Abstract

Επιθηλιακά μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (EpCAM), καρκινικό βλαστοκυττάρων (CSC) δείκτης πάνω εκφράζεται σε επιθηλιακά καρκίνους και βλάστωμα του αμφιβληστροειδούς (RB ). Έχουμε κατασκευαστεί ένα EpCAM στόχευση απταμερούς-siRNA χίμαιρα και διερευνήθηκαν ιδιοκτησία αντι-όγκου και EpCAM ενδοκυττάρια περιοχή (EpICD) σηματοδότηση μέσω του σε επιθηλιακό καρκίνο. Η αποτελεσματικότητα κατά των όγκων του EpCAM απταμερούς-siEpCAM χίμαιρα (EpApt-SIEP) αξιολογήθηκε με qPCR, βόρεια και δυτική αποτύπωση σε κυτταρική σειρά weri-Rb1- RB, πρωτογενή κύτταρα RB όγκου και MCF7- κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού. αντι-όγκου των EpApt-SIEP μελετήθηκε

in vivo

χρησιμοποιώντας επιθηλιακού καρκίνου (MCF7) μοντέλο ποντικών ξενομοσχεύματος. Ο μηχανισμός και τα μονοπάτια που εμπλέκονται στην αντικαρκινική δραστικότητα μελετήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας δέσμες πρωτεΐνης και qPCR. EpApt-SIEP χίμαιρα υποβλήθηκε σε επεξεργασία

in vitro

από το ένζυμο Dicer. Η επεξεργασία των κυττάρων weri-Rb1 και MCF7 με EpApt-SIEP αποκάλυψε στατιστικά σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης EpCAM (Ρ & lt? 0.005) και συνακόλουθη μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Στην πρωτογενή κύτταρα RB καλλιεργούνται από RB όγκους, EpApt-SIEP σιγήσει EpCAM, ανέστειλε σημαντικά (P & lt? 0,01) πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προκαλείται από κυτταροτοξικότητα. Νοκ ντάουν της EpICD εκφράζονται σε RB πρωτογενείς όγκους οδήγησε στην καταστολή των δεικτών πλειοδυναμίας, SOX2, Oct4, Nanog, και CD133.

In vivo

μελέτες έδειξαν πλήρη υποχώρηση της ανάπτυξης του όγκου χωρίς τοξικότητα σε ζώα (P & lt? 0.001) και καρκινικών ιστών έδειξαν σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω (P & lt? 0,05) του EpCAM, MRP1, ABCG2, stathmin, survivin και προς τα πάνω ρύθμιση των ΑΤΜ ( P & lt? 0.05) οδηγεί σε απόπτωση από ενδογενή οδό με μικρές μεταβολές στις κυτοκίνες. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι EpApt-SIEP δυνητικά να εξαλειφθεί EpCAM θετικά καρκινικά κύτταρα μέσω της καταστολής δείκτη CSC και την απόπτωση, ενώ διαφυλάσσει την κανονική EpCAM αρνητικά γειτονικά κύτταρα

Παράθεση:. Subramanian Ν, Kanwar JR, Kanwar RK, Sreemanthula J, J Biswas , Khetan V, et al. (2015) Στόχοι EpCAM Απταμερές-siRNA Χίμαιρα και Παλινδρομώντας επιθηλιακού καρκίνου. PLoS ONE 10 (7): e0132407. doi: 10.1371 /journal.pone.0132407

Επιμέλεια: Vittorio de Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Ιταλία

Ελήφθη: 8 Οκτωβρίου, 2014? Αποδεκτές: 14 Ιουν 2015? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Subramanian et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι διαθέσιμα στο χαρτί. Επιπλέον, οι πρώτες εικόνες που χρησιμοποιούνται για τη συναρμολόγηση στοιχεία κατατεθεί στο Figshare. (Link: figshare.com/s/cb264ee0178b11e5be5906ec4b8d1f61)

Χρηματοδότηση: Το έργο υποστηρίχθηκε από BARC-2010/35/19 /BRNS και εν μέρει από Τμήμα Biotechnology- Ινδο-Αυστραλιανή υποστήριξη δανειοληπτικής BT /Ινδο-Aus /06/08/2011 και COE-Grant BT /01 /CE1B /11 /V /16-πρόγραμμα για RB

Ανταγωνιστικά συμφέροντα.: οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

μόριο επιθηλιακά κυττάρων (EpCAM) είναι ένα πολύ γνωστό στέλεχος καρκινικών κυττάρων (CSC) δείκτης εκφράζεται στην επιφάνεια των κυττάρων και θεωρείται ως ένα όγκο συναφούς αντιγόνου [1]. EpCAM υπερεκφράζεται σε επιθηλιακούς όγκους όπως ο καρκίνος του μαστού και ο καρκίνος του οφθαλμού της παιδικής ηλικίας όπως ρετινοβλάστωμα (RB) [2-4]. ΕρΟΑΜ σχετίζεται με αυξημένο πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή τόσο καρκίνου του μαστού και RB [5, 6] .EpCAM πρωτεΐνη διαφοροποιείται στα εξωκυτταρική περιοχή (EpEx), διαμεμβρανική περιοχή (EpTM) και ενδοκυτταρική περιοχή (EpICD). Παίζει ζωτικό ρόλο στην ογκογόνο σηματοδότηση από EpCAM πρωτεόλυση και EpICD μετατόπιση στον πυρήνα [7, 8] .Proteolysis της EpCAM οδηγεί EpICD να σχηματίσουν πολύπλοκα withFHL2, β-κατενίνης και Ι.ΕΡ1. Αυτό το σύμπλοκο δεσμεύεται σε θέση πρόσδεσης theLef1 των γονιδίων-στόχων και διαμορφώνει τη μεταγραφή τους [7] .EpICD είναι γνωστό ότι καταλαμβάνουν την περιοχή προαγωγού και ρυθμίζουν θετικά SOX2, Oct4 και Nanog η οποία συμβάλλει στην αυτο-ανανέωση και πλειοδυναμία των καρκινικών κυττάρων [9].

