Αφηρημένο

Στόχος

Ανάπτυξη ισχυρό προγνωστικό ή /και προγνωστική βιολογικών δεικτών σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) είναι επιτακτική ανάγκη για την προώθηση στρατηγικές θεραπείας για την ασθένεια αυτή. Έχουμε ως στόχο να καθορίσει αν το καθεστώς έκφραση ορισμένων miRNAs μπορεί να έχουν προγνωστική /προγνωστική αξία σε ασθενείς CRC αντιμετωπίζεται με συμβατική κυτταροτοξική χημειοθεραπεία.

Μέθοδοι

Μελετήσαμε μία ομάδα από 273 δείγματα CRC από το στάδιο II /ασθενείς III που έλαβαν θεραπεία με 5-φθοριοουρακίλη-επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη και το στάδιο IV ασθενείς που υποβάλλονται σε 5-φθοριοουρακίλη και οξαλιπλατίνη χημειοθεραπεία με βάση. Σε ένα σύνολο ελέγχου (n = 44), 13 από 21 υποψήφιων miRNAs ποσοτικοποιήθηκαν επιτυχώς με πολλαπλή ποσοτική RT-PCR. Στη σειρά επικύρωσης, το οποίο ολόκληρης της κοόρτης του ασθενούς, κατάσταση έκφρασης miR-148a εκτιμήθηκε με ποσοτική RT-PCR, και μεθυλίωση προαγωγού του ποσοστώθηκε με όξινο θειώδες Pyrosequencing. Τέλος, αναλύσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης του miR-148a και την επιβίωση των ασθενών.

Αποτελέσματα

Μεταξύ των υποψηφίων miRNAs που μελετήθηκαν, η έκφραση του miR-148a ήταν πιο σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε προχωρημένο ιστούς CRC. Στο στάδιο ΙΙΙ και IV CRC, χαμηλή έκφραση του miR-148a συσχετίστηκε με σημαντικά μικρότερο ελεύθερο νόσου επιβίωση (DFS), ένα χειρότερο θεραπευτική ανταπόκριση, και την κακή συνολική επιβίωση (OS). Επιπλέον, η κατάσταση μεθυλίωσης του miR-148a συσχετίζεται αντιστρόφως με την έκφραση του, και συνδέθηκε με χειρότερη επιβίωση σε στάδιο IV CRC. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, η έκφραση του miR-148a ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό /προγνωστική βιοδείκτη για ασθενείς με προχωρημένο CRC (DFS στο στάδιο ΙΙΙ, χαμηλή έναντι υψηλής έκφρασης, HR 2,11? OS στο στάδιο IV, HR 1,93)

Συζήτηση. κατάσταση

MiR-148a έχει προγνωστική /προγνωστική αξία σε ασθενείς με προχωρημένο CRC αντιμετωπίζεται με συμβατική χημειοθεραπεία, η οποία έχει σημαντικές κλινικές επιπτώσεις στη βελτίωση των θεραπευτικών στρατηγικών και εξατομικευμένη διαχείριση αυτής της κακοήθειας

Παράθεση:. Takahashi Μ, Cuatrecasas Μ, Μπαλαγκέρ F, Hur Κ, Toiyama Υ, Castells A, et al. (2012) Η κλινική σημασία της MiR-148a ως έξυπνη βιοδεικτών σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (10): e46684. doi: 10.1371 /journal.pone.0046684

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 18 Ιουνίου, 2012? Αποδεκτές: 3 του Σεπτεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2012

Copyright: © Takahashi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα έργο χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις R01 CA72851 και CA129286 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, με κονδύλια από το Ινστιτούτο Baylor Ερευνών (CRB και AG), καθώς και από επιχορηγήσεις από το Ministerio Επιστημών e Innovación (SAF2010-19273), Agencia de διοίκηση αλλοτρίων d’Ajuts Universitaris i de Recerca (2009 SGR 849? AC), και Fundación mutua Madrileña (AP7901-2010? MC), XBTC, BT, Biobanc. MT υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση από το κινητό Ίδρυμα Επιστημών Ερευνών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επί του παρόντος, ορθοκολικό καρκίνο (CRC) των ασθενών με μετάσταση λεμφαδένα (ΤΝΜ στάδιο III) υποβάλλεται σε επεξεργασία με επικουρική χημειοθεραπεία που περιλαμβάνει κυτταροτοξικά φάρμακα όπως 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και οξαλιπλατίνη, μετά από χειρουργική εκτομή του Καρκίνος. Ομοίως, οι ασθενείς με απομακρυσμένες μεταστατικό CRC (στάδιο IV) υποβάλλεται σε επεξεργασία με διάφορους συνδυασμούς χημειοθεραπευτικών φαρμάκων και μοριακά στόχευση φάρμακα που περιλαμβάνουν αντι-VEGF και αντισώματα αντι-ΕΟΡΚ. Αν και αυτά τα θεραπευτικά σχήματα έχουν βελτιωμένα αποτελέσματα σε ασθενείς με προχωρημένο CRC, ένα σημαντικό ποσοστό των ατόμων που αδυνατούν να αντλήσουν κανένα όφελος από αυτές τις θεραπείες, και κάποια εμπειρία χειρότερα αποτελέσματα ως αποτέλεσμα της τοξικότητας του φαρμάκου που σχετίζονται. Υπάρχει επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη της πρόβλεψης βιοδείκτες που μπορούν να επιλέξετε την υποομάδα των ασθενών που θα επωφεληθούν από τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα, έτσι ώστε οι ασθενείς οι οποίοι δεν θα ωφεληθούν από τη θεραπεία μπορεί να γλιτώσει από την τοξικότητα των φαρμάκων και προσφέρονται εναλλακτικές θεραπείες.

