Αφηρημένο

Λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου? Ωστόσο, οι μεταγενέστεροι γεγονότα σηματοδότησης που διέπουν αυτές τις διαδικασίες παραμένουν κακώς χαρακτηρίζεται. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να ερευνήσει τα μονοπάτια σηματοδότησης ενεργοποιούνται από LPA για τη ρύθμιση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Έχουμε χρησιμοποιήσει τρία μοντέλα κυτταρική σειρά της CRC, και αρχικά ανέλυσε το προφίλ έκφρασης των υποδοχέων LPA (LPAR). Στη συνέχεια, κατεργάζεται τα κύτταρα με Ι_ΡΑ και γεγονότα που σχετίζονται με ογκογόνο δυναμικό τους, όπως η μετανάστευση, εισβολή, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό καθώς και απόπτωση και κυτταρικό κύκλο αξιολογήθηκαν. Χρησιμοποιήσαμε την τεχνική συστοιχία τσιπ για να αναλύσει την παγκόσμια προφίλ γονιδιακής έκφρασης που εμφανίζεται μετά τη θεραπεία LPA, και προσδιορίσαμε κύτταρο μονοπατιών σηματοδότησης που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο. Η αναστολή αυτών των οδών επαλήθευσε τα συμπεράσματα της transcriptomic ανάλυση. Βρήκαμε ότι οι κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν LPAR1, -2 και -3 σε ένα διαφορικό τρόπο και ότι 10 μΜ LPA δεν επηρέασε τη μετανάστευση των κυττάρων, η εισβολή και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, αλλά επήγαγε πολλαπλασιασμό και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε HCT-116 κύτταρα . Αν και LPA σε αυτή τη συγκέντρωση δεν προκάλεσε μεταγραφική δραστικότητα του β-κατενίνης, προώθησε την ενεργοποίηση των Rho και STAT-3. Επιπλέον, οι αναστολείς ROCK και STAT-3 εμπόδισε Ι_ΡΑ-επαγόμενο πολλαπλασιασμό, αλλά η αναστολή ROCK δεν εμπόδισε STAT-3 ενεργοποίησης. Τέλος, παρατηρήθηκε ότι το ΙΡΑ ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και ότι οι συνδυασμένες αναστολή της ROCK και STAT-3 εμπόδισε την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και αύξησε την Ι_ΡΑ-επαγόμενη έκφραση των κυκλινών Ε1, Α2 και Β1 σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι είτε αναστολέα μόνο. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το ΙΡΑ αυξάνει το πολλαπλασιαστικό δυναμικό HCT-116 κύτταρα αδενοκαρκινώματος κόλου μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει τη συνεργασία μεταξύ των οδών Rho-ROCK και STAT3 που ενέχονται στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου

Παράθεση:. Leve F, Peres- Moreira RJ, Binato R, Abdelhay E, Morgado-Díaz JA (2015) LPA Προκαλεί καρκίνο παχέος εντέρου Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μέσω μιας συνεργασίας μεταξύ της ROCK και STAT-3 Pathways. PLoS ONE 10 (9): e0139094. doi: 10.1371 /journal.pone.0139094

Επιμέλεια: Shrikant Anant, Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 15 Ιούνη, 2015? Αποδεκτές: 9η Σεπτεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 29 του Σεπτεμβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Leve et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa κάνει Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) και Instituto Nacional de Επιστημών e Tecnologia em Καρκίνος INCT (573806 /2008-0 και 170.026 /2008) για να JAMD? και Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa κάνει Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) (26/11703/2013) για να JAMD

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) είναι ένα φυσικό βιοδραστικών λυσοφωσφολιπίδιο παρόν στους περισσότερους ιστούς και βιολογικά υγρά. LPA μπορεί να παραχθεί τόσο από λυσοφωσφολιπάση D (λυσο-PLD), όπως αυτοταξίνη (ΑΤΧ), ή μέσω φωσφολιπάση Α1 ή Α2 (Ρ1Α και PLA2, αντίστοιχα) [1]. ATX εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε κακόηθες μελάνωμα ως χημειοτακτικός παράγοντας απαραίτητος για το μελάνωμα διεισδυτικότητα [2], και ΑΤΧ /λυσο-PLD είναι παρεκκλίνοντα εκφράζονται σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους και σε φλεγμονώδη νόσο του εντέρου [1,3]. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα ΙΡΑ βρέθηκαν στο πλάσμα και ασκιτικό υγρό των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [4]? Ομοίως, τα υψηλά επίπεδα του λυσοφωσφατιδυλοχολίνης (LPC), ένας πρόδρομος LPA, βρέθηκαν στο πλάσμα του ορθοκολικού καρκίνου (CRC) των ασθενών [5]. Παρά το γεγονός ότι η αύξηση των επιπέδων LPA σε υγρά από ασθενείς με CRC δεν έχει ακόμη αποδειχθεί άμεσα, Lin

κ.ά.

. [6] έχουν δείξει ότι η από του στόματος χορήγηση του LPA στην APC

Min /+ ποντίκια, τα οποία είναι ένα μοντέλο που χρησιμοποιείται ευρέως στην CRC, σχεδόν διπλασίασε τον αριθμό των πολυπόδων στο έντερο. Μαζί, αυτές οι μελέτες υποστηρίζουν την άποψη ότι το ΙΡΑ διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην παθολογία CRC, η οποία είναι η τρίτη πιο συχνή μορφή καρκίνου στους άνδρες και η δεύτερη πιο συχνή στις γυναίκες παγκοσμίως [7].

