Αφηρημένο

Σκοπός

Για να εξεταστεί η

in vitro

και

in vivo

αποτελεσματικότητα του διπλού αναστολέα της PI3K /mTOR NVP-BEZ235 στη θεραπεία του

PIK3CA

άγριου τύπου καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC).

Σχεδιασμός Πειραματική

PIK3CA

μεταλλαγμένων και άγριου τύπου ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC υποβλήθηκαν σε θεραπεία

in vitro

με NVP-BEZ235, και τις επιπτώσεις προκύπτουν για τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, και αξιολογήθηκαν σηματοδότηση. Παχέος όγκους από ένα μοντέλο γενετικά τροποποιημένο ποντίκι (GEM) για σποραδικές άγριου τύπου

PIK3CA

CRC υποβλήθηκαν σε θεραπεία

in vivo

με NVP-BEZ235. εξετάστηκαν οι επιπτώσεις προκύπτουν για την ανάπτυξη μακροσκοπικών όγκου /παλινδρόμησης, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, αγγειογένεση και σηματοδότησης.

Αποτελέσματα

In vitro

θεραπεία των κυτταρικών σειρών CRC με NVP- BEZ235 οδήγησε σε παροδικό αποκλεισμό PI3K, υπέστησαν μειώσεις mTORC1 σηματοδότηση /mTORC2, και μια αντίστοιχη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων (διάμεσος IC

50 = 9,0 – 14,3 nM). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε ζεύγη ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές CRC που διέφεραν μόνο στην παρουσία ή απουσία ενός ενεργοποιητικού

PIK3CA

μεταλλαγμένο αλληλόμορφο.

In vivo

θεραπεία του κολονικού ποντικών που φέρουν όγκο με NVP-BEZ235 οδήγησε σε παροδική αναστολή της ΡΙ3Κ και διατηρούμενη αποκλεισμός της σηματοδότησης mTORC1 /mTORC2. Διαμήκης επιτήρηση του όγκου με οπτική κολονοσκόπηση έδειξε μια αύξηση 97% στο μέγεθος του όγκου σε ποντίκια ελέγχου (ρ = 0.01) σε σχέση με μια μείωση 43% (p = 0.008) σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή.

Ex vivo

ανάλυση των όγκων NVP-BEZ235 επεξεργασμένο έδειξε μια μείωση 56% στον πολλαπλασιασμό (p = 0,003), χωρίς επιπτώσεις στην απόπτωση, και μια μείωση κατά 75% στην αγγειογένεση (p = 0,013).

Συμπεράσματα

Οι μελέτες αυτές παρέχουν την προκλινικές σκεπτικό για μελέτες που εξετάζουν την αποτελεσματικότητα του διπλού αναστολέα της PI3K /mTOR NVP-BEZ235 στη θεραπεία του

PIK3CA

άγριου τύπου CRC.

Παράθεση: Roper J, Richardson MP, Wang WV, Richard LG, Chen W, καφέ ΕΜ, et al. (2011) Η Διπλή PI3K /mTOR αναστολέα NVP-BEZ235 Προκαλεί Όγκων παλινδρόμησης σε ένα γενετικά τροποποιημένο μοντέλο ποντικού του

PIK3CA

άγριου τύπου καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (9): e25132. doi: 10.1371 /journal.pone.0025132

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 14 Ιουνίου του 2011? Αποδεκτές: 25 Αυγ 2011? Δημοσιεύθηκε: 26 Σεπτεμβρίου του 2011

Copyright: © 2011 Roper et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (2U01CA084301) και το Εθνικό Ινστιτούτο διαβήτη και του πεπτικού και νεφρικά νοσήματα (ΝΙϋϋΚ) (5K08DK7803325, R03DK088014 και Τ32-DK07542). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το 2011, καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) θα συνεχίσει να είναι η τρίτη πιο κοινή αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στις ΗΠΑ [1]. Παρά την αυξανόμενη οπλοστάσιο των χημειοθεραπευτικών παραγόντων, η διάμεση επιβίωση για ασθενείς με μεταστατικό CRC εξακολουθεί να είναι λιγότερο από 20 μήνες, γεγονός που υπογραμμίζει την επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων [2].

θηλαστικών στόχος της ραπαμυκίνης ( mTOR) είναι μία κινάση σερίνης /θρεονίνης η οποία ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. mTOR δεσμεύει ρυθμιστικής πρωτεΐνης που συνδέεται του mTOR (Raptor) και LST8 θηλαστικών /G-πρωτεΐνη β-υπομονάδα πρωτεΐνης (mLST8 /GβL) για να σχηματιστεί το σύμπλοκο mTOR 1 (mTORC1), η οποία προάγει τη μετάφραση μέσω φωσφορυλίωσης της κινάσης S6 ρ70 (S6K), ριβοσωμική πρωτεΐνη S6 (S6), και ευκαρυωτικών παράγοντα έναρξης 4E δεσμευτική πρωτεΐνη 1 (4Ε-BP1). Εναλλακτικά, mTOR μπορεί να δεσμεύσει ραπαμυκίνης-insensitive σύντροφος του mTOR (Rictor), mLST8 /GβL, και στρες-ενεργοποιημένης πρωτεΐνης κινάσης θηλαστικού πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης 1 (mSIN1) για να σχηματίσει το mTOR συμπλόκου 2 (mTORC2) [3], [4].

