττάρων σε σύγκριση με CD4

+ Foxp3

+ LAP

– Τ κύτταρα ( ΟΟΡ4: 40,7% ± 5,9% έναντι 37,7% ± 6,2%, P = 0,2? CCR5: 13,2% ± 1,9% έναντι 6,2% ± 1,7%, P = 0,001). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs έχει ενεργοποιηθεί φαινότυπο.

CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs εμφανίζουν ισχυρή TGF -β-εξαρτώμενη ικανότητα καταστολής

ΤΟΡ-β είναι ένα ανοσοκατασταλτικό κυτοκίνη που είναι γνωστό ότι παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην παραγωγή και λειτουργική δράση των Tregs. Μεμβράνη ΤΟΡ-β διατηρείται σε λανθάνουσα μορφή δια συνδέσεως με LAP μη ομοιοπολική. Να εξετάσει τη σύνδεση της LAP-θετική Treg φαινότυπο με TGF-β, αναλύσαμε την παραγωγή TGF-β στο CRC Foxp3

+ LAP

+ Tregs διεγερμένα με ΡΜΑ /ιονομυκίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, ΤΟΡ-β επίπεδα ήταν υψηλότερα στην LAP-θετικά Treg υποσύνολο σε σχέση με το LAP-αρνητικά Treg υποσύνολο (7,50% ± 1,1% έναντι 2,8% ± 1,1%, Ρ = 0,001), υποδεικνύοντας ότι CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ κύτταρα ασκούν κανονιστική λειτουργία τους μέσω της οδού TGF-β.

(Α) Η έκφραση του TGF-β σε CD4

+ Foxp3

+ LAP

+, CD4

+ Foxp3

+ LAP

-, και CD4

+ Foxp3

+ Tregs αναλύθηκε με FACS. Τ κύτταρα διεγέρθηκαν in vitro όπως περιγράφεται στα Υλικά και μέθοδοι, και ΤΟΡ-β έκφραση συγκρίθηκε μεταξύ αυτών των τριών ομάδων από ζεύγη

t-test

(** Ρ & lt? 0,01). (Β) CD4

+ CD25

+ LAP

+ Τ κύτταρα και CD4

+ CD25

+ LAP

– Τ κύτταρα διαχωρίζονται με διαλογή κυττάρων χρησιμοποιώντας FACSAria και διεγείρονται με αντι- CD3 και αντι-CD28 αντισώματα για 96 ώρες. πολλαπλασιασμός των κυττάρων Τ εκτιμήθηκε με θυμιδίνης [

3Η] ενσωμάτωση και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων? τα δεδομένα αναλύθηκαν από ζεύγη

t-test

(* P & lt? 0,05). (C) αντίσωμα αντι-TGF-β (10 μg /ml) προστέθηκε στο CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs συν-καλλιεργήθηκαν με CD4

+ CD25

-LAP

+ Τ κύτταρα (αναλογία 1:01) και ενεργοποιούνται από αντι-CD3 και αντι-CD28 mAbs. Το ποσοστό καταστολής με την παρουσία ή απουσία του αντι-ΤΟΡ-β mAb εκφράζεται ως η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * P & lt? 0,05 από ζεύγη

t-test

Η

Στη συνέχεια, μελετήσαμε την έκφραση του LAP μεταξύ των CD4

+ CD25

-, CD4

+. CD25

lo, και CD4

+ CD25

hi υποπληθυσμών CD4

+ Tregs και διαπίστωσε ότι το CRC ασθενείς, LAP-θετικών CD4

+ Foxp3

+ Tregs είχαν παρατηρείται κυρίως μέσα η CD4

+ CD25

hi διαμέρισμα. Στη συνέχεια, CD4

+ CD25

+, CD4

+ CD25

-, CD4

+ CD25

+ LAP

+ και CD4

+ CD25

+ LAP

– πληθυσμοί Treg διαχωρίστηκαν με ταξινόμηση κυττάρων, και την ικανότητά τους να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των προσφάτως απομονωθέντων CD4

+ CD25

– Τ κύτταρα αξιολογήθηκε με την [H

3] δοκιμασία ενσωμάτωσης θυμιδίνης . Μεταξύ αυτών των υποπληθυσμών Treg, CD4

+ CD25

+ LAP

+ κύτταρα επέδειξαν την πιο ισχυρή ικανότητα καταστολής (Ρ & lt? 0,03? Εικ. 4Β), το οποίο ανεστάλη in vitro από τη χορήγηση αντι-ΤΟΡ β αντίσωμα (Σχ. 4C). Εμπλουτισμός στο περιφερικό αίμα CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κύτταρα συσχετίζεται με την εξέλιξη της CRC.