οι μεταλλάξεις στο

KRAS

είναι οι μόνοι εγκατεστημένοι πρόβλεψης δείκτες για την επιλογή των θεραπευτικών στρατηγικών στην CRC. Οι ασθενείς με όγκους που φέρουν μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 ή 13 του

KRAS

γονίδιο δεν επωφελούνται από φαρμακευτική θεραπεία αντι-ΕΟΡΚ που βασίζεται [1], [2], και κατά συνέπεια, ο έλεγχος για αυτή τη μετάλλαξη συνιστάται για όλους ασθενείς σταδίου IV που είναι υποψήφιοι για αντι-EGFR φαρμακευτική θεραπεία που βασίζεται σε αντίσωμα. Επιπλέον, αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI), ένα φαινότυπο παρόν σε -15% του ΚΕΣ, έχει δειχθεί ότι συνδέουν με βελτιωμένη συνολική επιβίωση (OS), ανεξάρτητα από επικουρική χημειοθεραπεία, καθώς και την έλλειψη κέρδους από 5-FU χημειοθεραπεία βασισμένη σε στάδιο ασθενείς II [3], [4]. Ωστόσο, αν η MSI έχει προγνωστική αξία σε ασθενείς σταδίου III που έλαβαν θεραπεία με χημειοθεραπεία παραμένει αβέβαιη [5], [6]. Ενώ μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι άλλες μοριακών δεικτών, όπως η κατάσταση φαινότυπο CpG νησιού methylator ή έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA ή του μεταβολισμού του φαρμάκου (όπως

ERCC1

και

Tyms

) μπορεί να έχουν δυναμικό ως προγνωστικοί /προγνωστική δείκτες, υπάρχει ανεπαρκής συνεπή δεδομένα που υποστηρίζουν τη χρησιμότητα αυτών των δεικτών [7] – [11]. Στο σύνολό τους, παρά άλματα γίνονται στη γονιδιωματική και Γενετικής χαρακτηρισμό του CRC, δεν υπάρχουν

ιδρύθηκε

βιοδείκτες που μπορεί αξιόπιστα να προβλέψει θεραπευτικά αποτελέσματα από τη συμβατική κυτταροτοξική χημειοθεραπεία σε ασθενείς με σταδίου ΙΙΙ ή IV CRC.

Δυσλειτουργία του microRNA (miRNA) έκφραση εμπλέκεται στην ογκογένεση νωρίς καθώς εξέλιξη της νόσου σε διάφορες κακοήθειες [12], [13]. miRNAs ασκούν ογκογόνο ή /και όγκου κατασταλτικά αποτελέσματα τους με σύνδεση στο 3′-αμετάφραστες περιοχές του mRNA, οδηγώντας σε καταστολή της μετάφρασης ή ενισχυμένη αποικοδόμηση του αντίστοιχου μηνύματος. Στο CRC, απορρυθμισμένη έκφραση αρκετών miRNAs, συμπεριλαμβανομένου του miR-17~92, miR-21, miR-31, miR-34b /c, miR-143, miR-145, και miR-203 έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [14] – [17]. Από miRNAs διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην ανθρώπινη καρκινογένεση, υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για την ταυτοποίηση των προγνωστικών ή πρόβλεψης miRNAs σε ασθενείς με CRC.

Ωστόσο, μόνο μια χούφτα των εκθέσεων έχουν διερευνήσει τις δυνατότητες των miRNA (s) ως προγνωστική /πρόβλεψης βιοδείκτες στο CRC. Σε μια δημιουργική μελέτη, Schetter

et al.

Έδειξαν ότι το miR-21 μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη προγνωστικό /πρόβλεψης δείκτη στο στάδιο II /III CRC αγωγή με 5-FU χημειοθεραπεία με βάση [17]. Ομοίως, μια άλλη ομάδα έχει δείξει ότι το στάδιο ΙΙ οι ασθενείς με αυξημένη έκφραση του miR-320 ή miR-498 είχε την καλύτερη ελεύθερη υποτροπής επιβίωσης [18]. Ωστόσο, τα μεγέθη των δειγμάτων που αναλύθηκαν στις μελέτες αυτές ήταν σχετικά μικρή, τα αποτελέσματα δεν έχουν επικυρωθεί σε άλλες μελέτες, και δεν υπήρξε καμία προσπάθεια να προσδιοριστεί η προγνωστική χρησιμότητα οποιουδήποτε miRNA σε στάδιο IV CRC. Υποθέσαμε ότι τα προφίλ έκφραση ειδικών miRNA (ες) μπορεί να έχει προγνωστική ή /και προγνωστική αξία σε ασθενείς με σταδίου IV CRC καθώς και εκείνα με τα προηγούμενα στάδια. Εδώ, σε ένα αρχικό στάδιο ελέγχου που εμπλέκονται ανάλυση των 21candidate miRNAs, ανακαλύψαμε ότι το miR-148a συχνά μειωτικά σε προχωρημένο CRC. Στη συνέχεια, αναλύοντας μια μεγάλη ομάδα επικύρωσης των 273 CRCs, θα παράσχει νέα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι το miR-148a είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε αυτή τη νόσο, και αυτό συμβαίνει κυρίως μέσω υπερμεθυλίωση της περιοχής του υποθετικού προαγωγού. Επιπλέον, έχουμε αποδείξει ότι η έκφραση χαμηλή miR-148a είναι σημαντικά συνδέεται με μια δυσμενή έκβαση σε ασθενείς με σταδίου ΙΙΙ CRC που έλαβαν θεραπεία με 5-FU χημειοθεραπεία με βάση και με χειρότερη θεραπευτική ανταπόκριση και την επιβίωση σε ασθενείς με σταδίου IV CRC που έλαβαν θεραπεία με 5- FU και οξαλιπλατίνη.