Η ανάντη φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάση (PI3K) μονοπατιού σηματοδότησης μπορούν να ενεργοποιήσουν το mTOR. Οι κλάσης ΙΑ ΡΙ3Κ ενεργοποιείται από παράγοντα ανάπτυξης υποδοχέα κινασών τυροσίνης (RTKs) και αποτελούνται από ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από ένα /ρ110β καταλυτικό και ένα ρ85 ρυθμιστική υπομονάδα ρ110α [5]. Η

PIK3CA

(φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση, καταλυτικό, α-πολυπεπτίδιο) γονίδιο που κωδικοποιεί ρ110α συχνά μεταλλάσσεται σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων CRC [6]. σημειακές μεταλλάξεις στο

PIK3CA

συμπλέγματος σε δύο hotspots: E545K στην ελικοειδή περιοχή (εξόνιο 9) και H1047R στον τομέα καταλυτικής κινάσης (εξόνιο 20). Αυτές οι μεταλλάξεις αυξάνουν δραστικότητα ρ110α και την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων CRC, εισβολή, και μετανάστευση

in vitro

μέσω ενεργοποίησης της οδού ΡΙ3Κ [7]. Μεταλλάξεις στα ελικοειδή και καταλυτικές περιοχές των

PIK3CA

προσδίδουν ουσιαστικά πανομοιότυπα φαινοτύπους σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC [7]. ΑΚΤ είναι ένα κρίσιμο καθοδικός τελεστής της οδού ΡΙ3Κ και προάγει την κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση μέσω ενός αριθμού μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της φωσφορυλίωσης του TSC2, που έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση mTORC1 [5]. Πλήρης ενεργοποίηση της ΑΚΤ επιτυγχάνεται μετά από φωσφορυλίωση σε Thr308 και Ser473 από PDK1 και mTORC2, αντίστοιχα [5], [8] – [11].

Λόγω του κεντρικού ρόλου της στην καρκινογένεση, mTORC1 αποκλεισμός είναι μια ελκυστική θεραπευτική στρατηγική για CRC. Θεραπεία της aPC Δ716 ποντικών με το everolimus αναστολέα mTORC1 αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση των όγκων, με αποτέλεσμα τη μείωση τόσο σε αριθμό όσο και το μέγεθος των εντερικών όγκων [12]. Έχουμε αναφέρει πρόσφατα ότι η επεξεργασία ενός μοντέλου γενετικά ποντικού (GEM) για σποραδικές CRC με τα αποτελέσματα ραπαμυκίνης αναστολέα mTORC1 σε μια μείωση κατά 80% σε επιμέρους ανάπτυξης όγκου, όπως παρατηρείται από τα διαμήκη κολονοσκόπηση επιτήρησης [11]. Ωστόσο, η κλινική αποτελεσματικότητα του αποκλεισμού mTORC1 μπορεί να εξασθενεί από την ταυτόχρονη απώλεια ενός mTORC1-εξαρτώμενη βρόχο αρνητικής ανάδρασης για σηματοδότηση PI3K (που αντικατοπτρίζεται από αυξημένη φωσφορυλίωση ΑΚΤ σε Thr308), και συνέχισε mTORC2 μεσολάβηση ενεργοποίηση της ΑΚΤ μέσω φωσφορυλίωσης σε Ser473 [9 ] – [14]. Πράγματι, μια κλινική δοκιμή Φάσης Ι που εξετάζει την αποτελεσματικότητα του everolimus αναστολέα mTORC1 σε προχωρημένους συμπαγείς όγκους αποδειχθεί μέτριο όφελος σε μόνο μία από τις 16 ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο και τη συνολική αυξημένη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ σε Ser473 [13]. Στο σύνολό τους, φαίνεται ότι θεραπευτικών στρατηγικών στην οποία PI3K και mTOR είναι ταυτόχρονα αναστέλλονται μπορεί να είναι πιο αποτελεσματική.

NVP-BEZ235 (Novartis) είναι μια διπλή παν-τάξης Ι ΡΙ3Κ και αναστολέας της κινάσης mTOR που έχει αποδειχθεί ότι να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου σε έναν αριθμό διαφορετικών αρκετές γενετικά ποντικού (GEM) μοντέλα ξενομοσχεύματος και και είναι προς το παρόν σε κλινικές δοκιμές [14] – [50]. Υπήρξε εισήγηση ότι η χρήση τέτοιων παραγόντων μπορεί να περιορίζεται σε όγκους με την ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

PIK3CA

[51], [52]. Όπως ενεργοποίηση

Οι PIK3CA

μεταλλάξεις δει μόνο το 17% των CRC, αυτό θα σήμαινε αυτών των παραγόντων μπορεί να απευθύνεται μόνο σε ένα μικρό ποσοστό των ασθενών [53]. Επειδή NVP-BEZ235 αναστέλλει την άγριου τύπου και μεταλλαγμένες μορφές του

PIK3CA

με συγκρίσιμη αποτελεσματικότητα [32], υποθέσαμε ότι NVP-BEZ235 μπορεί να έχει σημαντική αποτελεσματικότητα στη θεραπεία του

PIK3CA

άγριας πληκτρολογήστε CRC.

σε αυτό το χειρόγραφο, περιγράφουμε τα αποτελέσματα από

in vitro

μελέτες θεραπείας που αποδεικνύουν συγκρίσιμη αποτελεσματικότητα του NVP-BEZ235 έναντι τόσο

PIK3CA

μεταλλαγμένων και άγριου τύπου ανθρώπινου CRC κυτταρικές γραμμές. Περιγράφουμε επίσης τα αποτελέσματα από

in vivo

μελέτες θεραπείας καταδεικνύουν σημαντική αποτελεσματικότητα σε ένα μοντέλο GEM για σποραδικές άγριου τύπου

PIK3CA

CRC. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας παρέχουν ένα συναρπαστικό προκλινικές σκεπτικό για κλινικές δοκιμές για να εξετάσει τη χρήση του ΚΠΑ-BEZ235 στη θεραπεία του

PIK3CA

άγριου τύπου CRC ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

In vitro

θεραπεία ανθρώπινων CRC κυτταρικές σειρές

HCT116 (

PIK3CA

μεταλλαγμένα? τομέα κινάσης σε H1047R), DLD-1 (

PIK3CA

μεταλλαγμένο? ελικοειδή περιοχή στο E545K) και SW480 (

PIK3CA

άγριου τύπου) ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC (ATCC) και ισογονιδιακό DLD-1