Η κλινική σημασία των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κυττάρων σε CRC εξετάστηκε σε 42 ασθενείς CRC (τα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά τους παρουσιάζονται στον πίνακα 1). Μόνο 9 ασθενείς είχαν υποτροπιάζοντα καρκίνο ή εξέλιξη της νόσου. Το ποσοστό των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κύτταρα στο CD4

+ Foxp3

+ πληθυσμού Τ κυττάρων δεν συσχετίζεται με εκείνη των CD4

+ Foxp3

+ Τ κυττάρων στο CD4

+ πληθυσμό κυττάρων Τ στο περιφερικό αίμα. Σε διηθούν όγκο λεμφοκυττάρων (ΤΙΤ) πληθυσμό, το ποσοστό των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κυττάρων συσχετίζεται με εκείνη των CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα (r

2 = 0.1, Ρ = 0.04). Η αναλογία των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κύτταρα αντιστρόφως ανάλογη με εκείνη των CD8

+ Τ κυττάρων στο περιφερικό αίμα (r

2 = 0.2, Ρ = 0,01)? σε ΤΙΤ, μια τάση αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ και CD8

+ Τ κυττάρων παρατηρήθηκε? Ωστόσο, δεν ήταν στατιστικά σημαντική (r

2 = 0,08, Ρ = 0,18). Εκτός αυτού, βρήκαμε καμία συσχέτιση μεταξύ κυκλοφορούντων CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κυττάρων και άλλων φλεγμονωδών κυττάρων όπως ουδετερόφιλα, λεμφοκύτταρα, και μονοκύτταρα (Εικ. 5Α). Η μελέτη περιέλαβε 26 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και 16 ασθενείς με καρκίνο του ορθού? Ωστόσο, το ποσοστό των κυκλοφορούντων ή διηθούν όγκο CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κύτταρα στο CD4

+ Foxp3

+ πληθυσμού Τ κυττάρων δεν διέφερε μεταξύ των δύο ομάδων της CRC ασθενείς (Σχήμα 5Β).

(Α) Συσχέτιση μεταξύ LAP

+ Foxp3

+ CD4

+ Τ κύτταρα και CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα, CD8

+ Τ κύτταρα, τα συνολικά λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα και ουδετερόφιλα (r

2 και οι τιμές Ρ) αξιολογήθηκε με την μέθοδο συσχέτισης Pearson. (Β) Το ποσοστό των LAP

+ Tregs στο PBMC και ΤΙΤ πληθυσμών συγκρίθηκε μεταξύ ασθενών CRC με ορθό και το κόλον όγκους? τα δεδομένα αναλύθηκαν από ζεύγη

t-test

(* P & lt? 0,05). ασθενείς (C) CRC ομαδοποιήθηκαν με βάση την παρουσία ή απουσία λεμφαδένων ή απομακρυσμένες μεταστάσεις. Το ποσοστό των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs στο PBMC και ΤΙΤ πληθυσμών συγκρίθηκε μεταξύ των ομάδων ασθενών με διαφορετικές CRC στάδια και τις υγιείς δότες. Η στατιστική ανάλυση έγινε με μονόδρομη ANOVA (** P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 και *** P & lt? 0.001).

Η

Τέλος, διερευνήθηκε η συσχέτιση της CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κυττάρων με το στάδιο του όγκου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, το ποσοστό των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Τ κυττάρων στο περιφερικό αίμα του μεταστατικού ασθενών ήταν σημαντικά υψηλότερο από ότι σε ασθενείς CRC χωρίς μετάσταση και σε υγιείς δότες. Επιπλέον, το μέγεθος των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Treg πληθυσμός αυξήθηκε σε ιστούς όγκου σε σύγκριση με μη καρκινικούς ιστούς (Σχήμα 5C). Έτσι, η αύξηση του LAP

+ Tregs στο περιφερικό αίμα ασθενών CRC μπορεί να αντικατοπτρίζει την αύξηση του LAP

+ Tregs σε ιστούς όγκων και θα μπορούσαν να συσχετιστούν με το στάδιο του καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι το μέγεθος του LAP- περιφερικού αίματος θετικών CD4

+ Foxp3

υποπληθυσμό + Τ κυττάρων μπορεί να χρησιμεύσει ως υποκατάστατο δείκτη για τη διαδικασία ανοσοκαταστολής σε CRC.

