Αφηρημένο

Von Hippel-Lindau ογκοκατασταλτικά (VHL) χάνεται στην πλειοψηφία των σαφές καρκινώματα νεφρικών κυττάρων κυττάρων (ccRCC). Folliculin (FLCN) είναι ένα ογκοκατασταλτικό των οποίων η λειτουργία έχει χαθεί στο σύνδρομο Birt-Hogg-Dube (BHD), μια διαταραχή που χαρακτηρίζεται από καρκίνο του νεφρού πολλών ιστολογικών τύπων συμπεριλαμβανομένων σαφών καρκίνωμα, δερματική fibrofolliculoma και πνευμοθώρακα. Εδώ θα διερευνηθεί κατά πόσον υπάρχει σύνδεση μεταξύ VHL και FLCN σε νεφρική κυτταρικές γραμμές καρκινώματος σαφή κυττάρων και όγκων. Έχουμε αποδείξει ότι VHL ρυθμίζει την έκφραση FLCN στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης σε κυτταρικές γραμμές RCC και ότι η έκφραση της πρωτεΐνης FLCN μειώνεται σε ανθρώπινους όγκους ccRCC με

VHL

απώλεια, σε σύγκριση με φυσιολογικό νεφρό συμφωνημένα ιστό. Knockdown των αποτελεσμάτων FLCN σε αυξημένο σχηματισμό όγκων από κύτταρα RCC με άγριου τύπου VHL σε ορθοτοπική ξενομοσχεύματα σε γυμνούς ποντικούς, ένδειξη ότι FLCN παίζει ένα ρόλο στην δραστικότητα καταστολής όγκου του VHL. Είναι ενδιαφέρον, FLCN, ομοίως με VHL, είναι απαραίτητη για τη δράση του LC3C μεσολάβηση πρόγραμμα αυτοφαγικά που έχουμε προηγουμένως χαρακτηριστεί ως συμβολή στην καταστολής όγκων δραστικότητα του VHL. Τα αποτελέσματα δείχνουν την ύπαρξη λειτουργικών στιχομυθία μεταξύ δύο μεγάλων καταστολείς όγκων σε καρκίνο του νεφρού, VHL και FLCN, συγκλίνουν σχετικά με τη ρύθμιση των αυτοφαγία

Παράθεση:. Bastola P, Stratton Υ, Kellner Ε, Mikhaylova O, Yi Υ, Sartor ΜΑ, et al. (2013) Folliculin Συμβάλλει στην VHL καταστολής όγκων δραστηριότητα στον καρκίνο των νεφρών μέσω του κανονισμού της Autophagy. PLoS ONE 8 (7): e70030. doi: 10.1371 /journal.pone.0070030

Επιμέλεια: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16, Απριλίου του 2013? Αποδεκτές: 14, Ιούνη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούλη του 2013

Copyright: © 2013 Bastola et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Myrovlytis Εμπιστοσύνη , Research Grant? ΝΙΗ /NCI CA122346? BLR & amp? D VAmerit AwardB101BX0011100-02? UC P30-ES006096CEG. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Νεφρική λογαριασμούς του καρκίνου για 2% έως 3% όλων των ενηλίκων κακοήθειες στις ΗΠΑ. Το 2011 περισσότερες από 64.770 νέες περιπτώσεις και 13.000 θάνατοι αναφέρθηκαν, και η συχνότητα αυξάνεται σταθερά κατά 2,5% ανά έτος. ccRCC αντιπροσωπεύει την πλειοψηφία (85% έως 90%) των ενηλίκων καρκίνων του νεφρού και είναι η πιο κακοήθης μορφή. Αυτός ο καρκίνος χαρακτηρίζεται από μια πρόωρη απώλεια της VHL ογκοκατασταλτικών στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 3 στην πλειονότητα των όγκων (80%). Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η απώλεια του VHL οδηγεί σε αυξημένη συσσώρευση και τη δραστηριότητα του παράγοντα μεταγραφής προκαλείται από υποξαιμία (HIF), που με τη σειρά της ενεργοποιεί την έκφραση των γονιδίων που προάγουν την ανάπτυξη του όγκου. Μεταξύ αυτών είναι αγγειογόνοι παράγοντες, οι οποίοι οδηγούν σε αυξημένη ροή του αίματος διαμέσου των όγκων, ενισχύοντας έτσι τη διανομή των θρεπτικών ουσιών και οξυγόνου σε καρκινικά κύτταρα. Γονίδια που διεγείρουν την αναερόβια γλυκόλυση ενεργοποιούνται επίσης, και αυτό υποστηρίζει την προσαρμογή στην μειωμένη διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών και μετατοπίζει τα καρκινικά κύτταρα προς μεταβολικές οδούς που προωθούν την ανάπτυξη του όγκου. Πρόσφατα, ανακαλύψαμε ότι ένας άλλος μονοπάτι καταστολής όγκου ρυθμίζεται από VHL. Βρήκαμε ότι VHL είναι ένα κύριος ρυθμιστής της διαδικασίας μακροαυτοφαγία (αυτοφαγία) [1]. Έχουμε προσδιορίσει ότι VHL, επάγοντας microRNA-204, ανέστειλε LC3B μεσολάβηση αυτοφαγία η οποία είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του όγκου ccRCC. Επιπλέον, VHL, με αναστολή HIF, επαγόμενη έκφραση και δραστικότητα ενός παράλογο LC3B, LC3C. Σε αντίθεση με LC3B, LC3C δρα ως καταστολέας όγκου [1].

