Abstract

Γενετικά τοξίνες βακτηριακής πρωτεΐνης είναι ελκυστικά συστήματα για την παράδοση των εξωγενών πρωτεϊνών στο κυτοσόλιο των κυττάρων θηλαστικών. Η δυαδική τοξίνη C2 από το

C. botulinum

έχει αναδειχθεί ως ισχυρό όχημα διανομής, το οποίο στηρίζεται σε δεσμευτικές /συστατικό μετατόπιση της C2IIa και το γενετικώς τροποποιημένο C2IN τομέα προσαρμογέα που ενεργούν σε συνεννόηση για να προκαλέσει κυτταρική πρόσληψη. Ο καταστολέας ρ53 πρωτεΐνη όγκος έχει μια κρίσιμη λειτουργία στην καταστολή της καρκινογένεσης και συχνά αδρανοποιείται με διάφορους μηχανισμούς σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Επομένως, κατασκευάσαμε μία πρωτεΐνη σύντηξης C2IN-p53, το οποίο εσωτερικοποιείται σε καρκινικά κύτταρα με C2IIa. Για το σκοπό αυτό, το κατασκεύασμα σύντηξης C2IN-ρ53 υπερεκφράζεται σε

E. coli

με καλή διαλυτότητα, καθαρίστηκε με χρωματογραφία και πρωτεΐνη συνάφειας ηπαρίνης ταυτότητα επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα. Δείξαμε ότι η πρωτεΐνη σύντηξης είναι ικανή να συνδέεται με την ρ53 συναίνεσης DNA με υψηλή συγγένεια σε μία ρ53-ειδικό τρόπο

in vitro

. Στη συνέχεια, η εσωτερικοποίηση του C2IN-p53 παρακολουθήθηκε σε κύτταρα HeLa με κύτταρο κλασματοποίηση και ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως, η οποία αποκάλυψε μια C2IIa μεσολάβηση μετατόπιση της πρωτεΐνης σύντηξης στο κυτταρόπλασμα. Η πρόσληψη αποδείχθηκε επίσης σε Α549 και Saos-2 κύτταρα με παρόμοια αποτελεσματικότητα. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με συνεστιακή ανοσοφθορισμού αναλύσεις C2IN-p53 /C2IIa επεξεργασμένο HeLa και Α549 κύτταρα, εμφανίζοντας κυρίως κυτταροπλασματική εντόπιση του κατασκευάσματος σύντηξης

Παράθεση:. Fahrer J, Rausch J, Barth Η (2013) Μια πρωτεΐνη κυττάρων διαπερατό Fusion Βασισμένο σε

Clostridium botulinum

C2 τοξίνης για την παράδοση του p53 Tumorsuppressor σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (9): e72455. doi: 10.1371 /journal.pone.0072455

Επιμέλεια: Mark Isalan, Κέντρο Genomic κανονισμού, Ισπανία

Ελήφθη: 2 Ιούνη 2013? Αποδεκτές: 18 του Ιούλ 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Σεπτέμβρη του 2013

Copyright: © 2013 Fahrer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου του Ulm (Bausteinprojekt L.SBN.0060 να JF) και ένα ερευνητικό stipendium από το Experimental Medicine Program Ulm στο JR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η τοξίνη C2 από

Clostridium botulinum

είναι το πρωτότυπο του δυαδικού ακτίνη ADP-ριβοζυλίωσης των τοξινών [1] και αποτελείται από το συστατικό ένζυμο C2I, η οποία μονο-ΑϋΡ-ριβοσυλιώνει G-ακτίνης και το ξεχωριστό στοιχείο C2II δέσμευσης /μετατόπιση. C2II πρέπει να υποβάλλονται σε πρωτεολυτική διάσπαση στο Ν-άκρο του να παραγάγει την βιολογικά ενεργό C2IIa, προκαλεί την πρόσληψη C2I στο κύτταρο ξενιστή κυτοσόλιο [1]. Στο διάλυμα, C2IIa σχηματίζει ένα επταμερές συμβολίζεται ως προ-πόρου και δεσμεύεται στον υποδοχέα της που βρίσκονται στην κυτταρική επιφάνεια όλων των τύπων κυττάρων θηλαστικών δοκιμάζονται μέχρι σήμερα [2]. Μετά τη συναρμολόγηση με C2I, το σύμπλοκο C2I /C2IIa εισέρχεται στο κύτταρο με κλαθρίνη ενδοκυττάρωση σε PI3K- και Akt-εξαρτώμενο τρόπο [3], [4]. Σε απάντηση της οξίνισης που συμβαίνουν στις αρχές ενδοσώματα, C2IIa υποβάλλεται σε ένα διακόπτη διαμορφωτική, προκαλώντας την εισαγωγή του μέσα της ενδοσωματικής μεμβράνης όπου σχηματίζει δια-μεμβράνης πόρου [5]. Αυτό επιτρέπει την μετατόπιση του C2I στο κυτοσόλιο, η οποία προωθείται από κύτταρο-ξενιστή συνοδούς όπως Hsp90 και πεπτιδύλ προλυλο

cis /trans

ισομεράσες [6], [7]. Στη συνέχεια, C2I καταλύει την ομοιοπολική μεταφορά της ΑϋΡ-ριβόζης πάνω σε G-ακτίνη χρησιμοποιώντας NAD

+ σαν συν-υπόστρωμα [8]. Αυτή η ομοιοπολική τροποποίηση έχει ως αποτέλεσμα μία κατάρρευση του κυτταροσκελετού ακτίνης και τελικά ενεργοποιεί κασπάση-εξαρτώμενη κυτταρικό θάνατο [9].

