Αφηρημένο

Η συστηματική θεραπεία των ασθενών με καρκίνους σε πρώιμα στάδια προσπάθειες για την εξάλειψη της απόκρυφης μεταστατική νόσο για την πρόληψη της υποτροπής και αυξημένη νοσηρότητα. Ωστόσο, η πρόβλεψη υποτροπής από την ανάλυση του πρωτογενούς όγκου περιορίζεται επειδή διαδίδονται καρκινικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μικρό υποσύνολο του πρωτογενούς βλάβης. Εδώ αναλύουμε την έκφραση των κυκλοφορούντων microRNAs (Mirs) σε ορό που ελήφθη προ-χειρουργικά από ασθενείς με καρκίνους του παχέος πρώιμο στάδιο. Ομάδες των πέντε ασθενείς με και χωρίς υποτροπή της νόσου είχαν χρησιμοποιηθεί για να προσδιορίσει ένα ενημερωτικό πίνακα των κυκλοφορούντων Mirs χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR του γονιδιώματος-ευρεία έκφραση του miR, καθώς και μια σειρά δημοσιευμένων υποψηφίου Mirs. Μια ομάδα έξι ενημερωτικών Mirs (miR-15a, mir-103, miR-148a, miR-320a, miR-451, miR-596) προήλθε από την ανάλυση αυτή και αξιολογήθηκε σε μια ξεχωριστή ομάδα επικύρωσης των τριάντα ασθενείς. Ιεραρχική συσταδοποίηση των επιπέδων έκφρασης αυτών των έξι κυκλοφορούντων Mirs και ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι ο κίνδυνος υποτροπής της νόσου του καρκίνου πρώιμο στάδιο του παχέος εντέρου μπορεί να προβλεφθεί από την παρούσα ομάδα Mirs που είναι μετρήσιμες στην κυκλοφορία κατά το χρόνο της διάγνωσης (Ρ = . 0,0026? Αναλογία κινδύνου 5.4? 95% CI 1,9 έως 15)

Παράθεση: Shivapurkar Ν, Weiner LM, Marshall JL, Madhavan S, Deslattes Mays Α, Juhl H, et al. (2014) Επανεμφάνιση του Early Stage καρκίνου του παχέος εντέρου προβλέπεται από Έκφραση μοτίβο του κυκλοφορούντος microRNAs. PLoS ONE 9 (1): e84686. doi: 10.1371 /journal.pone.0084686

Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Αυγούστου του 2013? Αποδεκτές: 18 Νοέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 του Ιανουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Shivapurkar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από ΝΙΗ επιχορηγήσεις CA108440 (AW), Ρ30 CA051008 (LW), HHSN2612200800001E (SM), ο Lombardi Cancer Center (NS) και το Ruesch Κέντρο (NS, JLM, SM, και AW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ένας από τους συγγραφείς (Δρ Juhl) είναι affiliatiated Indivumed, GmbH. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και των υλικών και δεν παρέχει μια σύγκρουση συμφερόντων.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη κορυφαία αιτία θνησιμότητας καρκίνου που επηρεάζει άνδρες και γυναίκες εξίσου. Σε όλο τον κόσμο αντιπροσωπεύει περίπου το ένα εκατομμύριο νέων κρουσμάτων καρκίνου και το μισό εκατομμύριο θανάτους που αντιπροσωπεύουν το 10 τοις εκατό των θανάτων από καρκίνο [1]. Τα αποτελέσματα για τους ασθενείς με πρώιμου σταδίου CRC είναι ετερογενείς, με ποσοστά επιβίωσης συγκεκριμένες νόσους 5 ετών για ασθενείς με στάδιο ΙΙ του 72-88% και 40-71% για το στάδιο ΙΙΙ [2]. Οι περισσότεροι ασθενείς με νόσο σταδίου ΙΙ θεραπευτεί μόνο με χειρουργική επέμβαση, ενώ επιπλέον η χημειοθεραπεία μπορεί να προσφέρει οφέλη επιβίωσης σε ασθενείς με μεταγενέστερο στάδιο της νόσου. Παρόλα αυτά, περίπου 1 στους 4 ασθενείς με νόσο πρώιμο στάδιο θα υποφέρουν από την επανάληψη και βιοδείκτες που τον εντοπισμό ασθενών υψηλού κινδύνου κατά τη στιγμή της αρχικής διάγνωσης και της χειρουργικής θα επιτρέψει να επιλέξετε εκείνους τους ασθενείς για τη στενότερη παρακολούθηση και ενδεχομένως συστηματικές θεραπείες ([3], [ ,,,0],4], [5]?. αναθεωρηθεί πρόσφατα [6])