PIK3CA

μεταλλάξεως και αγρίου-τύπου κύτταρα (που λαμβάνεται από B. Vogelstein) διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen) με 10% FBS και 1 χ πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε διαφορετικές αρχικές πυκνότητες (HCT116: 3000 κύτταρα /φρεάτιο, DLD-1: 5500 κύτταρα /φρεάτιο, SW480: 4500 κύτταρα /φρεάτιο, DLD-1

PIK3CA

μεταλλαγμένο: 7000 κύτταρα /φρεάτιο, και DLD -1

PIK3CA

άγριου τύπου: 9.000 κύτταρα /φρεάτιο) να λογοδοτήσει για την διαφορική κινητική ανάπτυξη. Μετά από 16 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις NVP-BEZ235 (Novartis), και περιέχει φάρμακο μέσο ανάπτυξης άλλαζε κάθε 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε 16 ώρες μετά την αρχική επίστρωση και 48 ώρες μετά την έναρξη της φαρμακευτικής αγωγής με τη χρήση της χρωματομετρικής ανιχνεύσεως CellTiter MTS 96® Υδατικό Ένα διάλυμα της δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά την αγωγή του φαρμάκου κανονικοποιήθηκε με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων επίσης αναπτύχθηκαν για 48 ώρες. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση 4 παραμέτρων μη γραμμικής παλινδρόμησης με GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Για ανάλυση στυπώματος Western, τα κύτταρα επιστρώθηκαν με 0 ηΜ ή μέγιστη ανασταλτική δόση (500 ηΜ) NVP-BEZ235 για 2, 6, 24, ή 48 ώρες.

Αλληλούχηση του κόλου όγκων από ένα μοντέλο GEM για σποραδική CRC

C57BL /6J

Αρο

όρους knockout ποντικών (APC CKO) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αδενο-Cre, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Μετά τη νεκροψία, 10 δείγματα όγκων συλλέχθηκαν σε 1 ml RNA Αργότερα (Invitrogen, Inc.), που αποθηκεύονται όλη τη νύκτα σε 4 ° C, στη συνέχεια απομακρύνεται από RNA αργότερα και αρχειοθετούνται σε -80 ° C. RNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα χρησιμοποιώντας RNeasy (Qiagen, Inc.), και δημιουργήθηκε cDNA με αντίστροφη μεταγραφάση (RT Omniscript, Qiagen, Inc). Εκκινητές που σχεδιάστηκαν από τους συγγραφείς της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία 553 bp και 477 bp αμπλικόνια (PCR πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας Platinum PCR SuperMix High Fidelity, Invitrogen, Inc.) που εκτείνονται σε κωδικόνια 532-554 της εξόνιο 9 (ελικοειδή τομέα? 9F: 5 ‘GCAGTGTGGTGAAGTTTCCA 3’, 9R: 5 ‘TGGCCAATCCTTTGATTTGT 3’) και c1011-1062 του εξονίου 20 (περιοχή κινάσης? 20F: 5 ‘ACTGCGTGGCAACCTTTATC 3’, 20R: 5 ‘TGATGGTGTGGAAGATCCAA 3’) του

PIK3CA

γονίδιο, αντίστοιχα, τα οποία περιλαμβάνουν περιοχές μετάλλαξη hotspot. Sanger αλληλουχίας των αμπλικονίων πραγματοποιήθηκε στην Εγκατάσταση βιοπολυμερή στο Harvard Medical School, και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με Sequencher 4.10.1 (γονίδιο κωδικοποιεί, Inc).

In vivo

επεξεργασία ενός μοντέλου GEM για σποραδικές CRC

ποντικοί Αρο CKO υποβλήθηκαν σε αγωγή με αδενο-Cre και ακολουθείται από οπτική κολονοσκόπηση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Ως κολονοσκοπική μέτρηση για το μέγεθος του όγκου, ο όγκος Μέγεθος Index (ΤΠΔ) υπολογίστηκε ως (περιοχή του όγκου /παχέος περιοχή αυλό) × 100 (%). Ποντίκια που έφεραν όγκο τυχαιοποιήθηκαν σε θεραπεία με είτε μόνο του φορέα ελέγχου (n = 8) ή 45 mg /kg σωματικού βάρους NVP-BEZ235 σε 10% 1-μεθυλο-2-πυρρολιδόνη /90% PEG 300 (n = 8) με ημερησίως από του στόματος καθετηριασμό για 28 ημέρες. Η δόση της θεραπείας επιλέχθηκε με βάση την βιβλιογραφία υποδεικνύει ότι 40-50 mg /kg σωματικού βάρους NVP-BEZ235 αντιμετωπίζει αποτελεσματικά μοντέλα όγκων ποντικών χωρίς δυσμενείς επιδράσεις [15], [24], [26], [28], [32], [ ,,,0],47]. Βάσει των φαρμακοκινητικών μελετών που καταδεικνύουν τη μέγιστη συγκέντρωση ιστού μία ώρα μετά τη χορήγηση NVP-BEZ235, τα ποντίκια που φέρουν όγκο θανατώθηκαν μία ώρα μετά τη δόση τελική αγωγή [32]. Παχέος όγκος του όγκου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δαγκάνες (πλάτος Χ μήκος Χ ύψος) και οι όγκοι συλλέχθηκαν για ανάλυση τόσο κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία.