EpCAM θεωρείται ως ένα ιδανικό θεραπευτικό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου λόγω της διαφοράς στη χωρική κατανομή του μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. ΕρΟΑΜ υπερεκφράζεται στην κορυφαία επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων [10] και ελάχιστα στην βασεοπλευρική επιφάνεια των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων και μεταλλάξεις δεν έχουν περιγραφεί σε ΕρΟΑΜ βαθμό σε καρκινικά κύτταρα [11]. Αρκετές αντισώματα αντι-ΕρΟΑΜ όπως edrecolomab και adecatumumab δημιουργήθηκαν για τη στόχευση του καρκίνου και μελετηθεί σε κλινικές μελέτες [12]. Για την περαιτέρω βελτίωση του θεραπευτικού δυναμικού στόχευσης EpCAM, αναζητήθηκαν απταμερή με μεγαλύτερη ειδικότητα και υψηλότερη συγγένεια [13].

Τα απταμερή είναι συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο (RNA /ssDNA) ή πεπτιδικά μόρια που προσδένονται σε ένα συγκεκριμένο στόχο με υψηλή συγγένεια λόγω τρισδιάστατες δομές τους [14]. Αυτά συντίθενται από την τεράστια μοριακές βιβλιοθήκες με μια διαδικασία επιλογής που ονομάζεται «Συστημική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού» (SELEX) [15, 16]. Αμφότερα τα RNA και ssDNA απταμερή αναπτύχθηκαν έναντι κυτταρικής επιφάνειας EpCAM [13, 17]. Από EpCAM RNA απταμερές δείχθηκε να πάρει εσωτερικεύεται με ενδοκυττάρωση, θα ήταν ικανά να μεταφέρουν siRNA στο κύτταρο κατά χιμαιρισμού. Αρκετές απταμερούς-siRNA στρατηγικές χιμαιρισμού μελετήθηκαν για στόχευση καρκινικών κυττάρων. RNA απταμερή εναντίον επιφανειακών δεικτών όπως PSMA, EGFR, BAFF-R, ιντεγκρίνες και DNA απταμερούς κατά νουκλεολίνης αναφέρθηκαν για την παράδοση siRNA σε διάφορα μοντέλα καρκίνου (συνοψίζονται στον Πίνακα S1).

Η λειτουργικότητα του απταμερούς-siRNA χιμαιρικό κατασκευάσματα θα μπορούσε να εξηγηθεί σε τρία στάδια όπως (i) σύνδεση και εσωτερίκευση, (ii) την επεξεργασία Dicer και (iii) RNAi μεσολάβηση σίγηση [18]. Προηγουμένως, έχουμε δείξει την ειδική στόχευση των RB χρησιμοποιώντας απταμερούς-δοξορουβικίνη (EpDT3-ϋΟΧ) που δεσμεύεται κυτταρικής επιφάνειας EpCAM να παραδώσει δοξορουβικίνη [19]. Εδώ, για πρώτη φορά, έχουμε κατασκευάσει EpCAM RNA απταμερούς-EpCAM siRNA χίμαιρα (EpApt-SIEP) για να επιτευχθεί στοχευμένη γονιδιακή αποσιώπηση EpCAM σε EpCAM θετικά κύτταρα. Έχουμε επίσης την έκθεση για πρώτη φορά ότι EpICD υπερεκφράζεται σε RB, και να χτυπήσει κάτω EpCAM οδηγεί στο κάτω-ρύθμιση των δεικτών CSC όπως SOX2, Oct4 και έκφραση Nanog. Μπορούμε επίσης να εκτελεστεί

in vivo

μελέτες χρησιμοποιώντας μοντέλο ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια με κυτταρική σειρά MCF7 καρκίνου του μαστού, ως απόδειξη της έννοιας στερεών επιθηλιακών καρκίνων που εκφράζει EpCAM. Υψηλή δραστικότητα κατά του όγκου επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας EpApt-SIEP χιμαιρικό κατασκεύασμα μας χωρίς τοξικότητα. Περαιτέρω, έχουμε μελετήσει το μηχανισμό εμπλέκεται στην κυτταρικό θάνατο και την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων στα ξενομοσχεύματα όγκου με τη διερεύνηση των πλήρεις αποπτωτικών και κυτοκίνες μόρια χρησιμοποιώντας δέσμες πρωτεΐνης.

Μέθοδοι

Κατασκευή χιμαιρική κατασκευή και

In vitro

Dicer διάσπαση δοκιμασία

EpApt-SIEP κατασκευάστηκε όπως περιγράφεται στο Dassie

et

.,

al

. 2009 [20]. Η δευτερεύουσα δομή του κατασκευάσματος μελετήθηκε με δομή RNA v5.3 [21] και το λογισμικό Mfold [22]. Οι σχεδιασμένες κατασκευές εμπορικά συντίθεται από Dharmacon Inc. (GE επιστήμες της ζωής, Lafayette, CO).

In vitro

δοκιμασία Dicer έγινε για να δείξει ότι EpApt-SIEP χίμαιρα είναι υπό επεξεργασία από το ένζυμο Dicer για την απελευθέρωση του siRNA από το χιμαιρικό απταμερές χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένο κιτ κόφτης κύβων (ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Dicer Enzyme Kit Cat Νο: T510002) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αντέδρασε προϊόντα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση και αναλύθηκαν με διαφανοσκόπιο UV (λεπτομερές πρωτόκολλο που προβλέπεται στο S1 αρχείου).