Κατά τη διαδικασία της αναζήτηση νέων γονιδίων VHL επαγόμενη που θα μπορούσαν να συμμετέχουν στην δραστικότητα καταστολής όγκου του VHL, ανακαλύψαμε ότι η ανασύσταση του άγριου -τύπος VHL σε κύτταρα RCC με χάνονται

VHL

επήγαγε ειδικές και σημαντικό εμπλουτισμό για τα γονίδια που εκφράζονται από τον τόπο Smith-Magenis (SM) στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 17ρ11.2. Το σύνδρομο Smith-Magenis είναι μια σύνθετη νευροσυμπεριφορικής διαταραχή που χαρακτηρίζεται από διανοητική ανεπάρκεια, κρανιοπροσωπικές και σκελετικές ανωμαλίες και διαταραχές του ύπνου [2]. Είναι ενδιαφέρον, αυτό το τόπο περιέχει ένα άλλο νεφρό γονίδιο καταστολής όγκων, folliculin (FLCN), των οποίων η δραστηριότητα χάνεται στο γενετικό αυτοσωματικό-κυρίαρχη διαταραχή, το σύνδρομο Birt-Hogg-Dube (BHD) [3]. BHD χαρακτηρίζεται από fibrofolliculomas δέρμα, πνευμονική κύστεις, και αυτόματος πνευμοθώρακας, καθώς και ο καρκίνος στα νεφρά των μικτών ιστολογικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων χρωμόφοβο, oncocytic, σαφείς κυττάρων, και θηλώδες τύπου [3]. Ο σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να προσδιοριστεί εάν FLCN συμβάλλει στην δραστηριότητα κατασταλτική του όγκου του VHL. Δείχνουμε ότι FLCN συμβάλλει στην VHL μεσολάβηση καταστολή της ανάπτυξης του όγκου επηρεάζοντας οδούς LC3B και LC3C αυτοφαγικά.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture μέθοδοι και θεραπείες

Η μέθοδός μας για την δημιουργώντας δεξαμενές ανθρωπίνου VHL (-) και VHL (+) 786-O, Α498 και κύτταρα Caki-1 που περιγράφεται από εμάς πριν από την [1], [4], [5]. κύτταρα RCC4 ήταν δώρο από τον Dr. Jamie Κάιρο (Jefferson University) και περιγράφεται από εμάς πριν [6]. Αυτοφαγικά συλλιπάσματα διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [1]. Για πρωτεΐνη ή εκχύλιση RNA, τα κύτταρα επιστρώθηκαν, 24 ώρες αργότερα μέσο άλλαξε σε ότι είτε με 10% ή 0,1% ορό, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα. Τα κύτταρα στη συνέχεια υπέστησαν λύση σε ρυθμιστικό RIPA με πρωτεάση, φωσφατάση, και αναστολείς του πρωτεασώματος για ανάλυση PAGE, ή σε Αντιδραστήριο TRI για εξαγωγή RNA. Για πειράματα RNAi, pLKO.1 που βασίζεται shRNA κατασκευάσματα για FLCN (TRCN0000005969, TRCN0000005970, και TRCN0000010979? Open Biosystems) ήταν VSV-G περιβλήματος συσκευάζεται (Cincinnati Νοσοκομείο Παίδων Ιατρικό Κέντρο Viral Vector πυρήνα) και μολύνονται σε κύτταρα, τα οποία στη συνέχεια υφίστανται κατεργασία με πλασμίδιο-κατάλληλα αντιδραστήρια επιλογής. VHL shRNA κατασκευάσματα περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Οι διαμολύνσεις με λεντοϊού σωματίδια διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 2 μg /ml πολυβρενίου.

Ανθρώπινο RCC Όγκοι

Καταψυγμένα δείγματα όγκων ccRCC (n = 128) και συνδυάζεται κανονικά δείγματα νεφρού (n = 114 ) ελήφθησαν και αναλύθηκαν για

VHL

αλληλουχίας και έκφραση της πρωτεΐνης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4]. Τα δείγματα αναλύθηκαν για την έκφραση των πρωτεϊνών και mRNA, επίσης όπως περιγράφεται προηγουμένως.

Ποσοτική RT-PCR

Για την ανάλυση mRNA, τα δείγματα πρώτα μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το κιτ TaqMan microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Biosystems), και ποσοτικοποιείται με PCR πραγματικού χρόνου σε ένα Applied Biosystems 7900HT Fast real-Time CRSystem. qRT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως, και χρησιμοποιώντας εκκινητές που περιγράφονται στον Πίνακα S4. Περιγραφή του RNA μικροσυστοιχίες παρέχεται στο Συμπληρωματικό Methods.