microRNAs (miRNAs ή Mirs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης RNAs που παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο των δραστηριοτήτων των κυτταρικών μονοπατιών τόσο στη φυσιολογία και παθολογία (βλέπε π.χ. [7]). Η διακριτή λειτουργία του Mirs σε διαφορετικές καρκίνους έχει γίνει πιο εμφανής κατά τα τελευταία χρόνια [8], [9], και πολλές μελέτες δείχνουν ότι miR υπογραφές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση διαφορετικών καρκίνων [10], [11], [12], [13], οι προγνώσεις [14], [15], αποκαλύπτουν δυνητικούς στόχους [16], αλλοιωμένη μονοπατιών σηματοδότησης [17], ή κακοήθη εξέλιξη από in situ καρκίνωμα να διεισδυτική νόσο [18]. Οι περισσότεροι ήταν αναμενόμενο, η σύγκριση των miR και mRNA προφίλ των πρωτογενών και μεταστατικών βλαβών του καρκίνου έδειξαν ότι Mirs παρέχουν μια πιο αξιόπιστη και χαρακτηριστική υπογραφή από τα mRNA και διαπίστωσαν ότι το miR υπογραφές ήταν ανώτερη από mRNAs στον εντοπισμό της πηγής των οργάνων των μεταστάσεων άγνωστης προέλευσης [19] , [20]. Μια προηγούμενη μελέτη [21] με τη χρήση προφίλ έκφρασης των 315 Mirs σε ιστούς από το στάδιο ΙΙ καρκίνων του παχέος εντέρου έδειξε διαφορές στα πρότυπα για υποτροπιάζουσα νόσο. Τα επίπεδα έκφρασης των ειδικών Mirs στους ιστούς συσχετίζονται με την πιθανότητα επιβίωσης χωρίς υποτροπή από πολυπαραγοντική ανάλυση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι διαταράσσονται έκφραση Mirs σε καρκίνο του παχέος εντέρου μπορεί να έχει μια προγνωστική δυναμικό.

Πέρα από αυτές τις αναλύσεις των φυσιολογικών και νοσούντων ιστών, πιο πρόσφατες αναφορές έχουν δείξει ότι τα είδη miR μπορεί να ανιχνευθεί στην κυκλοφορία [22] και ακόμη και πρότεινε ότι η ανάλυση των δειγμάτων ορού για ορίζεται Mirs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό ασθενών με καρκίνο [23], [24], [25], [26]. Μελέτες του αίματος που μεταδίδονται miRome έδειξε επίσης εφαρμογή σε άλλες ασθένειες εκτός του καρκίνου ([27]? Αναθεωρηθούν [28], [29]). Mirs στην κυκλοφορία φαίνεται να είναι αξιοσημείωτα σταθερή [30], [31] και προτάθηκε ότι η σταθερότητα μπορεί να αποδοθεί σε Mirs να περιλαμβάνονται στην κυστίδια λιποπρωτεϊνών, που είναι γνωστή ως εξωσώματα [32]. Εδώ, μελετήσαμε Mirs σε δείγματα αίματος που λήφθηκαν προ-χειρουργικά από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου πρώιμο στάδιο που παρέμειναν χωρίς υποτροπή ή είχαν υποτροπή της νόσου. Υποθέσαμε ότι η τροποποιημένη μορφή των κυκλοφορούντων Mirs μπορεί να υποδεικνύουν αυξημένο κίνδυνο υποτροπής της νόσου οφείλεται στην αποκρυφιστική μεταστατικό σπόρους κατά τη στιγμή της αρχικής διάγνωσης. Αναφέρουμε ότι ένα σύνολο έξι Mirs μπορεί να είναι χρήσιμη στην πρόβλεψη της επανεμφάνισης της νόσου κίνδυνο για καρκίνο του παχέος εντέρου πρώιμο στάδιο.

