Αφηρημένο

Ιστορικό

Έως και 80% των ασθενών που πεθαίνουν από καρκίνο του προστάτη έχουν αναπτύξει οστικές μεταστάσεις που είναι ανίατη. Ο ευνουχισμός χρησιμοποιείται συνήθως για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Αν και η νόσος ανταποκρίνεται αρχικά να ανδρογόνων στρατηγικές αποκλεισμό, συχνά γίνεται ευνουχισμό ανθεκτικά (CRPC ευνουχισμού Resistant καρκίνου του προστάτη). Τα περισσότερα από τα μοντέλα ποντικού μικτών βλαβών που προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη είναι ανδρογονο ευαίσθητες. Έτσι, έχουμε δημιουργήσει ένα νέο μοντέλο CRPC (υποδοχέα ανδρογόνων (AR), αρνητικό) που προκαλεί ανάμεικτα βλάβες στα οστά.

Μέθοδοι

PC3 και τα παράγωγα νέα κύτταρα της PC3c κυτταρικός κλώνος ήταν άμεσα ένεση κνημών του SCID αρσενικά ποντίκια. Η ανάπτυξη του όγκου αναλύθηκε με ακτινογραφία και ιστολογία. Οι άμεσες επιπτώσεις της ρυθμισμένο μέσο των δύο κυτταρικές σειρές ελέγχθηκαν στους οστεοκλάστες, οστεοβλάστες και οστεοκύτταρα.

Αποτελέσματα

Βρήκαμε ότι τα κύτταρα PC3c προκαλείται από μικτές βλάβες 10 εβδομάδων μετά intratibial ένεση.

Σε

vitro

, PC3c ρυθμισμένο μέσο ήταν σε θέση να τονώσει τρυγικό φωσφατάση ανθεκτική οξύ (TRAP) -θετικό οστεοκλάστες. Οστεοπροτεγερίνη (OPG) και ενδοθηλίνη-1 (ΕΤ1) έχουν υψηλά εκφράζεται από PC3c ενώ dikkopf-1 (DKK1) έκφραση μειώθηκε. Τέλος, PC3c εκφράζεται έντονα οστού που συνδυάζεται δείκτες οστεοποντίνη (ΟΡΝ), Runx2, αλκαλική φωσφατάση (ALP), οστού σιαλοπρωτεϊνη (BSP) και παρήγαγε μεταλλοποιημένο μήτρα

σε

vitro

σε οστεογονικές συνθήκες.

Συμπεράσματα

Έχουμε αναπτύξει μια νέα CRPC κυτταρική σειρά ως ένα χρήσιμο σύστημα για τη μοντελοποίηση της ανθρώπινης μεταστατικό καρκίνο του προστάτη που παρουσιάζει το μικτό φαινότυπο των οστικών μεταστάσεων που παρατηρείται συνήθως σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη με προχωρημένη νόσο. Αυτό το μοντέλο θα βοηθήσει στην κατανόηση των μηχανισμών ανεξάρτητου από ανδρογόνα εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη στα οστά και παρέχει ένα προκλινικό μοντέλο για τη δοκιμή των επιδράσεων των νέων θεραπειών για οστικές μεταστάσεις

Παράθεση:. Fradet Α, Sorel Η, Depalle Β, Serre CM, Farlay D, Turtoi A, et al. (2013) Ένα νέο μοντέλο ποντικού οστεοβλαστικά /οστεολυτικές βλάβες από Ανθρωπίνων ανδρογόνων-Resistant καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (9): e75092. doi: 10.1371 /journal.pone.0075092

Επιμέλεια: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Ιουνίου 2013? Αποδεκτές: 8 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 19, Σεπ 2013

Copyright: © 2013 Fradet et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το CNRS (Edith Bonnelye), Inserm, Πανεπιστήμιο της Λυών, «Ligue Régionale contre le Cancer» (Isère) (ΕΒ) https://www.ligue-cancer.net/και «Σύλλογος pour la Recherche sur les Tumeurs de la προστάτη (ARTP) «(Edith Bonnelye) https://www.artp.org/. Anais Fradet υποστηρίζεται από την Ligue Nationale contre le Cancer, https://www.ligue-cancer.net/Baptiste Depalle με επιχορήγηση από την περιοχή Rhône-Alpes «Cible» του προγράμματος και Akeila Bellahcene είναι Ανώτερος Επιστημονικός Συνεργάτης του Εθνικού Ταμείου Επιστημονικής Έρευνας, το Βέλγιο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Edith Bonnelye είναι στη λίστα των PLoS ONE Ακαδημαϊκών συντάκτες. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλους PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