ασθενείς και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Institutional Review Boards (IRB) της Hospital Clinic, Βαρκελώνη, Ισπανία, και γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

ασθενείς

φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστών από μία ομάδα από 273 ασθενείς με CRC (πρωτοπαθείς όγκους από 76 σταδίου ΙΙ, 125 σταδίου ΙΙΙ και 72 σταδίου IV CRCs) και 20 δείγματα ιστού από την κανονική βλεννογόνο του κόλου υγιών ατόμων ελήφθησαν από το Τμήμα Παθολογίας του Νοσοκομείου Clinic, Βαρκελώνη, Ισπανία. Οι ασθενείς που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη εγγράφηκαν μεταξύ του 1996 και του 2008. Όλα σταδίου II και III ασθενείς έλαβαν θεραπεία με 5-FU επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη για 6 μήνες μετά την εκτομή του όγκου, και όλοι οι σταδίου IV ασθενείς έλαβαν θεραπεία με 5-FU και οξαλιπλατίνη έως ότου η θεραπεία απέτυχε. Οι σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν κάθε τρεις μήνες για τα πρώτα δύο χρόνια, και κάθε έξι μήνες για τα επόμενα τρία χρόνια. Τόσο τοποπεριοχική υποτροπή ή /και μακρινή μετάσταση ορίστηκαν ως υποτροπή του όγκου, ενώ metachronous παχέος βλάβες δεν θεωρήθηκαν ως υποτροπή. Οι μέσοι χρόνοι παρακολούθησης είναι 52,2 μήνες (εύρος? 2,9 έως 173 μήνες) στο στάδιο ΙΙ και ΙΙΙ των ασθενών, και 19,1 μήνες (εύρος? 3,7 έως 83,7 μήνες) στη φάση IV ασθενείς. Μεταξύ σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ ασθενείς, 70 ασθενείς (35%) είχαν υποτροπή του όγκου (διάμεση τιμή? 17,8 μήνες, εύρος: 5,5 έως 144 μήνες), και το μεσαίο DFS της μη επανάληψης των ασθενών ήταν 40,5 μήνες (εύρος? 7,5 έως 155 μήνες) . Η παρακολούθηση των ασθενών ολοκληρώθηκε το Νοέμβριο του 2009. ανταπόκριση Χημειοθεραπευτικοί στο στάδιο IV ασθενείς αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα Κριτήρια Αξιολόγησης απόκρισης σε συμπαγείς όγκους (RECIST) κατευθυντήριες γραμμές [19], κάθε δύο μήνες. MSI κατάσταση των όγκων προσδιορίστηκε με ανάλυση πέντε δείκτες μονονουκλεοτίδιο (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21, και NR-24? MSI Σύστημα Ανάλυσης, Promega, Madison, Wisconsin, USA). Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

DNA και RNA εκχύλιση

DNA εκχυλίστηκε από 10 μm πάχους ιστούς FFPE χρησιμοποιώντας το κιτ ιστού QIAmp DNA FFPE (Qiagen , Valencia, California, USA). Ολικό RNA που περιλαμβάνει το κλάσμα miRNA εκχυλίστηκε από ιστούς FFPE χρησιμοποιώντας το RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid Απομόνωση Kit (Ambion, Inc., Austin, Texas, USA).

Multiplex ποσοτική RT-PCR

ένα σύνολο ελέγχου που περιλάμβανε φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου από υγιή άτομα και 44 ιστούς CRC (16 σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ η κάθε μία και 12 σταδίου IV ασθενείς), η κατάσταση έκφρασης των 21 υποψήφιων miRNAs (miR-9, miR-10b, miR-19a, miR -21, miR-31, miR-34a, miR-34c, miR-101, miR-103, miR-137, miR-143, miR-145, miR-148a, miR-148b, miR-152, το miR-155 , miR-194, miR-320, miR-335, miR-373 και miR-519c) προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας τα υψηλής απόδοσης Fluidigm μικρορροϊκή δυναμική συστοιχίες [20]. Κάθε δοκιμασία Taqman miRNA (. Μέρος δεν 4427975, Applied Biosystems, Foster City, California, USA) χρησιμοποιήθηκε στην πολλαπλή ανάλυση RT-PCR ως εξής: ID δοκιμασία, 000583, 002218, 000395, 000397, 002279, 000426, 000428, 002253 , 000439, 001129, 002249, 002278, 000470, 000471, 000475, 002623, 000493, 002277, 000546, 000561 και 001163 αντίστοιχα. Αυτά τα υποψήφια miRNAs έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι εμπλέκεται στην CRC και /ή άλλες ανθρώπινες κακοήθειες [16], [18], [21] – [35].

Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης miRNA με πραγματικού χρόνου RT- PCR

Στη σειρά επικύρωσης που περιλάμβαναν το σύνολο της κοόρτης του ασθενούς, η έκφραση miRNA ποσοτικοποιήθηκε με Taqman αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ΑΒΙ 7000 (Applied Biosystems). Η έκφραση του miR-148a υπολογίστηκε με τη μέθοδο της τιμής Ct δέλτα, χρησιμοποιώντας miR-16 έκφρασης ως normalizer [36], [37]. Για να κρατήσει συνεπή μετρήσεις σε όλα τα τρυβλία, τρία ανεξάρτητα δείγματα RNA φορτώθηκαν όπως εσωτερικοί έλεγχοι σε κάθε εκτέλεση PCR, και τα αποτελέσματα από κάθε πλάκα ομαλοποιήθηκαν σύμφωνα με τα στοιχεία που λαμβάνονται από εσωτερικούς ελέγχους.

