Αφηρημένο

Matrix μεταλλοπρωτεϊνάση 7 (ΜΜΡ7), ένα metallohydrolase που εμπλέκονται στην ανάπτυξη διαφόρων μορφών καρκίνου, είναι μειωτικά στο

Αρο

μοντέλο ποντικού Min /+

καρκίνου του παχέος εντέρου μετά από θεραπεία σουλινδάκη. Για να καθοριστεί εάν η επίδραση αυτή είναι σχετική με την ανθρώπινη κατάσταση, ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου κόλου υποβλήθηκαν σε αγωγή με σουλινδάκ και των μεταβολιτών της, και συγκρίνονται με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από

in vivo μελέτες

ποντικού. Η έκφραση του

ΜΜΡ7

παρακολουθήθηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι θειώδες σουλινδάκ μειωτικά αποτελεσματικά τόσο

ΜΜΡ7

έκφραση και δραστικότητα. Επιπλέον, πρωτεομική βάσει δραστηριοτήτων έδειξε ότι θειώδες σουλινδάκ μειωθεί δραματικά τη δραστηριότητα του λευκοτριενίου Α4 υδρολάσης σε κύτταρα ΗΤ-29 όπως αντικατοπτρίζεται από μία μείωση του επιπέδου του προϊόντος, λευκοτριενίου Β4 του. Η μελέτη αυτή αποδεικνύει ότι η επίδραση της θεραπείας σουλινδάκης σε ένα μοντέλο ποντικού καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί να είναι σχετικές με το ανθρώπινο ομόλογό του και τονίζει την επίδραση της θεραπείας σουλινδάκης για metallohydrolases

Παράθεση:. Guillen-Ahlers Η Tan J, Castellino FJ, Ploplis VA (2011) Επίδραση της θειώδες σουλινδάκ για Metallohydrolases στην Ανθρώπινη Colon Cancer Cell γραμμή ΗΤ-29. PLoS ONE 6 (10): e25725. doi: 10.1371 /journal.pone.0025725

Επιμέλεια: Ματθαίος Bogyo, το Πανεπιστήμιο του Stanford, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Φλεβάρη 2011? Αποδεκτές: 9η Σεπτεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2011

Copyright: © 2011 Guillen-Ahlers et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (National Heart, Lung, και αίματος Ινστιτούτο) PO1HL07375 επιχορήγησης (έως FJC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ), όπως η σουλινδάκη, είναι χημειο-προληπτικός αντιδραστήρια προς παχέος εντέρου [1], [2], [3]. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με τις παρατηρήσεις

in vitro

σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [4], καθώς και

in vivo

στο

Αρο

Min /+ ποντικό

όπου παρατηρείται μεγάλη μείωση στον φορτίο όγκου μοντέλο, [5]. Οι γαστρεντερικές επιπλοκές που αναπτύσσονται σε χρήστες NSAID είναι καλά τεκμηριωμένα [6], και αποτελεί εμπόδιο στη χρήση αυτών των φαρμάκων ως παράγοντες χημειο-προληπτικός. Οι πλειοτροπικές επιδράσεις της σουλινδάκης για την πρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι ακόμα ασαφής και εμποδίζουν την ανάπτυξη των πιο συγκεκριμένες θεραπείες με μειωμένες παρενέργειες. Όσον αφορά το θέμα αυτό, έχει δειχθεί ότι η θεραπεία σουλινδάκη προκαλεί αλλαγές στο εξωκυττάριο εκδηλώσεις αναδιαμόρφωση μήτρας, συμπεριλαμβανομένης μειορρύθμιση της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 7 (

ΜΜΡ7

) στην εντερική αδενώματα του

Αρο

Min /+

ποντίκια [7].