Λόγω του ιδιότητες, το δυαδικό τοξίνη C2 έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλές μελέτες ως ένα διαμεσολαβητικό σύστημα ευέλικτο παράδοσης η πρόσληψη εξωγενών πρωτεϊνών μέσα στο κύτταρο ξενιστή κυτοσόλιο [10]. Το Ν-τερματικό πεδίο του C2I (C2IN) δεσμεύεται με C2IIa και είναι ζωτικής σημασίας για C2IIa μεσολάβηση εσωτερικοποίηση, αλλά δεν περιλαμβάνει την περιοχή ένζυμο το οποίο είναι υπεύθυνο για κυτταροτοξικά αποτελέσματα. Ως εκ τούτου, ο προσαρμογέας C2IN μπορεί να συνδεθεί με τις πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος με γενετικά μέσα που ακολουθείται από έκφραση ως ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες σύντηξης. Προηγουμένως, C2IN έχει συντηχθεί με τον παράγοντα λοιμικότητας SpvB από

Salmonella enterica

για να προκαλέσει την εσωτερικοποίηση του σε κύτταρα θηλαστικών [11]. Ένα άλλο χαρακτηριστικό παράδειγμα αφορά τη βακτηριακή C3 ADP-ριβοσυλοτρανσφεράσης, ένας εκλεκτικός αναστολέας της Rho ΟΤΡάσης, που επίσης εκφράζεται ως πρωτεΐνη σύντηξης C2IN και άνοιξε το δρόμο για τη διαλεύκανση Rho-μεσολάβηση σηματοδότησης σε ευκαρυωτικά κύτταρα [10], [12]. Πρόσφατα, C2IN έχει συνδεθεί με το βιοτίνη πρωτεΐνη δέσμευσης στρεπταβιδίνης, δημιουργώντας ένα ευέλικτο σύστημα θηλαστικών παράδοσης για επισημασμένο με βιοτίνη (μακρο) μόρια [13].

Ο όγκος ρ53 καταστολέα πρωτεΐνη είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που είναι ενεργοποιείται σε απόκριση σε ποικίλες ερεθίσματα όπως στρες γονιδιοτοξικές προσβολές και υποξυγοναιμία [14]. p53 είναι ένας βασικός παράγοντας για τη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας και ασκεί αντικαρκινική δράση από διέπουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και επάγουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε σοβαρά κατεστραμμένα κύτταρα. Δρα κυρίως ως ένας μεταγραφικός διεγέρτης ένα ευρύ φάσμα των γονιδίων που εμπλέκονται σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου και γήρανση, την απόπτωση και την επιδιόρθωση του DNA [15], αλλά είναι επίσης ικανή να ενεργοποιεί την απόπτωση σε μια μεταγραφή-ανεξάρτητο τρόπο [16]. Σπουδαιότητας, p53 βρίσκεται αδρανοποιημένο σε πολλούς ανθρώπινους όγκους λόγω αποκτηθεί μεταλλάξεις στο κεντρικό DNA του τομέα δέσμευσης [17] και η αυξημένη πρωτεολυτική αποικοδόμηση μετά (πολυ) ουβικιτινίωση [18]. Λόγω κεντρικές λειτουργίες της σε καταστολή όγκου, ρ53 είναι στο επίκεντρο της βιοϊατρικής και κλινικής έρευνας και πολυάριθμες στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί για την αποκατάσταση της ρ53 στα κύτταρα ρ53 ανεπάρκεια του όγκου [19]. Μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση έχει ως στόχο την παράδοση του γονιδίου ρ53 σε κύτταρα όγκου με διαφορετικά οχήματα. Εχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι τα πολυμερή μικροσφαιρίδια φορτωμένα με νανοσωματίδια χιτοσάνης-ϋΝΑ που φέρει το ανθρώπινο γονίδιο ρ53 αποτελεσματικά εσωτερικεύονται σε ανθρώπινα κύτταρα ηπατώματος [20]. Μια άλλη μελέτη ανέφερε την ταυτόχρονη πρόσληψη του γονιδίου ρ53 και του αντινεοπλασματικού παράγοντα δοξορουβικίνη μέσω ενός υβριδικού συστήματος νανοσωματιδίων σε κύτταρα HeLa [21]. Μία περαιτέρω ενδιαφέρουσα στρατηγική βασίζεται στην εσωτερίκευση της πρωτεΐνης ρ53 που συνδέεται με (πολυ-) πεπτίδια που διευκολύνουν την πρόσληψη του. Για το σκοπό αυτό, το ρ53 έχει συντηχθεί με γοναδοτροπίνη που απελευθερώνει ορμόνη (GnRH), το οποίο επιτρέπει την πρόσληψη των πρωτεϊνών σύντηξης σε κύτταρα όγκου GnRH-θετικά με ενδοκυττάρωση με μεσολάβηση υποδοχέα [22]. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι πολύ πρόσφατα συζευγμένο με βιοτίνη πρωτεΐνη ρ53 εσωτερικοποιείται σε ένα μη-ομοιοπολικό τρόπο από το σύστημα C2-στρεπταβιδίνης μεταφορών [23].