Αφού συνδεθεί με συγκεκριμένες G -πρωτεΐνη-συζευγμένων υποδοχέων (GPCRs), LPA μεσολαβεί πολλές βιολογικές αποκρίσεις σε καρκίνο. Σε κύτταρα CRC, LPA αυξάνει πολλαπλασιασμό [8], η προστασία της απόπτωσης [9], η μετανάστευση [10] και την προσαρμογή στην υποξία [11]. Είναι κοινά αποδεκτό ότι η κυτταρική απόκριση σε LPA εξαρτάται από το πρότυπο έκφρασης του Ι_ΡΑ υποδοχέων (LPARs) επειδή ποικίλλει ευρέως μεταξύ των διαφόρων ιστούς και κυτταρικούς τύπους. Υπάρχουν επί του παρόντος έξι αναγνωρισμένες LPARs, LPA

1-6, που υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων CRC [12,13,14]. Μεταξύ αυτών των LPARs, οι κλασικές πολύ γνωστές LPARs, LPA

1-3, ανήκουν στην γονιδίου ενδοθηλιακού κυτταρική διαφοροποίηση (EDG) οικογένεια των GPCRs και έχουν περιγραφεί για τη ρύθμιση διαφορετικές συμπεριφορές σε κύτταρα CRC. Για παράδειγμα, με τη χρήση ειδικών παρεμβολή RNA, δείχθηκε ότι LPA

2 και LPA

3 αλλά δεν LPA

1 είναι στόχοι για την LPA-επαγόμενο πολλαπλασιασμό των HCT-116 και LS174T [8]. Επιπλέον, δείχθηκε ότι το ΙΡΑ

1 μεσολαβεί στην LPA διεγείρεται κύτταρο σκέδασης των κυττάρων DLD-1 χρησιμοποιώντας ένα shRNA-lentivirus σύστημα [15]. Επιπλέον, LPA

3 νοκ ντάουν αυξάνει τη μετανάστευση και την εισβολή των HCT-116 κύτταρα [16].

LPARs να προκαλέσει μια σειρά από μονοπάτια κατάντη σηματοδότησης. Είναι καθιερωμένο ότι LPA παράγει Rho-εξαρτώμενες αποκρίσεις κυτταροσκελετικές όπως σχηματισμός ινιδίων του στρες [17], τα οποία είναι δομές που σχετίζονται με την κυτταρική μετανάστευση. Πράγματι, δείξαμε ότι σε κύτταρα Caco-2, επαγόμενων από το ΙΡΑ μετανάστευση των κυττάρων εξαρτάται Rho-ROCK [10]. Επιπροσθέτως, σηματοδότηση Rho-ROCK αναφέρθηκε επίσης να παίξει ένα ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [18]. Αν και μερικές μελέτες έχουν ήδη δείξει ότι το ΙΡΑ διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου, όπως HCT-116 και SW480 [8,19], η συμμετοχή σηματοδότησης Rho-ROCK σε αυτή την περίπτωση δεν ήταν απευθύνεται.

Ο μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT-3) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που εμπλέκονται στις διαδικασίες ογκογένεση. Συστατική ενεργοποίηση STAT-3 σχετίζεται με διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και συνήθως υποδηλώνει κακή πρόγνωση [20]. Είχε προηγουμένως δείξει ότι ROCK διεγείρει STAT-3 ενεργοποίηση μέσω της Janus κινάση 1 (JAK 1)? STAT-3 και JAK 1 συνεργάζονται για να ελέγχουν ακτομυοσίνης συσταλτικότητα να μεσολαβήσει το στρογγυλεμένο αμοιβαδοειδή μετανάστευση σε κύτταρα μελανώματος [21]. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι το Ι_ΡΑ επάγει κυτταρική κινητικότητα μέσω STAT-3 φωσφορυλιώσεως σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [22]. Είναι ενδιαφέρον ότι, STAT-3 φωσφορυλιώσεως εμπλέκεται στην HCT-116 κυτταρική ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου [23]. Παρ ‘όλα αυτά, είναι άγνωστο αν LPA ενεργοποιεί STAT-3 σε κύτταρα CRC ή προκαλεί την ενεργοποίηση της συμμετοχής Rho-ROCK σε αυτό το σηματοδοτικό μονοπάτι.

Έτσι, ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αναλύσει το ρόλο που διαδραματίζει στην LPA διαφορετικές βιολογικές διαδικασίες της εξέλιξης CRC, όπως η μετανάστευση, εισβολή και πολλαπλασιασμό, και να καθορίσει τους μηχανισμούς που διέπουν αυτά τα γεγονότα. Εδώ, αποδείξαμε ότι το ΙΡΑ αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΟΤ-116 μέσω ενός καταρράκτη που ενσωματώνει RhoA-ROCK και STAT-3 σηματοδότηση για τον έλεγχο της έκφρασης κυκλίνης και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και αντιδραστήρια