οστών είναι η πιο συχνή εντόπιση των μεταστάσεων του καρκίνου του προστάτη με οστικές μεταστάσεις σε ποσοστό έως 80% της νόσου σε προχωρημένο στάδιο [1]. Χειρουργικές και ορμονικές θεραπείες έχουν δείξει ευεργετικά αποτελέσματα μόνο για ορμόνη αποκρίνονται ασθένεια πρώιμου σταδίου. Πράγματι, εάν η ασθένεια στις περισσότερες περιπτώσεις αποκρίνεται αρχικά, συχνά εξελίσσεται και να γίνει ανεξάρτητο από ανδρογόνα. Σε αυτό το στάδιο, οι ασθενείς με προχωρημένη νόσο εμφανίζουν συχνά οστεοβλαστική ή μικτές βλάβες στα οστά [2,3]. Οι μηχανισμοί με τους οποίους οι καρκίνοι του προστάτη διεγείρονται για να κάνουν μετάσταση στα οστά βασίζονται σε ένα συγκρότημα αλληλεπίδραση μεταξύ κυττάρων καρκίνου του προστάτη και του μικροπεριβάλλοντος των οστών [4]. Η ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του προστάτη μεταβάλλει αναδιαμόρφωση οστού (σχηματισμός και επαναρρόφηση) εκκρίνοντας παράγοντες που θα επηρεάσουν άμεσα οστεοβλάστες (κύτταρα που σχηματίζουν οστά) και οστεοκλάστες (κύτταρα επαναρρόφησης οστού). RANKL (Receptor ενεργοποιητής του συνδέτη NF-kB) διεγείρει διαφοροποίηση οστεοκλαστών και δράση, ενώ οστεοπροτεγερίνη (OPG) ενεργεί ως δόλωμα υποδοχέα RANK (υποδοχέας RANKL). Επομένως, η ισορροπία μεταξύ RANKL και OPG, που μπορεί να παραχθεί τόσο από τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, είναι κρίσιμη για τον έλεγχο δραστηριότητας οστεοκλαστών και οστεόλυση στην οστική μετάσταση [4-6]. Από την άλλη πλευρά, προ-οστεοβλαστικά μόρια μπορούν επίσης να παραχθούν με κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Στην πραγματικότητα, οι πρώτες κλινικές μελέτες για να στοχεύουν συγκεκριμένα οστεοβλάστες σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του προστάτη βασίστηκε σε ενδοθηλίνη-1 (ΕΤ1), μία μιτογόνος παράγοντας για οστεοβλάστες που μπορούν να προωθήσουν την ανάπτυξη των οστεοβλαστών σε μεταστατικές θέσεις [7,8]. Επιπλέον, αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης β (ΤΟΡβ), αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) είναι άφθονα εκφράζονται από τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη και έχουν άμεση επίδραση στη λειτουργία των οστεοβλαστών [9,10]. Η χωρίς φτερά (WNT) μονοπάτι που εμπλέκεται στην οστεοβλαστογενέσεως έχει επίσης ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη των οστεοβλαστικών μετάσταση στον καρκίνο του προστάτη [11]. Up-ρύθμιση του WNT συνδέτη οικογένειας WNT1 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και μείωση στον ορό του ανταγωνιστή WNT dikkopf-1 (DKK1) έκφραση έχει αναφερθεί σε ασθενείς με προχωρημένο μεταστατικό καρκίνωμα του προστάτη και σχετίζεται με οστεοβλαστικές αλλοιώσεις [12] . Τέλος καρκινικά κύτταρα του προστάτη που προκαλούν μετάσταση στα οστά επίσης εκφράζουν μεγάλη ποσότητα που σχετίζεται παράγοντες οστών όπως η οστεοποντίνη (OPN), οστεοκαλσίνης (OCN) ή των οστών σιαλοπρωτεϊνη (BSP) που εκκρίνεται στη μήτρα των οστών και ότι θα συμβάλει στην προώθηση της ιδιότητες osteomimicry τους [13].

Η πλειοψηφία των μικτών οστικές μεταστάσεις προέρχονται από μοντέλα ποντικών με καρκίνο του προστάτη είναι ευαίσθητο στα ανδρογόνα και για το θέμα αυτό στην πραγματικότητα δεν μιμούνται την κλινική κατάσταση. Περιγράψαμε τον χαρακτηρισμό μιας νέας κυτταρικής γραμμής (δηλαδή PC3c) που διεγείρουν μικτές σκελετικές αλλοιώσεις σε ζώα που προέρχονται από το ανθρώπινο ανδρογόνο ανεξάρτητη κυτταρική γραμμή PC3 AR-αρνητικό, είναι γνωστό ότι επάγουν καθαρό οστεολυτικές οστικές μεταστάσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

τα ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη μας ήταν αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τους κανόνες του διατάγματος Αρ 87-848 du 19/10/1987, στο Παρίσι. Το πειραματικό πρωτόκολλο έχουν ελεγχθεί και εγκριθεί από την Περιφερειακή Επιτροπή Rhone-Alpes για την ηθική των πειραμάτων σε ζώα (Λυών, Γαλλία) (Αριθμός Μητρώου: 0121). Τα πειράματα σε ζώα έχουν συνήθως ελέγχονται από τον θεράποντα κτηνίατρο για να εξασφαλιστεί η συνεχής συμμόρφωση με τις προτεινόμενες πρωτόκολλα. SCID ποντίκια, ηλικίας 6 εβδομάδων, στεγάσθηκαν υπό συνθήκες φραγμού σε στρωτή ροή απομονωθεί κουκούλες. Τα ζώα που φέρουν ξενομοσχεύματα όγκου παρακολουθούνται προσεκτικά για τις καθιερωμένες συμπτώματα δυσφορίας και δυσφορία και ήταν ευθανασία.

καλλιέργειας κυττάρων

PC3 κυτταρική σειρά ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA , ΗΠΑ). Τα κύτταρα PC3c, μια υποκουλτούρα κυτταρική σειρά PC3 απομονώθηκε στο εργαστήριο μας

in vitro

μετά από καλλιέργεια και μόνο κυτταρικό πληθυσμό. Κατά συνέπεια, στην αυθόρμητη παραγωγή των κυττάρων, λάβαμε τελικά μια υποκουλτούρα κυτταρική γραμμή που ονομάζεται PC3c που επιλέχθηκε με βάση την επιθηλιακά φαινότυπο του (Σχήμα S1) [14,15]. Η ορμόνη που εξαρτώνται από ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη VCAP ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο του Pr Μ Cecchini (Τμήμα Κλινικής Έρευνας, Πανεπιστήμιο της Βέρνης, Βέρνη, Ελβετία) και ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). VCAP καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI. PC3 και PC3c κύτταρα συνήθως καλλιεργούνται σε μείγμα F12K θρεπτικών συστατικών και ϋΜΕΜ μέσο (τεχνολογίες Life, Carlsbad, CA, USA), αντίστοιχα συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Perbio /Thermo επιστημονική? Rockford, IL, USA ) και 1% (ν /ν) πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (τεχνολογίες Life, Carlsbad, CA, USA) στους 37 ° C σε επωαστή 5% CO2. PC3 και PC3c ήταν επίσης καλλιεργήθηκαν επάνω σε οστεογόνο συνθήκες για τρεις εβδομάδες στο μέσο οστεοβλάστη συμπληρωμένο με 50 μg /ml ασκορβικό οξύ (Sigma-Aldrich, Buchs, Ελβετία). Προστέθηκε Δέκα mM β-γλυκεροφωσφορικό νάτριο (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) κατά τη διάρκεια 1 εβδομάδα στο τέλος της καλλιέργειας. PC3 και PC3c ήταν συνεχώς (ημέρα 1 έως την ημέρα 21) εκτίθενται σε οστεογονικές συνθήκες. Για την οπτικοποίηση της μεταλλοφορίας, πηγάδια μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με νοη Kossa και για ALP [16].