Εδώ αναφέρουμε τη δημιουργία μίας πρωτεΐνης συγχωνεύσεως, στην οποία ανθρώπινο p53 συνδέθηκε με την C2IN τομέα προσαρμογέα με γενετική μηχανική, διευκολύνοντας έτσι την παράδοση του από το C2IIa δεσμευτική /μονάδα μετατόπιση σε καρκινικά κύτταρα. Δείχνουμε ότι η ειδική δραστικότητα δέσμευσης DNA ανασυνδυασμένου C2IN-p53 πρωτεΐνη σύντηξης εμφανίζει

in vitro

και καταδεικνύουν την εξαρτώμενη από C2IIa πρόσληψη C2IN-p53 στο κυτοσόλιο διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών όπως καρκίνωμα τραχήλου HeLa και Α549 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

η γενετική μηχανική, την έκφραση και τον καθαρισμό της GST-tagged C2IN-p53

cDNA Ανθρώπου ρ53 κλωνοποιήθηκε σε πλαίσιο με την περιοχή προσαρμογέα C2IN προκειμένου για να δημιουργήσει το πλασμίδιο έκφρασης ρ-GEX2T-C2IN-p53, το οποίο φιλοξενεί το κατασκεύασμα σύντηξης C2IN-p53 GST-tagged (Εικ. 1Α). Εδώ, η περιοχή C2IN μεσολαβεί στην εξαρτώμενη από C2IIa πρόσληψη της πρωτεΐνης σύντηξης στο κύτταρο ξενιστή κυτοσόλιο, ενώ το τμήμα ρ53 υποτίθεται ότι εξασκεί αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα μετά την εσωτερίκευση. Η πρωτεΐνη σύντηξης στη συνέχεια υπερεκφράζεται στους 16 ° C σε

E. coli

Rosetta κύτταρα και εξαρτώμενη από τον χρόνο έκφραση αναλύθηκε με χρώση με Coomassie και στύπωμα Western (Εικ. 1Β). Η χρώση Coomassie απεκάλυψε μία ζώνη γύρω από 97 kDa, ανάλογα με το αναμενόμενο μοριακό βάρος της GST-C2IN-p53, η οποία αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου. Σε συνέπεια, η ανίχνευση ανοσοκηλίδος με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι του ανθρώπινου ρ53 εμφανίζεται επίσης μια αναδυόμενη ταινία πρωτεΐνης με παρόμοιο μοριακό βάρος. Η μέγιστη έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης βρέθηκε μετά από 20 ώρες, ωστόσο με κάποια υποβάθμιση των προϊόντων. Η έκφραση του κατασκευάσματος σε υψηλότερη θερμοκρασία (29 ° C) κατέληξε σε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στην ευκολία της σημαντικά περισσότερο προϊόντων αποδόμησης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, βακτηριακές καλλιέργειες συλλέχθηκαν μετά από 20 ώρες λύθηκαν με κατεργασία με υπερήχους και το λύμα που λαμβάνεται φορτώθηκε σε μία στήλη ανταλλαγής ανιόντων. GST-C2IN-p53 ανακτήθηκε στη ροή μέσω (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και στη συνέχεια εγχέεται σε μία στήλη ηπαρίνης-σεφαρόζης. Το δεσμευμένο GST-C2IN-p53 εκλούσθηκε με μία βαθμίδα άλατος παρακολουθείται με απορρόφηση υν και συλλέγονται κλάσματα αξιολογήθηκαν για περιεκτικότητα ρ53 με κηλίδωση Western (Εικ. 1 C). Η πρωτεΐνη σύντηξης GST-tagged ανιχνεύθηκε κυρίως στα κλάσματα C4-C6, το οποίο αντιστοιχεί στο τρίτο κορυφή στο χρωματογράφημα FPLC. Αυτά τα κλάσματα συνενώθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι ρυθμιστικού χαμηλού άλατος, με αποτέλεσμα μια μέση συγκέντρωση 250 ng σύντηξης πρωτεΐνης /ml. Αξίζει να σημειωθεί, καθαρισμό συγγένειας της πρωτεΐνης σύντηξης με γλουταθειόνη-sepharose δεν ήταν δυνατή. Επιπλέον, η θρομβίνη διάσπαση για να αφαιρέσετε την ετικέτα δεν ήταν αποτελεσματική, λόγος για τον οποίο είχε παραλειφθεί αυτό το στάδιο καθαρισμού.

Μια

. Σχέδιο του κατασκευάσματος σύντηξης GST-C2IN-p53.

Β

. Χρονική πορεία της έκφρασης GST-C2IN-p53 στο

Ε. coli

Rosetta. Δείγματα συλλέχθηκαν μετά από χρονικά σημεία που υποδεικνύονται (0, 1, 3, 6 και 20 ώρες) και υποβλήθηκε σε SDS-PAGE ακολουθούμενη από χρώση με Coomassie (κορυφή) ή ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ρ53 (κάτω). GST-C2IN-p53 συμβολίζεται με ένα βέλος.