ανάλυση Western blot

Οι συγκεντρώσεις των κυττάρων ή του όγκου λύματα ολόκληρων προσδιορίστηκαν από την Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad). 10 μg και 25 μg πρωτεΐνης προϊόντος λύσεως για ολόκληρων κυττάρων και του όγκου, αντίστοιχα, διαχωρίστηκε επί 10% δϋδ /ΡΑΟΕ, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, αποκλείστηκε σε 1% BSA για μία ώρα, επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για δύο ώρες με πρωτεύον αντίσωμα και μία ώρα δευτερεύον αντίσωμα. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα ™ ECL ™ Western Blot Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης Amersham (GE Healthcare). ρ-ΑΚΤ Thr308 (1:1000 αραίωση), σ-ΑΚΤ Ser473 (1:2000 αραίωση), ολική Akt (1:1000 αραίωση), σ-S6 /244 (1:3000 αραίωση) Ser240, ρ-S6 Ser235 /236 (1:1000 αραίωση), S6 (1:1000 αραίωση), διασπασμένη κασπάση 3 (1:1000 αραίωση), και διασπασμένη PARP (1:1000 αραίωση) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technologies (Beverly, ΜΑ). β-ακτίνης (1:5000 αραίωση) ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Υπεροξειδάσης AffiniPure Donkey Anti- Κουνέλι Ig δευτερογενούς αντισώματος (1:10,000 αραίωση) λήφθηκε από Jackson ImmunoResearch (West Grove, ΡΑ) [11].

Η ανοσοϊστοχημεία

Πέντε μm τομές ιστών σε παραφίνη ενσωματωμένο αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο ακολουθούμενη από επανυδάτωση αλκοόλ. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη σε 1 × κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6,0) (Zymed) χρησιμοποιώντας ένα Ιατρικό Decloaking τμήμα (Biocare Medical). Τα πλακίδια αποκλείστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με υπεροξειδάση Blocking Reagent (DAKO), η κανονική γαϊδούρι /ορού κουνελιού, και αβιδίνη /βιοτίνη Kit φραγής (Vector Laboratories). Τα πλακίδια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα και 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με δευτερεύον αντίσωμα. Το κιτ Vectastain ABC (Vector Laboratories) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πλακίδια χρωματίστηκαν με το υγρό DAB + υποστρώματος χρωμογόνου συστήματος (Dako) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αντίθετα με διάλυμα αιματοξυλίνης του Mayer και διάλυμα Bluing Scott. ρ-ΑΚΤ Ser473 (1:50 αραίωση), σ-S6 Ser240 /244 (1:50 αραίωση), σ-S6 Ser235 /236 (1:100 αραίωση), ελήφθησαν από την Cell Signaling Technologies (Beverly, ΜΑ). CD31 (1:100 αραίωση) ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). ΚΙ-67 (1:100 αραίωση) λήφθηκε από ΗΠΑ Βιολογική (Swampscott, ΜΑ). TUNEL δοκιμασίας (ApopTag) αγοράστηκε από την Millipore (Billerica, ΜΑ) [11]. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού ΚΙ-67 υπολογίστηκε ως ο μέσος αριθμός των ΚΙ-67 θετικών κυττάρων /συνολικό αριθμό των αδενικών κυττάρων ανά πεδίο υψηλής ισχύος (μέση 16 πεδία υψηλής ισχύος) × 100, και της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD) υπολογίστηκε ως ο αριθμός των CD31 θετικά κύτταρα ανά πεδίο υψηλής ισχύος (μέση τιμή 16 πεδία υψηλής ισχύος). δείκτης θετικότητας ΤυΝΕί υπολογίστηκε ως μέσος αριθμός των TUNEL θετικών κυττάρων /συνολικό αριθμό των αδενικών κυττάρων ανά πεδίο υψηλής ισχύος (μέση τιμή 16 πεδία υψηλής ισχύος) × 100. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν από τρεις τύφλωσε, ανεξάρτητοι παρατηρητές σε τέσσερις ελέγχου και τέσσερις όγκοι αντιμετωπίζονται.

Στατιστικά

Συγκρίσεις τελικό όγκο του όγκου, ΚΙ-67, MVD και αποπτωτικών κυττάρων μεταξύ ελέγχου και NVP- ομάδες BEZ235 αγωγή υπολογίστηκαν με τη χρήση των δύο-ουρά Ανεξάρτητη t-test. Πριν και ΤΠΔ μετά τη θεραπεία οι τιμές συγκρίθηκαν με το Wilcoxon signed-rank test. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική για όλες τις αναλύσεις. Όλες οι αναλύσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας SPSS 18.0 για Windows (IBM, Inc).

Αποτελέσματα

In vitro

NVP-BEZ235 θεραπεία ανθρώπινων κυτταρικών σειρών CRC μειώνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αλλά έχει καμία επίδραση στην απόπτωση

για να εξεταστούν τα αποτελέσματα των

in vitro

θεραπεία NVP-BEZ235 στην κυτταρική βιωσιμότητα, τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC (HCT116, DLD-1, και SW480) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την αύξηση της ποσότητες NVP-BEZ235 για 48 ώρες, και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε από μία χρωματομετρική ανίχνευση MTS. Αυτές οι μελέτες αποκάλυψαν μια παρόμοια εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στη βιωσιμότητα μετά την αγωγή NVP-BEZ235 (μέση IC

50 από τρία ξεχωριστά πειράματα = 14,3 ± 6,4, 9,0 ± 1,5 και 12,0 ± 1,6 ηΜ για HCT116, DLD-1, και SW480 κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα? ρ = 0,74) για όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 1Α). Για να καθοριστεί εάν η παρατηρούμενη μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα μετά τη θεραπεία NVP-BEZ235 προκύψει από επαγωγή της απόπτωσης, ανάλυση στυπώματος western για διασπασμένης κασπάσης-3 και διασπασμένη PARP διεξήχθη, αποκαλύπτοντας καμία αύξηση σε αυτά τα αποπτωτικά δείκτες με θεραπεία NVP-BEZ235 (Σχήμα 1Β ). Λαμβανόμενες μαζί, αυτές οι μελέτες προτείνουν ότι

in vitro

θεραπεία με αποτελέσματα NVP-BEZ235 σε αντίστοιχη μείωση σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε δύο κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν CRC διακριτές

PIK3CA

μεταλλάξεις (HCT116 και DLD-1) καθώς και σε ένα

PIK3CA

άγριου τύπου καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων (SW480), με καμία επίδραση στην απόπτωση.