L-α-λυσοφωσφατιδικού οξέος (cat ολεοϋλ νάτριο δεν L7260..), κουνελιού αντι-Ι_ΡΑ

1 (Ν-τερματικό?. cat Νο SAB4500689), κουνελιού αντι-Ι_ΡΑ

2 (αρ. κατ. HPA019616), κουνελιού αντι-Ι_ΡΑ

3 (αρ. κατ. HPA013421), αντι-κυκλίνη Β1 (αρ. κατ. SAB4503501), 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διϋδροχλωρίδιο (DAPI ?.. Cat ηο 32670) και συζευγμένη με ραφανιδική υπεροξειδάση κατσίκας αντι-κουνελιού και IgG αντι-ποντικού ελήφθησαν από τη Sigma-Aldrich (Saint Louis, ΜΟ, USA). Κουνέλι μονοκλωνικό αντι-STAT-3 (cat ηο 9139..), Ποντικού μονοκλωνικό αντι-φωσφο-STAT3 (ρΤγΓ 705?.. Cat Νο 9131), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-α τουμπουλίνης (Cat Νο 2144..), Μονοκλωνικά αντι-κουνελιού -GSK-3β (cat ηο 9315.), αντι-φωσφο-GSK-3β (pSer9?.. cat Νο 9336)., ποντικού μονοκλωνικό αντι-β-κατενίνης (αρ. κατ. 9582) και αντι-GAPDH (cat ηο . 2118) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). STA-21 ((S) -Ochromycinone deoxytetrangomycin?.. Cat Νο sc-200757), αντι-κυκλίνη Α2 (αρ. Κατ. Sc-596) και ποντικού αντι-κυκλίνη Ε1 (αρ. Κατ. Sc-247) αγοράστηκαν από Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Η Alexa 488-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (αρ. Κατ. A11008) ελήφθη από την Molecular Probes (Eugene, OR, USA). Υ-27632 ((R) – (+) – trans-Ν- (4-Πυριδυλ) -4- (1-αμινοαιθυλ) -κυκλοεξανοκαρβοξαμιδίου?. Cat Νο US1688000). Αγοράσθηκε από την Calbiochem EMD Millipore (Darmstadt, Γερμανία)

καλλιέργειας κυττάρων και θεραπείες LPA

το ανθρώπινο ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρικών σειρών Caco-2 (ΗΤΒ-37TM) και ΗΤ-29 (ΗΤΒ-38TM), η ανθρώπινη ορθοκολικού καρκινώματος κυτταρική γραμμή HCT-116 ( CCL-247TM) και ο καρκίνος των ωοθηκών κυτταρική γραμμή Ovcar-3 (ΗΤΒ-161) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA, USA). Τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) (Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), πενικιλλίνη G (60 mg /L) και στρεπτομυκίνη (100 mg /L) στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 /αέρα. Τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν εβδομαδιαία με 0,05% θρυψίνη /0,02% ΕϋΤΑ σε διάλυμα PBS. Τα κύτταρα αδενοκαρκινώματος ωοθηκών αναπτύχθηκαν σε μέσο Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) (Sigma-Aldrich), που συμπληρώθηκε με 20% FBS, πενικιλλίνη G (60 mg /L) και στρεπτομυκίνη (100 mg /L) στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 /αέρα. Caco-2 κύτταρα έχουν ένα διαφοροποιημένο φαινότυπο όταν σχηματίζουν συρρέουσα μονοστιβάδα, με χαμηλή διεισδυτική και μεταστατική πιθανότητα? τα κύτταρα ΗΤ-29 μετρίως διαφοροποιημένο, ενώ HCT-116 κύτταρα έχουν μια αδιαφοροποίητη φαινότυπο και υψηλή ογκογόνο δυναμικό. Έτσι, αυτά τα κύτταρα αντιπροσωπεύουν διαφορετικά στάδια εξέλιξης CRC. Οι κυτταρικές καλλιέργειες μεταφέρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες πριν από την επεξεργασία LPA 10 μΜ, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [10].

Εκλεκτικοί αναστολείς φαρμακολογικές προστέθηκαν στις κυτταρικές καλλιέργειες 1 ώρα πριν από την αγωγή και LPA ήταν παρόντες καθ ‘όλη τη θεραπεία, όπως υποδεικνύεται. Οι αναστολείς αραιώθηκαν σε DMSO και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C. Κάθε συμπυκνωμένο διάλυμα αραιώθηκε αμέσως πριν τη χρήση για να δώσουν τελικές συγκεντρώσεις 10 μΜ Υ-27632 (ROCK) και 10 μΜ STA-21 (STAT-3).

Western κηλίδας ανάλυση

επεξεργασμένα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (1% Triton Χ-100, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.2% SDS, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM Hepes, ρΗ 7.4) που περιέχει 20 mM NaF, 1 mM ορθοβαναδικό, και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma, ΜΟ, αραίωση 1: 100) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα ομογενοποιημένα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 10,000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για την επακόλουθη ανάλυση. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (30 έως 60 μg /λωρίδα), ποσοτικά με το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (BioRad, Hercules, CA, USA), παρασκευάστηκαν με βρασμό μετά την προσθήκη του ρυθμιστικού δείγματος μετουσίωσης? ήταν ηλεκτροφορητικά διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε 7,5, 10 ή 12% πηκτώματα και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας ένα ημι-ξηρό κύτταρο μεταφοράς (BioRad) στα 10 V για 60 λεπτά. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα με ΤΒδ-Τ (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7.6, 137 mM NaCl και 0.1% Tween-20) που περιείχε 5% χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά γάλα σε σκόνη ή με 1% BSA (Sigma)? επωάστηκαν όλη τη νύκτα με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-Ι_ΡΑ