C

. Καθαρισμός της πρωτεΐνης σύντηξης GST-C2IN-p53 με χρωματογραφία συγγενείας ηπαρίνης. GST-C2IN-p53 απομονώθηκε από εκχυλίσματα ολικού κυττάρου με χρωματογραφία ηπαρίνης-based και εκλούσθηκε με μία γραμμική βαθμίδα άλατος όπως παρακολουθείται με απορρόφηση υν. Στη συνέχεια, τα κλάσματα συλλέγονται κατά τη διάρκεια χρωματογραφία συγγενείας χαρακτηρίστηκαν με ανάλυση ανοσοστυπώματος με αντίσωμα ρ53.

Η

Στο σύνολό τους, ένα κατασκεύασμα σύντηξης που αποτελείται από C2IN και ρ53 κλωνοποιήθηκε επιτυχώς, που εκφράζεται και καθαρίζεται με χρωματογραφία συγγενείας ηπαρίνης με επαρκή απόδοση .

In vitro

χαρακτηρισμός των GST-C2IN-p53

Το απομονωμένο ανασυνδυασμένο GST-C2IN-ρ53 πρώτα χαρακτηρίζεται από κηλίδωση Western με αντι-C2IN, αντι-p53 και τα αντισώματα αντι-GST (Εικ. 2Α). Εκτός από την πρωτεΐνη σύντηξης, κάποιες μικρές θραύσματα αποικοδόμησης ήταν επίσης ορατή ακόμη ιδίως μετά από μακροχρόνια χρόνους έκθεσης. Στη συνέχεια, η ειδική ικανότητα δέσμευσης του DNA του GST-C2IN-p53 προσδιορίστηκε

in vitro

μέσω μιας δοκιμασίας μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA), δεδομένου ότι αυτό είναι ένα ζωτικής σημασίας ιδιότητα για τις λειτουργίες της μεταγραφής εξαρτώμενη της. Αυτή η δοκιμασία βασίζεται η πρόσδεση του ρ53 σε ένα βιοτινυλιωμένο ολιγονουκλεοτίδιο διπλής όψης που περιέχει την συναινετική αλληλουχία που βρέθηκε στην υποκινητή MDM2. Η επώαση αυτού του διπλού με GST-C2IN-p53 ως αποτέλεσμα το σχηματισμό συμπλοκών υψηλού μοριακού βάρους DNA /GST-C2IN-p53 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο, με εξαφάνιση της ελεύθερης ολιγονουκλεοτιδίου ήδη στα 250 ng και την εμφάνιση ενός συγκεκριμένου DNA -πρωτεΐνη συγκρότημα σε 500 ng πρωτεΐνης σύντηξης. Ταυτόχρονα, GST-C2IN-p53 ανιχνεύθηκε με ένα αντίσωμα αντι-C2IN. Ως έλεγχος, ανασυνδυασμένη C2IN (-26 kDa) είχε συμπεριληφθεί, η οποία δεν παράγει κανένα ορατό συγκρότημα, τεκμηριώνοντας έτσι την ρ53-εξαρτώμενη DNA δέσμευσης της πρωτεΐνης σύντηξης. Θα πρέπει επίσης να αναφερθεί ότι η πρόσδεση του C2IN-p53 DNA ήταν παρόμοια με εκείνη της άγριου-τύπου ρ53 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι δεν υπάρχει απώλεια της δραστικότητας δέσμευσης DNA λόγω της γενετικής μηχανικής.

Α

ανίχνευση διαφορετικών τομέων της πρωτεΐνης σύντηξης με κηλίδωση Western. Αυξανόμενες ποσότητες GST-C2IN-p53 (50, 100 και 200 ​​ng) διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδωση Western με διαφορετικά αντισώματα (αντι-C2IN, αντι-ρ53, αντι-GST).

Β

. DNA δέσμευσης καθαρισμένου GST-C2IN-p53. Αυξανόμενες ποσότητες GST-C2IN-p53 επωάστηκαν με ένα επισημασμένο με βιοτίνη διπλό ολιγονουκλεοτίδιο που περιέχει ένα στοιχείο απόκρισης ρ53 (ρ53-RE). Ο σχηματισμός συμπλέγματος στην συνέχεια παρακολουθείται με αυτοφυή PAGE που ακολουθείται από ανίχνευση με στρεπταβιδίνη-POD (STV-POD). C2IN χρησίμευσε ως αρνητικός μάρτυρας και έγινε ορατή από ένα αντίσωμα C2IN. Το αστέρι υποδηλώνει ένα τμήμα βιοτίνης, ενώ ο κύκλος αντιπροσωπεύει το GST-tag της πρωτεΐνης σύντηξης.

Η

Συλλογικά, η ταυτότητα του GST-C2IN-p53 επιβεβαιώθηκε με ειδικά αντισώματα και η πρωτεΐνη σύντηξης ήταν ενεργός

in vitro

, όπως ασκείται συγκεκριμένη δραστηριότητα δέσμευσης DNA.