μεθυλίωσης DNA ανάλυση

DNA ήταν όξινο θειώδες τροποποιηθεί χρησιμοποιώντας το EZ μεθυλίωσης του DNA Gold Kit (Zymo Research, Irvine, California, USA). Η μεθυλίωση της περιοχής υποκινητή υποθετική miR-148a ποσοτικά με όξινο θειώδες Pyrosequencing (σύστημα Pyrosequencing PSQ ΕΣ 96Α, Qiagen). Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν? miR-148a προς τα εμπρός, 5′-βιοτίνη-TAGGAAGGAAGGAGAGTG, miR-148a αντίστροφη, 5′-CCCAACAAAAATAATATTTTAACA, και αλληλουχίας miR-148a, 5′-CAAAAATAATATTTTAACAACC. Τα επίπεδα μεθυλίωσης του τρεις θέσεις CpG αναλύθηκαν και το επίπεδο μεθυλίωσης του κάθε όγκου αναπαρίσταται ως η μέση τιμή των επιπέδων μεθυλίωσης των τριών τόπων CpG. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες κύκλου PCR: αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 7 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 52 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 30 sec

In situ υβριδισμού

για miR-148a

Σε situ υβριδισμού

(ISH) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται από τον Navarro et al. [38] με μικρές προσαρμογές. Ένα φλουορεσκεΐνη (FITC) 5′-επισημασμένο κλειδωμένη οξύ-ενσωματώνεται miRNA ανιχνευτή νουκλεϊκού (ανιχνευτής ανίχνευσης miRCURY LNA, Exiqon, Woburn, Massachusetts, USA) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση του miR-148a επί 3 μm πάχους τομές ιστού FFPE. Ένα περιπλεγμένο και ένας ανιχνευτής RNU6b συμπεριλήφθηκαν ως αρνητικός και θετικός έλεγχος, αντίστοιχα (Exiqon). Οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε ένα φούρνο στους 59 ° C όλη τη νύκτα. Οι τομές αποπαραφινώθηκαν με ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν με αιθανόλη, και υποβάλλεται σε επεξεργασία με διαιθυλπυροανθρακικό νερό για 1 λεπτό. Χρωμογόνο ISH πραγματοποιήθηκε σε μια αυτοματοποιημένη πλατφόρμα Bond Max (Vision BioSystems, Norwell, Μασαχουσέτη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με πρωτεάση 1 για 4 λεπτά στους 37 ° C. Ένα σύνολο 300 μΙ ιχνηλάτη 25 ηΜ υβριδοποιήθηκε σε χλωριούχο νάτριο, ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού κιτρικό νάτριο στους 45 ° C όλη τη νύκτα. Ανοσολογική ανίχνευση διεξήχθη με αντι-ΡΙΤΟ αντισώματος ποντικού στους 37 ° C για 60 λεπτά που ακολουθείται από ένα βιοτίνης-free, πολυμερικό σύστημα υπεροξειδάσης κοχλιαρίας συζυγές συνδετήρα αντίσωμα (Σύστημα Ανίχνευσης Βελτίωση, Vision BioSystems). DAB χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο και αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε ως αντιχρώση.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA) ή MedCalc v12 (λογισμικό MedCalc, Βέλγιο). Οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αναλύθηκαν με το U-test Mann-Whitney. αναλύσεις συσχέτισης πραγματοποιήθηκαν με τη μέθοδο κατάταξης συσχέτισης Spearman του. Οι όγκοι CRC κατηγοριοποιήθηκαν σε ομάδες έκφραση υψηλής και χαμηλής miR-148 με τη χρήση λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη ανάλυση καμπύλης τις μέσες τιμές έκφρασης (στάδιο IV) (στάδιο II /III) ή. Η ανάλυση Kaplan-Meier διεξήχθη για να εκτιμήσει τις κατανομές επιβίωσης ελεύθερης νόσου (DFS) και ειδική για τον καρκίνο συνολική επιβίωση (OS) στο στάδιο ΙΙ και ΙΙΙ ασθενείς, και η επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) και το λειτουργικό σύστημα στο στάδιο IV ασθενείς. Μια δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν οι στατιστικές διαφορές στην επιβίωση όπως συμπεραίνεται από καμπύλες Kaplan-Meier. Cox ανάλυση παλινδρόμησης αναλογικού-κινδύνου πραγματοποιήθηκε για τον υπολογισμό ΥΕ και 95% CI για κάθε covariable. Το τελικό πολυπαραγοντικό μοντέλο βασίστηκε σε μια κλιμακωτή μέθοδο για την κλινική παράγοντες που σχετίζονται με την καλή ή κακή επιβίωση (p & lt? 0,1) σε μονοπαραγοντική μοντέλα. Για την ανάλυση επιβίωσης, η μοναχική του όγκου MSI είχε αποκλειστεί από την ομάδα στάδιο IV. Όλες οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

miR-148a είναι υποψήφια miRNA που είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται στο στάδιο ΙΙΙ και IV CRC

σε ένα σύνολο διαλογής, θα προβληθεί πρώτα 21 υποψήφιες miRNAs που έχουν ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση, χρησιμοποιώντας τα Fluidigm Microfluidics δυναμική συστοιχίες (n = 44? συμπληρωματικό πίνακα S1). Μεταξύ των 21 miRNAs που αναλύθηκαν, 13 miRNA απέδωσε επιτυχώς τα αποτελέσματα της έκφρασης στην πολλαπλή RT-PCR. Επτά miRNAs έδειξαν μεταβληθεί σημαντικά έκφρασης μεταξύ των φυσιολογικών και CRC ιστούς. Μεταξύ όλων, μόνο miR-148a αποκάλυψε μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω σε όγκους με λεμφαδένων (στάδιο ΙΙΙ) ή μακρινή μετάσταση (IV) σε σύγκριση με τους όγκους χωρίς (II), η οποία υπογραμμίζει τη σημασία αυτού του miRNA στην CRC εξέλιξη /μετάσταση. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, μπορούμε στη συνέχεια καθορίζεται αν ένα miR-148a αλλοίωση έκφραση σε μια μεγαλύτερη ομάδα της CRC έχει κάποια προγνωστική /προγνωστική αξία.