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια πρωτογενών RB και απταμερούς μελέτη πρόσληψη

Ανθρώπινο RBcell γραμμή (weri-Rb1) , καρκινικό κύτταρο μαστού γραμμή (MCF7) αγοράστηκε από την τράπεζα Riken κύτταρο, RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japan) συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Οι κυτταρικές σειρές ήταν ελεύθεροι μόλυνσης από μυκόπλασμα, όπως επαληθεύεται από επιφυλακή για Mycoplasma κιτ (Sigma Aldrich, Bangalore). MCF7 andWERI-Rb1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποίηση του Dulbecco μέσου Eagle (DMEM) και Rosewell Park Memorial Institute μέσο (RPMI-1640) mediarespectively με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Gibco, Life Technologies, Μπανγκαλόρ, Ινδία). Όλες οι κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% δείγματα όγκων incubator.RB CO2 από εξορυγμένος μπάλες μάτι συλλέχθηκαν ως μέρος της θεραπείας και χρησιμοποιούνται για ερευνητικούς σκοπούς ανώνυμα. Μια γενική γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους γονείς /κηδεμόνες του που υποβάλλεται enucleation ασθενή. Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι, στο Ίδρυμα Vision Research, αφού λάβει την έγκριση από την Ηθική Υπο-επιτροπής (Institutional Review Board) του Sankara Nethralaya νοσοκομείο μάτι [Ηθικές κάθαρση. όχι. 240-2010-Ρ]. Πρωτογενή κύτταρα όγκου RB λαμβάνονται από τα μάτια χωρίς πυρήνα διαχωρίστηκε από το εγχειρίδιο κονιοποίηση, και καλλιεργήθηκαν σε μέσα RPMI που περιέχει 20% FBS. RPMI και DMEM μέσα αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, Bangalore, Ινδία). Η πρόσληψη του FITC επισημασμένου EpApt-SIEP από MCF7 και weri-Rb1 κυττάρων μελετήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής και μικροσκοπία φθορισμού ακόλουθο πρωτόκολλο που προβλέπεται στο S1 αρχείου.

In vitro

αποτελεσματικότητα της EpApt-SIEP στο κελί γραμμές

Η αποτελεσματικότητα της EpApt-SIEP αξιολογήθηκε

in vitro

χρησιμοποιώντας MCF7 και weri-Rb1 κυτταρικές σειρές. Εν συντομία, 2X10

5 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EpApt-SIEP ή επιμολυσμένα με siEpCAM για 48 ώρες, απομόνωση του RNA που ακολουθείται από κηλίδα northern, qPCR για την ανάλυση mRNA και κηλίδωση Western για τα επίπεδα της πρωτεΐνης (S1 File).

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, βόρεια και Δυτική κηλίδωση

για να αναλυθεί η επίδραση της siEpCAM και EpApt-SIEP στην έκφραση EpCAM, qPCR και διεξήχθη κηλίδωση northern χρησιμοποιώντας ολικό RNA. qPCR διεξήχθη με κανονικοποίηση του γονιδίου-στόχου σε β-2-microgloublin (Β2Μ) με SYBR πράσινο μέθοδο βασισμένη χρησιμοποιώντας τις αλληλουχίες εναρκτήρα που απαριθμούνται στο S2 πίνακα. Κηλίδωση Northern διεξήχθη με ηλεκτροφόρηση του ολικού RNA σε πηκτή αγαρόζης φορμαλδεΰδης, απορροφήθηκε χρησιμοποιώντας SSC ρυθμιστικό, ανιχνεύθηκε με επισημασμένο με βιοτίνη αντι-νόημα διερευνητή EpCAM RNA και αναπτύχθηκε με τη μέθοδο χημειοφωταύγειας. Κηλίδωση Western Διεξήχθη η ανάλυση του επιπέδου της πρωτεΐνης EpCAM χρησιμοποιώντας τυπικό πρωτόκολλο με αντι-EpCAM (c-10) αντίσωμα (λεπτομερές πρωτόκολλο παρέχονται στο S1 File).

Ανοσοϊστοχημεία

ανοσοϊστοχημεία (IHC) ήταν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Novolink πολυμερές σύστημα ανιχνεύσεις (Leica Biosystems, Μπανγκαλόρ, Ινδία) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας τμήματα ιστών de-παραφινοποιήθηκαν ανθρώπινη RB. Εν συντομία, ανάκτηση αντιγόνου έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο χύτρα ταχύτητας, τότε το κλείδωμα υπεροξειδάση ιστού και πρωτογενών μπλοκάρισμα εκτελέσθηκε ακολουθούμενη από επώαση με αντι-EpICD αντίσωμα (Imgenex, Ινδία). Πολυμερές με βάση την ανίχνευση χρησιμοποιώντας DAB χρωμογόνου έγινε, αποξηραμένα πλάκες τοποθετούνται και σκόραρε για τα επίπεδα έκφρασης (λεπτομερές πρωτόκολλο που προβλέπεται στο S1 αρχείου).

πολλαπλασιασμού ΜΤΤ κυττάρων δοκιμασία

Ίδιος αριθμός MCF7 και weri -Rb1 κύτταρα (10.000 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν αντιστοίχως σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 400ηΜ απταμερούς-siRNA χίμαιρα. Τα κύτταρα επίσης επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen LifeScience, Bangalore, Ινδία) με 200 ηΜ siRNA EpCAM (Qiagen, Germany). Τα κατεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν για 48hat 37 ° C σε 5% CO2 επωαστή. Μετά από 48 ώρες, ΜΤΤ (Sigma Aldrich, Bangalore, Ινδία) σε φρέσκο ​​μέσο προστέθηκε στα κύτταρα και επωάστηκαν για 4 ώρες. Οι κρύσταλλοι που σχηματίζονται διαλύθηκαν σε DMSO και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας SpectraMax φασματοφωτόμετρο.

In vivo

αποτελεσματικότητα κατά του όγκου των EpApt-SIEP σε επιθηλιακό καρκίνο ξενομοσχεύματος μοντέλο

να μελετήσει την

in vivo

αποτελεσματικότητα της EpApt-SIEP, MCF7, επιθηλιακό καρκίνο μοντέλο επιλέχθηκε διότι η

in vitro

αποτελεσματικότητα ήταν καλύτερη από ό, τι weri-Rb1 κυτταρική σειρά. Αυτή η μελέτη διεξήχθη στις εγκαταστάσεις της Syngene International Pvt. Ltd., εμπορικά. Όλα τα ζώα χειρίζονται με τρόπο ώστε να ελαχιστοποιηθεί ή να εξαλειφθεί ο πόνος και η ταλαιπωρία, χρησιμοποιώντας ισοφλουράνιο που βασίζεται αναισθητοποίηση. φροντίδα των ζώων ήταν σε συμμόρφωση με τις συστάσεις της Επιτροπής για τον έλεγχο και την εποπτεία των πειραμάτων σε ζώα (CPCSEA), η κυβέρνηση της Ινδίας και Σύνδεσης για την αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου ζώων Care International (AAALAC). Το «Έντυπο Β» για τη διεξαγωγή πειραμάτων σε ζώα αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από το Syngene International Pvt. Ltd., θεσμική Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων (IAEC Πρωτόκολλο Αριθμός έγκρισης: Syngene /IAEC /430/10 – 2.013). Τα ζώα διατηρούνται σε ελεγχόμενες και άσηπτες συνθήκες και με την προϋπόθεση με αραβόσιτος, RO νερού αυτόκαυστο κατά βούληση και με το φως σκοτεινό κύκλο 12h κάθε /. MCF7cells εναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 5X10