C2IIa μεσολάβηση εσωτερίκευση του GST-C2IN-ρ53 σε καρκινικά κύτταρα

στη συνέχεια ασχολήθηκε με το ερώτημα είτε GST-C2IN-p53 εσωτερικοποιείται σε καρκινικά κύτταρα μέσω C2IIa. Αρχικά πειράματα διεξήχθησαν σε κύτταρα HeLa, λόγω της έντονα μειωμένη έκφραση του ενδογενούς τους ρ53 [24]. κύτταρα HeLa επωάστηκαν για διαφορετικούς χρόνους με GST-C2IN-p53 συν C2IIa και στη συνέχεια υποβάλλεται σε διγιτονίνη με βάση κύτταρο κλασμάτωση. ανίχνευση ανοσοκηλίδας με αντίσωμα ρ53 αποκάλυψαν μια εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση του GST-C2IN-ρ53 σε κύτταρα HeLa εκχυλίζεται (Σχ. 3 Α, αριστερό πλαίσιο), η οποία περιλαμβάνει κυτταρική μεμβράνη δεσμευμένη και εσωτερικεύονται πρωτεΐνη που κατοικούν σε κυστίδια. GST-C2IN-p53 δείχθηκε να μετατοπίζεται στο κυτταρόπλασμα με μέγιστη μετά από 5 h (Σχ. 3Α, δεξί πάνελ), η οποία ανιχνεύθηκε επίσης με ένα αντι-C2IN (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, GST-C2IN-p53 δεν ήταν ανιχνεύσιμο στο κυτταρόπλασμα μετά από 24 ώρες (τα δεδομένα δεν φαίνονται), το οποίο θα μπορούσε να είναι μια συνέπεια της υποβάθμισης του πρωτεασώματος της. Ως αρνητικός έλεγχος, τα κύτταρα προκλήθηκαν με GST-C2IN-p53 απουσία C2IIa. Εδώ, GST-C2IN-p53 ανιχνεύθηκε σε εκχυλίζεται κύτταρα, αλλά όχι στο κυτταρόπλασμα, η οποία μπορεί να είναι αποτέλεσμα της μη-ειδικής δέσμευσης. Πρόωρη αντιγόνο ενδόσωμα 1 (EEA1), μια πρωτεΐνη δείκτη για την πρόωρη κυστίδια ενδοσωμιακό [25] βρέθηκε μόνο σε εκχυλίζεται κύτταρα αλλά όχι στο κυτταρόπλασμα, καταδεικνύοντας επιτυχή παρασκευή του κυτοσολικό κλάσμα χωρίς διασταυρούμενη μόλυνση στις αρχές ενδοσώματα (Εικ. 3Α, κορυφή πίνακα).

Α.

πρόσληψη C2IN-ρ53 σε κύτταρα καρκίνου τραχήλου HeLa ελέγχονται από κύτταρο κλασματοποίηση. κύτταρα HeLa επωάστηκαν με GST-C2IN-p53 και C2IIa για μέχρι 5 ώρες. Στη συνέχεια, με βάση το διγιτονίνη κύτταρο κλασματοποίηση εκτελέστηκε και εκχυλίζεται κύτταρα καθώς και κυτοσολικά κλάσματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και επακόλουθη κηλίδωση Western. Εσωτερικοποιημένες GST-C2IN-p53 ανιχνεύθηκε με αντι-ρ53. Hsp90 εντοπίστηκε ως έλεγχος φόρτωσης, ενώ EEA1 οπτικοποιήθηκε να αποκλείσει μια διασταυρούμενη μόλυνση του κυτταροπλασματικό κλάσμα με την πρόωρη ενδοσωμάτων.

Β

. C2IIa εξαρτώμενη εσωτερικοποίηση του GST-C2IN-p53 σε αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 και Saos-2 κύτταρα οστεοσαρκώματος (

C

). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω, εκτός του ότι Rab5 ανιχνεύθηκε ως δείκτης για την πρόωρη ενδοσώματα.

Η

Με αφορμή αυτά τα αποτελέσματα, περαιτέρω καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων αδενοκαρκινώματος Α549 πνεύμονα (p53-wt) και Saos -2 κύτταρα οστεοσαρκώματος (p53-αρνητικά) αναλύθηκαν. Η C2IIa-εξαρτάται από την παράδοση του GST-C2IN-p53 στο κυτταρόπλασμα ήταν συγκρίσιμο με αυτό που παρατηρήθηκε σε κύτταρα HeLa (Σχ. 3Β και C). Θα πρέπει να αναφερθεί ότι ορισμένες GST-C2IN-p53 ήταν επίσης ανιχνεύσιμη σε εκχυλίζεται κύτταρα Saos-2 με την απουσία του C2IIa, η οποία μπορεί να αποδοθεί σε μια σύνδεση προς την επιφάνεια του κυττάρου και την επακόλουθη πινοκυττάρωση (Σχ. 3C) μη ειδική. Μόνο αμελητέες ποσότητες της πρωτεΐνης σύντηξης απεικονίστηκαν σε κύτταρα Α549 διγιτονίνης-διαπερατά απουσία C2IIa αναφέροντας το συγκεκριμένο C2IIa εξαρτώμενη πρόσληψη σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 3Β). Παρακαλώ σημειώστε ότι η ανίχνευση του μικρού ΟΤΡάσης Rab5, μια καθιερωμένη πρωτεΐνη δείκτη για πρόωρη ενδοσώματα [26], χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ποιότητας για την παρασκευή κυτοσόλιο.