Σε ολόκληρη την ομάδα μας (n = 273), miR-148a έκφραση στο στάδιο III /IV όγκους ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στην κανονική βλεννογόνο του κόλου (ρ & lt? 0,001? Σχήμα 1Α). Παρατηρήσαμε επίσης μία τάση προς προοδευτική μείωση της έκφρασης miR-148a με την προχωρημένη φάση των CRCs (Σχήμα 1Α). Πιο συγκεκριμένα, η έκφραση του miR-148a σε στάδιο III και IV όγκοι ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στην κανονική βλεννογόνο του κόλου (ρ & lt? 0,001), ενώ δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των όγκων σταδίου II και των κανονικών βλεννογόνου δείγματα (ρ = 0,41? Σχήμα 1Α) .

Α. έκφραση του miR-148a στο βλεννογόνο του κόλου από υγιείς μάρτυρες (NC), και στο στάδιο ΙΙ, ΙΙΙ και IV CRCs? ο αριθμός των ασθενών (Ν) και ο μέσος έκφρασης (διάμεση τιμή) παρατίθενται κάτω από το γράφημα. Β

Η in situ υβριδοποίηση

για miR-148a σε όγκους CRC και φυσιολογικό βλεννογόνο, στην οποία το χρωμογόνο λεκέδες κόκκινο, και το επίχρωση μπλε. Αντιπροσωπευτικά μικροφωτογραφίες φαίνονται από ένα φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου (επάνω πάνελ), ενός όγκου με χαμηλή έκφραση miR-148a (μεσαία πλαίσια), και ενός όγκου με υψηλή έκφραση miR-148a (κάτω πάνελ) στο υποδεικνυόμενο μεγεθύνσεις. Μια μικροφωτογραφία δεικνύεται από έναν όγκο με έκφραση υψηλού miR-148a χρησιμοποιώντας ανιχνευτή σκαρφάλωμα ως αρνητικός έλεγχος (κάτω, αριστερό πάνελ). Γ επίπεδα miR-148a μεθυλίωσης στο στάδιο IV όγκους. Η υποθετική περιοχή προαγωγού του miR-148a, και η θέση του Pyrosequencing εκκινητές απεικονίζονται στο πέτασμα κορυφής. Το διάγραμμα διασποράς των επιπέδων έκφρασης miR-148a και μεθυλίωσης φαίνονται στον κάτω πίνακα. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-148a Δ παρουσιάζεται για μετουσιωμένο και μη-μετουσιωμένο CRCs στην κορυφή του πίνακα. Τα επίπεδα μεθυλίωσης miR-148a δείχνονται για όγκους με υψηλή και χαμηλή έκφραση miR-148a στον κάτω πίνακα. Μία τιμή ακραία τιμή (το επίπεδο μεθυλίωσης? 48%). Εξαιρείται από την μεθυλιωμένη ομάδα στο γράφημα κάτω

Η

Στη συνέχεια, για να επιβεβαιώσετε το πρότυπο έκφρασης όγκου-ειδικά για miR-148a, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ISH σε ένα υποσύνολο του σταδίου IV όγκων με υψηλό και χαμηλό έκφραση miR-148a. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση σε φυσιολογικό κολονικό βλεννογόνο του σταδίου όγκους II ήταν υψηλό, επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα qRT-PCR (Εικόνα 1Β). CRCs με υψηλή έκφραση miR-148a στο qRT-PCR εκφράζεται επίσης αυτή miRNA κυρίως εντός του κυτταροπλάσματος των νεοπλασματικών κυττάρων (Σχήμα 1Β), αλλά όχι στα μη επιθηλιακά κύτταρα στρωματικά, εκτός από την χρώση μερικών φλεγμονωδών κυττάρων στο χορίο, ιδιαίτερα τα πλασματοκύτταρα. Επιπλέον, CRCs με χαμηλή έκφραση miR-148a εξακριβωθεί με qRT-PCR αποκάλυψε επίσης πολύ χαμηλή ή απούσα έκφραση αυτού του miRNA σε επίπεδο ISH (Εικόνα 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα αποτελέσματα qRT-PCR μας αντικατοπτρίζεται με ακρίβεια την ενδογενή έκφραση του miR-148a μέσα στα καρκινικά κύτταρα που λαμβάνονται από δείγματα ιστών CRC.

Η έκφραση του miR-148a συσχετίζεται αντίστροφα με μεθυλίωση προαγωγού κατάσταση

του

Η υποθετική περιοχή προαγωγού των τόπων miR-148a εντός νησί CpG, και μεθυλίωση αυτών των CpG θέσεων έχουν προταθεί ως πιθανός μηχανισμός για την απενεργοποίηση miR-148a σε CRC και καρκίνους του μαστού [39] – [41]. Ωστόσο, καμία από τις προηγούμενες μελέτες έχουν ερευνήσει σε βάθος την άμεση συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του miR-148a και την κατάσταση μεθυλίωσης του σε μια μεγάλη ομάδα των δειγμάτων καρκίνου. Ως εκ τούτου, μας ενδιαφέρει διευκρίνιση εάν η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-148a που παρατηρείται σε ομάδα μας ήταν μια συνέπεια της υπερμεθυλίωσης του υποκινητή. Από το miR-148a ήταν πιο συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε στάδιο IV CRC, επικεντρώσαμε την ανάλυση μεθυλίωσης μας για αυτούς τους όγκους. Ποσοτική θειώδους Pyrosequencing αποκάλυψε ότι ορισμένοι στάδιο IV CRCs αποδειχθεί miR-148a υπερμεθυλίωση. Τα επίπεδα μεθυλίωσης κυμάνθηκε μεταξύ 4-26% (διάμεσος, 10%), και όταν η κατάσταση μεθυλίωσης του κάθε όγκου συγκρίθηκε με qRT-ΡΟΚ-λαμβανόμενο κατάσταση έκφρασης του, παρατηρήθηκε μία σημαντική συσχέτιση (συντελεστής Spearman, το R