ΜΜΡ7 ανήκει σε μια ομάδα από μέταλλο πρωτεασών ιόντων-εξαρτώμενη. Σύμφωνα με την βάση δεδομένων Merops (www.merops.sanger.uk), μεταλλοπρωτεάσες μήτρας (MMPs), που αποτελείται από 24 μέλη, περιλαμβάνουν την υποοικογένεια M10 της οικογένειας ΜΑ της metallohydrolases φυλή M. MMPs έχουν έντονα ενοχοποιηθεί στην ανάπτυξη πολλών καρκίνους. Η διαγραφή του

ΜΜΡ2

και

ΜΜΡ9

σε ποντίκια έχουν δείξει ότι μειώνει παγκρεατική ογκογένεση μέσω της μείωσης της αγγειογένεσης [8]. Σχετικές με τη μελέτη αυτή,

ΜΜΡ7

διαγραφή στο

Αρο

Min /+

ποντίκια έχει αποδειχθεί ότι μειώνει έντονα την εντερική φορτίο όγκου [9]. Οι παρατηρήσεις αυτές εμπλέκουν ΜΜΡ7 ως βιώσιμο στόχο για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών αγωγών.

Η τρέχουσα μελέτη προσδιορίζεται το αποτέλεσμα της αγωγής επί της σουλινδάκης ΜΜΡ7 στο ανθρώπινο κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου, ΗΤ-29, και να χρησιμοποιηθεί μια συνολική προσέγγιση για την ανίχνευση αλλαγμένων δραστηριοτήτων άλλων metallohydrolases. Τα αποτελέσματα αυτών των ερευνών που περιγράφονται εδώ.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

ΗΤ-29 κύτταρα (American Type Culture Collection, Manassas, VA) διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy μέσο 5Α (Gibco, Grand Island, ΝΥ) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C σε μια ατμόσφαιρα 95% αέρα /5% CO

2. Σουλινδάκ, σουλφίδιο, και σουλφονικό σουλινδάκ αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Αυτά τα φάρμακα αραιώθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). DMSO προστέθηκε στο μέσο σε μια τελική συγκέντρωση 1% και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων. Μόλις τα κύτταρα ήταν 80% συρρέοντα, αυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις σουλινδάκης και των μεταβολιτών της. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και απαριθμήθηκαν τα βιώσιμα κύτταρα χρησιμοποιώντας την μέθοδο κυανού τρυπάνης.

Η γονιδιακή έκφραση

κύτταρα ΗΤ-29, κατά τη στιγμή της συγκομιδής, θρυψινοποιήθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, και το σφαιρίδιο κυττάρων που χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση RNA ακολουθώντας το πρωτόκολλο Qiagen. Η συγκέντρωση και η ποιότητα των δειγμάτων εκτιμήθηκαν με τη χρήση της φασματικής προφίλ που λαμβάνεται από το NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). αλυσίδα ανάστροφη μεταγραφή-αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-PCR) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Εκκινητές και ανιχνευτές έχουν σχεδιαστεί για ανθρώπινη

ΜΜΡ7

,

MMP25

,

Trypsin1

, και

Οι RPL-19

παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

για μελέτες RT-PCR, ολικό RNA εκχυλίστηκε από κύτταρα ΗΤ-29, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή 100 μΜ θειώδες σουλινδάκ για 24 ώρες χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Qiagen. RT-PCR αντίδραση περιελάμβανε 2.5 χ Hotmaster Mix (5 Primer Inc., Gaithersburg, MD), RNase Αναστολέας, Multiscribe RT ένζυμο, παθητική χρωστική αναφοράς ROX, και SYBR Green. Ολικό RNA (25 ng) ήταν Revere-μεταγράφονται σε 30 μΐ μίγματος αντίδρασης στους 48 ° C για 30 λεπτά. Οι ακόλουθες συνθήκες χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση: προ-μετουσίωση για 5 λεπτά στους 95 ° C, 30 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 59 ° C για 20 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 25 δευτερόλεπτα. PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης 3% που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο. Ένα DNA σκάλα 50 bp (Promega, Madison, WI) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης μοριακού βάρους.