Ανάλυση Western Blot

Σύνολο κυτταρολύματα ελήφθησαν με λύση κυττάρων σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει αναστολείς πρωτεϊνάσης και φωσφατάσης. 5 έως 30 μg των εκχυλισμάτων διαχωρίστηκαν σε 4% έως πηκτές πολυακρυλαμιδίου 12% ή 10% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Ημι-ποσοτική ανοσοκηλίδωση για ανθρώπινων όγκων RCC και συμφωνημένα φυσιολογικούς νεφρούς διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4]. Τα ακόλουθα πολυκλωνικά αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvar, ΜΑ): αντι-FLCN, αντι- S6 κινάση 1 και Τ

389 φωσφορυλίωση? αντι-S6 και S

240/244 φωσφορυλίωση? αντι 4ΕΒΡ και Τ

37/46 ή S

65 φωσφορυλίωση. Πολυκλωνικά αντι-LC3B (Abcam, Cambridge, ΜΑ) και αντι-LC3C (Abgent, San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκαν. Η ακόλουθη ποντικού χρησιμοποιήθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα: αντι-VHL (Pharmingen? San Jose, CA), αντι-αιμαγλουτινίνη (Boehringer Ingelheim, Αυστρία)? και αντι-GAPDH (Abcam? Cambridge, ΜΑ).

Ποντίκια Ξενομοσχεύματος Πειράματα

Για τις ενέσεις ενδο-νεφρού, 30.000 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε Matrigel σε ένα τελικό όγκο 30 μΐ, και στη συνέχεια ενίεται αργά μερικά χιλιοστά κάτω από το νεφρό κάψα του 4- έως 5-εβδομάδων αθυμικά γυμνά ποντίκια. Μετά θυσιάστηκαν 10 έως 12 εβδομάδες τα ποντίκια, οι όγκοι με τα νεφρά συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, παραφίνη ενσωματωμένο, και Η &? Ε χρώση ή υποβάλλονται σε επεξεργασία για S6 χρώση /S6P στην ιστοπαθολογία Πυρήνα στο στο Τμήμα Παθολογίας CCHMC

Στατιστική ανάλυση των ποσοτικοποιημένων δεδομένων

κανονικοποίηση των δεδομένων και την ανάλυση του RNA μικροσυστοιχίες περιγράφονται στο Συμπληρωματικό Μέθοδοι. Τα στοιχεία που κατατέθηκαν στην έκφραση γονιδίων Omnibus με αριθμό ένταξης GSE47106. Για περιγραφική στατιστική, τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SEM εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Η ανάλυση της διαφορικής έκφρασης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας t-test ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από Tukey-Kramer τεστ πολλαπλών συγκρίσεων. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πειραμάτων ανοσοκηλιδώσεως οι κανονικοποιημένες τιμές των επιπέδων της αφθονίας πρωτεΐνης log2 μετασχηματίζονται για να διευκολύνουν ισχυρή, ακραία τιμή-insensitive ανάλυση. Τυπική οικόπεδα box-και-whisker χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση διανομές του κανονικοποιημένου μέτρου αφθονία για μεμονωμένες πρωτεΐνες. Οι διαφορές μεταξύ των μέσων επιπέδων σε δύο τύπους δειγμάτων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας (διπλής όψης) t-test και περαιτέρω επικυρωθεί από δοκιμή Wilcoxon. Διαφορές που προκύπτουν στην P & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα σε ποντίκια έγιναν αυστηρά σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Cincinnati Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήσης. (Αριθμός πρωτοκόλλου: 06-07-21-01). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο και όλες οι προσπάθειες έγιναν για την ελαχιστοποίηση του πόνου. Όλα τα ανθρώπινα δείγματα ήταν ανώνυμες και απαλλάσσονται από το Πανεπιστήμιο του Cincinnati απαιτήσεις του πρωτοκόλλου εσωτερική κριτική του Διοικητικού Συμβουλίου.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της FLCN προκαλείται από VHL

Για τον εντοπισμό των γονιδίων VHL που προκαλείται ότι θα μπορούσε να συμμετέχει στη δραστηριότητα καταστολής όγκου του VHL, εκτελέσαμε πειράματα μικροσυστοιχιών mRNA στα οποία συγκρίναμε την έκφραση του γονιδίου σε ανθρώπινα RCC 786-O VHL (-) κύτταρα και τα ίδια κύτταρα με την ανασύσταση, άγριου τύπου VHL (786-O VHL (+)). Η στατιστική ανάλυση που προσδιορίζονται 1310 μεταγραφές εκφράζονται διαφορικά σε δύο τύπους κυττάρων (FDR & lt? 0,1 και & gt? 50% αλλαγή στο επίπεδο της έκφρασης). (Πίνακας S1)