Επιπλέον, η ιδιαιτερότητα της πρόσληψης και υποκυτταρικού εντοπισμού του GST-C2IN -ρ53 αναλύθηκε με μεγαλύτερη λεπτομέρεια με συνεστιακή ανοσοφθορισμού μικροσκοπία κυττάρων HeLa σε επεξεργασία για 5 ώρες με GST-C2IN-p53 με την απουσία ή παρουσία C2IIa. Για την οπτικοποίηση των πυρήνων, τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα για PARP-1 και 0,75 μm οπτικές τομές αποκτήθηκαν και αξιολογήθηκαν για GST-C2IN-p53 χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα C2IN. Μόνο πολύ μικρές ποσότητες της GST-C2IN-p53 βρέθηκαν στην απουσία C2IIa, που αναδεικνύει την ιδιαιτερότητα της C2IIa που εξαρτώνται από την πρόσληψη. Το μεγαλύτερο μέρος των εσωτερικεύονται GST-C2IN-p53 εμφανίζεται κυτταροπλασματική εντόπιση, αλλά επίσης ανιχνεύθηκε στον πυρήνα, όπου συν-εντοπισμένη με PARP-1, όπως αποδεικνύεται από το κίτρινο χρώση στη συγχωνευμένη κανάλι (Εικ. 4Α.). Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε η C2IIa-εξαρτάται από την παράδοση του GST-C2IN-p53 σε κύτταρα Α549, τα οποία έδειξαν μία συγκρίσιμη ενδοκυτταρική κατανομή όπως παρατηρείται σε κύτταρα HeLa (Σχ. 4Β).

A

. Συνεστιακή μικροσκοπία πρόσληψης GST-C2IN-ρ53 σε κύτταρα HeLa. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GST-C2IN-p53 και C2IIa για 5 ώρες. Ως έλεγχος, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή επωάστηκαν χωρίς C2IIa. Ακολούθως, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά και βάφτηκαν για C2IN με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που ακολουθείται από μια Alexa 633-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (κόκκινο). ΡΑΚΡ-1 ανιχνεύθηκε με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα και επακόλουθη χρώση με Alexa 488-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα για την οπτικοποίηση των πυρήνων (πράσινο). Z-Stack εικόνες καταγράφηκαν σε 0,75 μm οπτικές τομές και επεξεργασία από ImageJ. Εκπρόσωπος εικόνες τους παρουσιάζονται. μπαρ κλίμακας: 10 μm.

Β

. Παράδοση του GST-C2IN-p53 σε κύτταρα Α549. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω. Z-Stack εικόνες αποκτήθηκαν σε 0,75 μm οπτικές τομές και επεξεργασία από ImageJ. Εκπρόσωπος εικόνες τους παρουσιάζονται. Ράβδος κλίμακας:.. 10 μm

Η

Συνοπτικά, αποδείξαμε ότι η GST-C2IN-p53 αποτελεσματικά εσωτερικοποιείται στο κυτταρόπλασμα των διαφόρων γραμμών καρκινικών κυττάρων σε μια συγκεκριμένη C2IIa τρόπο εξαρτώμενο

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη βασίζεται σε ένα με γενετική μηχανική πρωτεΐνη σύντηξης που βασίζονται σε μη-τοξικά τοξίνη C2 που παραδίδει την πρωτεΐνη ρ53 καταστολέα του όγκου στο κυτοσόλιο διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Εδώ, ρ53 κλωνοποιήθηκε σε πλαίσιο προς το C2IN τομέα προσαρμογέα που μεσολαβεί στην αλληλεπίδραση με την πρόσδεση της C2IIa /μονάδα μετατόπιση, οδηγώντας σε μετέπειτα κυτταρική πρόσληψη του. Το κατασκεύασμα εκφράστηκε ως GST-tagged πρωτεΐνη σύντηξης και καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας ηπαρίνης. Ωστόσο, η GST-tag δείχθηκε να είναι ανεπαρκή σε δεσμευτική γλουταθειόνη και δεν μπορούσε να απομακρυνθεί με διάσπαση θρομβίνης, η οποία μπορεί να οφείλεται σε παρεμπόδιση της πρόσβασης της θρομβίνης σε θέση διάσπασης του στερεοχημική παρεμπόδιση. Ωστόσο, το υπόλοιπο GST-ήμισυ στο Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης σύντηξης ούτε εμποδίζεται η ρ53-διαμεσολαβούμενη DNA δέσμευσης της πρωτεΐνης σύντηξης

in vitro

, ούτε η πρόσληψη C2IIa εξαρτώμενη του στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων-στόχων . Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενα ευρήματα που δείχνουν ότι το Ν-τερματικό GST-tag κάνει ούτε αναστέλλουν την αποτελεσματική C2II μεσολάβηση παράδοση των GST-C2I [27], ούτε ότι τοξίνης σύντηξης GST-C2IN-C3lim [28] στο κυτοσόλιο των HeLa κύτταρα. Αυτό είναι αξιοσημείωτο, δεδομένου ότι η σωστή αναδίπλωση της ρ53 είναι απαραίτητη για την δραστικότητα δέσμευσης DNA του και επηρεάζεται από μια πληθώρα παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της κατάστασης οξειδοαναγωγής [29] και άλλοι [30].

Μια εναλλακτική στρατηγική συνεπάγεται βιοτίνης-επισήμανση του ανασυνδυασμένου ρ53 και μετέπειτα σύζευξη της προς το C2-στρεπταβιδίνης μεταφορέα, όπως αποδεικνύεται πολύ πρόσφατα από την ομάδα μας [23]. Ωστόσο, η ομοιοπολική σύνδεση της ρ53 στον προσαρμογέα C2IN όπως παρουσιάζεται εδώ προσφέρει μια ανώτερη σταθερότητα σε σύγκριση με σύζευξη βιοτίνης-p53 να C2IN-στρεπταβιδίνης σε ένα μη-ομοιοπολικό τρόπο [23], καθώς στηρίζεται σε ένα τμήμα στρεπταβιδίνης βιοτίνης με μειωμένη δεσμευτική συγγένεια [13], [31]. Από την άλλη πλευρά αυτό επιτρέπει για ενδοκυτταρική απελευθέρωση του με βιοτίνη επισημασμένο συνδετήρα,

π.χ.