Αποτελέσματα

Κυκλοφορούν έκφραση microRNA Σύγκριση χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση υποψήφιου γονιδίου

για τη μέτρηση Mirs στην κυκλοφορία, ιδρύσαμε ποσοτική RT-PCR [33] ως μια μέθοδος ανίχνευσης με ένα δυναμικό εύρος μέχρι και 10

6-φορές για Mirs σε δείγματα ορού [18]. Ως αρχική προσέγγιση, πήραμε ένα πάνελ δεκαέξι Mirs που είχε δειχθεί ότι εκφράζεται διαφορικά μεταξύ καρκίνου του παχέος εντέρου και των φυσιολογικών ιστών κόλον [21], [34], [35]. Αρχικά έτρεξε μια πιλοτική μελέτη και αναλύονται μια σειρά από δείγματα ορού από ασθενείς με καρκίνο πρώιμο στάδιο του παχέος εντέρου που παρέμεινε ελεύθερη νόσου (n = 5) ή είχαν υποτροπή της νόσου (n = 5), μέσα σε ένα μέσο όρο των 26 μηνών (& lt? 0,05 vs. δεν θα επαναληφθούν? Σχ. 1Α, Β). Σύκο. 2Α δείχνει την περίπου 100.000 φορές εύρος συγκέντρωσης των δεκαέξι κυκλοφορούν Mirs αναλύονται στην πιλοτική μελέτη. Παρατηρήσαμε τις αναμενόμενες τάσεις της αντίστοιχης πάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση σε ορισμένες από τις επιλεγμένες Mirs (δηλαδή miR-20, miR-135b, miR-195, miR-320, miR-615). Ωστόσο, οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (Σχ. 2Β). Είναι αξιοσημείωτο ότι miR-320 ήταν ένα από τα δύο Mirs που έδειξε μια ρύθμιση προς τα κάτω σε ιστούς που συσχετίστηκε με κακή επιβίωση χωρίς υποτροπή [21]. Εδώ, miR-320 στη κυκλοφορία ήταν περίπου δύο φορές χαμηλότερη σε ασθενείς με υποτροπή της νόσου, αν και αυτό μειορρύθμιση δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Εικ. 2Β). Η έκφραση του miR-498, το άλλο miR από τη μελέτη στο Ref. [21], ανιχνεύθηκε μόνο σε πολύ χαμηλά επίπεδα στην κυκλοφορία και, επομένως, δεν είναι κατάλληλο για την ανάλυση.

Α, από πιλοτική μελέτη με 10 ασθενείς υποψήφιο Mirs προγνωστική της υποτροπής της νόσου εντοπίστηκαν και ελέγχθηκαν για την πρόβλεψη τους υποτροπής της νόσου σε μια μελέτη επικύρωσης. Β, Kaplan-Meier οικόπεδο υποτροπής της νόσου σε ασθενείς στην πιλοτική μελέτη. Ασθενείς με υποτροπή της νόσου (n = 5) vs καμία υποτροπή (n = 5): Chi τετράγωνο 5.47, ρ = 0.0193? διάμεσος χρόνος μέχρι την υποτροπή = 26 μήνες. χρησιμοποιήθηκαν οι αλγόριθμοι Gehan-Breslow-Wilcoxon.