Είναι ενδιαφέρον ότι, μεταξύ των 588 μεταγραφές που προκαλούνται από την ανασύσταση του VHL, βρήκαμε ένα σημαντικό εμπλουτισμό σε γονίδια που βρίσκεται στο μικρό βραχίονα του χρωμοσώματος 17 (10,71% του συνόλου των σημαντικά επάγεται γονίδια), και ιδιαίτερα σε cytoband 17ρ11.2, το οποίο περιέχει τον τόπο SM (1,7% του συνόλου των σημαντικά επάγεται γονίδια) (Πίνακας 1 και S2). Υπήρξε επίσης μια συγκέντρωση των γονιδίων που προκαλείται από VHL στο χρωμόσωμα 14 (7,85% του συνόλου των σημαντικά επάγεται γονίδια) με τα κύρια cytoband είναι 14q22.1. VHL μεσολάβηση επαγωγή πολλών από τα γονίδια SM επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ποσοτική RT-PCR (Σχ. S1). Σε αντίθεση, τα γονίδια που έχουν κατασταλεί από VHL εμπλουτίστηκαν στο χρωμόσωμα 7 (63 γονίδια, 9,75% του συνόλου των σημαντικά καταπιεσμένη γονίδια) και του χρωμοσώματος 9 (42 γονίδια, το 6,5% του συνόλου των καταπιεσμένων γονίδια) (Πίνακας S3).

Ο τόπος SM περιέχει ένα γονίδιο που κωδικοποιεί μια άλλη νεφρική καταστολέα του όγκου των νεφρών, FLCN. Ανάλυση FLCN mRNA και πρωτεΐνης αποκάλυψε αυξημένη έκφραση τόσο σε 786-O και Α498 κυττάρων με ανασυσταθεί VHL, σε σύγκριση με τη γονική VHL (-) κύτταρα (Εικ. 1Α και Β). Επιπλέον, FLCN mRNA και η έκφραση πρωτεΐνης καταστέλλεται Caki1 νεφρικά καρκινικά κύτταρα στα οποία έχουμε χτυπηθεί κάτω ενδογενούς έκφρασης VHL με τη χρήση shRNA (Σχ. 1C και 1D). Η μεταβολή στην έκφραση του mRNA FLCN ήταν στην περιοχή από 1,5 έως 2 φορές, παρόμοια με άλλα γονίδια SM (σύγκρινε Σχ. S1). Ωστόσο, η επαγωγή στο επίπεδο της πρωτεΐνης ήταν στο εύρος 3 έως 4 φορές, μία ένδειξη ότι μεταγραφικούς μηχανισμούς παίζουν ρόλο σε αυτόν τον κανονισμό. Σε αυτές τις μελέτες παρατηρήσαμε επίσης VHL μεσολάβηση επαγωγή του ρ53, ένα άλλο γονίδιο που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 17ρ13.1 στη γειτονία του τόπου SM, επικύρωση έτσι ένα εύρημα που έχει προηγουμένως περιγραφεί από άλλους [7].

Ανασύσταση του VHL σε 786-O και Α498 κύτταρα οδήγησε σε επαγωγή FLCN και mRNAs ρ53 (Α) και πρωτεΐνες (Β). Knockdown του VHL σε κύτταρα Caki-1 οδήγησε σε μειωμένη FLCN mRNA (C) και τα επίπεδα (D) πρωτεΐνη? *** P & lt? 0.001, ** P & lt? 0,01. ιός έλεγχος σκαρφάλωμα Scr-.

Η

Επειδή VHL χάνεται σε σποραδικές καρκίνωμα σαφής κύτταρο νεφρικών κυττάρων (ccRCC), μετρήσαμε την έκφραση του FLCN σε προϊόντα λύσης από ανθρώπινους όγκους ccRCC σε σύγκριση με παρακείμενες νεφρικό ιστό σε δείγματα με γνωστά

VHL

κατάσταση. Έχουμε περιγράψει προηγουμένως τον πληθυσμό των ανθρώπινων ζεύγη νεφρών ccRCC-φυσιολογικό που χρησιμοποιήσαμε για την ανάλυση αυτή [4]. Η πρωτεΐνη FLCN αναλύθηκε με ημι-ποσοτική ανοσοκηλίδωση όπως περιγράφεται προηγουμένως [4] και του mRNA προσδιορίστηκε με ποσοτική RT-PCR. Η έκφραση της πρωτεΐνης FLCN ήταν έκδηλα μειωμένη σε όγκους ccRCC σε σύγκριση με φυσιολογικούς νεφρούς στον πληθυσμό των ccRCC με το

VHL

διαγράφεται (Σχ. 2Α και 2Β). Αντίθετα, δεν είδαμε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα FLCN κατά τη σύγκριση ccRCC με άγριου τύπου

VHL

με την αντίστοιχη κανονική νεφρικό ιστό (Εικ. 2C). Είναι ενδιαφέρον ότι τα επίπεδα του mRNA FLCN δεν διέφερε μεταξύ των ζευγών όγκο νεφρού σε καμία ομάδα των όγκων (Σχ. 2D), υποστηρίζοντας ένα ρόλο για μεταγραφικούς μηχανισμούς στη ρύθμιση της έκφρασης FLCN.