Μελέτες σε ζώα

Για ενδοοτικού πειράματα ξενομοσχεύματος όγκου (Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ , USA), μια μικρή οπή ανοίχθηκε με μια 26-gauge αποστειρωμένη βελόνα μέσα από την δεξιά κνήμη με το γόνατο σε κάμψη σε αναισθητοποιημένους 6- έως 8 εβδομάδων ποντίκια SCID. Χρησιμοποιώντας μια νέα αποστειρωμένη βελόνα έχει τοποθετηθεί σε 50 μl αποστειρωμένη σύριγγα Hamilton (Hamilton Co .; Bonaduz, GR, Ελβετία), ένα single-κυτταρικό εναιώρημα (6×10

5 σε 15 μl PBS) των PC3 ή PC3c κύτταρα ήταν προσεκτικά εγχέεται στην κοιλότητα του μυελού των οστών. Από την εβδομάδα 2 μετά τον ενοφθαλμισμό κυττάρων νεοπλασίας, ακτινογραφίες αναισθητοποιημένων ποντικών εβδομαδιαία ελήφθησαν με τη χρήση του MIN-R2000 φιλμ (Kodak, Rochester, ΝΥ, USA) σε ένα σύστημα ακτίνων Χ MX-20 ερμάριο (Faxitron Χ-ray Corp, Tucson , AZ, USA). Τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία μετά από 6 και 10 εβδομάδες για τα ποντίκια που ενέθηκαν με PC3 και PC3c κύτταρα αντίστοιχα. Τομογραφίας με μικροϋπολογιστή αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μικρο-αξονικό τομογράφο SKYSCAN 1174 (SKYSCAN? Kontich, Βέλγιο). Ο σωλήνας ακτίνων Χ ορίστηκε σε μια τάση 50 kV και ρεύμα 800 μΑ. Ένα φίλτρο αλουμινίου 0.5 mm χρησιμοποιείται για να μειώσει αντικείμενα σκλήρυνσης δέσμης. Τα δείγματα σαρώθηκαν σε 70% αιθανόλη με μέγεθος voxel των 20 μm. Για κάθε δείγμα, 265 εικόνες ενότητα ανακατασκευάστηκαν με λογισμικό NRecon (έκδοση 1.6.1.8, SKYSCAN). Τρισδιάστατη μοντελοποίηση και ανάλυση BV (Bone Τόμος) /TV αναλογία (συνολικός όγκος) (ποσοστό του οστικού ιστού) ελήφθησαν με την CTAn (έκδοση 1.9, SKYSCAN) και CTVol (έκδοση 2.0, SKYSCAN) λογισμικού. Οι αποσυντίθενται οστά στη συνέχεια υπέστησαν επεξεργασία για ιστολογική και ιστομορφομετρική ανάλυση.

Οι υποδόριες ενέσεις κυττάρων PC3c (10

6 σε 100 μΐ PBS) πραγματοποιήθηκαν επίσης σε 6 έως 8 εβδομάδων ποντίκια SCID. Τα ζώα θανατώθηκαν μετά από 12 εβδομάδες και καθορίστηκαν οι όγκοι και τα ενσωματωμένα σε παραφίνη.

ιστομορφομετρίας οστών και ιστολογία

κνήμη από μονιμοποιήθηκαν ζώα, απασβεστωμένες με 15% EDTA /0,4% PFA και τα ενσωματωμένα σε παραφίνη. Πέντε μm τομές βάφτηκαν με Trichrome Goldner και προχώρησε για ιστομορφομετρική ανάλυση για τον υπολογισμό της φυματίωσης (Tumor Βάρος) /STV (Soft Tissue τόμος) αναλογία (ποσοστό του ιστού του όγκου). Η

in situ

ανίχνευση των οστεοκλαστών εκτελέστηκε σε τομές ιστού μεταστατικού οστού χρησιμοποιώντας την φωσφατάση ανθεκτική σε τρυγικά οξύ (TRAP) Assay Kit δραστηριότητα (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland).

οστεοκλαστογένεση δοκιμασία

κύτταρα μυελού των οστών Πρωτογενή ελήφθησαν μετά κνήμης και του οστού του μηριαίου οστού του μυελού έξαψη από 6-εβδομάδων αρσενικών ποντικών OF1. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες, σε μέσο διαφοροποίησης: α-ΜΕΜ μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (τεχνολογίες Life, Carlsbad, CA, USA), 20 ng /mL του M-CSF (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ , USA) και 200 ​​ng /mL του διαλυτού ανασυνδυασμένου RANK-L παρουσία ή απουσία του ρυθμισμένου μέσου που εξάγεται από PC3 και PC3c (25μg πρωτεϊνών για κάθε συνθήκες) [17]. Μέτρια ήταν, πρώτον, άλλαξε κάθε δύο ημέρες έπειτα από την 4η ημέρα κάθε ημέρα. Μετά από 7 ημέρες, ελήφθησαν ώριμη πολυπύρηνα οστεοκλάστες (ΣΛ) και χρωματίστηκαν για δραστικότητα TRAP (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πολυπύρηνα TRAP-θετικών κυττάρων που περιέχουν τρεις ή περισσότερους πυρήνες μετρήθηκαν ως ΣΛ.