Η

Οι υποψήφιες προσέγγιση miR. Τα κυκλοφορούντα επίπεδα του 16 Mirs αναγράφεται στον άξονα χ που είχαν δημοσιευτεί ως διαφορικά εκφραζόμενα μεταξύ καρκίνου του παχέος εντέρου και μη κακοήθεις ιστοί κόλου αναλύθηκαν [21], [34], [35]. δείγματα ορού προ-χειρουργική ήταν από ασθενείς στην πιλοτική μελέτη. Οι ασθενείς είχαν ακολουθηθεί για υποτροπή της νόσου και τα αντίστοιχα δεδομένα είναι στο σχήμα. 1Β. Α, Συγκέντρωση των κυκλοφορούντων Mirs (σε σχέση με U6). Σημειώστε το log-κλίμακας που καλύπτει ένα φάσμα από 100.000 φορές. Β, η αναλογία της έκφρασης μεταξύ των ομάδων ασθενών. Alhough miR-20, miR-195 και miR-320 έδειξε μια ≥2 φορές μειορύθμιση, και miR-135b και miR-615 α ≥2 φορές προς τα πάνω ρύθμιση σε ορό από ασθενείς με υποτροπή της νόσου, καμία από τις συγκρίσεις που επιτεύχθηκε στατιστική σημαντικότητα από ANOVA (p & gt? 0,05).

η

Κυκλοφορούν έκφραση microRNA Σύγκριση χρησιμοποιώντας μια αμερόληπτη, Γονιδιώματος ολόκληρη Ανάλυση

από τα παραπάνω πιλοτική μελέτη επιλέξαμε δύο δείγματα ασθενών από την ελεύθερη υποτροπής ( Nrec) και επανάληψης (Rec) ομάδα για μια αμερόληπτη γονιδίωμα-ευρεία ανάλυση miR. Διαλέξαμε ασθενείς από τα παραπάνω πιλοτική μελέτη που είχε δείξει το πιο διαφορική έκφραση των υποψηφίων Mirs. Εμείς αιτιολογημένη ότι η σύγκριση σε ένα τέτοιο ζεύγος δείγματος θα μπορούσαν να προσφέρουν μια μεγαλύτερη πιθανότητα να πάρει υποτροπής ειδικά Mirs. Αναλύσαμε αυτό το ζευγάρι των δειγμάτων των ασθενών που χρησιμοποιούν συστοιχίες SYBR Green qPCR με βάση το γονιδίωμα-ευρεία miR έκφρασης για 760 Mirs συσταθεί στο εργαστήριό μας, χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα αντιδραστήρια (SBI, Θέα στο βουνό CA). Το αντίστοιχο αποτέλεσμα για την κορυφή 70 Mirs φαίνεται στο Σχ. 3 ως Heatmap. Για μια ανεξάρτητη μελέτη επικύρωσης που επιλέγεται από αυτόν τον πίνακα έξι Mirs που πληρούν δύο κριτήρια: (1) επαρκή επίπεδα έκφρασης σε δείγματα ορού, δηλαδή RT-PCR Ct τιμές ≤32 και (2) η διαφορική έκφραση (& gt? 3 φορές σε απότομη ανωφέρεια ή προς τα κάτω ρύθμιση) ενός δεδομένου δείγματα miR σύγκριση Rec και Nrec.

Η θερμότητα χάρτη της ανάλυσης έκφραση microRNA γονιδίωμα-ευρεία χρήση ποσοτικής RT-PCR. Δύο ασθενείς επιλέχθηκαν από την πιλοτική μελέτη (βλέπε Εικ. 1 και 2). Η ανάλυση της έκφρασης miRNA διεξήχθη για 760 miRNAs χρησιμοποιώντας ανάλυση έκφρασης qPCR με βάση. διήθηση και ανάλυση δεδομένων διεξήχθησαν και οι 70 Mirs που δείχνουν τη μεγαλύτερη διαφορική έκφραση που εκπροσωπούνται στο χάρτη θερμότητας.