κηλίδωση Western

των πρωτεϊνών εκχυλίστηκαν από κύτταρα ΗΤ-29 και στη συνέχεια κατεργάζεται με θειώδες σουλινδάκ (100 μΜ) για 24 ώρες στους 80% συρροή. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, και στη συνέχεια πλύθηκαν σε PBS. Οι σβώλοι κυττάρων μετά ομογενοποιήθηκαν Dounce και υπερηχήθηκε. Η πρωτεώματος φυγοκεντρήθηκε στα 100.000 χ

g

για το διαχωρισμό των κλασμάτων κυτοσολικά και μεμβράνης. Το εκκρινόμενο κλάσμα λήφθηκε με φυγοκέντρηση του μέσου των κυττάρων σε 100.000 χ

g

. Η πρωτεώματος καταβυθίστηκε με την προσθήκη θειικού αμμωνίου. Δείγματα διήλθαν επί μιας στήλης αφαλάτωσης Ρϋ-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) και οι συγκεντρώσεις πρωτείνης προσδιορίστηκαν με χρήση του NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Τα δείγματα φορτίου επάνω σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10%, ηλεκτροφορήθηκαν, και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ανθρώπινο ΜΜΡ7 (Abcam, Cambridge ΜΑ), και πολυκλωνικά κουνελιού-αντιανθρώπινο ενεργός ΜΜΡ7 (Abcam) στο 1 μg /ml σε ρυθμιστικό δέσμευσης (PBS, 3% άπαχο ξηρό γάλα , 0,1% Tween 20). Για MMP25 και α-τουμπουλίνης, κουνέλι αντι-ανθρώπινο MMP25 (Abcam) και ποντικού αντι-ανθρώπινου α-τουμπουλίνης (Santa Cruz Technology), αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν. HRP-συζευγμένο αντίσωμα αντι-κουνελιού IgG ή συζευγμένο με HRP-αντι-ποντικού IgG (Cell Signaling Technology, Boston ΜΑ) στο ρυθμιστικό μπλοκαρίσματος χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια LumiGLO (Protein Research Products, Gaithersburg, ΜΑ) ή τη Δυτική Lightning ECL υποστρώματος (Perkin Elmer Inc., Waltham, ΜΑ).

πρωτεωμική βάσει δραστηριότητας για την ταυτοποίηση των ενεργοποιημένων metallohydrolases

των πρωτεϊνών ρυθμίστηκαν σε συγκέντρωση 1 mg /ml σε PBS. Ένα κοκτέιλ αλκυνίου ανιχνευτών με στόχο την ενεργή θέση της metallohydrolases ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο του Benjamin F Cravatt (The Institute Scripps Research, La Jolla, CA). Η επισήμανση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Εν συντομία, οι ανιχνευτές προστέθηκαν σε μια τελική συγκέντρωση 1 μΜ και επωάστηκαν κάτω από υπεριώδες φως για 1 ώρα. Ροδαμίνης αζίδιο στη συνέχεια δεσμεύεται με τους ανιχνευτές που χρησιμοποιούν χημεία κάντε κλικ στο [11]. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 10% πολυακρυλαμιδίου και σαρώνονται χρησιμοποιώντας είτε ένα Hitachi FMBIO Πε επίπεδο σαρωτή (MiraBio, Alameda, CA) ή το KODAK In-Vivo Πολυφασματικής Σύστημα FX (Carestream Υγείας, Rochester, NY).

Προσδιορισμός των δραστηριοτήτων που βασίζονται επισημασμένων πρωτεϊνών

σε πραγματικό μέγεθος σάρωσης gel εκτυπώσεις χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπο για την εξαγωγή των επιθυμητών ζωνών και σαρώνεται στη συνέχεια για να εξασφαλιστεί σωστή τεμαχισμό της γέλης. Κάθε βύσμα γέλη υπέστη αναγωγή με 10 mM διθειοθρεϊτόλης σε διττανθρακικό αμμώνιο και αλκυλιώθηκε με 55 mM ιωδοακεταμίδιο. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε πέψη με 0.1 μg θρυψίνη (Promega, Madison, WI) σε 100 μΐ 10 mM διττανθρακικού αμμωνίου και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Τρυπτικά πεπτίδια εκχυλίζονται από βύσματα γέλης με 50% ακετονιτρίλιο /49,9% Η

2O /0,1% τριφθοροξικό οξύ που ακολουθείται από 100% ακετονιτρίλιο και τελικά με 0.1% τριφθοροξικό οξύ.