1 (1: 500), αντι-Ι_ΡΑ

2 (1: 500), αντι-Ι_ΡΑ

3 (1: 500), αντι -α-τουμπουλίνης (1: 1000), αντι-GAPDH (1: 3000), αντι-β-κατενίνης (1: 1000), αντι-GSK3-β (1: 1000), αντι-φωσφο-GSK3-β (Ser9 ) (1: 1000), αντι-STAT-3 (1: 1000), αντι-φωσφο-STAT-3 (Tyr 705) (1: 1000), αντι-κυκλίνης Α2 (1: 2000), αντι-κυκλίνης Ε1 ( 1: 2000) και αντι-κυκλίνης Β1 (1: 2000). Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα με συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IgG (1: 5000). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν, και οι πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο κιτ χημειοφωταύγειας (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK). Οι εικόνες συγκρότημα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων προσδιορίστηκαν ποσοτικά με οπτική πυκνότητα χρησιμοποιώντας Labworks 4,6 λογισμικού (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

RhoA δοκιμασία ενεργοποίησης

προσδιορίστηκαν Οι δραστηριότητες της πρωτεΐνης Rho χρησιμοποιώντας ένα ειδικό G-LISA

TM

RhoA Ενεργοποίηση Δοκιμασία Biochem Kit

TM (Κυτταροσκελετός, CO, EUA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, Rhotekin RBD συνδέεται προς τις πλάκες χρησιμοποιήθηκαν για να καθιζάνουν GTP-δεσμευμένη Rho από το προϊόν λύσης κυττάρου. Η δραστική RhoA ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα εναντίον Rho και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντίδραση χημειοφωταύγειας. Το επίπεδο ενεργοποίησης μετρήθηκε με την απορρόφηση καθορίστηκε σε 490 nm σε φασματοφωτόμετρο μικροπλακών.

επούλωση πληγών δοκιμασία

μονοστοιβάδες κυττάρων σε παντελή στέρηση ορού για 24 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΙΡΑ και γδαρμένο χρησιμοποιώντας ένα στείρο ρύγχος πιπέτας. Για κάθε πιάτο, τρεις πληγές με το χέρι γίνει, και οι τρεις τακτικές θέσεις τραύματος επαληθεύτηκαν κάτω από το μικροσκόπιο Axio Παρατηρητής Ζ1 (Carl Zeiss, Inc., Jena, Germany) εξοπλισμένο με Axio Cam ΣΑΔ και ένας αναλυτής 8.2 Εικόνα Axio Vision Release? τα τραύματα στη συνέχεια επιλέγονται και επισημαίνονται. Μετά την πλύση με PBS, φρέσκο ​​μέσο που περιέχει τους αναστολείς προστέθηκε στα κύτταρα, τα οποία επωάστηκαν στους 37 ° C σε ελεύθερο ορού ϋΜΕΜ που περιείχε 10 μΜ LPA. Τα μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν στο τραυματισμένη περιοχή και φωτογραφήθηκαν και οι δύο αμέσως μετά τον τραυματισμό (0 h) και 24 ώρες μετά τον τραυματισμό. Η απόσταση μεταξύ των δύο άκρων του τραυματισμού ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας το Adobe Photoshop 6.0 από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές παρουσιάζονται ως ποσοστά και απεικονίζονται στο γράφημα.

δοκιμασία Invasion

Για να δοκιμαστεί εισβολή των καρκινικών κυττάρων, ένα transwell με ένα φίλτρο πολυανθρακικού 6,5 mm (8 μm μέγεθος πόρου, Cat. ηο. 3422? Costar, Cambridge, ΜΑ) επικαλύφθηκε με 20 μΙ Matrigel® (Cat ηο 356230?.. BD Biosciences, San Diego, CA) αραιωμένο σε ϋΜΕΜ (1:10) και επωάζονται στους 37 ° C για 30 λεπτά. Caco-2 (2,5 χ 10

4), ΗΤ-29 (2 χ 10

4), HCT-116 (2 χ 10

4) και Ovcar-3 (2 χ 10

4) κύτταρα, σε 200 μΐ μέσου άνευ ορού με Ι_ΡΑ, σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο του transwell. Το μέσο καλλιέργειας με 20% FBS προστέθηκε ως χημειοελκτικό στον κατώτερο θάλαμο. Μετά από 48 ώρες επώασης, η άνω επιφάνεια της μεμβράνης καθαρίζεται με ένα βαμβάκι. Τα εισέβαλαν κυττάρων στον κατώτερο μεμβράνη μονιμοποιήθηκαν σε αιθανόλη για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Ο αριθμός των μη επεξεργασμένων εισέβαλαν και επεξεργασμένα κύτταρα εκφράστηκε ως ο μέσος όρος των τεσσάρων τυχαίων πεδίων κάτω από το μικροσκόπιο. Οι τιμές παρουσιάζονται ως ποσοστά και απεικονίζονται στο γράφημα. Ovcar-3 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος της αποτελεσματικότητας LPA.