Η

Επικύρωση των κυκλοφορούντων προτύπων έκφρασης microRNA ως Predictor της νόσου Επανεμφάνιση

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον οι κυκλοφορούν Mirs προσδιορίζονται στην παραπάνω πιλοτική μελέτη μπορεί να προβλέψει την υποτροπή της νόσου σε ασθενείς χαμηλού κινδύνου, χρησιμοποιήσαμε μια ξεχωριστή, ανεξάρτητη ομάδα τριάντα ασθενείς με πρώιμο στάδιο καρκίνου του παχέος εντέρου με γνωστά αποτελέσματα. Δεκαπέντε από αυτούς τους ασθενείς είχαν υποτροπή της νόσου κατά μέσο όρο 25 μήνες ενώ η άλλη δεκαπέντε παρέμεινε χωρίς υποτροπή. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών σε αυτή επικύρωσης που κατά το χρόνο της αρχικής τους διάγνωση παρέχεται στον Πίνακα 1. Κατά τη στιγμή της διάγνωσης οι δύο ομάδες ασθενών με και χωρίς υποτροπή της νόσου δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές σε σχέση με την ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου , το στάδιο του όγκου, τη θέση του πρωτογενούς βλάβης ή ιστοπαθολογία (Πίνακας 1) τους. Όλοι οι ασθενείς είχαν αρνητικούς λεμφαδένες ασθένεια και περισσότερα από δώδεκα λεμφαδένες που εξετάστηκαν κόμβους. Μόνο ένας ασθενής (στο μη-επανάληψης ομάδα) ήταν ένα Τ4, όλοι οι άλλοι ήταν Τ1 έως Τ3 όγκους και έτσι με χαμηλό γνωστό κίνδυνο υποτροπής.

Η

Η έκφραση των έξι Mirs παράγωγες προσδιορίζονται στην πιλοτική μελέτη μετρήθηκε με qRT-PCR και τα προκύπτοντα δεδομένα παρουσιάζονται ως πρώτες τιμές Ct καθώς και ένα εύρος συγκεντρώσεων στο Σχ. 4Α (αριστερά και δεξιά άξονες αντίστοιχα). Η συγκέντρωση των έξη επιλεγμένων Mirs στην κυκλοφορία καλύπτει ένα εύρος περίπου 1.000 φορές, και έτσι μια 100-φορές στενότερο εύρος από τις Mirs παρακολουθούνται στην πιλοτική μελέτη (σύγκρινε Σχ. 4Α και 2Α). Μια ανάλυση συσχέτισης των δεδομένων έδειξε μια ισχυρή συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης του miR-15a, miR-148a, miR-320a και miR-451 (r = 0,746 – 0,897? P & lt? 0,0001), ενώ τα επίπεδα του miR-103 και ΜΙΚ 596 δεν συσχετίστηκαν με τα επίπεδα των άλλων Mirs. Μια Principal Component Analysis (PCA) του συνόλου των δεδομένων έδειξε μια ξεχωριστή ομαδοποίηση των ασθενών με και χωρίς υποτροπή (Εικ. 4Β) γεγονός που υποδηλώνει ότι η ομάδα του Mirs να διακρίνουμε τους διάφορους κινδύνους υποτροπής των ασθενών.

μελέτης επικύρωσης για έξι Mirs που εντοπίζονται στην πειραματική μελέτη. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Έξι Mirs προήλθαν από την πιλοτική μελέτη. Α, τα επίπεδα έκφρασης με βάση το κατώφλι κύκλου (Ct) τιμές του qRT-PCR (αριστερός άξονας) και η συγκέντρωση υπολογίζεται miR (δεξιός άξονας). Β, Principal Component Analysis των δεδομένων με τις δύο ομάδες εμφανίζονται σε μαύρο και κόκκινο σύμβολα, αντίστοιχα.