(Α) κυτταρική βιωσιμότητα των HCT116, DLD-1, και των κυττάρων SW480 CRC γραμμές εκτιμήθηκε με δοκιμασία MTS μετά από θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (0-500 ηΜ) NVP-BEZ235 για 48 ώρες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) ανάλυση Western blot για το p-ΑΚΤ

Thr308, π-ΑΚΤ

Ser473, π-S6

Ser240 /244, σ-S6

Ser235 /236, διασπασμένη κασπάση 3, και διασπασμένη PARP έγινε μετά από 2, 6, 24, και 48 ώρες επώασης με το (-). 0 ή (+) 500 nM NVP-BEZ235

η

In vitro θεραπεία

NVP-BEZ235 της ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC αποτελέσματα υπέστη mTORC1 και mTORC2 αναστολή, αλλά παροδική PI3K αποκλεισμό

για να εξεταστούν τα αποτελέσματα των

in vitro

θεραπεία NVP-BEZ235 σε PI3K (p-ΑΚΤ

Thr308) , mTORC1 (p-S6

Ser235 /236 και ρ-S6

Ser240 /244), και mTORC2 (π-ΑΚΤ

Ser473) σηματοδότησης mTOR, διεξήχθη ανάλυση κηλίδας western. Μετά από δύο ώρες επεξεργασίας NVP-BEZ235, τα επίπεδα της p-ΑΚΤ

Thr308, π-ΑΚΤ

Ser473, π-S6

Ser235 /236, και π-S6

Ser240 /244 ήταν σημαντικά μειώθηκε. Λαμβάνοντας υπόψη ότι μια σταθερή μείωση παρατηρήθηκε στα επίπεδα της p-ΑΚΤ

Ser473, π-S6

Ser235 /236, και π-S6

Ser240 /244, πλήρη αναστολή της p-ΑΚΤ

Thr308 ήταν χάνεται σε μόλις έξι ώρες (Εικόνα 1Β). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι

in vitro

NVP-BEZ235 αποτελέσματα της θεραπείας σε παρατεταμένη αναστολή της mTORC1 και mTORC2 σηματοδότησης, αλλά ότι ο αποκλεισμός της PI3K είναι παροδική.

Η αποτελεσματικότητα του

in vitro επεξεργασία

NVP-BEZ235 των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών CRC δεν εξαρτάται από PIK3CA κατάστασης μεταλλάξεων

Η συγκρίσιμη αποτελεσματικότητα της θεραπείας NVP-BEZ235 στο

PIK3CA

μεταλλαγμένο (HCT116 και DLD-1) και

PIK3CA

άγριου τύπου (SW480) ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC υποδηλώνει ότι η κλινική αποτελεσματικότητα του δεν μπορεί να περιορίζεται σε εκείνους τους ασθενείς των οποίων οι όγκοι περιέχουν ενεργοποίηση

PIK3CA

μεταλλάξεις. Να εξετάσει περαιτέρω τη δυνατότητα αυτή, εκτιμήσαμε την επίδραση των ΚΠΑ-BEZ235 σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ενδοκυτταρική σηματοδότηση των κυττάρων σε ζεύγη

PIK3CA

κυτταρικές σειρές μεταλλαγμένες και άγριου τύπου. Η

PIK3CA

μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά προήλθε από DLD-1 μέσω διακοπής του άγριου τύπου

PIK3CA

αλληλόμορφο από στοχευμένες ομόλογο ανασυνδυασμό, ενώ η

PIK3CA

κυττάρων άγριου τύπου γραμμή προήλθε μέσω διάσπαση του μεταλλαγμένου

PIK3CA

αλληλόμορφο (ένα ευγενές δώρο από τον Β Vogelstein) [7]. Ως εκ τούτου, η γενετική σύνθεση αυτών των κυττάρων διαφέρει μόνο στο

PIK3CA

τόπο, καθιστώντας αυτά τα άλλα τέλεια ισογονιδιακές ελέγχους. Βρήκαμε παρόμοια του IC50 για NVP-BEZ235 τόσο

PIK3CA

DLD-1 κύτταρα μεταλλαγμένων και άγριου τύπου (μέση τιμή IC

50 από τρία ξεχωριστά πειράματα = 15.1 ± 6.0 και 12.1 ± 4.3 nM για DLD-1

PIK3CA

κυτταρικές σειρές μεταλλαγμένης και άγριου τύπου, αντίστοιχα? ρ = 0,82, Σχήμα 2Α). Η ανάλυση στυπώματος Western των ρ-ΑΚΤ και ρ-S6 αποκάλυψε υπέστη αναστολή της ρ-ΑΚΤ

Ser473, ρ-S6

Ser235 /236, και ρ-S6

Ser240 /244? Ωστόσο, η αναστολή της ρ-ΑΚΤ

Thr308 ήταν παροδική στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, η θεραπεία NVP-BEZ235 δεν αύξησε τα επίπεδα της διασπασμένη κασπάση-3 και διασπασμένη PARP είτε κυτταρική γραμμή (Σχήμα 2Β). Συνολικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι

PIK3CA

κατάστασης μεταλλάξεων δεν προβλέπουν την αποτελεσματικότητα της θεραπείας NVP-BEZ235 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC.