οστεοβλαστογενέσεως δοκιμασία

κρανιακά καλύμματα των 3-ημερών OF-1 ποντίκια αποκόπηκαν έπειτα τα κύτταρα ενζυματικά απομονώνονται με διαδοχική πέψη με κολλαγενάση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18,19]. Κύτταρα που λαμβάνονται από την τελευταία τέσσερα από τα πέντε στάδια πέψης (πληθυσμοί II-V) απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε 2×10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες επώασης, το μέσο συμπεριλαμβανομένης α-ΜΕΜ μέσο που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (τεχνολογίες Life, Carlsbad, CA, USA) αλλάχθηκε και συμπληρώθηκε με 50 μg /ml ασκορβικό οξύ (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) και με ή χωρίς ρυθμισμένο μέσο (25μg πρωτεϊνών για κάθε συνθήκες) εξάγεται από PC3 και PC3c. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε δύο ημέρες επί 15 ημέρες. Προστέθηκε 10 mM β-γλυκεροφωσφορικό νάτριο (Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) κατά τη διάρκεια 1 εβδομάδα στο τέλος της καλλιέργειας. Την ημέρα 15, όταν σχηματίστηκαν οστό ανοργανοποιείται οζίδια, τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και χρωματίσθηκαν με νοη Kossa για ποσοτικό προσδιορισμό. ALP + και των οστών ανοργανοποιείται οζίδια κατόπιν μετρήθηκαν σε ένα πλέγμα [16]. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως ο μέσος αριθμός των οζιδίων ± SD από τρία φρεάτια για τους ελέγχους και κάθε συνθήκη (PC3, PC3c) και ήταν αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. Οστεοκυττάρου κυτταρική σειρά MLO-Υ4 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο της Pr L Bonewald (Οδοντιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο του Missouri, Kansas City, MO, USA) και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

Ανοσοκυτοχημεία

όγκων PC3c και μεταστατικό κνήμης μονιμοποιήθηκαν και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Πέντε μm τομές υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας κουνελιού πολυκλωνικά αντισώματα οστεοποντίνη αντίσωμα αντι ανθρώπου /ποντικού (Bachem, Bubendorf, Ελβετία), αντι ανθρώπινο αντίσωμα ενδοθηλίνης-1 (Abbiotec, San Diego, CA, USA) και αντι ανθρώπινο OPG αντίσωμα (Abbiotec, San Diego, CA, USA). BSP αντίσωμα ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο του Δρ L MALAVAL (Πανεπιστήμιο της J Monnet, Σεντ Ετιέν, Γαλλία). Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ιπμεθυλκυκλοεξαν, ένυδρο έπειτα σε επεξεργασία με ένα αντιδραστήριο αποκλεισμού υπεροξειδάσης (Dako, Glostrup, Δανία). Οι τομές επωάστηκαν με φυσιολογικό ορό μόσχου για 1 ώρα και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα (αραίωση: 1/100). Τομές επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP αντι-κουνελιού γαϊδάρου (Amersham /GE Healthcare? Chalfont St Giles, Ηνωμένο Βασίλειο) (αραίωση 1/300) για 1 ώρα. Μετά την πλύση, οι τομές αποκαλύφθηκαν από 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (Dako, Glostrup, Δανία). Αντιχρωματισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη Mayer του (Merck, Σταθμός Whitehouse, NJ, USA).

πραγματικού χρόνου RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA ) από PC3, PC3c, ευρ, συνθήκες λειτουργίας και τα κύτταρα MLO-Υ4. Δείγματα ολικού RNA (1 μg) έχουν μεταγραφεί αντίστροφα χρησιμοποιώντας τυχαία εξαμερή (Promega, Madison, WI, USA) και το πρώτο σετ σύνθεση κλώνου Superscript

TM II (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Real-time RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Module Roche Lightcycler (Roche, Penzberg, Γερμανία) με εναρκτήρες ειδικούς για ανθρώπινη και ποντικού (βλέπε Πίνακες S1 και S2). Real-time RT-PCR διεξήχθη με χρήση SYBR Green (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με ένα αρχικό βήμα για 10 λεπτά στους 95 ° C που ακολουθείται από 40 κύκλους των 20 sec στους 95 ° C, 10 sec στην Tm (βλέπε πίνακες S1 και S2) και 10 sec στους 72 ° C. Επαληθεύσαμε ότι μία μονή κορυφή λήφθηκε για κάθε προϊόν με τη χρήση του λογισμικού Lightcycler Roche. Amplimers ήταν όλα κανονικοποιούνται σε αντίστοιχες τιμές L32. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο CT: σε πραγματικό χρόνο κάθε αναπαράγουν μέσος γονίδια CT κανονικοποιήθηκε προς τη μέση CT του L32 αφαιρώντας τη μέση CT του L32 από κάθε αναπαράγουν για να δώσει την ΔCt. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως log

-2 __CT με ΔΔCT ισοδύναμη με την ΔCt από τα γονίδια στο PC3, PC3c ή επεξεργασμένα ωφελημάτων, συνθήκες λειτουργίας και τα κύτταρα MLO-Υ4 αφαιρώντας την ΔCt του ενδογενούς μάρτυρα (μη-επεξεργασμένα ωφελημάτων, συνθήκες λειτουργίας και τα κύτταρα MLO-Υ4 αντίστοιχα).

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

κύτταρα PC3c καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν για 1 ώρα σε 2% γλουταραλδεϋδη σε 0.1 Μ ρυθμιστικού διαλύματος κακοδυλικού νατρίου σε ρΗ 7 0.4. Μετά από τρεις εκπλύσεις σε 0,2 Μ σακχαρόζης σε 0,1 Μ ρυθμιστικού κακοδυλικού νατρίου, τα κύτταρα σταθεροποιούνται στη συνέχεια εις 1% τετροξείδιο tetroxyde σε 0,15Μ κακοδυλικού ρυθμιστικού, αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αιθανόλη και στη συνέχεια ενσωματώνονται σε Εροη. Εξαιρετικά λεπτές τομές αντίθετα με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο, το εξετάστηκαν κάτω από ένα 1200 EX JEOL ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Jeol, Tokyo, Japan).