2 = -0.43, p & lt? 0.001? Σχήμα 1C). Επιπλέον, όταν έχουμε κατηγοριοποιούνται όλους τους όγκους σε ένα μη-μεθυλιωμένου (επίπεδο μεθυλίωσης & lt? 15%) και μεθυλιωμένα ομάδες (≥15% μεθυλίωσης), παρατηρήσαμε ότι οι μεθυλιωμένες όγκοι είχαν έκφραση σταθερά χαμηλότερες miR-148a (0,068 έναντι 0,088, p = 0.029? Σχήμα 1ϋ, κορυφή). Επιπλέον, CRCs με χαμηλότερη έκφραση miR-148a ήταν συχνότερα μεθυλιώνεται σε σύγκριση με όγκους με υψηλότερη έκφραση (διάμεσος, 11% έναντι 8%, ρ = 0,001, Mann-Whitney test υ? Σχήμα 1ϋ, κάτω). Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν ότι η υπερμεθυλίωση της περιοχής του υποκινητή υποθετική miR-148a είναι ένα σημαντικό ρυθμιστικό μηχανισμό για την έκφραση της στην CRC.

έκφραση Χαμηλή miR-148a σχετίζεται με κακή έκβαση σε ασθενείς με σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ CRC

Είμαστε δίπλα στόχο να καθορίσει αν το καθεστώς έκφραση του miR-148a είχε αντίκτυπο στην πρόγνωση σε ασθενείς με σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ CRC αντιμετωπίζονται με επικουρική χημειοθεραπεία 5-FU βάση. Για τις αναλύσεις αυτές, συγκρίναμε τις διαφορές στην DFS και OS μεταξύ της υψηλής έκφρασης (στάδιο ΙΙ = 58, III = 80) και χαμηλή έκφραση (ΙΙ = 18, III = 45) ομάδες. Δεν βρήκαμε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-148a και οποιοδήποτε από τα clinicopathological παράγοντες όπως η ηλικία, το φύλο, τη θέση του όγκου ή status MSI (Πίνακας 1). Ωστόσο, η έκφραση χαμηλή miR-148a συσχετίστηκε σημαντικά με μικρότερη DFS (5-year DFS, χαμηλή έναντι υψηλής, 54% έναντι 71%, p = 0,023? Εικόνα 2Α), και έδειξε μια τάση προς χειρότερη OS (5-ετή OS, 78% έναντι 85%, ρ = 0,12? Σχήμα 2Β). Αξιολογήσαμε την επόμενη της προγνωστικής /προγνωστική αξία της έκφρασης miR-148a σε ένα μοντέλο παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου Cox. Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, το στάδιο υψηλότερο ΤΝΜ (III εναντίον II, HR 2,06, 95% CI 1,21 – 3,52, p = 0,008) και χαμηλότερη έκφραση του miR-148a (HR 1.74, 95% CI 1,08 – 2,83, p = 0,025) ήταν σημαντικά που συνδέονται με μικρότερη DFS και νεότερη ηλικία έδειξε μια τάση προς μικρότερη DFS (& lt? 60, HR 1,57, 95% CI 0,97 – 2,56, p = 0,071? Πίνακας 2). Επιπλέον, στο πολυπαραγοντικό μοντέλο, συμπεριλαμβανομένων αυτών των τριών παραγόντων, κατάσταση η έκφραση του miR-148a συσχετίστηκε ανεξάρτητα με χειρότερη επιβίωση (HR 1.83, 95% CI 1,12 – 2,99, p = 0,017? Πίνακας 2).

Kaplan-Meyer καμπύλες για Α, ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) και Β, η συνολική επιβίωση (OS) στο στάδιο II /III ασθενείς, σύμφωνα με την έκφραση του miR-148a. Kaplan-Meyer καμπύλες για C, DFS στο στάδιο ΙΙ και D, στάδιο ΙΙΙ DFS ανάλογα με την έκφραση του miR-148a.

Η

επόμενο ανέλυσαν στοιχεία από το στάδιο ΙΙ και ΙΙΙ CRC χωριστά για να διαπιστωθεί αν η συσχέτιση μεταξύ χαμηλής έκφρασης miR-148a και χειρότερη έκβαση ήταν ομοιόμορφη στις δύο στάδια, ή κατά κύριο λόγο ευθυγραμμίζεται με ένα στάδιο. Βρήκαμε ότι στο στάδιο II, η έκφραση του miR-148a δεν συνδέουν με DFS (5-year DFS, υψηλή έναντι χαμηλή, 77% έναντι 83%, p = 0,50? Σχήμα 2C) ή OS (5-ετή OS, 89 % έναντι 87%, ρ = 0,94? δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, στο στάδιο ΙΙΙ, χαμηλή έκφραση του miR-148a ήταν σημαντικά σχετίζεται με φτωχότερη DFS (5-year DFS, 43% έναντι 66%, p = 0.0071? Σχήμα 2D), αλλά όχι με το OS (5-ετή OS, το 75% vs . 81%, ρ = 0,16? δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η χαμηλή έκφραση του miR-148a ήταν ένας μόνος παράγοντας που σχετίζεται με την υποτροπή του όγκου στο στάδιο ΙΙΙ (Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η κατάσταση έκφρασης του miR-148a έχει δυνατότητες ως προγνωστικός /προγνωστική βιοδείκτη για τη φάση III CRC.