(Α) Κυτταρική βιωσιμότητα των μεταλλαγμένων και άγριου τύπου ισογονιδιακές

PIK3CA

κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία MTS μετά από θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (0-500 ηΜ) NVP-BEZ235 για 48 ώρες. Τα αποτελέσματα που δεικνύονται είναι ο μέσος όρος τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) ανάλυση Western blot για το p-ΑΚΤ

Thr308, π-ΑΚΤ

Ser473, π-S6

Ser240 /244, σ-S6

Ser235 /236, διασπασμένη κασπάση 3, και διασπασμένη PARP έγινε μετά από 2, 6, 24, και 48 ώρες επώασης με το (-). 0 ή (+) 500 nM NVP-BEZ235

η

Σε επάγει θεραπεία vivo

NVP-BEZ235 υποχώρηση του όγκου σε ένα μοντέλο GEM για σποραδικές PIK3CA άγριου τύπου CRC

για να εξεταστούν τα αποτελέσματα των

in vivo

θεραπεία NVP-BEZ235 σε παχέος ανάπτυξη του όγκου, χρησιμοποιήσαμε ένα νέο μοντέλο GEM για σποραδικές CRC ότι έχουμε περιγράψει πρόσφατα [11]. Αδενοϊό που εκφράζει Cre ανασυνδυάση (αδενο-Cre) χρησιμοποιήθηκε για την επαγωγή του κόλου νεοπλάσματα σε floxed

Αρο

ποντίκια. Οι όγκοι από 10 ποντίκια αναλύθηκαν για την παρουσία μεταλλάξεων ενεργοποίησης με άμεση αλληλούχιση των εξονίων 9 και 20 του

PIK3CA

γονίδιο. Δεν μεταλλάξεις εντοπίστηκαν, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα ποντίκια είναι αντιπροσωπευτικό του

PIK3CA

άγριου τύπου CRC. Οπτική κολονοσκόπηση χρησιμοποιήθηκε για τυχαίο θεραπεία του ιδίου μεγέθους του κόλου όγκους με όχημα φάρμακο ελέγχου ή 45 mg /kg NVP-BEZ235 με ημερήσιες από του στόματος καθετηριασμό για 28 ημέρες. Σημειώσαμε δεν προκαλεί τοξικότητα ή πλευρά κατά τη διάρκεια αυτού του σχήματος φαρμακευτική αγωγή. Μεταγενέστερες διαμήκη ανάπτυξη ή υποχώρηση των μεμονωμένων κολονικής όγκων προσδιορίσθηκε με οπτική κολονοσκόπηση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Για κάθε όγκου, ένας συγγενής του όγκου Μέγεθος Index (ΤΠΔ) μετρικό υπολογίστηκε ως το μέγεθος του όγκου (Τ) κανονικοποιημένη σε παχέος αυλού περιοχή (L) (Εικόνα 3Α).

Ποντίκια με όγκους του παχέος εντέρου τυχαιοποιήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο αραιωτικό (Ν = 8) ή 45 mg /kg NVP-BEZ235 (Ν = 8) με ημερήσια από του στόματος καθετηριασμό για 28 ημέρες. Με αποτέλεσμα του παχέος ανάπτυξη του όγκου ή παλινδρόμηση σειριακά εξετάστηκε με οπτική κολονοσκόπηση. (Α) Tumor Μέγεθος Index (ΤΠΔ) υπολογίστηκε ως περιοχή του όγκου (Τ) διαιρούμενο με Lumen Χώρου (L) × 100. (Β) Εκπρόσωπος κολονοσκόπηση όγκου ακίνητες εικόνες κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας 28 ημερών. (Γ) Το μέγεθος του όγκου ελέγχου και NVP-BEZ235 αγωγή όγκων κατά τη νεκροψία (μέσος όρος 65 χιλιοστά

3 έναντι 5 mm

3? P = 0.01). (Δ) Τελική ΤΠΔ εναντίον του όγκου Όγκος (R

2 = 0,89, P & lt? 0,0001). Μεταβολή της μέσης TSI για το (Ε) έλεγχος (προ-θεραπεία έναντι 57% μετά την αγωγή 32%, Ρ = 0,01) και (F) που έλαβαν θεραπεία (32% έναντι 20%, Ρ = 0,02) ομάδες.

Ένα αντιπροσωπευτικό χρονική πορεία της κολονοσκόπησης εικόνων για τον έλεγχο (η = 8) και NVP-BEZ235 αγωγή όγκων (n = 8) δείχνεται στο Σχήμα 3Β. όγκος του όγκου κατά τη νεκροψία ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε έλεγχο εναντίον ομάδες αντιμετωπίζονται (65 mm

3 έναντι 5 mm

3? p = 0,01? Σχήμα 3C). Σύμφωνα με προηγούμενες αναλύσεις μας [11], το τελικό TSI και στις δύο ομάδες θεραπείας συσχετίζεται θετικά με τον όγκο του όγκου κατά τη νεκροψία (R

2 = 0.89, ρ = 0.0001? Σχήμα 3D). Η μέση TSI στην ομάδα ελέγχου αυξήθηκε σημαντικά κατά την περίοδο της θεραπείας (32% έναντι προ-θεραπεία 57% μετά την αγωγή, ρ = 0,01? Σχήμα 3Ε), ενώ ότι στην κοόρτη NVP-BEZ235 μειώθηκε σημαντικά (36% vs. 20%, ρ = 0,008? Σχήμα 3F). Κάθε όγκος στην ομάδα ελέγχου αυξηθεί σε μέγεθος? αντιμετωπίζονται οι όγκοι μειώθηκαν όλες σε μέγεθος. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι

in vivo

θεραπεία με NVP-BEZ235 αποτέλεσμα σημαντική οπισθοδρόμηση σε

PIK3CA

άγριου τύπου του παχέος όγκους.

In vivo

θεραπεία NVP-BEZ235 ενός μοντέλου GEM για σποραδικές αποτελέσματα CRC σε διαρκή mTORC1 και mTORC2 αναστολή, αλλά παροδική PI3K αποκλεισμό

για να εξεταστούν τα αποτελέσματα των

in vivo θεραπεία

NVP-BEZ235 σε PI3K και σηματοδότηση mTOR, ανάλυση κηλίδας western πραγματοποιήθηκε σε κολονικό όγκους που συλλέχθηκαν μία ώρα μετά την τελική χορήγηση της δόσης του φαρμάκου τις ημέρες 5 και 28 της θεραπείας. Η ανάλυση στυπώματος Western για τα επίπεδα του p-ΑΚΤ

Thr308, ρ-S6

Ser240 /244, και ρ-ΑΚΤ

Ser473 διεξήχθη όπως υποκατάστατα για την ενεργοποίηση των οδών ΡΙ3Κ, mTORC1, και mTORC2, αντίστοιχα. Μια διαρκής μείωση στα επίπεδα του p-ΑΚΤ