Μετασχηματισμός Fourier InfraRed Microspectroscopy (FTIRM)

ασβεστοποιημένα τμήματα ( 2μm-πυκνά) της κνήμης ενσωματωμένο στο ΜΜΑ κόπηκαν κατά μήκος με μικροτόμο ΡοΙγουί (Reichert-Jung, Leica, Γερμανία), και αποθηκεύεται μεταξύ 2 γυάλινες διαφάνειες. FTIRM έγινε με PerkinElmer GXII μικροσκόπιο Auto-εικόνα (Norwalk, CT, USA), εξοπλισμένο με ένα ψυχόμενο υγρό άζωτο ευρεία ζώνη Τελλουριούχου υδραργύρου-καδμίου ανιχνευτή (7800000000-400000000 εκατομμύρια cm

-1). Υπέρυθρες μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε μήτρα οστού (σε φλοιώδες οστό) γύρω από τον όγκο και στον ίδιο τον όγκο. Υπέρυθρη μέτρηση του φλοιού των οστών από ψευδή ποντίκια συλλέγονται επίσης. IR φάσματα συλλέχθηκαν σε κατάσταση μετάδοσης, στα 4 cm

-1 της χωρικής ανάλυσης, και 40 μm Χ 40 μm της χωρικής ανάλυσης. Συμβολή του αέρα και MMA αφαιρέθηκαν από το αρχικό φάσμα. Αυτόματη διόρθωση γραμμής βάσης έγινε σε κάθε φάσμα IR με το λογισμικό Spectrum (PerkinElmer, Inc).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσος όρος +/- SD, και αναλύθηκαν στατιστικά με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από post hoc t-tests ή Student t-test για την αξιολόγηση των διαφορών μεταξύ των ομάδων για

in vitro

και

in vivo

μελέτες. Η στατιστική σημαντικότητα λαμβάνεται ως ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η έκφραση των προ-οστεοβλαστικών παράγοντες από PC3c κύτταρα

Από την ανθρώπινη ανδρογόνο-ανθεκτική προστάτη PC3 καρκίνου κυτταρική γραμμή, λάβαμε μετά από καλλιέργεια και μόνο κυτταρικό πληθυσμό

in vitro

μια νέα υποκουλτούρα κυτταρική σειρά που ονομάζεται κύτταρα PC3c που επιλέχθηκε με βάση τα επιθηλιακά φαινότυπο του (Σχήμα S1). Όπως αναμένεται και παρομοίως στα γονικά κύτταρα PC3, AR δεν μπορούσε να ανιχνευθεί με πραγματικού χρόνου PCR σε PC3c ενώ εκφράστηκε στην εξαρτώμενη από ορμόνη κυτταρική γραμμή VCAP χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος (Σχήμα 1Α). Από την άλλη πλευρά, οι δείκτες προστάτη P504S (άλφα μεθυλακυλοσυνένζυμο-CoA ρακεμάση (AMACR)) και το όξινη προστατική φωσφατάση (ΡΑΡ) εκφράστηκαν στις δύο κυτταρικές σειρές που επιβεβαιώνει τον προστάτη προέλευση των κυττάρων (Σχήμα 1Β) [21].

Ανίχνευση με PCR πραγματικού χρόνου της έκφρασης AR mRNA σε PC3, PC3c και VCAP καρκινικά κύτταρα γραμμές (Α), AMACR, PAP (Β) και DKK1, ΕΤ-1, FGF9, Noggin, OPN, OPG, Runx2 και έκφραση ΤΟΡβ mRNA (C και D) σε PC3 και PC3c καρκινικά κύτταρα γραμμές. έκφραση γονιδίων αξιολογήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου σε δείγματα εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν έναντι εκείνη του ριβοσωμικού γονιδίου πρωτεΐνη L32 * ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0001, *** p & lt?. 0,0001

Η

Χαρακτηρισμός με PCR πραγματικού χρόνου των κυττάρων PC3c έδειξε ότι ΕΤ1 και OPG, δύο παράγοντες που έχουν ενοχοποιηθεί για την παθογένεση της οστεοσκληρωτικό οι οστικές μεταστάσεις από καρκίνο του προστάτη που υπερεκφράζεται σε σύγκριση με την γονική κυτταρική σειρά PC3 (Εικόνα 1 C-D), ενώ άλλοι παράγοντες, όπως παράγοντα ανάπτυξης ινοβλάστης 9 (FGF9) και TGFβ παρομοίως εκφράζονται στις δύο κυτταρικές σειρές [8,22,23]. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση του DKK1 και νογκίνης, δύο αναστολείς οστεοβλαστών (αντίστοιχα Wnts και μορφογενετική πρωτεΐνη οστού (ΒΜΡ) αναστολείς), μειώνεται σε PC3c έναντι PC3 (Εικόνα 1 C-D) [24,25]. Επιπλέον, PC3c παρομοίως σε κύτταρα PC3 εξέφρασαν παράγοντες που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε προστάτη osteomimicry καρκίνου όπως ΟΡΝ και Runx2. Όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κύτταρα PC3c μπορεί δυνητικά να επάγει αλλοιώσεις οστεοβλαστική όταν συγκρίνονται με κύτταρα PC3 που είναι γνωστό ότι εμφανίζουν κυρίως οστεολυτικές βλάβες στα οστά.

PC3c κύτταρα επάγουν μικτά οστεοβλαστικά /οστεολυτικές βλάβες των οστών

για να ελέγξετε την ιδιότητα του PC3c να προκαλέσει βλάβες των οστών, ενέσεις ενδο-κνημιαίο διεξήχθησαν σε αρσενικά ποντίκια SCID. Δέκα εβδομάδες μετά τον ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων, ακτινολογική ανάλυση αποκάλυψε ότι τα ζώα που φέρουν PC3c όγκοι είχαν αλλοιώσεις των οστών που περιλαμβάνονται οστεολυτικές και οστεοβλαστικές συστατικά (Σχήμα 2Θ), ενώ παρατηρήθηκε καθαρή οστεολυτικές βλάβες σε όγκους PC3 φέρει ζώων μετά από 6 εβδομάδες (Σχήμα 2Ε). Η ικανότητα των PC3 και PC3c να επάγει καθαρή οστεολυτικές και μικτές βλάβες, αντίστοιχα, επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας 3D μικρο-CT ανασυγκρότηση (Σχήμα 2F-G και JK) (όγκος οστού, BV /TV, Πίνακας 1), ιστολογία (Σχήμα 2Η και L ) και ιστομορφομετρικές αναλύσεις των κνημών (επιβάρυνση σκελετικών όγκων, TB /STV? Πίνακας 1). Όπως αναμενόταν δεν σκελετικές αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν μετά την ένεση PBS (Sham ζώα) (Σχήμα 2Α-D, Πίνακας 1). Με ανοσοϊστοχημεία, επιβεβαιώσαμε,