Η

Μια τύφλωσε ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης [18] (εικ. 5Α) παρουσίασαν σημαντική υποσυνόλων σε δύο διακριτές ομάδες . Δεκατρείς από δεκαπέντε ασθενείς με υποτροπή της νόσου και έντεκα από δεκαπέντε ασθενείς που ήταν χωρίς υποτροπή ήταν ταξινομείται ορθώς από τις Mirs στα δείγματα αίματος που συλλέχθηκαν πριν από την πρώτη χειρουργική επέμβαση (p = 0,0025? Λόγος πιθανοτήτων = 17.9?. Rel κινδύνου = 5,5, 95% CI = 1,5 – 20,7). Μια ανάλυση Kaplan-Meier των καιρών σε υποτροπή της νόσου στους ασθενείς εκχωρηθεί σε υψηλό ή χαμηλό κίνδυνο από την hierarchival ομαδοποίησης έδειξαν σημαντικά διαφορετικό αποτέλεσμα μεταξύ των δύο ομάδων (Ρ = 0,0026, Σχ. 5Β). Έτσι, οι έξι Mirs επιλέγεται εδώ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει τον κίνδυνο υποτροπής της νόσου του πρώιμο στάδιο, χαμηλού κινδύνου καρκίνου του παχέος εντέρου από την ανάλυση ενός δείγματος αίματος που συλλέγονται κατά το χρόνο της αρχικής διάγνωσης.

Α, ιεραρχική ομαδοποίηση των ασθενών από τη μελέτη επικύρωσης σε ομάδες χαμηλού και υψηλού κινδύνου με βάση τα επίπεδα του miR ορό. Η ανάλυση οδήγησε σε διαχωρισμό σε δύο ομάδες. Β, Kaplan-Meier οικόπεδο ασθενείς αναμένεται να έχουν υψηλό και χαμηλό κίνδυνο υποτροπής της νόσου. Η σύγκριση οδήγησε σε Ρ = 0,0026, Λόγος Κινδύνου 5,4 (1,9 – 15,0 95% CI). Στον πίνακα Α ασθενείς με υποτροπή της νόσου είναι # 1 έως # 15 και χωρίς υποτροπή:. # 16 έως # 30

Η

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη αξιολογεί την πιθανή χρήση των κυκλοφορούντων microRNAs ( Mirs) για τον εντοπισμό ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου με υψηλό κίνδυνο υποτροπής της νόσου Παρά της διάγνωσης της πρώιμο στάδιο, η νόσος χαμηλού κινδύνου που περιγράφεται από τους καθιερωμένους σταδιοποίηση του όγκου. Αυτό θα μπορούσε να βοηθήσει να εντοπίσουμε τα άτομα που θα επωφεληθούν από τη στενότερη παρακολούθηση ή /και επιπλέον συστηματική θεραπεία και θα αποφευχθεί η υπερβολική θεραπεία των ασθενών που δεν θα επωφεληθούν λόγω του χαμηλού κινδύνου τους (αναθεωρηθεί πρόσφατα στο [6]). Η ανάλυση μπορεί να γίνει με ένα μικρό ποσό (& lt? 1 ml). Ορού