6cells σε 200 μΐ μέσο ελεύθερο ορού που περιέχει 50% Matrigel και εγχύθηκαν υποδορίως στο πίσω μέρος του αθυμικών γυμνών-Foxn1

nuovariectomized θηλυκά ποντίκια 7-8 εβδομάδων εμφυτεύεται με 17β- σφαιρίδια οιστραδιόλης. Άπαξ και οι όγκοι έγιναν ψηλαφητοί, τα ζώα ομαδοποιήθηκαν τυχαίως με βάση τον όγκο του όγκου (TV≈80mm

3) και η δοσολογία ξεκίνησε. Το πρόγραμμα θεραπείας ακολούθησε δίνεται στον Πίνακα S3. Ο όγκος σωματικά βάρη και όγκων μετρήθηκαν μία φορά κάθε τρεις ημέρες και% μεταβολή στο βάρος σώματος υπολογίστηκε. Κατά τη διάρκεια της θυσίας, συλλέχθηκε αίμα υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο από όλες τις ομάδες για την κλινική αξιολόγηση της λειτουργίας του ήπατος (SGOT, SGPT) & amp? νεφρικής λειτουργίας (BUN, ουρία), επίχρισμα περιφερικού αίματος για μέτρηση διαφορικής λευκοκυττάρων. ιστούς και τα όργανα του όγκου αποκόπηκαν και αναλύθηκαν ιστο-παθολογικά με χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης.

δέσμης πρωτεΐνης για αποπτωτική δείκτες και κυτοκίνες

Proteome profiling εκτελέστηκε για τη μελέτη του μηχανισμού της EpApt-SIEP κατασκεύασμα Mediated δραστηριότητα και να μελετηθεί η επίδρασή της επί της απόπτωσης έναρξης και φλεγμονώδη απόκριση κατά του όγκου. Οι πρωτεΐνες συστοιχίες-Ανθρώπινη σειρά απόπτωση, κατάλογος # ARY009 και το ποντίκι του πίνακα array κυτοκίνη Ένας κατάλογος # ARY006 (R & amp? D Systems, Abingdon, UK) πραγματοποιήθηκαν ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ποντίκι ξενομόσχευμα (έλεγχος επεξεργασμένο με αποστειρωμένο νερό για ένεση και EpApt-SIEP αγωγή οχήματος) ιστούς προϊόντα λύσης πρωτεΐνης και του ορού παρασκευάστηκαν με την ομαλοποίηση συγκέντρωση πρωτεΐνης τους και χρησιμοποιούνται στη συστοιχία. Οι συστοιχίες διεξήχθησαν σε ένα ταυτόσημο κατάσταση και να αναπτυχθούν ταυτόχρονα για τις ομάδες τόσο ο έλεγχος και η θεραπεία χρησιμοποιώντας XRS chemidoc

+ μέσο (BioRad) χρησιμοποιώντας ίδια έκθεση. Ιστορικό κανονικοποίηση του σήματος έγινε και ολοκληρωμένη πυκνότητα pixel μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ με το plugin προφίλ μικροσυστοιχιών. Οι διαφορές μεταξύ των διπλών σημεία χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της τυπικής απόκλισης και εκφράζεται ως μπαρ σφάλμα στα οικόπεδα ιστόγραμμα.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση για το

in vitro

ανάλυση απταμερούς χίμαιρας σε κυτταρικές σειρές διεξήχθη με αταίριαστο

t-test

. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκε τρεις φορές. Για την αξιολόγηση της στατιστικής σημασίας της αναστολής όγκου, μη ζευγαρωμένα

t-test

διεξήχθη χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism V5. Οι μελέτες αναστολής όγκου διεξήχθησαν σε ξενομόσχευμα ποντικούς με η = 8. Οι τιμές ρ μικρότερες από 0.05 υποδεικνύει στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων. τιμή P στην περιοχή (0,01-0,05) υποδεικνύεται με «*», οι τιμές στην περιοχή (0,01 έως 0,001) με το «**» και λιγότερο από 0.001 υποδεικνύεται με «#».

Αποτελέσματα

χιμαιρισμού της EpApt με siEpCAM?

in vitro

Dicer μεσολάβηση επεξεργασία και την κυτταρική πρόσληψη

EpCAM απταμερούς siRNA χίμαιρα κατασκευάστηκε σύμφωνα με τις προηγουμένως βελτιστοποιημένες δομές του PSMA απταμερούς siRNA χιμαιρικό κατασκεύασμα [20]. Στην προηγούμενη μελέτη, στέλεχος και απταμερές βρόχο χίμαιρα με κλώνο μετάθεσης εμφάνισαν καλύτερα σίγηση σε σύγκριση με τις άλλες χιμαιρικές μορφές. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, θα κατασκευαστεί απταμερούς χίμαιρα με την επέκταση της σειράς απταμερές με την αλληλουχία siRNA στο 5 ‘άκρο και 3’ άκρο του. Η κατασκευάζονται EpApt-siRNA πραγματοποιείται siRNA που στοχεύουν EpCAM. Η δομή στελέχους και βρόχου σχεδιάστηκε με το χέρι με την ενσωμάτωση αλληλουχία siRNA που στοχεύει EpCAM. Επιπλέον, η απταμερή-siRNA διεξάγεται ανθεκτικά νουκλεάση τροποποίηση (2’F) στις πυριμιδίνες. Το 5 ‘άκρο του απταμερούς ήταν άκρο σημασμένο με FITC για την παρακολούθηση της δέσμευσης απταμερούς και πρόσληψη από τα κύτταρα και 3’ άκρο του απταμερούς harbored δύο προβόλους ουριδίνης που βοηθά στην αναγνώριση και τη φόρτωση ενζύμου Dicer [23]. Η EpApt και κατασκευασθεί απταμερούς χιμαιρικές δομές προβλεφθεί χρησιμοποιώντας δομή RNA v5.3 και Mfold και παρουσιάζονται στο Σχήμα 1Α και 1Β. Οι ενισχύσεις EpApt σε σύνδεση με EpCAM, εσωτερίκευση και απελευθέρωση στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου. Η EpApt-SIEP υπό την επήρεια Dicer, generates21bp siRNA που φορτώνει στο σύνθετο RISC, ενορχηστρώνει αναστολή της μετάφρασης από τη διάσπαση EpCAM mRNA.