Ανάλυση FLCN πρωτεΐνης (Α -C) και του mRNA (D) σε δείγματα ανθρώπινων ccRCC με γνωστά

VHL

κατάσταση, σε σύγκριση με παρακείμενες νεφρικό ιστό. A. Μια αντιπροσωπευτική ανάλυση western blot της FLCN πρωτεΐνης σε ζεύγη των νεφρών (Κ) και όγκου με χαθούν

VHL

(VHL-DEL) διαχωρίζεται στη σελίδα 10%. Η κάτω ζώνη μπορεί να αντιπροσωπεύει μια υποβάθμιση ή μετα-μεταφραστική τροποποίηση των FLCN. Β και C. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεϊνών FLCN σε όγκους που είχαν χάσει

VHL

(VHL-DEL) και οι όγκοι με άγριου τύπου

VHL

(VHL-WT). Τα κουτιά αντιπροσωπεύουν άνω και κάτω τεταρτημόρια διαχωρισμένα από το διάμεσο (παχιά οριζόντια γραμμή) και τα μουστάκια εκτείνονται μέχρι τις ελάχιστες και μέγιστες τιμές, με εξαίρεση τα σημεία που βρίσκονται έξω από το 1,5 διατεταρτημοριακό εύρος από το πλαίσιο (σημειώνεται ως κύκλοι). Μέσα ± SD από κάθε διανομή υποδεικνύονται με κλειστά τελείες και διασχίζει στις μουστάκια, αντίστοιχα. μέτρησης Δ Ποσοτική RT-PCR των επιπέδων mRNA FLCN στα νεφρά και ccRCC VHL-DEL και οι όγκοι VHL-WT.

Η

FLCN Συμβάλλει στην VHL με τη μεσολάβηση του όγκου καταστολή

Για να προσδιοριστεί εάν υπήρχε μια λειτουργική σύνδεση μεταξύ FLCN και της δραστηριότητας του όγκου-καταστολή της VHL, που γκρέμισε την έκφραση της FLCN σε 786-O VHL (+) κύτταρα με τη χρήση τριών διαφορετικών Τα siRNAs (Εικ. 3Α). Εμείς στη συνέχεια με ένεση αυτών των κυττάρων κάτω από τις κάψουλες νεφρό γυμνών ποντικών, που είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη συχνότητα εμφάνισης όγκου και μεγαλύτερο μέγεθος όγκου, σε σύγκριση με τους όγκους που προέρχονται από εγχυθεί κύτταρα ελέγχου που είχαν υποστεί μεταγωγή με φακοϊούς περιέχει αλληλουχία σκαρφάλωμα (Σχ. 3Β). Οι όγκοι με FLCN νοκ ντάουν είχε μια πολύ κακοήθη, αποδιαφοροποιημένων φαινότυπο (Σχ. 3C).

shRNA που προκαλείται νοκ ντάουν της FLCN προωθεί το σχηματισμό όγκων από 786-Ο κύτταρα με ανασυσταθέντος VHL. Α κηλίδος Western καταδεικνύει μια μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα FLCN σταθερώς εκφράζουν τρεις διαφορετικές FLCN Τα siRNAs σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με μπάλα (SCR) έλεγχος. B. Η ποσοτικοποίηση της επίπτωσης και του βάρους των όγκων που σχηματίζονται από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές σε ορθοτοπική ξενομοσχεύματα. ΝΚ- μέσο βάρος των φυσιολογικών νεφρών. Γ H & amp? Ε χρώση των αντιπροσωπευτικών τμημάτων για τους όγκους που καλλιεργούνται από VHL (+) /κυττάρων ελέγχου αγωνίζομαι και τα κύτταρα VHL (+) με FLCN knockdowns. Ράβδοι κλίμακας = 50 μm.

Η

Επειδή FLCN δείχθηκε να αναστέλλει τη δράση της οδού mTORC1 σε UOK257 κύτταρα και μοντέλα ποντικών του BHD νεφρών καρκίνο [8], [9], αναλύσαμε τα αποτελέσματα του FLCN knockdown για τη δραστηριότητα αυτού του μονοπατιού στα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για αυτές τις ορθοτοπική ξενομοσχεύματα. Σημαντικά, knockdown του FLCN οδήγησε σε μειωμένη δραστηριότητα mTORC1 (Σχ. 4Α), όπως μετράται με την φωσφορυλίωση του S6K, S6 και 4ΕΒΡ, σε καλλιεργημένα κύτταρα. Έχουμε καθορίζεται επίσης έκφραση του S6 και S6-Ρ είναι τομές από ξενομοσχεύματα όγκων που σχηματίζεται από VHL (+) /σκαρφάλωμα επιμολυσμένα κύτταρα εναντίον όγκων που σχηματίζονται από αυτά τα κύτταρα με FLCN χτυπηθεί κάτω. Σταθερά με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από πειράματα κυτταρικής καλλιέργειας, τμήματα από VHL (+) /FLCNKD όγκους έδειξαν χαμηλότερη χρώση για S6-P σε σύγκριση με τους ιστούς ελέγχου, ενώ η χρώση για το σύνολο S6 ήταν παρόμοια (Σχ. 4Β). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι επαυξημένη δραστηριότητα της οδού της mTORC1 δεν συμβάλλει στην αύξηση της ανάπτυξης του όγκου σε αυτά τα κύτταρα.