Η προέλευση των κυκλοφορούντων Mirs έχει αποτελέσει αντικείμενο συζήτησης. Tumor-σχετίζεται Mirs ανιχνεύονται στην κυκλοφορία θα μπορούσε προφανώς να προκύψουν από τον θάνατο κυττάρων όγκου καθώς και από την ενεργό απελευθέρωση από τα κύτταρα του όγκου. Επιπλέον, Mirs συσκευασμένα σε προστατευτικά φορείς όπως εξωσώματα μπορεί να απελευθερώνονται σε κύτταρα δέκτες όπου ασκούν γονιδιακή σίγηση μέσω του ίδιου μηχανισμού όπως κυτταρικά Mirs [36] ή μπορούν να ρίξει στην κυκλοφορία. Περαιτέρω, εκκρίνεται Mirs έχει πιθανολογηθεί ότι εμπλέκονται στην μεσολάβηση της επικοινωνίας κυττάρου-κυττάρου. Επίσης επιλέξτε σύνολα Mirs απελευθερώνεται από τα καρκινικά κύτταρα και η σύνθεση αυτών των συνόλων Mirs έχει συσχετισθεί με κακοήθεια [37]. Αν και ο καρκίνος που σχετίζεται με κυκλοφορούσα Mirs είναι δυνατόν να προέρχονται από τον εαυτό τους τα καρκινικά κύτταρα, το ανοσοποιητικό ή άλλα στρωματικά κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου, καθώς και άλλα όργανα που ανταποκρίνονται σε σήματα από τον όγκο είναι πιθανές πηγές [38]. Έτσι, κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος μπορεί να εκκρίνουν σχετίζονται με τον καρκίνο Mirs, προωθώντας έτσι ή αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και την απόπτωση [38], [39] και την απορύθμιση αυτών των Mirs μπορεί να είναι μια σημαντική σχέση μεταξύ της ασυλίας και του καρκίνου. Παρά το γεγονός ότι, μερικές μελέτες διαπιστώθηκε παράλληλη εξέλιξη μεταξύ κυκλοφορούντων Mirs και Mirs ιστού (π.χ. [18], [24]), άλλοι δείχνουν ότι δεν είναι όλα τα κυκλοφορήσει Mirs αντικατοπτρίζει την αφθονία miR σε καρκινικά κύτταρα (π.χ. [37], [40]). Σε γενικές γραμμές, οι Mirs ανιχνεύονται στην κυκλοφορία που παρέχονται από διάφορα όργανα και φυσιολογική ρύθμιση ή παθολογικές αλλαγές θα μεταβάλλει τα πρότυπα έκφρασης των κυκλοφορούντων Mirs (για την πρόσφατη παραδείγματα και αναφορές βλέπε αναφορές. [29], [41], [42], [43 ]).

κατά την ανάλυση των Mirs στην παρούσα μελέτη ένα-ένα και όχι σε μια πολυπαραγοντική ανάλυση, δύο Mirs βρέθηκαν διαφορικά εκφρασμένων στην κυκλοφορία, δηλαδή miR-103 (μειωτικά) και miR-596 (ρυθμισμένη προς τα πάνω). miR-103 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω (p = 0,038) σε δείγματα αίματος από ασθενείς με υποτροπή της νόσου σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς υποτροπή (Σχ. 4Α). Σε εντερικών κυττάρων κρύπτη miR-103 είναι μέρος του /κανονιστικού δικτύου μετάβαση G1 S κατά τη διάρκεια της IGF-1 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και αυτό οδηγεί σε ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των κυττάρων και την επιβίωση [44]. Σε αντίθεση, miR-596 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (p = 0,0012) σε δείγματα αίματος από ασθενείς με υποτροπή της νόσου. Η έκφραση του miR-596 συσχετίστηκε με κακή επιβίωση των ασθενών με ependymoma [45], αλλά αδρανοποιήθηκε σε HCC [46] και προς τα κάτω σε παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα [47]. Έτσι, δεν υπάρχει καμία σαφής ένδειξη ακόμη να συνδέσει την έκφραση ιστού της παρούσας miR σε μια ξεχωριστή λειτουργία που θα τη συνδέει με την εξέλιξη της νόσου. Mirs με μόνο μικρές συνολικές μεταβολές μεταξύ των ομάδων των ασθενών ήταν miR-148a που αποτελεί μέρος μιας ομάδας αρνητικοί ρυθμιστές της προ-φλεγμονωδών γονιδίων σε μυελοειδή κύτταρα [48], αλλά μειώνεται σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς [18], που εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στο ήπαρ ιστούς [49] και σχετίζεται με ηπατική βλάβη [50]. miR-320a αναφέρθηκε νωρίτερα ως μια πολλά υποσχόμενη ένδειξη του κακοήθους εξέλιξης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [25] αν και δεν είδαμε μια σαφή ένδειξη των επιπτώσεων της miR-320 αλλαγές μόνοι τους σε αυτή τη μελέτη. miR-15a μπορεί να προκαλέσει απόπτωση [51] και έχει αναφερθεί ότι συμμετέχουν στον έλεγχο της ογκο-στρωματικών αλληλοπαρεμβολών στον καρκίνο του προστάτη [52], καθώς και διαμεσολαβούν προ-αγγειογόνος περιόδων ισχαιμίας που σχετίζεται με παθολογία [53]. Είναι ενδιαφέρον ότι, miR-451 χαρακτηρίσθηκε ως ένα κυκλοφορούν δείκτης της παρουσίας του καρκίνου του μαστού [54] και δείχθηκε να απελευθερωθεί επιλεκτικά από μετασχηματισμένα μαστικούς επιθήλια και να συμβάλλουν στην μεταβολή της ευαισθησίας σε χημειοθεραπευτικούς ή ενδοκρινικές στοχευμένων φαρμάκων στον καρκίνο του μαστού (που επισκοπείται στο [ ,,,0],55]). Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι τα κυκλοφορούντα Mirs προσδιορίζονται εδώ ως δείκτες του κινδύνου υποτροπής της νόσου μπορεί να συμβάλει στη διαδικασία με επηρεάζουν την επιβίωση καρκινικών κυττάρων, αλληλεπιδράσεις στρωματικών όγκων, αγγειογένεση ή φλεγμονώδεις κυτταρικές αποκρίσεις στις λανθάνουσες μεταστάσεις.