in vivo

, ότι η ΕΤ-1 και OPG είχαν εντόνως εκφρασμένο σε όγκους PC3c (Σχήμα S1, Β, D) σε σύγκριση με PC3 (Εικόνα S2, A, C).

(Α) και PC3 PC3c κύτταρα εμβολιάστηκαν σε αρσενικούς ποντικούς SCID? 10 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό, ακτινογραφία αποκάλυψε καθαρό οστεολυτικές βλάβες σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα PC3 (n = 6) (Ε) και αναμίχθηκε αλλοιώσεις σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα PC3c (n = 8) (Ι) σε σύγκριση με ποντίκια που ενέθηκαν με PBS (η = 10) (Α) (βλέπε * (λύση) και λευκά βέλη (σχηματισμός)). (B, C-F, G-J, K) Τρισδιάστατο μικρο-CT ανακατασκευές κνημών και (D, H, L) ιστολογία μετά από χρώση Trichrome Goldner επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα ακτινογραφία. Τ: Tumor? Σημείωση:. New Bone

Η BV /TV (%)

TB /STV (%)

Sham (n = 10) 22,4 +/- 2,90PC3 (n = 6) 3,6 +/- 4,1 *** 72,6 +/- 6,6 *** PC3c (n = 8) 39,5 +/- 3,0 *

$ 36,6 + /- 4,5 ***

$ Πίνακας 1. η ιστομορφομετρική ανάλυση της κνήμης με μεταστάσεις που προκαλείται από την έγχυση των PC3 και PC3c κύτταρα

BV /TV: όγκος των οστών /συνολικός όγκος.. TB /STV: φορτίο όγκου /όγκο των μαλακών ιστών. Sham διεξήχθησαν ως έλεγχος.

n

είναι ο αριθμός των ποδιών με οστικές μεταστάσεις. * P & lt? 0,05? *** P & lt? 0001 σε σύγκριση με το Sham?

$ P & lt? 0,001 σε σύγκριση με PC3. CSV Λήψη CSV

οστικής ανακατασκευής διέγερση από κύτταρα PC3c

Με αυτά τα δεδομένα, έχουμε την επόμενη ρώτησε αν PC3c θα μπορούσε να μεταβάλει το κόκαλο απορροφητικά κύτταρα, οι οστεοκλάστες (ΣΛ) και τα κύτταρα που σχηματίζουν οστό, οι οστεοβλάστες (παρατ) . Θεραπεία των κυττάρων του μυελού των οστών πρωτογενή ποντίκι με ΚΑΝΚΕ, παράγοντα διέγερσης αποικιών μακροφάγων (Μ-CSF) και με το ρυθμισμένο μέσο της PC3c διεγείρεται περισσότερο τον σχηματισμό όξινης φωσφατάσης ανθεκτικό σε οξύ (TRAP) -θετικό πολυπύρηνα ΣΛ σε σύγκριση με εκείνη που παρατηρείται με το ρυθμισμένο μέσο των κυττάρων PC3 και μη επεξεργασμένα κύτταρα (CT) (Σχήμα 3Α). Από την άλλη πλευρά, η θεραπεία των κυττάρων θόλου του κρανίου πρωτογενών ποντικού καλλιεργήθηκαν σε οστεογονικές συνθήκες με το ρυθμισμένο μέσο από PC3c είχαν λιγότερο ανασταλτική επίδραση στην ΟΒ διαφοροποίηση από ρυθμισμένο μέσο των PC3 κυττάρων σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Ct) (Σχήμα 3Β). Πράγματι, ένας μεγάλος αριθμός των ωφελημάτων οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας OPN ανοσοχρώση

in vivo

(Σχήμα 4Α α-β). Είναι ενδιαφέρον, PC3 ρυθμισμένο μέσο διεγερμένων έκφραση OPG και RANKL από το πρωτογενές ωφελημάτων ενώ PC3c ρυθμισμένο μέσο μειωμένη OPG παραγωγή οδηγώντας σε μια ισχυρότερη αύξηση του λόγου RANKL /OPG με ωφελημάτων που έλαβαν θεραπεία με PC3c ρυθμισμένο μέσο σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων PC3 (Εικόνα 3C). Συνεπής με αυτά

in vitro

αποτελέσματα, η χρώση TRAP τμημάτων κνημιαίου του μεταστατικού πόδια από ζώα που φέρουν PC3c έδειξαν υψηλό αριθμό TRAP-θετικών πολυπύρηνων ΣΛ σε σύγκριση με εκείνη που παρατηρείται σε PC3 και τα ζώα Sham (Σχήμα S3). Τέλος, ημι-ποσοτική PCR πραγματοποιείται στην κυτταρική γραμμή οστεοκυττάρου, MLO-Υ4, μας επέτρεψε να δείξουμε ότι σκληροστίνης (SOST) και την οδοντίνη μήτρα όξινο φωσφοπρωτεΐνη 1 (DMP1) έκφραση διεγείρεται μετά από 24 ώρες της θεραπείας με PC3 και PC3c ρυθμισμένο μέσο αντίστοιχα, ενώ OPG και RANKL έκφραση δεν επηρεάστηκε (Εικόνα 3D).