Ser473 και ρ-S6

Ser240 /244 παρατηρήθηκε στους όγκους των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με NVP-BEZ235, σε σύγκριση με διαλύτη ελέγχου (Σχήμα 4Α και 4Β). Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν με ανοσοϊστοχημεία όγκου (Σχήμα 4C). Όπως με το

in vitro

μελέτες μας, μία αρχική μείωση στα επίπεδα του p-ΑΚΤ

Thr308 παρατηρήθηκε σε πέντε ημέρες μετά την θεραπεία, αλλά κανονικοποιήθηκαν από 28 ημέρες (Σχήματα 4Α και 4Β). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι

in vivo

NVP-BEZ235 αποτελέσματα της θεραπείας σε παρατεταμένη αναστολή mTORC1 και mTORC2, αλλά παροδικό αποκλεισμό PI3K.

Ποντίκια με όγκους του παχέος εντέρου τυχαιοποιήθηκαν σε αγωγή με αραιωτικό ελέγχου ή 45 mg /kg NVP-BEZ235 με ημερήσιες από του στόματος καθετηριασμό για πέντε ημέρες. Η ανάλυση στυπώματος Western των ρ-ΑΚΤ

Thr308, ρ-ΑΚΤ

Ser473, και ρ-S6

Ser240 /244 διεξήχθη για όγκους που έλαβαν θεραπεία με (-) αραιωτικό ελέγχου ή (+) NVP-BEZ235 για ( Α) πέντε και (Β) 28 ημέρες. (Γ) Ανοσοϊστοχημεία ρ-ΑΚΤ

Ser473, ρ-S6

Ser240 /244, και ρ-S6

Ser235 /236 διεξήχθη για όγκους που έλαβαν θεραπεία με αραιωτικό ελέγχου ή NVP-BEZ235 για 28 ημέρες.

In vivo

NVP-BEZ235 επεξεργασία ενός μοντέλου GEM για σποραδικές CRC αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, δεν έχει καμία επίδραση στην απόπτωση και την αγγειογένεση τμήματα του όγκου

για να εξεταστούν τα αποτελέσματα του

in vivo

θεραπεία NVP-BEZ235 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, του παχέος όγκοι εξετάστηκαν με ανοσοϊστοχημεία για τον δείκτη πολλαπλασιασμού ΚΙ-67. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι ο πολλαπλασιασμός μειώθηκε κατά 56% μετά από 28 ημέρες θεραπείας NVP-BEZ235 (ρ = 0,003, Σχήμα 5Α). Για να αξιολογηθεί η επίδραση της θεραπείας NVP-BEZ235 στην κυτταρική απόπτωση, κολικά καρκινώματα εξετάστηκαν με προσδιορισμό TUNEL. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των όγκων που έλαβαν θεραπεία με αραιωτικό ελέγχου και NVP-BEZ235 (p = 0,9, Σχήμα 5Β). Δεδομένου ότι οι οδοί PI3K και mTOR παίζουν σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση του όγκου [54], [55], εξετάσαμε τις επιδράσεις της θεραπείας NVP-BEZ235 σε μικροαγγειακή πυκνότητα (MVD) μέσω ανοσοϊστοχημεία για το CD31 ενδοθηλιακά δείκτη. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι MVD μειώθηκε κατά 75% μετά από 28 ημέρες θεραπείας NVP-BEZ235 (ρ = 0,013, Σχήμα 5C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το

in vivo

θεραπεία με NVP-BEZ235 οδηγεί σε σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού του όγκου, δεν επάγει κυτταρική απόπτωση, και αναστέλλει την αγγειογένεση των όγκων.

(Α) Αντιπροσωπευτική ανοσοϊστοχημεία για τον δείκτη πολλαπλασιασμού ΚΙ-67 μετά από επεξεργασία με αραιωτικό ελέγχου ή NVP-BEZ2355 για 28 ημέρες (ρ = 0,003). δείκτης πολλαπλασιασμού ΚΙ-67 υπολογίστηκε ως μέσος αριθμός θετικών καρκινικών κυττάρων ανά πεδίο υψηλής ισχύος. (Β) TUNEL ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σε όγκους υπέστησαν αγωγή με διαλύτη ελέγχου ή NVP-BEZ235 για 28 ημέρες (ρ = 0.9). χρώση TUNEL ήταν ποσοτικά ως επί τοις εκατό θετικά κύτταρα ανά υψηλής ισχύος πεδίου. (C) Αντιπροσωπευτική ανοσοϊστοχημεία για τον δείκτη ενδοθηλιακού PECAM μετά την αγωγή με αραιωτικό έλεγχο ή 45 mg /kg NVP-BEZ2355 (p = 0.013). μικροαγγειακή πυκνότητα υπολογίστηκε ως ο μέσος αριθμός των θετικών σκαφών ανά πεδίο υψηλής ισχύος.

Η

Συζήτηση

Λόγω του κεντρικού ρόλου τους στην έναρξη και την εξέλιξη της CRC, αποκλεισμός του mTOR και PI3K μονοπάτια σηματοδότησης έχει αναδειχθεί ως ένα συναρπαστικό στόχο για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών CRC [10], [56] – [59]. Εμείς και άλλοι έχουν αποδείξει την αποτελεσματικότητα της mTORC1 αναστολής οδού σε προκλινικά μοντέλα CRC [11], [12]. Ωστόσο, ένα πρώιμο κλινική δοκιμή εξέταση αναστολέων mTORC1 σε ανθρώπους ασθενείς με CRC αποδειχθεί μέτρια αποτελέσματα, ίσως λόγω της απώλειας ενός mTORC1 εξαρτώμενη βρόχο ανάδρασης που περιορίζει την ενεργοποίηση ΡΙ3Κ και /ή συνέχιση της mTORC2 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΑΚΤ [3], [60]. Στο σύνολό τους, φαίνεται dual /αναστολείς mTOR PI3K, όπως NVP-BEZ235, που απαιτούνται για τη μέγιστη θεραπευτική αποτελεσματικότητα.

Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι

PIK3CA

μεταλλαγμένο καρκίνων «ογκογονικώς εθισμένοι» στο σηματοδότηση ΡΙ3Κ, οδηγώντας σε αυξημένη ευαισθησία σε θεραπεία με αναστολέα ΡΙ3Κ [7], [61], [62]. Ωστόσο, μία ομάδα έχει αναφερθεί καμία συσχέτιση μεταξύ της

PIK3CA

κατάστασης μεταλλάξεων και η ανταπόκριση σε αναστολείς PI3K [63]. Παρ ‘όλα αυτά, μια άλλη ομάδα έχει αναφερθεί αποκλειστικά στόχευση

PIK3CA

μεταλλαγμένο ασθενείς για θεραπεία PI3K /mTOR [64]. Ως

Οι PIK3CA

μεταλλάξεις δει μόνο το 17% του ανθρώπινου CRC, η προσέγγιση αυτή θα περιορίσει σημαντικά την κλινική επίπτωση αυτών των παραγόντων [53]. Επειδή NVP-BEZ235 αναστέλλει επίσης τις μορφές μεταλλαγμένων και άγριου τύπου του

PIK3CA

, υποθέσαμε ότι NVP-BEZ235 θα έχουν σημαντική αποτελεσματικότητα στην ανθρώπινη άγριου τύπου

PIK3CA

CRC [32]. Προς υποστήριξη αυτού, βρήκαμε συγκρίσιμη ευαισθησία στο

in vitro

θεραπεία NVP-BEZ235 στο

PIK3CA

μεταλλαγμένο (HCT116, κινάση μετάλλαξη τομέα? DLD-1, ελικοειδή μετάλλαξη τομέα) και

PIK3CA

άγριου τύπου (SW480) CRC κυτταρικές σειρές, καθώς επίσης και σε συμφωνημένα

PIK3CA

μεταλλάξεως και αγρίου-τύπου ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές. Άμεση αλληλούχιση των περιοχών hot spot σε εξώνια 9 και 20 του

PIK3CA

στις παχέος όγκους επικυρωμένο μοντέλο GEM μας ως υποκατάστατο για

άγριου τύπου PIK3CA

CRC, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί σε μας

in vivo μελέτες θεραπείας

NVP-BEZ235. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η θεραπεία NVP-BEZ235 μπορεί να έχουν κλινικό όφελος στο 83% των ασθενών CRC με άγριου τύπου

PIK3CA

. Για την περαιτέρω αξιολόγηση αυτής της δυνατότητας, επιδιώξαμε να εξετάσει κατά πόσον NVP-BEZ235 θα είναι αποτελεσματικό σε ένα μοντέλο GEM για σποραδικές

άγριου τύπου PIK3CA

CRC.

Παραδοσιακά

in vivo

προσεγγίσεις επικύρωση στόχο βασίζονται σε πλατφόρμες ξένου μοσχεύματος. Δυστυχώς, αυτά τα μοντέλα δεν είναι πραγματικά προγνωστικά απόκρισης σε ασθενείς ανθρώπους, επειδή προέρχονται από κυτταρικές γραμμές όγκου υψηλής διαβιβάσεως αναπτύχθηκαν

in vitro

. Αυτές οι κυτταρικές σειρές εμφυτεύτηκαν σε έκτοπες θέσεις που δεν μοιάζουν με το παχέος μικροπεριβάλλον, και ως εκ τούτου αδυνατούν να ανακεφαλαιώσω την ετερογενή φύση του καρκίνου και τη στήριξη του στρώματος του [65]. Αν και GEM μοντέλα καρκίνου του αντιμετωπιστούν αυτά τα προβλήματα, τα περισσότερα μοντέλα GEM απασχολούν βλαστικής σειράς ή ιστού σε επίπεδο τροποποίηση των γονιδίων που είναι γνωστό ότι μεταλλάσσεται στο ανθρώπινο CRC. Επιπλέον, πολλά μοντέλα CRC GEM κυρίως παρόν με μικρό εντερικό όγκους [66]. Για να μοντελοποιήσουμε με ακρίβεια την ανθρώπινη σποραδικές CRC, έχουμε περιγράψει πρόσφατα μια διαδικασία κατά την οποία αδενο-Cre χορηγείται σε floxed ποντίκια για να αδρανοποιήσει σωματικά το

Αρο

γονιδίου σε ένα στοχαστικό τρόπο και να περιορίσει το σχηματισμό όγκων στο περιφερικό παχύ έντερο. Η επαναλήψιμη ανατομική τοποθεσία αυτών των όγκων επιτρέπει τη χρήση οπτικών κολονοσκόπησης να εξετάζει μεμονωμένες όγκους σε μία διαμήκη τρόπο [11].

Για να εξεταστεί η αποτελεσματικότητα του

in vivo

θεραπεία NVP-BEZ235, εμείς χρησιμοποιείται το μοντέλο GEM μας για σποραδικές CRC. Στις μελέτες μας, υπήρχε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των τελικών μεγεθών του όγκου αξιολογήθηκε από την κολονοσκόπηση έναντι νεκροψία (R

2 = 0,89), την επικύρωση έτσι κολονοσκόπηση με βάση το πρωτόκολλο του μεγέθους του όγκου μας. Σύμφωνα με μας

in vitro

θεραπεία NVP-BEZ235 των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών CRC, του παχέος όγκους από το μοντέλο GEM μειώθηκαν κατά 43% σε μέγεθος μετά

in vivo

θεραπεία με NVP-BEZ235, ενώ όγκους ελέγχου αυξήθηκε σε μέγεθος κατά 97% (p & lt? 0,0001). Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί με άλλο αναστολέα της διπλής PI3K /mTOR, PKI-587, σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος του CRC [67].