έκφραση Χαμηλή miR-148a συνδέεται με χειρότερη μια θεραπευτική ανταπόκριση και χειρότερη επιβίωση σε στάδιο IV CRC

επόμενο διευκρινιστεί αν το καθεστώς miR-148a είχε ένα δυναμικό για την πρόβλεψη θεραπευτικό αποτέλεσμα σε ασθενείς με σταδίου IV CRC που έλαβαν θεραπεία με 5-FU και οξαλιπλατίνη. Την ηλικία, το φύλο, τη θέση του όγκου, και κατάσταση απόδοσης δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των υψηλών και χαμηλών ομάδες έκφρασης (Πίνακας 1). Όγκοι από μη ανταποκρινόμενοι (σταθερή νόσο και προοδευτική νόσο) έδειξε μια τάση προς χαμηλότερη έκφραση του miR-148a σε σύγκριση με εκείνα από ανταποκρίθηκαν (πλήρης ανταπόκριση και μερική ανταπόκριση) (διάμεση τιμή, 0.063 έναντι 0.092, p = 0,10? Σχήμα 3Α, αριστερά) . Παρ ‘όλα αυτά, όταν οι όγκοι σταδίου IV χωρίστηκαν σε ομάδες έκφρασης χαμηλής και υψηλής miR-148a, η ομάδα χαμηλής έκφρασης ήταν σημαντικά σχετίζεται με μια δυσμενή θεραπευτική ανταπόκριση (που ανταποκρίθηκαν, 49% έναντι 81%, p = 0,006? Σχήμα 3Α, το δικαίωμα ). Στην ανάλυση Kaplan-Meyer, η ομάδα χαμηλής έκφρασης έδειξε μια τάση προς χειρότερη PFS (διάμεση τιμή, 8,1 έναντι 10,1 μηνών, p = 0,16? Σχήμα 3Β, αριστερά) και σημαντικά χειρότερη OS (16,1 έναντι 25,6 μηνών, p = 0,024? Εικόνα 3Β, δεξιά). Εκτός από την κατάσταση έκφρασης, την κατάσταση μεθυλίωσης miR-148a που σχετίζεται επίσης και με τα δύο χειρότερα PFS (μεθυλιωμένο έναντι μη μεθυλιωμένου, 6,9 έναντι 9,3 μηνών, p = 0,020? Εικόνα 3C, αριστερά) και OS (10,2 έναντι 21,8 μήνες p = 0,0015? Σχήμα 3C, δεξιά)

.. Θεραπευτική αντιμετώπιση σύμφωνα με την έκφραση του miR-148a. Πλήρης ανταπόκριση, CR? μερική ανταπόκριση, PR? σταθερή νόσο, SD? προοδευτική ασθένεια? PD. Β Kaplan-Meyer καμπύλες για επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS, αριστερό πάνελ) και OS (δεξιά πάνελ) στη φάση IV ασθενείς, σύμφωνα με την έκφραση του miR-148a. Γ Kaplan-Meyer καμπύλες για PFS (αριστερό πάνελ) και OS (δεξιά πάνελ) στη φάση IV ασθενείς, σύμφωνα με miR-148a μεθυλίωσης.

Η

Αξιολογήσαμε επίσης την προγνωστική αξία του miR-148a σε ένα Cox αναλογικό μοντέλο κινδύνου. Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, χειρότερα PS (HR 2.62, 95% CI 1,26 – 5,43, p = 0,010), μειώνουν την έκφραση του miR-148a (HR 1.79, 95% CI 1,08 – 2,98, p = 0,026) και miR-148a υπερμεθυλίωση (HR 2.76 , 95% CI 1,44 – 5,28, p = 0,002) συσχετίζονταν σημαντικά με χειρότερη επιβίωση (Πίνακας 3). Στο τελικό πολυπαραγοντικό μοντέλο που περιελάμβανε τους τρεις αυτούς παράγοντες, τόσο το καθεστώς έκφραση του miR-148a (HR 1.93, 95% CI 1.15 έως 3.23, p = 0,014) και miR-148a υπερμεθυλίωση (HR 3.04, 95% CI 1,56 – 5,93, p = 0,0011) αναδείχθηκε ως ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες που σχετίζονται με φτωχότερη έκβαση (Πίνακας 3).

Η

Συζήτηση

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διευκρινιστεί αν η έκφραση του miR-148a είναι απορυθμίζεται σε CRC, και επιπλέον, αν αυτό έχει τη δυνατότητα να χρησιμεύσει ως προγνωστικός ή πρόβλεψης βιοδείκτη σε αυτή την ασθένεια. Στο παρόν, δεν παρέχουν στοιχεία που αναδεικνύουν ένα σημαντικό ρόλο για το miR-148a απορρύθμισης στην CRC. Κατ ‘αρχάς, η έκφραση του miR-148a ήταν συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε CRC, ιδίως στις προηγμένες όγκους στάδιο. Δεύτερον, η έκφραση του miR-148a στο παχύ έντερο ρυθμιζόταν τουλάχιστον εν μέρει μέσω επιγενετικών μηχανισμών επί τη βάσει του αντίστροφη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της έκφρασης του και την κατάσταση μεθυλίωσης. Τρίτον, χαμηλή έκφραση του miR-148a συσχετίστηκε ανεξάρτητα με κακή πρόγνωση σε στάδιο ΙΙΙ ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με επικουρική χημειοθεραπεία. Τέταρτον, χαμηλή έκφραση του miR-148a συσχετίστηκε επίσης με χειρότερη θεραπευτική ανταπόκριση και φτωχότερη επιβίωση σε στάδιο IV ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με χημειοθεραπεία. Τέλος, η κατάσταση μεθυλίωσης ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για χειρότερη πρόγνωση σε στάδιο IV CRC.