A. Ανάλυση κηλίδας Western των mTOR κατάντη στόχων σε 786-O VHL (+) κύτταρα που εκφράζουν σταθερώς είτε σκαρφάλωμα ή δύο διαφορετικές FLCN Τα siRNAs. Ο έλεγχος φόρτωσης GAPDH παρουσιάζεται για κάθε ομάδα ανοσοαποτυπώματα σε επεξεργασία από την ίδια πηκτή. τμήματα Β Εκπρόσωπος του ανέφερε όγκων χρωματίστηκαν για S6 και S6P. μπαρ κλίμακας = 50 μm.

Η

Πρόσφατα έχουμε περιγράψει ότι VHL καταστέλλει LC3B μεσολάβηση, φιλο-ογκογόνο αυτοφαγία, ενώ διεγείρει ένα μυθιστόρημα καταστολής όγκων αυτοφαγικά πρόγραμμα, με τη μεσολάβηση LC3C [1]. LC3s έχουν καθιερωθεί ρυθμιστικές αυτοφαγικά απαραίτητη για το σχηματισμό των διπλών αυτοφαγοσώματα μεμβράνης και για την απόκτηση του φορτίου. Έτσι, ερευνήσαμε αν FLCN μπορεί να ασκεί τη δραστηριότητά της καταστολής των όγκων κατάντη από VHL με τη ρύθμιση LC3C ή LC3B αυτοφαγία. LC3C επάγεται από ασιτία σε κύτταρα VHL (+), έτσι σε αυτά τα πειράματα, VHL (+) 786-O και RCC4 κύτταρα στερήθηκαν τροφής σε 0.1% ορό για 48 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται για 1 ώρα με χλωροκίνη, έναν αναστολέα λυσοσωμικών προκειμένου για την αναστολή της ροής αυτοφαγικά και τη συσσώρευση της ταχύτερης μεταναστευτικών, λιπιδιωμένη μορφή (LC-II) LC3B και LC3C μετρήθηκε με κηλίδωση western. Βρήκαμε ότι knockdown του FLCN ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της συσσώρευσης των LC3C με μια αύξηση στην LC3B αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Εικ. 5). Η αλλαγή στην LC3B σε VHL (+) κύτταρα RCC δεν συνδέθηκε με οποιεσδήποτε σταθερές αλλαγές του miR-204 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι FLCN ρυθμίζει αυτοφαγία παρόμοια με VHL, και ως εκ τούτου οι επιπτώσεις στην αυτοφαγία μπορεί να είναι εν μέρει υπεύθυνη για τη συμβολή της FLCN στον όγκο δραστηριότητας της VHL καταστολή.

Νοκ ντάουν της FLCN (shRNA 3) 786- O (Α) ή RCC4 (Β) VHL (+) κυττάρων μειώνει τη συσσώρευση του κατασταλτικού όγκου LC3C-ΙΙ αλλά επάγει έκφραση των ογκογόνων LC3B-ΙΙ. Western στυπώματα ανιχνεύθηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα. C. Ποσοτικός προσδιορισμός των 3 ανεξάρτητα πειράματα, όπως φαίνεται στον πίνακα Α και τα επίπεδα πρωτεΐνης Β LC3 μετρήθηκε με οπτική πυκνότητα αρχικά κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. Στη συνέχεια, η αναλογία του LC3 υπολογίστηκε μεταξύ των επιπέδων LC3 μετρηθεί σε δείγματα αντιμετωπίζονται χλωροκίνη σε κύτταρα με FLCN χτυπηθεί κάτω και κύτταρα ελέγχου (σύγκρινε διαδρομή 6 έως λωρίδα 3 σε πίνακες Α και Β). Δ Υπόδειγμα του προτεινόμενου κανονισμού.