σε Συμπέρασμα

Ο κίνδυνος της υποτροπής του καρκίνου του παχέος εντέρου πρώιμο στάδιο μπορεί να προβλεφθεί από την παρακολούθηση Mirs σε δείγματα αίματος ασθενών που συλλέγονται κατά τη στιγμή της αρχικής διάγνωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

miR Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός σε δείγματα αίματος

Η συλλογή και χρήση των biospecimen εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review (IRB) του Πανεπιστημίου Georgetown βάσει του πρωτοκόλλου # 2007 – 345 πιο πρόσφατα, στις 10/24/2012. Όλοι οι ασθενείς υπογράψετε ένα έντυπο συγκατάθεσης που επιτρέπει τη χρήση του δώρισε δείγματα υγρών των ιστών και το σώμα. Τα έντυπα συγκατάθεσης και το περιεχόμενό τους αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από το IRB. δείγματα ορού (& lt? 1 ml) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μετά την αφαίρεση των προσωπικών στοιχείων. απομόνωση miR περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, δείγματα ορού αναμίχθηκαν σε αναλογία 1:10 με αντιδραστήριο λύσης Qiazol και στροβιλίστηκε. Το προϊόν της λύσης εκχυλίζεται με CHCl3 και η υδατική φάση περαιτέρω επεξεργασία για ολικό RNA χρησιμοποιώντας το miRNeasy Mini κιτ (Qiagen, Valencia, CA) και εμπλουτίζεται για miR χρησιμοποιώντας το RT2 qPCR-Grade miR Απομόνωση Kit, ΜΑ-01 (SABiosciences).

Ανάλυση δεδομένων

PCA και ιεραρχική ομαδοποίηση έγιναν με βάση τη μέση στο κέντρο και κλιμακώνονται τα επίπεδα έκφρασης του miR. Οι μέθοδοι ομαδοποίησης χρησιμοποιούνται XLSTAT (Addinsoft Inc.) στο Excel (Microsoft Inc.) στο OSX 10.7.5. Οι μέθοδοι αυτές επιτρέπουν τον υπολογισμό της σημαντικότητας μεταξύ των ιεραρχικών ομίλων και αντλούν p-τιμές χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Prism 5.0 (Graphpad) λογισμικό που χρησιμοποιείται για άλλες εξετάσεις και απεικόνιση των δεδομένων.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Daksnapriya Balasubbramanian, Anju Preet και Ryan Navarro (όλα στο Georgetown University) για την τεχνική βοήθεια. Δρχ. Daniel F. Hayes (U Michigan, Ann Arbor), John M. Jessup (Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Bethesda) Michael B. Atkins, Stephen Byers και Beppe Giaccone (όλα στο Πανεπιστήμιο Georgetown) διαβάζουν σχέδια του χειρογράφου και εφόσον σχόλια και προτάσεις για τα δεδομένα αναλύσεων και την ερμηνεία.