Α. EpCAM απταμερούς πρόβλεψη δευτεροταγούς δομής από Mfold σε απευθείας σύνδεση. Β EpCAM απταμερούς siRNA χιμαιρικό κατασκεύασμα που φέρει το EpCAM στόχευση siRNA (EpApt-SIEP) είναι διπλωμένο χρησιμοποιώντας Mfold σε απευθείας σύνδεση και το απταμερές ενδείκνυται σε μπλε κουτί και το siRNA μέσα κόκκινο κουτί. Γ EpCAM απταμερές siRNA χιμαιρικό κατασκεύασμα επωάστηκε με το ανασυνδυασμένο ένζυμο Dicer στους 37 ° C για 18 ώρες. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χωρίς Dicer ως αντίδραση ελέγχου. ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου των αντιδράσεων με και χωρίς ένζυμο Dicer έτρεξαν σε 15% πήκτωμα και χρώση με EtBr. Παρατηρήθηκαν η επεξεργασία siRNA 21bp και των μη επεξεργασμένων ειδών κατασκεύασμα. Δ EpCAM απταμερές siRNA χιμαιρικό μόρφωμα προστέθηκε σε κύτταρα weri-Rb1 και MCF7 σε ρυθμιστικό σύνδεσης και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Το γράφημα επικάλυψη δείχνει την πρόσληψη του χιμαιρικό απταμερούς. οικόπεδο Ε διασποράς που δείχνει την πρόσληψη EpApt-SIEP από τον RB κυτταρική γραμμή, weri-Rb1 και RB πρωτογενή καρκινικά κύτταρα. ΣΤ EpCAM απταμερές siRNA χιμαιρικό μόρφωμα προστέθηκε σε πρωτογενή κύτταρα RB σε μέσα χωρίς ορό για 2 ώρες στους 37 ° C που ακολουθείται από έκπλυση με 1Χ PBS. Μικροσκοπικές εικόνες ελήφθησαν σε 20Χ στόχος κάτω φάση και FITC κανάλια και μόνο κύτταρα ελέγχου και κύτταρα με EpApt-SIEP. Δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές ανεξαρτήτως με παρόμοια αποτελέσματα. ** P αξία των 0,01 έως 0,001? * P αξία των 0,05 – 0,01.

Η

Για την λειτουργικότητα του συντίθεται EpApt-SIEP, αναγνώριση Dicer είναι απαραίτητο. Αυτό ελέγχθηκε με διεξαγωγή

in vitro δοκιμασία

διάσπασης κόφτης κύβων. Το κατασκεύασμα EpApt-SIEP επωάστηκε με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη κόφτης κύβων για 18 ώρες και στη συνέχεια σε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν 21bp και 19merproducts αντιστοιχούν σε siRNA και απταμερή αντίστοιχα (S1 Εικ). Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τη λειτουργία μιας PAGE μη-μετουσίωσης, ελήφθησαν διασπαστεί θραύσματα ~ μήκους 20-22bp (Σχήμα 1C). Εμείς περαιτέρω Επιδιώξαμε να εξετάσουμε τη σταθερότητα του κατασκευάσματος υπό φυσιολογικές συνθήκες μιμούνται. Το κατασκεύασμα οδήγησε σε ελάχιστη αποικοδόμηση (& lt? 10% αποικοδόμηση) μέχρι 72 ώρες σε μέσα χωρίς και με 10% FBS, αντίστοιχα. Η κατασκευή στο 100% FBS ήταν σταθερή μέχρι 96 ώρες, αν και, μια μικρή υποβάθμιση ήταν εμφανής σε διάρκεια 48 ώρες. Έτσι, οι κατασκευές θα μπορούσαν να είναι σταθερό υπό φυσιολογικές συνθήκες μιμούνται μέχρι 72 ώρες (S1 Α Σχήμα).

Η κυτταρική πρόσληψη μελέτες EpApt-SIEP είναι απαραίτητα για να τεκμηριώσει την εσωτερίκευση του απταμερούς με τη μεσολάβηση υποδοχέα ενδοκύτωση. Το EpCAM απταμερές (EpDT3 /EpApt) έχει ήδη διευκρινιστεί για την ενδοκυττάρωση υποδοχέα [13] .Earlier μελέτες και την τρέχουσα μελέτη χρησιμοποίησε απταμερούς EpCAM αγωνίζομαι (ScrApt), με την τροποποίηση 2’OMe στην σπονδυλική στήλη EpApt εμποδίζει τη σύνδεση με EpCAM [13 , 19]. Παρόμοια με την EpApt-SIEP, ScrApt χίμαιρα (ScrApt-SIEP) κατασκευάστηκε. Η ScrApt-SIEP κατά χιμαιρισμού οδήγησε σε μη-ειδική σύνδεση με κύτταρα MCF7 (S1B Σχήμα) και όχι διερευνηθεί περαιτέρω. Βρήκαμε υψηλότερη κυτταρική πρόσληψη του EpApt-SIEP κατασκευάσει στην MCF7 από weri-Rb1cells (Σχήμα 1D). Τα πρωτογενή κύτταρα RB και η κυτταρική γραμμή weri-Rb1 έδειξε πρόσληψη της χίμαιρας. Τα πρωτογενή κύτταρα RB βρέθηκαν να επιδεικνύουν μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα δεσμευτική από κυτταρικές γραμμές, λόγω των υψηλότερων επιπέδων έκφρασης EpCAM στους όγκους (Σχήμα 1 Ε). Από τις μικροσκοπικές μελέτες το 75% των πρωτογενών κυττάρων RB έδειξε πρόσληψη του EpApt-SIEP (Σχήμα 1 F).