Η

Συζήτηση

Εδώ ανέφερε ότι VHL ρυθμίζει την έκφραση των FLCN και ότι, με τη σειρά του, FLCN συμμετέχει στον όγκο καταστολή δραστηριότητα της VHL. Οι παρατηρούμενες επιδράσεις της FLCN νοκ ντάουν στην αύξηση του όγκου είναι συνεπής με την αρνητική επίδραση της FLCN υπερέκφραση για το σχηματισμό των όγκων από 786-O VHL (-) κύτταρα, όπως παρατηρήθηκε από άλλους [10]. Σημαντικά, FLCN ρυθμίζει προγράμματα LC3B και LC3C αυτοφαγικά με τρόπο παρόμοιο με VHL, δηλ FLCN αναστέλλει LC3B και διεγείρει δραστικότητα αυτοφαγικά LC3C (Σχ. 5D). Επειδή έχουμε αποδείξει ότι και οι δύο LC3B και η άσκηση LC3C σημαντικά και αντίθετα αποτελέσματα στην ανάπτυξη των όγκων ccRCC [1], προτείνουμε ότι η συνεισφορά της FLCN στη δραστηριότητα όγκων-καταστολή των αποτελεσμάτων VHL, τουλάχιστον εν μέρει, από τις επιπτώσεις της στην αυτοφαγία (Εικ . 5D). Κανονισμός του LC3B από FLCN πιθανόν να αντιπροσωπεύει ένα μηχανισμό επιπλέον στην περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς VHL μεσολάβηση αναστολή της LC3B μέσω miR-204, καθώς δεν μετρούν συνεπή αποτελέσματα της FLCN για miR-204. Συγχρόνως και οι δύο καταστολείς όγκων θα μπορούσε να επάγει την έκφραση του LC3C μέσω της καταστολής του HIF, αφού LC3C είναι ένα γονίδιο HIF-αναστέλλεται. VHL είναι καλά αναγνωρισμένο για την ικανότητά της να αναστέλλει την έκφραση της πρωτεΐνης HIF-αδ και δραστηριότητα. Πρόσφατα, FLCN έχει επίσης αναφερθεί να μειώνει δραστικότητα HIF, ακόμη και αν δεν επηρεάζει την συσσώρευση του HIF-αδ υπομονάδες [11].

Ο ειδικός ρόλος της FLCN στη ρύθμιση του autophagy υποστηρίζεται περαιτέρω από την προσφάτως προσδιορίζονται παρουσία του τομέως Denn στην καρβοξυ-τερματική περιοχή του FLCN [12]. Αυτό το μοτίβο είναι παρόν επίσης σε folicullin πρωτεΐνη που συνδέεται-1 και 2 (FNIP1 και FNIP2 [13]), και, κατά τρόπο ενδιαφέροντα σε μια άλλη πρωτεΐνη που εκφράζεται από τον τόπο SM, SMCR8 [13], η οποία επίσης βρήκαμε να επάγεται από VHL (Σχ . S1). Αυτές οι πρωτεΐνες λειτουργούν ως παράγοντες ανταλλαγή ΑΕΠ-GTP (GEFs) για GTPases RAB, ενδεχομένως αναγκαία για τη συνδεδεμένη αυτοφαγία της εμπορίας ανθρώπων και της σύντηξης [11], [13].

Ο τόπος SM δεν έχει συνδεθεί με ccRCC. Προηγουμένως, μόνο ένα γονίδιο από αυτόν τον τόπο, TNFSF13 (παράγοντα νέκρωσης όγκων μέλος υπεροικογένειας 13), είχαν μελετηθεί από την άποψη αυτή. Διαπιστώθηκε ότι εμφανίζουν μειωμένα επίπεδα mRNA σε ccRCC σε σύγκριση με φυσιολογικό νεφρό. Επιπλέον, υψηλότερα επίπεδα αυτού του υποδοχέα έχουν δειχθεί ότι συσχετίζεται με καλύτερη συνολική και ελεύθερη νόσου επιβίωση [14]. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι η περαιτέρω ανάλυση θα αποκαλύψει πρόσθετες λειτουργίες autophagy σχετίζονται των γονιδίων που εκφράζονται από SM τόπο.

FLCN συμβάλλει στην καταστολή όγκου VHL που προκαλείται από έναν μηχανισμό που δεν φαίνεται να περιλαμβάνει ενεργοποίηση του μονοπατιού mTOR. Πράγματι, το 786-Ο κύτταρα με ανασυσταθεί VHL και FLCN νοκ-κάτω, μπορούμε πραγματικά έδειξε μια έντονη μείωση σε διάφορες εκδηλώσεις φωσφορυλίωσης που χρησιμοποιούνται ως δείκτες της δραστηριότητας mTOR. Σταθερά με την αναστολή της mTOR που μετρήθηκε αυξημένη συσσώρευση LC3B, ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο αυτοφαγικά ανάγνωσης, και αυτή η αυξημένη LC3B μεσολάβηση αυτοφαγία μπορεί να συνεισφέρει στην ανάπτυξη του όγκου. Οι παρατηρούμενες επιδράσεις της FLCN σχετικά με τη δραστηριότητα του mTOR είναι συνεπείς με διάφορα δημοσιεύματα που ανέφεραν θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της FLCN και mTOR σε U251, ΗΕΚ293, HK-2, ACHN, 786-O VHL – κύτταρα [15] (). Ωστόσο, η τρέχουσα κανονική κατανόηση της σύνδεσης FLCN-mTOR είναι ότι FLCN ρυθμίζει αρνητικά την πορεία mTOR [8], [9], [16]. Συναφώς, η ανθρώπινη UOK257 κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από έναν ασθενή BHD, που δεν εκφράζει VHL, δείχνει ένα υψηλό επίπεδο δραστηριότητας mTOR, και ποντίκια με FLCN knockout επιδεικνύουν υψηλά επίπεδα φωσφορυλίωσης S6 [8], [9]. Ο λόγος για αυτή την ασυμφωνία αυτή τη στιγμή δεν είναι κατανοητό, αλλά ίσως τα δεδομένα δείχνουν προς μια διαμερισματοποιημένη επίδραση της FLCN για mTOR που επηρεάζεται από την κυτταρική έννοια, όπως η δραστηριότητα του VHL. Παρ ‘όλα αυτά, η σύνδεση του VHL σε ογκοκατασταλτικά που ρυθμίζει ένα μεταβολικό μονοπάτι σε καρκίνο του νεφρού μπορεί να αποκαλύψει μία νέα άποψη της δραστικότητας καταστολής όγκου VHL που είναι συμπληρωματικό ρόλους στη ρύθμιση της αγγειογένεσης και αυτοφαγία.