. από τον ανταγωνισμό με ενδογενή βιοτίνη.

Στη συνέχεια, απέδειξαν την C2IIa διαμεσολαβούμενη πρόσληψη της πρωτεΐνης σύντηξης GST-C2IN-p53 σε διάφορες γραμμές καρκινικών κυττάρων, με την οποία μετατίθεται στο κυτοσόλιο όπως επιβεβαιώθηκε από την ανίχνευση ανοσοκηλίδας κατά την κυτταρική κλασμάτωση. Αυτό είναι ένα ενδιαφέρον εύρημα έχοντας κατά νου ότι ο πόρος tanslocation που σχηματίζεται από C2IIa στις μεμβράνες οξινισμένου κυστίδια ενδοσωματιακής είναι μάλλον στενό [32] και μπορεί να περιορίσει την μετατόπιση του GST-C2IN-p53. Ως εκ τούτου, μπορεί να απαιτείται μερική εκδίπλωση της πρωτεΐνης σύντηξης, όπως παρατηρείται για άλλους εταίρους C2IN που βασίζονται σύντηξης [33]. Δεν έχουμε αναλύσει τη λειτουργικότητα ρ53 της πρωτεΐνης σύντηξης σε ζωντανά κύτταρα μετά την εσωτερίκευση και, ως εκ τούτου, δεν μπορεί να αποκλείσει ότι η διαδικασία μετατόπισης με υποθετικό ξεδίπλωμα του C2IN-p53 μπορεί να έχει επηρεάσει τη λειτουργία του ως μεταγραφικός παράγοντας, που πρέπει να διερευνηθεί σε μελλοντικές μελέτες . Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές όσον αφορά το κυτοσολικό εσωτερίκευση μεταξύ των κυτταρικών σειρών που δοκιμάστηκαν. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ενδογενής ρ53 ήταν ανιχνεύσιμη ούτε στην εκχυλίζεται κύτταρα ούτε στο κυτοσόλιο όλων των κυτταρικών γραμμών σε ρυθμίσεις χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western. Αυτό δεν είναι αξιοσημείωτη, επειδή τα κύτταρα HeLa και Saos-2 έχουν αναφερθεί για να εμφανιστεί πολύ χαμηλά έως μη ανιχνεύσιμα επίπεδα της πρωτεΐνης p53 [24], [34]. Επιπλέον, έχουμε δείξει πρόσφατα ενδογενές ρ53 σε μη τεταμένη Α549 κύτταρα με συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας μόνο υψηλής έντασης λέιζερ [35] ή με την επαγωγή της βλάβης του DNA με δοξορουβικίνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, ορισμένα μη ειδική σύνδεση της πρωτεΐνης σύντηξης απουσία C2IIa αποκαλύφθηκε σε εκχυλίζεται κύτταρα Saos-2 και HeLa. GST-C2IN-p53 συσσωρεύεται στο κυτοσόλιο μετά από 5 ώρες, αλλά δεν ήταν πλέον ανιχνεύσιμη μετά από 24 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συνέπεια, ένα κυτοσολικό αποικοδόμηση έχει επίσης αναφερθεί για άλλες πρωτεΐνες C2IN που βασίζονται σύντηξης, όπως C2IN-C3 [36], C2IN-SpvB [37] και C2IN-στρεπταβιδίνη [38]. Κατά την εσωτερίκευση σε HeLa και Α549 κύτταρα GST-C2IN-p53 ανιχνεύθηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα και λιγότερο εμφανώς στον πυρήνα, όπως παρατηρήθηκε με συνεστιακή μικροσκόπηση. Αυτό συνάδει με την ιδέα ότι η ρ53 βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα σε μη τεταμένη κύτταρα λόγω της Crm1 εξαρτώμενη πυρηνική εξαγωγή σε συνδυασμό με Mdm2 [39], [40]. Ωστόσο, πρέπει να έχουμε κατά νου ότι η υποκυτταρική εντόπιση του ρ53 ρυθμίζεται στενά από ένα δίκτυο μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών [41], η οποία μπορεί επίσης να επηρεαστεί από την GST-tag ή το C2IN-τομέα.