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη

Caco-2, ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων πλάκα ( προηγουμένως καλύφθηκε με 1 ml 0,6% αγαρόζης ημι-στερεό) σε πυκνότητα 250 κύτταρα /φρεάτιο σε ένα διάλυμα ϋΜΕΜ που περιέχει 10% SFB και 0,3% αγαρόζη για 30 λεπτά. ΫΜΕΜ με 10% FBS που είτε περιείχαν LPA ή δεν περιείχε ΙΡΑ (έλεγχος) προστέθηκε στο πάνω μέρος του ημι-στερεού διαλύματος και ανανεώθηκε κάθε 3 ημέρες. Μετά από 14 ημέρες, οι αποικίες σχηματίζονται απεικονίστηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Axio Παρατηρητής Ζ1 (Carl Zeiss, Inc.) μικροσκόπιο εξοπλισμένο με μια φωτογραφική μηχανή AxioCam MRC5.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων ανάλυση

HT-29 ( 1×10

3 κύτταρα /mL) και HCT-116 (2 χ 10

4 κυττάρων /κυττάρων mL) σπάρθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και, μετά την εξάντληση FBS, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένα από τα παρακάτω διαλύματα: 10 μΜ LPA μόνο, 10 μΜ STA-21, 10 μΜ Υ-27632, ή LPA σε συνδυασμό με αυτούς τους αναστολείς για τους υποδεικνυόμενους χρόνους πριν από την επώαση με ΜΤΤ (Sigma Chemical Co.). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C και φυγοκεντρήθηκαν στα 1500 g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και οι κρύσταλλοι διαλύθηκαν σε DMSO. Η απορρόφηση στα 538 nm μετρήθηκε με ένα Spectra Max 190 φασματοφωτόμετρο (Molecular Devices Sunnyvale, CA).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Η μέθοδος ιώδες κρύσταλλο χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Caco-2 (2×10

4 κύτταρα /mL), ΗΤ-29 (10

3 κύτταρα /mL) και HCT-116 (2×10

4 κύτταρα /mL) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και είχαν FBS-εξαντλημένο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται με ΙΡΑ και αναστολείς της STAT-3 και ROCK για 24, 48 και 72 ώρες και μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη για 10 λεπτά. Το διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους (0,05% κρυσταλλικό ιώδες και 20% μεθανόλη) προστέθηκε για 10 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με νερό και στη συνέχεια διαλυτοποιήθηκαν με μεθανόλη. Η απορρόφηση στα 595 nm μετρήθηκε με ένα Spectra Max 190 φασματοφωτόμετρο (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Οι τιμές παρουσιάζονται ως ποσοστά και απεικονίζονται στο γράφημα.

Η απόπτωση και επιβίωση ανάλυση

HT-29 και HCT-116 κύτταρα (10

5-10

6 κύτταρα /mL) καλλιεργήθηκαν σε πλάκες μικροτίτλου έξι φρεατίων και ήταν άνευ ορού για 24 ώρες. Μετά, αυτά υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24, 48 και 72 ώρες με 10 μΜ Ι_ΡΑ. Η απόπτωση ανιχνεύθηκε με ένα ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση ανιχνεύσεως /αννεξίνης V για την ανίχνευση πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων, αποπτωτικά κύτταρα αργά, και μη αποπτωτικά κύτταρα στους υποδεικνυόμενους χρόνους. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν σε 100 μL αννεξίνης V ρυθμιστικού (0.1 Μ Hepes /NaOH (ρΗ 7.4), 1.4 Μ NaCl, 25 mM ΟαΟ

2) που περιέχει αννεξίνη V-FITC και ΡΙ (δεσμευτική 1 μg /mL) για 15 λεπτά. Μια ανάλυση FACS διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur και το λογισμικό CellQuest (BDBiosciences, San Jose, CA, USA)? τα κύτταρα αρνητικά τόσο για αννεξίνη V και ΡΙ κρίθηκαν βιώσιμες (επιβίωσης).

κυτταρικού κύκλου ανάλυσης

HCT-116 κύτταρα (10

5-10

6 κυττάρων /mL ) καλλιεργήθηκαν σε πλάκες μικροτίτλου έξι φρεατίων FBS εξαντλημένο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 8, 12 και 16 ώρες με Ι_ΡΑ ή /και αναστολείς της STAT-3 ή ROCK. Μετά την περίοδο αυτή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και πλύθηκαν μία φορά με παγωμένο PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν στο σκοτάδι με 75 μΜ ιωδιούχου προπιδίου (Sigma) για 10 λεπτά σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 3.4 mM Tris-HCl (ρΗ 7.6), 10 mM NaCl, 0.2% Triton Χ-100 και 3500 U /L RNAse. Μια ανάλυση του περιεχομένου του DNA πραγματοποιήθηκε με τη συλλογή 10.000 εκδηλώσεις για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου και υπο-G1 χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Transduction Labs, Lexington, KY, EUA) και Mod Fit LT λογισμικού.

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα απλώθηκαν σε καλυπτρίδες που είχαν τοποθετηθεί σε πλάκες 24-καλά εκ των προτέρων. Μετά την εξάντληση και τη θεραπεία FBS, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS συμπληρωμένο με 100 mM ΟαΟ

2 και 100 mM MgCl

2 (PBS /CM) και σταθεροποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη για 20 λεπτά. Τα δείγματα διαπερατά με 0,5% ΤΧ-100 σε PBS για 10 λεπτά. Αργότερα, τα κύτταρα επωάστηκαν σε 50 mM ΝΗ CI

4 σε PBS για 10 λεπτά και αποκλείστηκαν σε 3% BSA για 1 ώρα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα, αντι-β-κατενίνης (1: 250) και αντι-STAT3 (1:50) για 1 ώρα, που ακολουθείται από μία επιπλέον ώρα επώασης με δευτερογενή Alexa 488-συζευγμένη αντι-κουνέλι ή αντι -mouse αντισώματα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 40,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (DAPI) (1: 1000) για 3 λεπτά. Οι καλυπτρίδες πλύθηκαν σε PBS και στερεώθηκαν με