In vitro μελέτες

χρησιμοποιώντας μη-παχέος κυτταρικές σειρές έχουν δείξει ότι το miR-148a ασκεί μια λειτουργία καταστολής όγκου με στόχευση πολλά γονίδια, όπως

PXR

,

TGIF2

,

MSX1

,

CDC25B

,

DNMT1

και

DNMT3b

[39], [42] – [46]. Η απορύθμιση της miR-148a έχει ενοχοποιηθεί σε CRC [14], [29], [39], [47], ωστόσο, η κλινική σημασία του αλλοιωμένη έκφραση miR-148a σε CRC αναμένεται να διευκρινιστεί πλήρως. Στη μελέτη μας, έχουμε αναλύσει τη μεγαλύτερη ομάδα ασθενών CRC μέχρι σήμερα (n = 273) και με την προϋπόθεση αδιάσειστες αποδείξεις ότι η έκφραση του miR-148a είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε προχωρημένο CRC και μειωμένη έκφραση της σχετίζεται με χειρότερη επιβίωση σε στάδιο ΙΙΙ και νόσος IV. Για το καλύτερο της γνώσης μας, καμία από τις προηγούμενες εκθέσεις έχουν ξεκινήσει με την ταυτοποίηση των miRNAs ως βιοδείκτες για την πρόβλεψη της θεραπευτικής ανταπόκρισης στο στάδιο IV ασθενείς CRC αγωγή με κυτταροτοξική χημειοθεραπεία. πιο κλινικά σημαντική παρατήρηση μας ήταν ότι το στάδιο IV ασθενείς CRC με υψηλή έκφραση του miR-148a ήταν πιο πιθανό να ωφεληθούν από κυτταροτοξική χημειοθεραπεία, τονίζοντας τη δυνητικά μυθιστόρημα προγνωστική αξία αυτής της miRNA ως εργαλείο λήψης αποφάσεων στη διαχείριση των ασθενών με CRC.

Οι ακριβείς μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω miR-148a κάτω ρύθμιση για την προώθηση της αντίστασης των κυττάρων CRC στη χημειοθεραπεία απαιτούν περαιτέρω διευκρίνιση. Ωστόσο, πρόσφατα στοιχεία για το ρόλο αυτού του miRNA σε άλλους καρκίνους έχουν προσφέρει ενδείξεις για την κατανόηση ορισμένων από τα αποτελέσματά της στην κυτταρική χημειοευαισθησίας. Fujita

et al.

Ανέφερε ότι το miR-148a στοχεύει άμεσα

MSK1

και η επιμόλυνση των πρόδρομων αυξημένη ευαισθησία του σε πακλιταξέλη σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [43]. έκφραση miR-148a έχει επίσης αποδειχθεί ότι βελτιώνει την ανταπόκριση στη σισπλατίνη και 5-FU σε καρκίνο του οισοφάγου κύτταρα [48]. Εκτός από αυτά

in vitro

ευρήματα, σε νέους ασθενείς με οξεία μυελοειδή λευχαιμία, υψηλότερες

BAALC

γονιδιακή έκφραση συσχετίζεται αντιστρόφως με έκφραση miR-148a, και έχει δειχθεί να συνδέσει με χειρότερη έκβαση ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με χημειοθεραπεία [49]. Συλλογικά, οι παρατηρήσεις μας για τις δυνατότητες της κατάστασης έκφρασης miR-148a ως προγνωστικό δείκτη σε στάδιο IV CRC συμφωνούν με αυτές τις προηγούμενες εκδόσεις και σε άλλες μορφές καρκίνου.

Η μελέτη μας είναι επίσης η πρώτη προσπάθεια για να επιβεβαιώσετε την μεθυλίωση μεσολάβηση αποσιώπηση της miR-148a με απευθείας σύγκριση των επιπέδων έκφρασης και μεθυλίωσης σε μια μεγάλη ομάδα καλά σχολιασμένο CRCs. Εκτός από τις αρχικές μελέτες με Lujambio

et al.

[39], πιο πρόσφατα δείχθηκε ότι miR-148a ήταν υπερμεθυλίωση σε 51 από τις 78 CRCs [40]. Ωστόσο, καμία από αυτές τις μελέτες που έχουν διεξαχθεί ανάλυση της έκφρασης του miR-148a και σχετίζεται άμεσα τα αποτελέσματά τους με υπερμεθυλίωση στους ιστούς. Επιπλέον, και οι δύο μελέτες αναλύθηκαν κατάσταση μεθυλίωσης miR-148a χρησιμοποιώντας ένα μη-ποσοτική μεθυλίωση-ειδική μέθοδο PCR, η οποία είναι εμφανώς μη ειδική για μεθυλίωση, και δεν παρέχει ένα κατώτατο όριο για μεθυλίωση που συσχετίζεται με μεταγραφική απενεργοποίηση του γονιδίου. Η ισχύς της μελέτης μας είναι ότι καθορίζεται έκφραση miR-148a με qRT-PCR, και συσχετίζονται τα δεδομένα έκφρασης με αποτέλεσμα Pyrosequencing ποσοτική όξινο θειώδες, η οποία είναι μια πιο ισχυρή προσέγγιση για την επίδειξη μεθυλίωση με μεσολάβηση απορύθμιση του οποιουδήποτε γονιδίου. Κατά συνέπεια, παρατηρήσαμε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης και της έκφρασης, ενισχύοντας την ιδέα ότι miR-148a κάτω ρύθμιση σε CRC οφείλεται, εν μέρει, να υπερμεθυλίωση προαγωγού.