τρυπτικών πεπτιδίων χρωματογραφήθηκαν επί 100 μm χ στήλη 10 cm C18 (μέγεθος σωματιδίων: 5 μm) και εκλούστηκε χρησιμοποιώντας μια γραμμική κλίση από 3 έως 45% ακετονιτρίλιο σε H

2O πάνω από 70 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, σε ένα ρυθμό ροής 500 nl /min. Το έκλουσμα ήταν ηλεκτρο-ψεκάζονται στο φασματόμετρο μάζας παγίδας γραμμική τετραπολικό ιόντων (LTQ) (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ). Sequest και Χ! Tandem αλγόριθμοι χρησιμοποιήθηκαν για να αναζητήσετε τη βάση δεδομένων που χρησιμοποιεί το δείκτη διεθνούς πρωτεΐνη (IPI) βάση δεδομένων του ποντικιού.

ενζυμική ανοσολογική λευκοτριενίων Β4

Στο 80% συρροή, ΗΤ-29 κύτταρα επωάστηκαν είτε με θειώδες σουλινδάκ ή DMSO για 24 ώρες. Ελήφθη το εκκρίνεται πρωτεώματος και συμπυκνώθηκαν με φυγοκέντρηση κενού. Των πρωτεϊνών ρυθμίστηκαν σε 5 mg /ml και LTB4 ποσοτικά με ένα κιτ ενζυματική ανοσοδοκιμασία (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ).

Αποτελέσματα

Η μειωμένη μεταβολίτης του σουλινδάκ, σουλφίδιο, αυξάνει επιλεκτικά κυτταρικό θάνατο των κυττάρων ΗΤ-29

ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με σουλινδάκ, σουλφίδιο, και σουλφονικό σουλινδάκ σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 10 έως 1000 μΜ (Εικόνα 1). Ξεκινώντας από 250 μΜ, θειώδες σουλινδάκ αυξήθηκε σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο, φθάνοντας το 100% κυτταρικό θάνατο στα 500 μΜ. Σε αντίθεση, σουλινδάκη και σουλφονικό σουλινδάκ απέτυχε να αυξήσει σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο, ακόμη και όταν τα φάρμακα όπου προστίθενται σε συγκεντρώσεις mM.

Σε 80% συρροή, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σουλινδάκη (γκρι), θειώδες σουλινδάκ ( λευκό), και σουλφονικό σουλινδάκ (μαύρο).

η

η σουλινδάκη σουλφίδιο μειώνει

ΜΜΡ7

στο mRNA, της πρωτεΐνης, και η δραστηριότητα επίπεδα

έχει αναφερθεί ότι δύο ημέρες της θεραπείας σουλινδάκης είναι επαρκής για να ρυθμίζουν προς τα κάτω ΜΜΡ7 σε όγκους του

Αρο

Min /+

ποντικούς [7]. Προκειμένου να καθοριστεί ποια μεταβολίτη μειωθεί αποτελεσματικά ΜΜΡ7, ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με sulindac και των μεταβολιτών της στα 100 μΜ, συγκέντρωση όχι τοξική στα κύτταρα όπως καταδεικνύεται στο σχήμα 1, για 24 ώρες. Το προφίλ έκφρασης του

ΜΜΡ7

συγκρίθηκε με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν προηγουμένως σε μελέτες ποντικού (Σχήμα 2Α). Μόνο ο ενεργός μεταβολίτης, θειώδες σουλινδάκ, ήταν ικανό να μειώσει σημαντικά την έκφραση του

ΜΜΡ7.