EpApt-SIEP σιωπές EpCAM ειδικά σε κυτταρικές σειρές και πρωτογενή καρκινικά κύτταρα RB

Ο στόχος συγκεκριμένη παράδοση, την παραγωγή siRNA και αποσιώπηση ικανότητα μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές MCF7 weri-Rb1 και. Δεδομένου ότι το επίπεδο έκφρασης του EpCAM είναι υψηλότερη σε κύτταρα MCF7 από weri-Rb1 [24], το χιμαιρικό κατασκεύασμα αξιολογήθηκε πρώτα για την αποσιώπηση του EpCAM στα κύτταρα MCF7. Οι βόρειες αποτύπωση αποτελέσματα έδειξαν φίμωση της EpCAM περίπου 40% σε EpApt-SIEP επεξεργασμένα κύτταρα και περίπου 25% σε SIEP επιμολυσμένα κύτταρα κανονικοποιούνται σε 28S rRNA (Σχήμα 2Α και πίνακα δικαίωμα αυτό). Μία ποσοτική ανάλυση της έκφρασης mRNA με qPCR έδειξαν καλύτερη αναστολή της έκφρασης EpCAM, -1.8 και -3.4 φορές προς τα κάτω ρύθμιση (73% και 90% αναστολή της έκφρασης του mRNA) σε κυτταρική σειρά MCF7 (Ρ & lt? 0,01) και -1,4 και -1,0 φορές προς τα κάτω ρύθμιση (63% και 51% αναστολή των επιπέδων mRNA) σε weri-Rb1cell γραμμή (Ρ & lt? 0,05) (Σχ 2Β). Η ρύθμιση προς τα κάτω EpCAM παρατηρήθηκε επίσης στα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 2C), weri-Rb1 κύτταρα παρουσίασαν 47% και 43% και MCF7 εμφάνισαν 65% και 49% του προς τα κάτω ρύθμιση πρωτεΐνης EpCAM (Ρ & lt? 0,05) (Σχ 2D). Τα μη επεξεργασμένα βόρειες και δυτικές κηλίδες εμφανίζονται στο S2 αρχείου.

Α. Τα επίπεδα mRNA EpCAM ανιχνεύθηκαν από το ολικό RNA του ελέγχου, SIEP και EpApt-SIEP κατεργασμένα κύτταρα MCF7 με κηλίδωση Northern. Το συνολικό RNA ηλεκτροφορήθηκε σε ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης φορμαλδεΰδης, στυπώθηκαν και αναπτύχθηκε με χημειοφωταύγεια μεθόδου που βασίζεται. EpCAM στόχευση siRNA χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση ανιχνευτή. Στα δεξιά της, η ανάλυση πυκνότητας των ζωνών πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ και παρίσταται ως γραφική παράσταση με την έκφραση του mRNA% έναντι του rRNA 28S. επίπεδα B. Το EpCAM mRNA ήταν ποσοτικά με πράσινο SYBR βάση qPCR από το cDNA του ελέγχου, SIEP και EpApt-SIEP αντιμετωπίζονται weri-Rb1 και τα κύτταρα MCF7. Γ κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε στο SIEP επιμολυσμένα και EpApt-SIEP αγωγή weri-Rb1 και τα κύτταρα MCF7 του EpCAM και β-τουμπουλίνης. EpCAM στόχευση siRNA χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση ανιχνευτή. D. Η ανάλυση πυκνομετρίας των κηλίδωση Western συγκροτήματα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ και σχεδιάστηκαν ως γραφική παράσταση με% πρωτεΐνη (EpCAM) έκφραση ομαλοποιηθούν σε β-τουμπουλίνης. Ε Ο πολλαπλασιασμός ποσοστό των κυττάρων προσδιορίστηκε ποσοτικά με τη διενέργεια δοκιμασίας ΜΤΤ για τον έλεγχο, SIEP επιμολυσμένα, EpApt-SIEP, EpApt και ScrApt αντιμετωπίζονται weri-Rb1 και τα κύτταρα MCF7. Το γράφημα δείχνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων% ομαλοποιήθηκε για τον έλεγχο των κυττάρων. Δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές ανεξαρτήτως με παρόμοια αποτελέσματα. ** P αξία των 0,01 έως 0,001? * P αξία των 0,05 – 0,01.

Η

Η επίδραση της χιμαιρικό μόρφωμα δοκιμάστηκε σε RB πρωτογενή κύτταρα του όγκου για φίμωση. Η λειτουργική /μεταβολικές activityof πρωτογενή κύτταρα wasevaluated bytransfecting pGFP πλασμίδιο. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση πλειονότητα των κυττάρων έδειξαν πολύ υψηλή έκφραση (Εικ S2A). Αυτό επιβεβαίωσε το μεταβολικά ενεργό κατάσταση των πρωτογενών κυττάρων, που στη συνέχεια προσπάθησε να αναλύσει το αποτέλεσμα της EpApt-SIEP και SIEP σε αυτά τα κύτταρα. Τα πρωτογενή κύτταρα όγκου έδειξαν αναστολή της έκφρασης EpCAM από -0,5 φορές και -2,4 φορές σε siRNA και χιμαιρικά κύτταρα κατεργασμένα κατασκεύασμα αντίστοιχα (Εικ S2B). Η κυτταρική κυτταροτοξικότητα όπως μετράται με τη δοκιμασία LDH έδειξε 37% και 35% αύξηση της δραστηριότητας LDH κατά αποσιώπηση του EpCAM χρησιμοποιώντας siRNA και EpApt-SIEP. Η EpApt-SIEP κατασκεύασμα σημαντικά (Ρ & lt? 0,01) ρυθμίζεται προς τα κάτω τα επίπεδα του mRNA EpCAM και προκάλεσε κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα όγκου πρωτογενή RB (S2C Εικ). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ως διαβάζεται από μεταβολική δραστηριότητα μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. TheWERI-Rb1 και MCF7 κύτταρα έδειξαν σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με EpApt-SIEP, ενώ EpApt ή ScrApt μόνη δεν έδειξε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 2Ε)