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ότι τα σήματα έκφρασης LAP ένας υποπληθυσμός των CD4

+ Foxp3

+ Tregs με ισχυρή ικανότητα καταστολής. Αν και οι περισσότεροι των CD4

+ Foxp3

+ Tregs σε ασθενείς CRC ταξινομούνται ως ενεργοποιούνται, μεταξύ των οποίων, LAP-θετική Tregs έχουν ακόμη πιο ισχυρή κατασταλτική λειτουργίες. Αυτό εκδηλώνεται με υψηλότερη έκφραση του ενεργοποιημένου δεικτών κυττάρου, αυξημένη παραγωγή ανοσοκατασταλτικών ΤΟΡ-β, και πιο ισχυρή ικανότητα καταστολής in vitro σε LAP-θετικά Tregs σύγκριση με LAP-αρνητικών Tregs. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι το LAP μπορεί να είναι ένας πιθανός δείκτης για τον εντοπισμό μια υποομάδα των Tregs που παρουσιάζουν TGF-β που σχετίζονται με κατασταλτικά λειτουργίες. Αυτός ο υποπληθυσμός Treg εμπλουτίστηκε στο περιφερικό αίμα ασθενών CRC, η οποία συσχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs μπορούν να έχουν κλινική εφαρμογή ως δείκτες όγκου-ειδικά Tregs σε CRC ασθενών.

Ο λειτουργικός ρόλος του LAP στην Tregs δεν είναι σαφής. LAP παραμένει μη ομοιοπολικά συνδέονται με ΤΟΡ-β μετά από διάσπαση από τον πρόδρομο πεπτίδιο και σχηματίζουν το ανενεργό λανθάνον σύμπλοκο ΤΟΡ-β? Ως εκ τούτου, συμβάλλει στην πρόληψη της ανεξέλεγκτης ενεργοποίηση των υποδοχέων του ΤΟΡ-β. Nakaruma et al. ήταν τα πρώτα που αποδεικνύουν ότι τόσο ποντικού και ανθρώπου CD4

+ CD25

+ Tregs θα μπορούσε να ασκήσει ΤΟΡ-β-εξαρτώμενη καταστολή των κυττάρων τελεστή, η οποία αντιστράφηκε από τον ανασυνδυασμένο LAP. Απέδειξαν επίσης ότι LAP-θετικά CD4

+ Τ κυττάρων θα μπορούσε να καταστείλει κολίτιδα in vivo, γεγονός που υποδηλώνει, για πρώτη φορά, ότι LAP θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ρυθμιστική δείκτης [24]. Qida et al. κατέδειξε περαιτέρω ότι η έκφραση LAP για ποντικού CD4

+ Τ κυττάρων που προκαλείται από τον TGF-β ανεξάρτητα από Foxp3 [25]. Shevach et al. παρατήρησε την έκφραση των συμπλοκών ΤΟΡ-β-LAP επί του ενεργοποιημένου Tregs αλλά όχι για το αναπαύεται Tregs επάγονται μέσω μη-αντιγόνου διέγερση [21], [31], [32]. LAP

+ Tregs κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων αλλά όχι των αθώων Τ κυττάρων σε ένα ΤΟΡ-β-εξαρτώμενο τρόπο και τη μεσολάβηση της ανοχής μόλυνση με μετατροπή Foxp3-αρνητικά Tregs σε λειτουργικά ενεργά Foxp3-θετικών Tregs [32]. Πιστεύεται ότι το σύμπλοκο LAP-ΤΟΡ-β αντιπροσωπεύει έναν σημαντικό μηχανισμό για Tregs να διατηρήσει το ανοσοποιητικό ομοιόστασης μέσω σηματοδότησης ΤΟΡ-β.