(Α) κύτταρα μυελού οστών ποντικού Πρωτογενή καλλιεργήθηκαν παρουσία RANKL και M-CSF και επεξεργασμένο ή όχι (CT) με ρυθμισμένο μέσο που λαμβάνεται από PC3 και τα κύτταρα PC3c. Πιο ΣΛ (λευκό βέλος) σχηματίστηκαν σε καλλιέργειες που κατεργάζονται με PC3c ρυθμισμένο μέσο σε σύγκριση με καλλιέργειες που κατεργάζονται με PC3 ρυθμισμένο μέσο και Ct (ANOVA, ρ & lt? 0,0001). (Β) τις καλλιέργειες θόλου κρανίου πρωτογενών κυττάρων ποντικού υποβλήθηκαν σε θεραπεία από την ημέρα 1-21 με ρυθμισμένο μέσο που λαμβάνεται από PC3 και PC3c κυττάρων. Mineralized οζίδια οστού ήταν παρόντες και οπτικοποιούνται με χρώση νοη Kossa κατά την ημέρα 21 (βλ ορυκτών σε μαύρο, λευκό βέλη). σχηματισμού ανοργανοποιημένου οστού οζιδίων μειώθηκε όταν πρωτογενή κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ρυθμισμένο μέσο από οποιοδήποτε από τα κύτταρα PC3 /PC3c (σε σύγκριση με τα μη-κατεργασμένα κύτταρα (Ct))? η μείωση ήταν μικρότερη όταν χρησιμοποιήθηκε PC3c κυττάρων ρυθμισμένο μέσο (σε σύγκριση με PC3) (ANOVA, p & lt? 0.001 έναντι Ct και έναντι PC3). (Γ) PC3 εμπλουτισμένο μέσο διέγειρε την έκφραση της OPG και RANKL σε πρωτογενείς ωφελημάτων συγκριτικά με μη επεξεργασμένο (Ct), ενώ PC3c εμπλουτισμένο μέσο αναστέλλει μόνο την έκφραση της OPG σε σύγκριση με Ct οδηγώντας σε υψηλότερη αναλογία RANKL /OPG σε συνθήκες PC3c. (Δ) Ανίχνευση με PCR πραγματικού χρόνου του SOST, DMP1, OPG και έκφραση RANKL mRNA σε κύτταρα MLO-Υ4 κατεργάζεται με PC3 και PC3c ρυθμισμένο μέσο. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως ο μέσος αριθμός των OC ± SD και ΟΒ οζίδια ± SD από τρία φρεάτια για ελέγχους και κάθε κατάσταση και είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. έκφραση γονιδίων αξιολογήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου σε δείγματα εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν έναντι εκείνη του ριβοσωμικού γονιδίου πρωτεΐνη L32 * ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0001, *** p & lt?. 0,0001

Η

(Α) Ανοσοσήμανση OPN στην ΟΒ σε οστικές μεταστάσεις που προκαλείται από τα κύτταρα PC3c (βλ ωφελημάτων α και β μεγεθύνσεις ένα? Δείτε μαύρα βέλη) (α) και σε όγκους κύτταρα (Βα). Ομοίως με ΟΡΝ, BSP έκφραση ανιχνεύεται σε όγκους κύτταρα

σε

vivo

(Β, b). (Γ) Ομοίως με πρωτογενή θόλο του κρανίου κύτταρα ποντικού, PC3 και PC3c καλλιεργήθηκαν σε οστεογόνο συνθήκες για 21 ημέρες. ALP (A, C) και χρώση νοη Kossa (b, d) δείχνουν υψηλή έκφραση του ALP (γ) και ανοργανοποίηση (λευκό βέλος) (δ) σε κύτταρα PC3c ενώ καμία έκφραση ALP (α) και ανοργανοποίηση ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα PC3 ( σι). (Δ) Ανίχνευση με PCR πραγματικού χρόνου του ΟΡΝ, ALP και η έκφραση mRNA σε OCN PC3c και PC3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε οστεογόνο συνθήκες για 21 ημέρες. Η γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε δείγματα εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν έναντι εκείνη του ριβοσωμικού γονιδίου της πρωτεΐνης L32 ** ρ & lt? 0001. Bar = 200μm Τ: Tumor? OB: οστεοβλάστες? Σημείωση:. New Bone

Η

PC3c κύτταρα επάγουν ισχυρή οστεοβλαστική αντιδράσεις κατά οστεογονικές συνθήκες

Επειδή τα κύτταρα PC3c που προκαλείται από το σχηματισμό νέου οστού

in vivo

, είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν θα μπορούσε να παράγει ωφελημάτων δείκτες. Μετά βρέθηκαν ανοσοχρώση τομών μεταστατικού ιστού των οστών, ΟΡΝ και BSP εκφράζεται σε κύτταρα PC3c

in situ

(Σχήμα 4Β α και β). Επιπλέον μετά από 3 εβδομάδες καλλιέργειας,

in vitro

, κατόπιν οστεογονική συνθήκες, συμπεριλαμβανομένων ασκορβικού οξέος και β-γλυκεροφωσφορικού (σχήμα 4Γ b και d), κύτταρα PC3c αποκαλύφθηκαν να είναι αλκαλική φωσφατάση (ALP) -θετικό (Σχ 4cc ) και ήταν σε θέση να σχηματίσει ένα ασβεστοποιημένο μήτρα θετικό για χρώση νοη Kossa (σχήμα 4Γ d), ενώ PC3 ήταν ALP-αρνητικά και δεν προκάλεσε ανοργανοποίηση μήτρας (Σχήμα 4C α και β). Η έκφραση της ALP μετά τη θεραπεία ασκορβικού οξέος επιβεβαιώθηκε σε PC3c κύτταρα με πραγματικού χρόνου PCR (Εικόνα 4D). Ομοίως, OPN ήταν άκρως εκφράζεται σε PC3c σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3, ενώ OCN εκφράστηκε και από τις δύο γραμμές κυττάρων υπό αυτές τις πειραματικές συνθήκες (Σχήμα 4D), γεγονός που υποδηλώνει υψηλό osteomimicry ιδιοκτησία του PC3c σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3. Τέλος, Fourier Transform μελέτη InfraRed Microspectroscopy (FTIRM) σε όγκους που ελήφθη μετά την υποδόρια ένεση των κυττάρων PC3c αποκάλυψε την παρουσία αμιδίων Ι (κυρίως C = O τέντωμα) και II (κυρίως ΝΗ κάμψη) και (τέντωμα κυρίως CN και ΝΗ κάμψη) III ομάδες πρωτεϊνών (Σχήμα S4, βλέπε Ι και ΙΙ κόκκινη γραμμή) που συνήθως αντιστοιχούν στην οργανική μήτρα (90% κολλαγόνου τύπου Ι) στα οστά (Σχήμα S4, δείτε Μπλε και μαύρη γραμμή). Δεν φωσφορικό ή ανθρακικό μοριακές δονήσεις βρέθηκαν, υποδεικνύοντας την απουσία ορυκτών εντός της PC3c όγκου