Μια καμπύλη τιτλοδότησης χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις θειώδες σουλινδάκ έδειξε ότι ακόμη και στα 50 μΜ,

ΜΜΡ7

παρουσίασε μικρή (14%), αλλά στατιστικά σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης (p = 0,044) (Σχήμα 2Β). Στα 100 μΜ, μείωση 65% παρατηρήθηκε (p = 0,000001). Η διαφορά μεταξύ 100 μΜ και 200 ​​μΜ ήταν λιγότερο δραματική (11%), αλλά ήταν ακόμα σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο αυτών συγκεντρώσεις (p = 0.017).

(Α) πραγματικού χρόνου RT-PCR του RNA από HT- 29 κυττάρων μετά από 24 ώρες θεραπείας με DMSO, σουλινδάκη (S), θειώδες σουλινδάκ (SD) και σουλφονικό σουλινδάκ (Sn). Τα αποτελέσματα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt με

hRPL-19

όπως το γονίδιο καθαριότητας. C

αξίες Τ μεταξύ 20.10 και 20.56 σε όλα τα δείγματα δείχνουν σταθερά επίπεδα του

hRPL-19

έκφρασης. (Β) Η έκφραση του

hMMP7

μετά από 24 ώρες θεραπείας σουλινδάκης. Η ρύθμιση προς τα κάτω του

hMMP7

ήταν σημαντική σε όλες τις συγκεντρώσεις. Τα αποτελέσματα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt με

hRPL-19

όπως το γονίδιο καθαριότητας. C

αξίες Τ μεταξύ 23.22 και 23.56 σε όλα τα δείγματα δείχνουν σταθερά επίπεδα του

hRPL-19

έκφρασης. (Γ) κυτοσολίου, μεμβράνη, και εκκρίνεται κλάσματα πρωτεώματος εξάγεται από DMSO-και θειώδες σουλινδάκ επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ-29 υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα το οποίο δεν κάνει διάκριση μεταξύ ενεργών και ανενεργών ΜΜΡ7 (επάνω) και ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει μόνο τη δραστική θέση (κάτω). Η αναμενόμενη ζώνη για ΜΜΡ7 εμφανίζεται στο 28 kDa, ωστόσο μια ζώνη στα 45 kDa συχνά αναφέρονται, πιθανώς ένα διμερές. Cyto υποδηλώνει κυτοσολικό κλάσμα? Mem, κλάσμα μεμβράνης, secr, που εκκρίνεται κλάσμα, και aMMP7, ενεργό ΜΜΡ7.

Η

κηλίδωση Western του ΜΜΡ7, καθώς η ενεργός θέση της ΜΜΡ7, διεξήχθη σε κυτοσολικά, μεμβράνης και εκκρίνεται κλάσματα ΗΤ-29 των πρωτεϊνών μετά από 24 ώρες θεραπείας σουλφίδιο σουλινδάκης στα 100 μΜ (Σχήμα 2C). Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, ΜΜΡ7 ανιχνεύθηκε μόνο στα εκκρίνονται κλάσματα του πρωτεώματος. Η σουλινδάκη θεραπεία σουλφίδιο έδειξε μία σαφή μείωση του ΜΜΡ7 στην εκκρινόμενη κλάσμα σε μια συγκέντρωση 100 μΜ. Η ανάλυση στυπώματος Western με στόχο την ενεργή θέση της ΜΜΡ7 αποκάλυψε μια πλήρη εξαφάνιση του ανιχνεύσιμου δραστικών ΜΜΡ7 μετά τη θεραπεία θειώδες σουλινδάκ.

Για να προσδιορισθεί αν άλλες MMPs, άλλες κατηγορίες πρωτεασών, και το γονίδιο καθαριότητας, RPL-19, επηρεάστηκαν από σουλινδάκη σε κύτταρα ΗΤ-29, RT-PCR (εκχυλίσματα ολικού κυττάρου) και στύπωμα Western (που εκκρίνεται, κυτοσολικά και κλάσματα) αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν. mRNA για MMP25, trypsin1, και RPL-19 δεν επηρεάστηκαν μετά από θεραπεία θειώδες σουλινδάκ (Σχήμα 3Α, Β). Ανάλυση κηλίδας Western του κλάσματος μεμβράνης των κυττάρων αυτών επιβεβαιωμένα αποτελέσματα RT-PCR για MMP25 (Σχήμα 3C).