N

προπυλ-gallate, και χρώση των κυττάρων ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα Axio Παρατηρητής Ζ1 μικροσκόπιο ανοσο-φθορισμού εξοπλισμένο με AxioCam HRc Rev. 3 κάμερα και ένα Axiovision Release 4.8. 1 image πρόγραμμα αναλυτή (Carl Zeiss Inc., Germany)

δοκιμασία λουσιφεράσης για δραστικότητα TCF

Δύο διαφορετικά γονίδια λουσιφεράσης TCF χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη δοκιμασία:. ένα άθικτο άγριου τύπου TCF-λουσιφεράσης κατασκεύασμα ανταποκριτή (SUPER 8 TOPFLASH) και ένα μεταλλαγμένο TCF-λουσιφεράσης κατασκεύασμα ανταποκριτή (SUPER 8 FOPFLASH), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. HCT-116 (2×10

4) κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν παροδικά με 2 μg του SUPER 8 TOPFLASH ή πλασμίδιο αναφοράς FOPFLASH, μαζί με 3 μΐ του αντιδραστηρίου Fugene * 6 Transfection (Roche). Ως μάρτυρας για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, 0,2 μg ενός κατασκευάσματος λουσιφεράσης Renila συμπεριλήφθηκε σε κάθε επιμόλυνση. Μετά από 24 h επιμόλυνσης, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, FBS εξαντλημένο επί 24 ώρες και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ Ι_ΡΑ. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 6 και 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και τα εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν με 200 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ανταποκριτή (Promega). Renila και δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας ένα Dual-Luciferase Assay Kit System Reporter (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης σε κάθε φρεάτιο κανονικοποιήθηκε στη δραστηριότητα renila. Τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε δοκιμάστηκαν εις τριπλούν, πραγματοποιήθηκαν σε χωριστές διόδους κύτταρο.

Έκφραση Chip δεδομένα array ανάλυση

Ολικό RNA από FBS-εξαντλημένο HCT-116 κύτταρα τα οποία είτε αγωγή ή όχι με LPA για 12h ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα RNeasy Mini Kit (QIAGEN, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εκατό νανογραμμάρια ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για να συνθέσει το βιοτινυλιωμένο cRNA σύμφωνα με την GeneChip δοκιμασία έννοια στόχος σήμανσης ολόκληρο μεταγραφής (WT) (

Affymetrix

,

ΗΠΑ

). Μετά, το βιοτινυλιωμένο cRNA υβριδίστηκε στον GeneChip ανθρώπινο γονίδιο 1,0 συστοιχία ST (

Affymetrix

,

ΗΠΑ

), πλύθηκαν και βάφτηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι συστοιχίες GeneChip σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή GeneChip® 3000. Η Affymetrix Έκφραση Console έκδοση λογισμικού 1.0 χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία συνοψίζονται τιμές έκφρασης (CHP-αρχεία), και εφαρμόστηκε η Στιβαρή πολλαπλών μικροπλακετών Ανάλυση (RMA) αλγόριθμο. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση Partek

® λογισμικό (https://www.partek.com) [24]? διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια με ≥ 2-φορές-την αλλαγή χρησιμοποιήθηκαν ως κριτήρια για τον ορισμό υπερέκφραση ή προς τα κάτω ρύθμιση. Οι διαδικασίες ανάλυσης της οδού και των σχετικών λήφθηκαν χρησιμοποιώντας MetaCore

λογισμικού TM (https://thomsonreuters.com/metacore) και την εφευρετικότητα

® λογισμικό ανάλυσης Pathway (https://www.ingenuity.com).

στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων διεξήχθη χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Οι στατιστικές αναλύσεις της μετανάστευσης, εισβολή, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, τη δραστηριότητα TCF και πρωτεΐνη οπτικής πυκνότητας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας t-tests του Student? Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA με μετα-τεστ Bonferroni? και μια δίπλευρη ANOVA με μετα-τεστ Bonferroni πραγματοποιήθηκε για την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Μια διαφορά θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική όταν * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Αποτελέσματα

Καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα εκφράζουν υποδοχείς ΙΡΑ σε ένα διαφορικό τρόπο, αλλά η θεραπεία LPA δεν μεταβάλλει τη μετανάστευση των κυττάρων, επιθετικότητα ή αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ανάπτυξη

Αρχικά, ερευνήσαμε τα επίπεδα έκφρασης των υποδοχέων Ι_ΡΑ σε τρεις κυτταρικές γραμμές καρκίνου του παχέος εντέρου, Caco-2, ΗΤ-29 και HCT-116, χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Το σχήμα 1 δείχνει ότι Caco-2, ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα εκφράζουν τους υποδοχείς Ι_ΡΑ

1, LPA

2 και LPA

3 σε απόκλιση τρόπους. Τα επεμβατική κύτταρα χαμηλού βαθμού Caco-2 παρουσιάζονται χαμηλότερα επίπεδα ΙΡΑ