Σημαντικά , τα επίπεδα πρωτεΐνης FLCN μειωθεί σε ανθρώπινο ccRCC με

VHL

απώλεια, υποστηρίζοντας περαιτέρω έναν ρόλο για αυτή την καταστολέα όγκου στην ανάπτυξη του ccRCC. Μέχρι στιγμής, δεν υπάρχουν μεταλλάξεις FLCN ή μεταβολές στα επίπεδα mRNA έχουν μετρηθεί σε ccRCC. Αυτή η σύγκλιση στις λειτουργίες του VHL και FLCN είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι οι σαφείς καρκίνωμα μπορεί να είναι μέρος της multihistological τύπου της νεφρικής καρκίνου που εμφανίζεται στο σύνδρομο BHD.

Η φύση της άμεσης μοριακός μηχανισμός με τον που VHL προκαλεί FLCN καταστολείς νεφρική όγκου μένει να καθοριστεί, αλλά είναι πιθανό να περιλαμβάνει πολλαπλούς μηχανισμούς. Επειδή μετρήσαμε την επίδραση της VHL για FLCN mRNA επίπεδα σταθερής κατάστασης σε κυτταρικές σειρές RCC, περιμένουμε κάποιο επίπεδο της μεταγραφικής επαγωγή ή σταθεροποίηση της FLCN mRNA. Από την άποψη αυτή δεν βρήκαμε κάποια ανεπιθύμητη των p53 νοκ ντάουν στην έκφραση FLCN. Επειδή δεν βρήκαμε αλλαγές στα επίπεδα FLCN mRNA μεταξύ των ζευγών ανθρώπινου νεφρού-όγκου, αν και βρήκαμε διαφορά στην σταθερή κατάσταση FLCN πρωτεΐνης, προτείνουμε ότι υπάρχει επίσης μια σημαντική μεταγραφική συνιστώσα του παρόντος κανονισμού, ενδεχομένως, ανάλογα με την ιδιαιτερότητα του διαφορετικών κυττάρων του νεφρού πληθυσμούς. Μια εξήγηση είναι ότι VHL μπορεί να καταστείλει την έκφραση συγκεκριμένων microRNAs, οι οποίες με τη σειρά τους καταπιέζουν FLCN μετάφραση.

Εν ολίγοις, με την παρούσα μελέτη, έχουμε δώσει πρώτα στοιχεία για μια άμεση σύνδεση μεταξύ του VHL και FLCN καταστολής όγκου μονοπάτια συγκλίνουν στη ρύθμιση της αυτοφαγία σε καρκίνο του νεφρού.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

VHL επάγει την έκφραση διαφόρων γονιδίων που εκφράζονται από τον τόπο Smith-Magenis σε 786-0 και Α498 κύτταρα. Η γραφική παράσταση δείχνει τις αλλαγές στην έκφραση των μεμονωμένων mRNAs με βάση ποσοτικές μετρήσεις qRT-PCR. Διπλώστε αλλαγή αντιπροσωπεύει τη διαφορά σε έκφραση των mRNAs σε VHL (+) έναντι VHL (-) κύτταρα. Η αλληλουχία των εκκινητών παρέχεται σε

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s001

(PDF)

Πίνακα S1.

Λίστα των γονιδίων καταστέλλεται σημαντικά ή προκαλείται από VHL σε 786-O κύτταρα. Διπλώστε αλλαγή αντιπροσωπεύει VHL (+) /VHL (-) αναλογία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s002

(DOCX)

Πίνακας S2.

Γονίδια που προκαλούνται σημαντικά από VHL και εμπλουτίζεται για συγκεκριμένες χρωμοσωμικές ή cytoband

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s003

(XLS)

Πίνακα S3.

Γονίδια μειωθεί σημαντικά από VHL και εμπλουτίζεται για συγκεκριμένες χρωμοσωμικές ή cytoband

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s004

(DOCX)

Πίνακας S4.

Ακολουθία των εκκινητών για τα υποδεικνυόμενα γονίδια που χρησιμοποιούνται στην qRT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070030.s005

(DOCX)

Ευχαριστίες

ευχαριστώ Γ Doerman για την προετοιμασία των σχημάτων και Δρ Μ Daston για την επεξεργασία του χειρογράφου.