(Α) PCR προϊόν του RT-PCR του RNA από ΗΤ-29 κυττάρων μετά από 24 ώρες θεραπείας με DMSO ή θειώδες σουλινδάκ. Διαδρομή 1, 50 bp DNA σκάλα? λωρίδα 2,

MMP25

μετά τη θεραπεία θειώδες σουλινδάκ? λωρίδα 3,

MMP25

μετά τη θεραπεία DMSO? λωρίδα 4,

Trypsin1

μετά τη θεραπεία θειώδες σουλινδάκ? λωρίδα 5,

Trypsin1

μετά τη θεραπεία DMSO? λωρίδα 6,

ΜΜΡ7

μετά τη θεραπεία θειώδες σουλινδάκ? λωρίδα 7,

ΜΜΡ7

μετά τη θεραπεία DMSO? λωρίδα 8

RPL-19

μετά τη θεραπεία θειώδες σουλινδάκ? λωρίδα 9,

RPL-19

μετά τη θεραπεία DMSO. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μόνο

ΜΜΡ7

έκφραση επηρεάζεται από σουλινδάκης επεξεργασία θειούχου. (Β) Ποσοτική RT-PCR του

MMP25

,

Trypsin1

, και

ΜΜΡ7

μετά DMSO ή θεραπεία θειώδες σουλινδάκ. Τα αποτελέσματα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt με

hRPL-19

όπως το γονίδιο καθαριότητας. Τα αποτελέσματα δείχνουν ποσοτικές διαφορές σε

ΜΜΡ7

έκφραση μετά την αγωγή θειώδες σουλινδάκ σχέση με τη θεραπεία DMSO. (Γ) Western στύπωμα της εκκρίνονται κλάσμα κυττάρων ΗΤ-29 αποδεικνύει ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης του MMP25 στο κλάσμα μεμβράνης είναι παρόμοια μεταξύ θειώδες σουλινδάκ και DMSO επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

βάσει δραστηριότητας πρωτεΐνη στόχευσης προφίλ metallohydrolases αποκαλύπτει μια μείωση στη δραστηριότητα LTA4H

των πρωτεϊνών που προέρχονται από το ΗΤ-29 κυττάρων μετά από 24 ώρες θεραπείας με θειώδες σουλινδάκ ή DMSO σημάνθηκαν με ένα κοκτέιλ ανιχνευτή με στόχο την υπεροικογένεια metallohydrolase και τρέχουν σε 1D γέλη. Μία ισχυρή ζώνη μεταξύ 60 και 65 kDa παρατηρήθηκε σε ΗΤ-29 κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO. Η σουλινδάκη κύτταρα σουλφίδιο αγωγή έδειξαν μία αμυδρή ζώνη παρόμοιου μοριακού βάρους. Οι ζώνες αποκόπηκαν και αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας. Τα δείγματα αναλύθηκαν με γραμμική τετράπολου MS /MS (Σχήμα 4) και τα αποτελέσματα ταιριάζουν με τη βάση δεδομένων Merops για metallohydrolases. Υπήρχαν δύο πεπτίδια (LTYTAEVSVPK και LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK) ανιχνεύθηκε στη ζώνη ~ 70 kDa που ταιριάζουν υδρολάσης λευκοτριενίων Α4 (Ι_ΤΑ4Η). Το προβλεπόμενο μοριακό βάρος του Ι.ΤΑ4Η είναι 69 kDa. LTA4H έχει προηγουμένως δειχθεί ότι είναι ένας στόχος για αυτό το κοκτέιλ ανιχνευτή μεταλλοπρωτεάση (10).