1 και LPA

3 σε σχέση με τις άλλες κυτταρικές σειρές και τα υψηλότερα επίπεδα του LPA

2 σε σχέση με το ΗΤ-29. Το ενδιαμέσως επεμβατική ΗΤ-29 κύτταρα εξέφρασαν παρόμοια επίπεδα και των τριών υποδοχέων LPA? και τα υψηλά διεισδυτική HCT-116 κύτταρα παρουσιάζονται υψηλότερα επίπεδα των υποδοχέων Ι_ΡΑ

2 και LPA

3, σε σύγκριση με Caco-2 και ΗΤ-29 κύτταρα, αλλά χαμηλότερα επίπεδα ΙΡΑ

1 σε σχέση με ΗΤ-29. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι στην πραγματικότητα, οι τρεις κυτταρικές σειρές αποκρίνονται σε αυτό το βιολιπίδιο. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι το ΙΡΑ μεσολαβεί κυτταρική μετανάστευση σε ένα ευρύ φάσμα τύπων καρκινικών κυττάρων [25,26], και έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι το ΙΡΑ αυξάνει τη μετανάστευση των Caco-2 κυττάρων [10]. Έτσι, θελήσαμε να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της LPA σε γεγονότα που σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου σε καρκινικά κύτταρα κόλου με υψηλότερο δυναμικό εισβολής. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε την επούλωση πληγών, μία δοκιμασία κυτταρικής εισβολής και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη (AIG) σε Caco-2, ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα. Βρήκαμε ότι LPA δεν μετέβαλε την κυτταρική μετανάστευση σε ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα ή να αυξήσει την επιθετική πιθανότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του κόλου τρία? Επιπλέον, LPA δεν μετέβαλε την γένεσιν όγκων, όπως αξιολογήθηκε από την AIG (S1, S2 και S3 σχήματα, αντίστοιχα).

Εκπρόσωπος Western και πυκνομετρική αναλύσεις των Caco-2, ΗΤ-29 και HCT-116 κύτταρα χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα έναντι LPAR

1-3 (ac, αντίστοιχα). Caco-2 κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα ΙΡΑ

2, ΗΤ-29 κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα ΙΡΑ

1-3 και HCT-116 κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα ΙΡΑ

2-3. Οι μέσες βαθμολογίες ± SEM. για τρία ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται.

Η

LPA δεν επάγει τον κυτταρικό θάνατο, αλλά αυξάνει τον πολλαπλασιασμό με την προώθηση πρόοδο του κυτταρικού στη φάση S και στη συνέχεια το G2 /M φάσεις

Επειδή LPA αυξάνει κύτταρο πολλαπλασιασμός και η φοροδιαφυγή του θανάτου σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [8,9,27], αποφασίσαμε να αξιολογήσει κατά πόσον LPA ρυθμίζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων στη μελέτη μας. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μετά από 48 και 72 ώρες της αγωγής, LPA αύξησε τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων HCT-116, αλλά όχι τον αριθμό των βιώσιμων Caco-2 και ΗΤ-29 κύτταρα (Σχ 2Α). Λόγω αυξημένου αριθμού των βιώσιμων κυττάρων μπορεί να υποδεικνύει την επαγωγή πολλαπλασιασμού ή να μειωθεί ο κυτταρικός θάνατος μέσω απόπτωσης διαφυγή, προσδιορίσαμε αν LPA θα μπορούσε να επηρεάσει τον κυτταρικό θάνατο με επώαση HCT-116 κύτταρα στερούνται ορού με LPA για 24, 48 και 72 ώρες και στη συνέχεια χρώση η κυττάρων με Annexin V και ΡΙ (Σχήμα 2Β και 2C). LPA δεν μεταβάλλει τον αριθμό των νεκρών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι η αύξηση του αριθμού των κυττάρων που παρατηρείται στο Σχήμα 2Α συμβαίνει μέσω της αύξησης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και όχι η μείωση του θανάτου. Για να προσδιοριστεί αν η LPA επαγόμενη κυτταρική ανάπτυξη ΗΟΤ-116 ήταν αποτέλεσμα της αλλοίωσης του ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, τα προφίλ του κυτταρικού κύκλου παρακολουθήθηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του περιεχομένου DNA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η κατανομή στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι η θεραπεία με ΙΡΑ για 8, 12 και 16 ώρες προωθούνται εξέλιξη του κυτταρικού στη φάση S και στη συνέχεια το G2 /M φάσεις, κατά τις οποίες ο πληθυσμός αυξήθηκε σε σύγκριση με το κύτταρα στερούνται ορού.

καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα FBS νηστεία για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΙΡΑ (10 μΜ) για 24, 48 ή 72 ώρες. Ο σχετικός αριθμός των κυττάρων εκτιμήθηκε μέσω χρώσης crystal violet (α), και η απόπτωση ακολούθησε τη μέθοδο της διπλής χρώσης αννεξίνης-ν /ΡΙ (β). α) LPA αύξησε τον σχετικό αριθμό των HCT-116 κύτταρα, αλλά όχι Caco-2 ή ΗΤ-29 κυττάρων. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση

αμφίδρομη

ANOVA με

post-hoc

Bonferroni test. ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001. Μέση βαθμολογία ± SEM. για τρία ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται. β) ανάλυση FACS μέσω χρώσης /ΡΙ αννεξίνης V-FITC έδειξε ότι LPA δεν μειώνουν τον κυτταρικό θάνατο σε HCT-116 κύτταρα. Τέσσερις διαφορετικοί πληθυσμοί κυττάρων ανιχνεύθηκαν μετά τη χρώση αννεξίνης V /PI του HCT-116 κύτταρα. Τα ζωντανά κύτταρα ομαδοποιούνται στο κάτω αριστερό μέρος του πίνακα, τα πρώιμα αποπτωτικών κυττάρων ομαδοποιούνται στην κάτω δεξιά μέρος του πίνακα, τα αργά αποπτωτικά κύτταρα συγκεντρώνονται στο υψηλότερο δεξί μέρος του πίνακα και νεκρωτικά κύτταρα ομαδοποιούνται στο υψηλότερο αριστερό τμήμα του πίνακα. FL1-Η, αννεξίνης V? FL2-Η, PI. γ) Τα δεδομένα που λαμβάνονται από τη ροή είναι κυτταρομετρίας αναλύσεις απεικονίζονται σε ένα γράφημα. Δεν υπήρχε αυξημένο ποσοστό Ι_ΡΑ απόπτωση.

Η

Τα κύτταρα FBS νηστεία για 24 ώρες (cont, έλεγχος), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΙΡΑ στους χρόνους που υποδεικνύονται, χρωματίστηκαν με ΡΙ και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACS. α) Η αναλογία των κυττάρων στην G2 /M φάση αυξήθηκε σημαντικά μετά από 12 και 16 ώρες με θεραπεία LPA. M1: τα κύτταρα στην G1? M2: κύτταρα στη φάση S? Μ3: κύτταρα σε G2 /M. β) Το γράφημα δείχνει το ποσοστό των S και G2 κύτταρα /Μ σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Η αναλογία του DNA κατά την S φάση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας ModfitLT Λογισμικού. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση

μονόδρομη ANOVA

(*** ρ & lt? 0.001). PI, ιωδιούχο προπίδιο? FACS, ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογή κυττάρων.

Η

επαγόμενων από το ΙΡΑ κυτταρικό πολλαπλασιασμό των HCT-116 περιλαμβάνει Rho-ROCK σηματοδότησης

ενεργοποίηση

Με βάση προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι το ΙΡΑ ενεργοποιεί το μικρό ΟΤΡάσης Rho [14] και ότι Rho ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [28], αποφασίσαμε να ερευνήσει εάν το ΙΡΑ επάγει πολλαπλασιασμό των HCT-116 κυττάρων είναι Rho-ROCK εξαρτώμενη. Τα κυτταρικά στρώματα στερήθηκαν ορού για 1 ώρα, ακολουθούμενη από κατεργασία με 10 μΜ Ι_ΡΑ στους υποδεικνυόμενους χρόνους? Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία δραστικότητας Rho. S4 σχήμα δείχνει ότι το ΙΡΑ προκαλεί την ενεργοποίηση RhoA κατά κύριο λόγο στα 5 και 15 λεπτά θεραπείας. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώνει προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι το ΙΡΑ ενεργοποιεί RhoA ΘΤΡάσης.

Στη συνέχεια, θα εξεταστεί κατά πόσον LPA ενεργοποιεί ROCK κατάντη του Rho και αν αυτή η οδός σηματοδότησης είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Έτσι, πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία ιώδες κρύσταλλο και ανάλυση του κυτταρικού κύκλου μετά την αναστολή της ROCK με Υ-27632. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αναστολή ROCK απέτρεψε την αύξηση του σχετικού αριθμού των κυττάρων μετά την αγωγή με ΙΡΑ για 48 ώρες (Εικόνα 4Α). Επιπλέον, ο αναστολέας ROCK εμπόδισε επαγόμενων από το ΙΡΑ εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 4Β). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι το ΙΡΑ επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCT-116 μέσω της ενεργοποίησης Rho-ROCK.

Υποσυρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων FBS εξαντληθεί για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΙΡΑ στους χρόνους που υποδεικνύονται. α) χρώση κρυσταλλικού ιώδους των HCT-116 έδειξε ότι ο αναστολέας ROCK Υ-27632 (10 μΜ) απέτρεψε LPA διαμεσολαβούμενη αύξηση του σχετικού αριθμού των κυττάρων μετά από 48 ώρες θεραπείας. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση

αμφίδρομη

ANOVA με

post-hoc

Bonferroni test. *** P & lt? 0.001, έναντι του ελέγχου? ### P & lt? 0.001, έναντι LPA. Μέση βαθμολογία ± SEM. για τρία ανεξάρτητα πειράματα φαίνονται. β) Η ανάλυση FACS μέσω χρώσης ΡΙ έδειξε ότι η αναστολή ROCK με Υ-27632 απέτρεψε την επαγόμενη από το Ι_ΡΑ αύξηση στην αναλογία των κυττάρων στην /φάση S-G2 M. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση

μονόδρομη

ANOVA με

post-hoc

Bonferroni test. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. (*** P & lt? 0.001, έναντι του ελέγχου? P ## & lt? 0,01, έναντι LPA)

Η

LPA ενεργοποιεί STAT-3 να μεσολαβήσουν πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ένα Rho-ROCK ανεξάρτητο τρόπο

είναι γνωστό ότι τόσο η LPA και Rho μπορεί να προκαλέσει διαφορετικές οδούς σηματοδότησης για να ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Επιπλέον, έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι LPA διαταράσσει διασταυρώσεις adherens σε κύτταρα Caco-2 μέσω Rho-ROCK σηματοδότησης [10], καθώς και μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε από τον Yang

et al

.