Chen et al. Οι επιπλέον λειτουργικά χαρακτηρίζεται CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs σε ένα μυϊκό αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα (ΕΑΕ) μοντέλο [30]. CD4

+ CD25

+ LAP

+ Treg πληθυσμού είχαν υψηλότερη συχνότητα της έκφρασης Foxp3 και παράγονται αυξημένα επίπεδα των μορίων τελεστή και κυτοκινών από LAP-αρνητικές τους ομολόγους τους. Tregs LAP-έκφραση ήταν ανενεργοί και κατασταλτική in vitro? Ωστόσο, κατασταλτική δράση τους ήταν περισσότερο ισχυρή σε σύγκριση με εκείνη των άλλων τύπων Treg. Αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν τόσο ΤΟΡ-β και των υποδοχέων του? η ικανότητα καταστολής της LAP

+ Tregs ανατράπηκε από τον TGF-β εξουδετέρωσης, που δείχνει ότι CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs ήταν, τουλάχιστον εν μέρει, ρυθμίζονται με TGF-β- εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, in vivo θετή μεταφορά των CD4

+ CD25

+ LAP

+ Tregs βελτιώνεται ΠΑΕ, επιβεβαιώνοντας την ανοσοκατασταλτική δραστικότητα αυτού του πληθυσμού Treg. Με βάση αυτά τα ευρήματα, LAP θα μπορούσε να θεωρηθεί ως δείκτης για την ταυτοποίηση μιας υποομάδας των CD4

+ CD25

+ Tregs με ισχυρή ικανότητα καταστολής [30]. Στους ανθρώπους, Shevach et al. έδειξε ότι η παρουσία των επιφανειακών ΤΟΡ-β σε σύμπλοκο με επαγόμενη Foxp3 και είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της κύτταρα ανταπόκρισης, υποδεικνύοντας μια πιθανότητα ότι και οι δύο Foxp3 και LAP θα μπορούσε να προσδώσει περισσότερο ισχυρή κατασταλτική δραστικότητα επί πληθυσμός ανθρώπινων κυττάρων Treg [31] LAP.

αν και ο ρόλος του LAP-θετικών Tregs δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί, τα διαθέσιμα στοιχεία δείχνουν ότι LAP μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για την αναγνώριση των ενεργοποιημένων Tregs σε ποντίκια και ανθρώπους. Στα ποντίκια, LAP μπορεί να εφαρμοστεί για την in vitro επιλογή του διογκωμένου CD4

+ Foxp3

+ κατασταλτικά Tregs [33], ενώ στον άνθρωπο, έχει προταθεί ως δείκτης για την παρακολούθηση Tregs μετά αντι-CTLA-4 ανοσοθεραπεία [34]. Η μελέτη μας ενισχύει περαιτέρω την ιδέα ότι LAP έκφραση μπορεί να διακρίνει ενεργοποιηθεί Tregs, ειδικά αυτά που κυκλοφορούν στο περιφερικό αίμα ασθενών CRC. Το πιο σημαντικό, την εξέλιξη του όγκου συσχετίζεται με την αυξημένη αναλογία των LAP

+ Tregs. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι κυκλοφορούν LAP-θετικά CD4

+ Foxp3

+ Tregs, παρά το γενικό πληθυσμό του CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια πιο ακριβή και ειδικό δείκτη για την παρακολούθηση της ανοσολογικής κατάστασης των ασθενών με καρκίνο.

Εν κατακλείδι, CD4

+ Tregs που εκφράζουν τόσο Foxp3 και LAP εμφανίζουν υψηλότερα ανοσοκατασταλτική δράση από ό, τι άλλα υποσύνολα κυττάρων Treg. Η κατασταλτική LAP

+ CD4

+ Foxp3

+ Tregs ρυθμίζουν το ανοσοποιητικό απαντήσεις, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της σηματοδότησης TGF-β. Ο εμπλουτισμός των CD4

+ Foxp3

+ LAP

+ Tregs στο περιφερικό αίμα των ασθενών CRC μπορεί να χρησιμοποιηθεί ενδεχομένως για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου παρακολούθηση σε κλινικό περιβάλλον.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Έκφραση της LAP. (ΈΝΑ). Το μονοκλωνικό αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου (IC) και ανασυνδυασμένο LAP (rLAP) επιβεβαιώθηκε η αξιοπιστία της χρώσης. (ΣΙ). Προσδιορισμός των CD4

+ Foxp3

+ Τ κύτταρα. Το μονοκλωνικό αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου (IC) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η LAP

+ χρώση κυττάρων Τ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0108554.s001

(ΔΕΘ)