EpICD σε πρωτογενείς όγκους RB:. Ρύθμιση των βλαστικών καρκίνο δείκτες κυττάρων

EpCAM έχει δειχθεί ότι υπερεκφράζεται σε καρκίνο κύτταρα έναρξης ή προγονικά καρκίνος /βλαστικά κύτταρα (CPC /ΚΕΠ) [25-27]. Ο μηχανισμός πίσω από αυτή την περιουσία ρυθμίζεται από το intramembrane πρωτεόλυση EpCAM που οδηγεί στην απελευθέρωση EpICD και εκτοπίζοντας με πυρήνα [7] Εμείς ανέφεραν την παρουσία του EpCAM στις αρχές του 2004 και στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να μελετήσουμε την έκφραση EpICD στην πρωτοβάθμια RB όγκους [28]. Τα αποτελέσματα έδειξαν IHC έντονη πυρηνική χρώση και την ένταση της χρώσης ποικίλλει πυρηνικών μεταξύ των όγκων που μελετήθηκαν. Οι όγκοι έδειξαν 40-60% των κυττάρων που είναι θετικά και σε ορισμένες περιπτώσεις έδειξε 70-80% των κυττάρων θετικών για την πυρηνική χρώση. Η κανονική αμφιβληστροειδή που μελετήθηκαν δεν αποκάλυψε καμία εμφανής πυρηνική χρώση (Σχήμα 3Α). Η ένταση και η ποσοστιαία κατανομή των θετικών κυττάρων EpICD στον όγκο παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

A. Ανοσοϊστοχημεία της κανονικής τμήματος αμφιβληστροειδή που δεν παρουσιάζουν εμφανή EpICD στον πυρήνα, RB τομές ιστού δείχνει έντονη χρώση του πυρήνα. Η έκφραση του EpICD ήταν majorly παρατηρήθηκε στον πυρήνα των κυττάρων του όγκου, όπως δείχνεται με λευκά βέλη. B. Η φορές αλλαγή στα επίπεδα του mRNA του SOX2, Oct4, Nanog, CD44S, CD133 και Survivin (BIRC5) ποσοτικοποιήθηκαν με πράσινο SYBR βασίζεται qPCR από την SIEP και EpApt-SIEP αγωγή weri-Rb1 κύτταρα και κανονικοποιήθηκε ως προς β-2-μικροσφαιρίνη η γονιδιακή καθαριότητας. C. Η φορές αλλαγή στα επίπεδα του mRNA του SOX2, Oct4 και Nanog ποσοτικοποιήθηκαν με SYBR πράσινο βασίζεται qPCR από την SIEP και EpApt-SIEP κατεργασμένα κύτταρα MCF7 και ομαλοποιήθηκε ως προς β-2-μικροσφαιρίνης ως housekeeping gene.Data αντιπροσωπεύει μέση ± SD. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 3 φορές ανεξαρτήτως με παρόμοια αποτελέσματα ** Ρ τιμή του 0,01 έως 0,001.? * P αξία των 0,05 – 0,01.

Η

Η κυκλοφόρησε EpICD αποτελεί συγκρότημα πυρηνικών πρωτεϊνών μέσω της αλληλεπίδρασης με την FHL2, β-κατενίνης και Ι.ΕΡ1 μεσολαβεί μεταγραφές γονίδιο και τις ενισχύσεις στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Η ρύθμιση της EpICD στην έκφραση των δεικτών πλειοδυναμίας αναφέρθηκαν νωρίτερα [9] και μας ενδιαφέρει να μελετήσουμε τη διαμόρφωση του EpCAM πίσω από την έκφραση του Oct4, SOX2, Nanog, CD133, CD44s. Μελετήσαμε επιπλέον την έκφραση των επιπέδων survivin κατά την αποσιώπηση της EpCAM σε RB κυτταρική γραμμή, weri-Rb1. EpCAM αποσιώπηση χρησιμοποιώντας την επιμόλυνση siRNA ή EpApt-SIEP έδειξε υψηλότερη ρύθμιση προς τα κάτω της SOX2, Oct4 και Nanog σε siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με το EpApt-SIEP, ενώ το CD133, CD44s και τα επίπεδα survivin ήταν περισσότερο προς τα κάτω σε EpApt-SIEP επιμολυσμένα κύτταρα (Εικ 3Β ). Μελετήσαμε επιπλέον την έκφραση SOX2, Oct4 και Nanog στα κύτταρα MCF7 και βρέθηκε αρνητική ρύθμιση των SOX2 και Nanog αλλά όχι Oct4 κατά την φίμωση EpCAM με τη χρήση siRNA ή EpApt-SIEP κατασκευή (Σχήμα 3C). Έτσι, ήμασταν σε θέση να διευκρινίσει τη ρύθμιση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων από EpCAM μέσω EpICD

EpApt-SIEP υποχωρούν καρκίνο του μαστού:.

In vivo

ξενομόσχευμα μελέτη

Η αντι-όγκου επίδραση της EpApt-SIEP μελετήθηκε χρησιμοποιώντας τον καρκίνο του μαστού

in vivo

μοντέλο. κύτταρα MCF7 εγχύθηκαν σε αμφίπλευρη ωοθηκεκτομή γυμνά ποντίκια συμπληρωμένο με εξωτερικούς οιστρογόνων. Η δοσολογία του EpApt-SIEP διεξήχθη σε εναλλασσόμενες ημέρες από ημέρα 0 έως day14 και day20, τα ζώα δοσολογήθηκαν, 24 ώρες αργότερα η = 4 θανατώθηκαν από κάθε ομάδα. Η κινητική της ανάπτυξης του όγκου έδειξαν σημαντική μείωση (Ρ & lt? 0,01) στον όγκο του όγκου, ο έλεγχος του οχήματος έδειξε 584 χιλιοστά