Metallohydrolase βάσει δραστηριοτήτων σήμανση των κυττάρων ΗΤ-29 που εκκρίνεται των πρωτεϊνών. πρότυπα ΜΜΡ2 και ΜΜΡ7 προστέθηκαν σε κύτταρο των πρωτεϊνών (βέλη). Η μπάντα που εμφανίζουν μια ισχυρή μείωση (*) μετά από θεραπεία θειώδες σουλινδάκ εκχυλίστηκε και αναλύθηκε με φασματομετρία μάζας. MS /MS φάσματα του LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK και LTYTAEVSVPK πεπτιδίων αντιστοιχούσε σε αμινοξέα 366-386 και 155-165, αντίστοιχα, της πρωτεΐνης LTA4H. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη σε όλα τα δείγματα ρυθμίστηκε στο 1 mg /ml και το ισοδύναμο των 15 μg του πρωτεώματος προστέθηκαν ανά λωρίδα. MW υποδηλώνει μοριακό βάρος? ΣΜΝ, πρότυπα, SD, θειώδες σουλινδάκ επεξεργασμένο και D, DMSO-θεραπεία.

Η

Για να επικυρώσετε τη μείωση της δραστηριότητας LTA4H, μια ενζυματική ανοσοδοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των λευκοτριενίων Β4 (LTB4) επίπεδα μετά θεραπεία σουλινδάκη (Σχήμα 5). Η σουλινδάκη κύτταρα σουλφίδιο επεξεργασμένα έδειξαν μειωμένη έντονα επίπεδα LTB4 σε σύγκριση με κύτταρα που DMSO-αγωγή.

Οι εκκρινόμενες των πρωτεϊνών του DMSO επεξεργασμένου και σουλινδάκη κύτταρα σουλφίδιο αγωγή αναλύθηκαν για επίπεδα LTB4 χρησιμοποιώντας μια ενζυματική ανοσοδοκιμασία.

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι θειώδες σουλινδάκ είναι ικανό να μειώσει τα επίπεδα του RNA και των πρωτεϊνών του ΜΜΡ7, το οποίο είναι σύμφωνο με αυτό που παρατηρήθηκε σε μελέτες του ποντικιού [7]. Μέσω βάσει δραστηριοτήτων πρωτεΐνη profiling, καταδείχθηκε ότι θειώδες σουλινδάκ μειώνει δραματικά τη δραστηριότητα της LTA4H. Το αποτέλεσμα αυτό επικυρώθηκε από μειωμένα επίπεδα LTB4.

Η συμμετοχή των μεταλλοπρωτεασών στον καρκίνο του παχέος εντέρου έχει ήδη εντοπιστεί, αλλά η ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν αυτά τα ένζυμα ηττήθηκε [12]. Ένα πρόβλημα είναι η χαμηλή εξειδίκευση των αναστολέων μεταλλοπρωτεάσης που έχουν κάνει σε κλινικές δοκιμές. ΜΜΡ7, ωστόσο, έχει σταθερά βρεθεί ότι είναι συναφείς σε καρκίνο του παχέος εντέρου και ζωικά μοντέλα του [9], [13]. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι θειώδες σουλινδάκ είναι σε θέση να μειώσει την έκφραση του

ΜΜΡ7

στο κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου του ανθρώπου ΗΤ-29 που επίσης παρατηρήθηκε,

in vivo

, σε

Apc

Min /+

ποντίκια [7]. Προκειμένου να προσδιοριστεί εάν άλλες MMPs ή άλλες τάξεις πρωτεασών επίσης τροποποιήθηκαν, MMP25, ένα ΜΜΡ συνδεδεμένη με μεμβράνη που έχει υψηλή έκφραση σε καρκινικά κύτταρα [14], και trypsin1 αναλύθηκαν και εδείχθη ότι είναι ανεπηρέαστη από κατεργασία θειώδες σουλινδάκ. Επιπλέον, το γονίδιο καθαριότητας RPL-19 επίσης δεν θίγονται από την παρούσα ΜΣΑΦ. Nobiletin, ένας άλλος παράγων με αντικαρκινικές ιδιότητες, έχει επίσης δειχθεί ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω

ΜΜΡ7

[15] σε κύτταρα ΗΤ-29. Αρκετοί μηχανισμοί έχουν προταθεί, με τα οποία ΜΜΡ7 προάγει την ανάπτυξη του όγκου. Αρκετές από αυτές τις μελέτες συνδέουν ΜΜΡ7 με διαταράσσεται από Fas αποπτωτική απόκριση [16], [17], [18], και της φλεγμονής που σχετίζονται με τη διευκόλυνση της ανάπτυξης του όγκου έχει προταθεί ότι προκαλείται με διάσπαση ΜΜΡ7 του συνδέτη Fas [19]. μεταλλοπεπτιδασών

Ο ψευδάργυρος αποτελείται από 12 μέλη και ανήκουν στην οικογένεια των metallohydrolases. Αυτές οι πρωτεάσες έχουν εμπλακεί σε αρκετές καρκίνους συμπεριλαμβανομένων αμινοπεπτιδάση Ν στον καρκίνο του παχέος εντέρου [20], cystinyl αμινοπεπτιδάση σε καρκίνο του νεφρού [21], και LTA4H στον πνεύμονα και του παχέος εντέρου αδενοκαρκινώματα [22]. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που συνδέει σουλινδάκη τη ρύθμιση Ι_ΤΑ4Η. Η ρύθμιση προς τα κάτω της δραστηριότητας του Ι_ΤΑ4Η, και μείωση του φορτίου του όγκου, μετά την αγωγή σουλινδάκη υποστηρίζει μελέτες στις οποίες έχει δειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, [6] -gingerol, ένα φυσικό συστατικό με αντιογκογένεσης ιδιότητες, έχει βρεθεί ότι καταστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου με αναστολή LTA4H [23]. Η μείωση της δραστηριότητας LTA4H επικυρώθηκε από την παρατήρηση ότι χαμηλότερα επίπεδα LTB4 βρέθηκαν μετά τη θεραπεία σουλινδάκη. LTB4 είναι ένας πολύ γνωστός εικοσανοειδών με χημειοτακτικές ιδιότητες και έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει τον πολλαπλασιασμό,

in vitro

, ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου [24].

Δεν υπήρξε καμία άλλη έκθεση της εμπλοκής της σουλινδάκη, ή οποιοδήποτε άλλο NSAID, σε ΜΜΡ7 ή LTA4H έκφρασης. Ωστόσο, σε προκαταρκτικές μελέτες, έχουμε δείξει ότι η σουλινδάκη δεν είναι το μόνο NSAID ικανή προς τα κάτω ρύθμιση

ΜΜΡ7

, δηλαδή, ασπιρίνη (τα δεδομένα δεν φαίνονται), γεγονός που υποδηλώνει ότι

ΜΜΡ7

ρυθμίζεται προς τα κάτω από ένα κοινόχρηστο μηχανισμό ΜΣΑΦ [7], [25] και όχι ένα μοναδικό ακίνητο της σουλινδάκης.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη εντοπίστηκαν δύο υποψήφιοι, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι είναι ιδιαίτερα χρήσιμο στην ανάπτυξη των όγκων, που έχουν αλλοιωθεί μετά τη θεραπεία σουλινδάκ . Νέα μορφές θεραπείας που στοχεύουν επιλεκτικά ΜΜΡ7 και Ι_ΤΑ4Η, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, προσφέρουν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις που εκμεταλλεύονται τα οφέλη της θεραπείας σουλινδάκης, αλλά ενδεχομένως χωρίς τις αρνητικές παρενέργειες αυτού του φαρμάκου.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Benjamin Cravatt (Scripps Research Institute, La Jolla CA) για αλκυνίου ανιχνευτές με στόχο την ενεργή θέση της metallohydrolases και Sherry Niessen και Eranthie Weerapana (Scripps Research Institute, La Jolla CA) για την τεχνική βοήθεια με τα πειράματα πρωτεομική.