in vivo

(Σχήμα S4). Από την άλλη πλευρά, νέα μήτρα οστού που λαμβάνεται από ποντικούς κνήμης ένεση με κύτταρα PC3c έδειξε την παρουσία ορυκτών (Σχήμα S4). Ταυτοχρόνως σε αυτά αποτέλεσμα, υψηλή ποσότητα Κολλαγόνου Τύπου I βρέθηκε να εκφράζεται από PC3c σε σύγκριση με PC3 κύτταρα με πραγματικού χρόνου PCR

in vitro

(Σχήμα 5Α). Επιπροσθέτως, τα κύτταρα PC3c δείχθηκαν περιβάλλεται από τυπικό κολλαγόνο τύπου Ι ίνες

in situ

όπως κρίνεται με ηλεκτρονική μικροσκοπία (Σχήμα 5Β βλέπε βέλη και μεγαλύτερη μεγέθυνση). Όλα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν υψηλότερη ιδιότητες osteomimicry για PC3c σύγκριση με τα κύτταρα PC3, εξηγώντας έτσι τουλάχιστον εν μέρει, την ικανότητά τους να επάγουν μικτά οστεοβλαστικά /οστεολυτικές αλλοιώσεις των οστών.

(Α) Ανίχνευση με PCR πραγματικού χρόνου του κολλαγόνο τύπου Ι έκφραση mRNA σε PC3c και PC3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κανονικές συνθήκες. Η γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε δείγματα εις τριπλούν και κανονικοποιήθηκαν έναντι εκείνη του ριβοσωμικού γονιδίου της πρωτεΐνης L32 * ρ & lt? 0,05. (Β) Απεικόνιση του κολλαγόνου τύπου Ι στα κύτταρα PC3c καλλιεργούνται σε γυάλινο κάλυμμα με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (βλ μαύρα βέλη).

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δημιουργήσει και χαρακτηρίζεται ένα νέα καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή ανεξάρτητου από ανδρογόνα (PC3c) η οποία δίνει ταχέως μικτό αλλοιώσεις των οστών σε αρσενικούς ποντικούς SCID, 10 εβδομάδες μετά την ενδο-κνημιαίο έγχυση κυττάρων όγκου. Αυτό το μοντέλο μπορεί να είναι χρήσιμο για τη μελέτη κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που διαφέρουν μεταξύ ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από ανδρογόνο καρκινώματα του προστάτη όταν μετάσταση στα οστά. Στον καρκίνο του προστάτη, ανδρογόνο στρατηγικές αποκλεισμός συνήθως χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία οστεοβλαστικές οστικές μεταστάσεις. Ωστόσο, οι απαντήσεις σε αυτές τις θεραπείες είναι συχνά σύντομες λόγω μετα-traductional τροποποιήσεις ή μεταλλάξεις της AR που μειώνουν συνδετήρας σύνδεσης και αναπόφευκτα να οδηγήσει σε CRPC [26,27]. Ο ρόλος της οδού AR στην οστεοβλαστική εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη είναι ελάχιστα κατανοητή επειδή τα διαθέσιμα μοντέλα της μικτής και καθαρής βλάβες οστεοβλαστική (C4-2B, PCa2B, VCAP) είναι κυρίως ανδρογόνων ανταποκρίνεται όπως [28,29]. Κατά συνέπεια, ένα ενεργό μονοπάτι AR πιστεύεται ότι εμπλέκεται στην οστεοβλαστική εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, σχετικά με το υπόδειγμα PC3c μας, αυτή η υπόθεση δεν συμβαίνει, καθώς οι δύο κυτταρικές σειρές PC3 και PC3c κυτταρικές σειρές δεν εκφράζουν AR. Από την άλλη πλευρά, AR αρνητικά πρότυπα που χρησιμοποιούνται συνήθως ως PC3 και DU145 κύτταρα που προέρχονται από ασθενείς CRPC επαγόμενη αλλοιώσεις καθαρή οστεολυτικές και δεν αναπαράγουν αυτό που παρατηρήθηκαν σε κλινικό [30,31]. Στη συνέχεια, προκειμένου να καλυφθεί η ανάγκη για κλινικά σχετική μοντέλα του καρκίνου του προστάτη που σχετίζονται με βλάβες των οστών, πιο πρόσφατα μοντέλα της ορμόνης-ανεξάρτητο έχουν αναπτυχθεί σαν MDA προστάτη 118 και Ace-1, που παρόμοια με το μοντέλο PC3c δεν εκφράζουν AR και προκαλούν ανάμεικτα βλάβες [22,32]. Παρ ‘όλα αυτά, οστεογένεση που προκλήθηκε με FGF-9 στο μοντέλο MDA PCa 118 δεν είχε εμπλακεί στην απόκριση που επάγεται από οστεοβλαστική PC3c ως FGF-9 έκφραση δεν ήταν στατιστικά σημαντικά διαμορφώνεται μεταξύ PC3 και PC3c κύτταρα.

Είναι ενδιαφέρον, σε σύγκριση με PC3 κύτταρα PC3c εκφράζεται έντονα ΕΤ-1, ένα μιτογόνο παράγοντα για ΟΒ [33,34].