3, ενώ το υπό θεραπεία ζώο έδειξε 52 χιλιοστά

3 σημαίνουν όγκου του όγκου. Το υπόλοιπο του n = 4 στην ομάδα ελέγχου του οχήματος και της ομάδας EpApt-SIEP χορηγήθηκαν σε day22 και day24, περαιτέρω μελετηθεί μέχρι day33. Οι όγκοι μέση του όγκου σε day33, για την ομάδα ελέγχου οχημάτων και EpApt-SIEP ήταν 922 χιλιοστά

3 και 64 χιλιοστών

3, αντίστοιχα. Το προφίλ της ανάπτυξης του όγκου, τόσο για τις ομάδες κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου φαίνεται στο Σχ 4Α. Η αναστολή της ανάπτυξης% του όγκου (TGI) για την ομάδα EpApt-SIEP σε επίπεδο δοκιμάστηκε δόση βρέθηκε να είναι 102% (Day33,

#indicates p & lt? 0.001). Στο day33, τα ποντίκια (Σχήμα 4Β) υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι όγκοι αφαιρέθηκαν (σχήμα 4Γ) που ακολουθείται από ανάλυση της έκφρασης των δεικτών κυττάρου EpCAM και στέλεχος του καρκίνου, αποπτωτικά κατασκευαστές και ανθεκτικές πρωτεΐνες φάρμακο διεξήχθησαν.

κινητική ανάπτυξη του όγκου των MCF7 ξενομοσχεύματος αντιμετωπίζονται με EpApt-SIEP. Θηλυκά γυμνά ποντίκια (HSD: αθυμικού-Foxn1

nu, αμφίπλευρη ωοθηκεκτομή) στεγάζονται σε ατομικά κλωβοί (IVCs) χρησιμοποιήθηκαν για την παρούσα έρευνα. Η ογκογονικότητα των κυττάρων MCF7 στα ποντίκια εξαρτάται από οιστρογόνα. Είκοσι ώρες πριν από την MCF-7 ένεση των κυττάρων, τα ζώα εμφυτεύθηκαν με 17β-οιστραδιόλη σφαιριδίων (0.36mg /σφαιρίδιο? Απελευθέρωσης 60 ημερών? Innovative Research of America, Sarasota, FL) σε περιοχή λεπίδα ραχιαία ώμων των ποντικών χρησιμοποιώντας τροκάρ. MCF-7 καρκινικά κύτταρα (5 x10

6 κύτταρα /ζώο) ενέθηκαν υποδορίως στα πλευρά των ζώων. Μετά από 7-10 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων, τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν με βάση τον όγκο του όγκου (TV≈80mm3) και η δοσολογία ξεκίνησε. Γράφημα που δείχνει την (Α) Το μέγεθος του όγκου της ομάδας ελέγχου οχήματος ένεση με PBS υποδορίως κοντά στη θέση του όγκου, EpApt-SIEP υποδορίως κοντά στη θέση του όγκου σε εναλλασσόμενες ημέρες. Τα βέλη πορτοκαλί υποδεικνύουν τις ενέσεις EpApt-SIEP δεδομένο και το μπλε αστερίσκος δείχνει την ημέρα της θυσίας. Την Ημέρα 21 και 33, λόγω των πειραματικών και ηθικούς λόγους ζώα από αμφότερες τις ομάδες θυσιάστηκαν 50% κάθε φορά. Φωτογραφίες των αντιπροσωπευτικών ποντίκια (Β) και εκτομή όγκων (C) του ελέγχου του οχήματος και αγωγή ομάδες. Δ αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης με κηλίδωση Western των πρωτεϊνών εκχύλιση από τον εκπρόσωπο ιστό των ποντικών ελέγχου ή ποντικών που έλαβαν θεραπεία με EpApt-SIEP (0.6nmol) και τερματίζεται στο 21 και 33 ημέρες αντίστοιχα (σχετικά με το δικαίωμα, γραφική παράσταση που αντιπροσωπεύει τη σχετική έκφραση υπολογίζεται ImageJ λογισμικό. Ε Γράφημα που δείχνει τις αλλαγές στην MCF7 ξενομοσχεύματος όγκου EpCAM ιστού, τα επίπεδα CD44s, CD24 και MRP1 mRNA μετά τη θεραπεία με κατασκεύασμα EpApt-SIEP. Ο έλεγχος του οχήματος χρησιμοποιήθηκε για την ομαλοποίηση της δίπλωσης έκφρασης και το β-2 μικροσφαιρίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικού ελέγχου. ΣΤ γράφημα που δείχνει τις μεταβολές στα επίπεδα STMN, BIRC5, Bcl2, Bax και mRNA ATM μετά τη θεραπεία με EpApt-SIEP απταμερές κατασκευή ομαλοποίηση έγινε τόσο με τον έλεγχο του οχήματος /καμία ομάδα θεραπείας. τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SE για

in vivo

πείραμα (η = 8) και η μέση ± SD για άλλα πειράματα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και η σημασία υπολογίστηκε με t-test # Ρ & lt?.. 0.001? ** Ρ τιμή του 0,01 έως 0,001? * τιμή Ρ από 0,05 έως 0,01.

Η

Η επίδραση της EpApt-SIEP κατασκευάσει στην έκφραση της EpCAM και άλλων δεικτών CSC μελετήθηκαν μεταξύ του ελέγχου του οχήματος και της ομάδας αγωγή (n = 2) τμήματα του όγκου που συλλέγονται από day21 και day33 αντίστοιχα. Για να ελέγξετε το αποτέλεσμα της EpCAM αποσιώπησης που προκαλείται από EpApt-SIEP κατασκευή, η έκφραση του EpCAM αναλύθηκε με Western blot σε επίπεδο πρωτεΐνης, συμπεριλήφθηκε επιπλέον πρωτεΐνη ABCG2. Η ανάλυση πυκνομετρίας έδειξε 55% και 60% του EpCAM πρωτεΐνης αρνητική ρύθμιση σε ομάδα day33 day21and, ενώ πρωτεΐνη ABCG2 έδειξε 60% και 85% των προς τα κάτω ρύθμιση σε day21 και day33 αντίστοιχα σε EpApt-SIEP επεξεργασμένων δειγμάτων σε σχέση με τον έλεγχο οχήματος (Εικ 4D). H & amp?