Λόγω της πανταχού παρούσα έκφραση του C2IIa-υποδοχέα σε όλα τα κύτταρα θηλαστικών δοκιμάστηκε [42], η πρωτεΐνη σύντηξης GST-C2IN-p53 μπορεί να παραδοθεί σε ένα ευρύ φάσμα καρκινικών κυτταρικών σειρών και πρωτογενή κύτταρα. Προκειμένου να επιτευχθεί μια στοχευμένη παράδοση, είναι νοητό να τροποποιήσει την δεσμευτική C2IIa /συνιστώσα μετατόπισης. Για το σκοπό αυτό, το C-τερματικό πεδίο της C2IIa που αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας θα μπορούσε να τροποποιηθεί με γενετική μηχανική, διατηρώντας την ικανότητα του C2IIa την μετατόπιση C2IN στο κυτοσόλιο [43]. Το τροποποιημένο C2IIa θα μπορούσε στη συνέχεια να συντηχθούν με πολυπεπτίδια όπως του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) ή η σωματοστατίνη, οι οποίες προωθούν την πρόσδεση στην EGF- ή somatastatin υποδοχέα που συχνά υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα [44], [45]. Αυτή η στρατηγική έχει περιγραφεί για προστατευτικό αντιγόνο (ΡΑ), το συστατικό πρόσδεσης /μετατόπιση των δυαδικών τοξινών άνθραξ που είναι στενά συνδεδεμένη με C2IIa. Μια μεταλλαγμένη μορφή του ΡΑ με ανεπάρκεια σε αναγνώριση υποδοχέα ήταν C-τερματικώς συντηγμένη προς ανθρώπινο EGF και κατευθυνόμενη την πρόσληψη LF και EF σε φέρουν υποδοχέα EGF κυττάρων [46].

Μία πιθανή σενάριο για την

σε vivo

χορήγηση C2IN-p53 στη θεραπεία όγκου θα ήταν εντός του όγκου έγχυση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σύμπλοκο με εγγενή C2IIa ή C2IIa τροποποιημένες με ομάδες στόχευσης όπως συζητήθηκε παραπάνω. Αυτή η στρατηγική θα μπορούσε αρχικά να δοκιμαστεί σε ξενομοσχεύματα ποντικών που ελήφθη μετά την ένεση των κυττάρων HeLa και μπορούσε τότε να μεταφράζονται στις κλινικές για τη θεραπεία των συμπαγών όγκων. Ωστόσο, η επιλεκτική παράδοση σε καρκινικά κύτταρα και ο αποκλεισμός των υποθετικών ανοσογόνος επιπτώσεις που προκαλούνται από την πρωτεΐνη σύντηξης αποτελούν απαραίτητες προϋποθέσεις για την επιτυχή

in vivo

εφαρμογή.

Εν κατακλείδι, έχουμε κατασκευάσει μια πρωτεΐνη σύντηξης που διατήρησε ρ53-εξαρτώμενη DNA του δραστικότητα δέσμευσης

in vitro

και εσωτερικοποιείται μέσω τομέα του C2IN στο κυτοσόλιο διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών χρησιμοποιώντας το δεσμευτικό C2IIa /συνιστώσα μετατόπισης.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλωνοποίηση της πρωτεΐνης σύντηξης C2IN-p53

cDNA ανθρώπινου ρ53 ενισχύθηκε με PCR από το πλασμίδιο RcCMV-ανθρώπινο ρ53, η οποία παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Michael Schwarz (Πανεπιστήμιο του Tübingen, Germany). Για το σκοπό αυτό, οι εκκινητές ρ53-Ι (5′-GAATTCAGATCTGAGGAGCCGCAGTC-3 ‘) και p53-ΙΙ (5′-GAATTCGGATCCTCAGTCTGAGTCAGG-3’) χρησιμοποιήθηκαν που επέτρεψε την εισαγωγή ενός

Bgl

II και ένα

Μπαμ

Η1 θέση περιορισμού. Το PCR προϊόν που ελήφθη στη συνέχεια συνδέθηκε εντός φορέα pCR-Blunt μέσω του κιτ κλωνοποίησης Zero Blunt PCR (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) και μετασχηματίσθηκε σε ικανά

E. coli

DH5a κύτταρα. Το πλασμίδιο pCR-p53 απομονώθηκε και σωστή ενίσχυση ελέγχθηκε με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA (GATC, Konstanz, Germany). Στη συνέχεια, απομονωμένες πλασμίδιο pCR-p53 χωνεύτηκε με

Bgl II και

Bam Η1

να απελευθερώσει cDNA ρ53 και συνδέθηκε εντός του πλασμιδίου pGEX2T-C2IN το οποίο είχε ευθυγραμμισθεί με το

Bam

Η1. Μετά το μετασχηματισμό σε αρμόδια

Ε. coli

κύτταρα, σωστή εισαγωγή του cDNA ρ53 στο προκύπτον πλασμίδιο pGEX2T-C2IN-p53 ελέγχθηκε με PCR αποικίας και ανάλυση ενζύμων περιορισμού. Τέλος, το κατασκεύασμα σύντηξης C2IN-p53 αλληλουχήθηκε με την pGEX2T 5′- και 3′-εκκινητές seqencing (GATC, Konstanz, Germany).

Έκφραση και καθαρισμός της ανασυνδυασμένης C2IN-p53

το παραγόμενο κατασκεύασμα σύντηξης C2IN-p53 υπερεκφράζεται ως GST-tagged πρωτεΐνη σύντηξης στο

Ε. coli

Rosetta και καθαρίστηκε έως ομοιογένεια με χρωματογραφία συγγένειας. Για το σκοπό αυτό,

E. coli

Rosetta κύτταρα μετασχηματισμένα με pGEX2T-C2IN-p53 αναπτύχθηκαν σε μία οπτική πυκνότητα της τάξης του 0,6 και η έκφραση της πρωτεΐνης προκλήθηκε με προσθήκη ισοπροπυλο-β-D-θειογαλακτοπυρανοσίδη (IPTG). Βακτηριακές καλλιέργειες στη συνέχεια επωάστηκαν για 20 ώρες στους 16 ° C και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Η λύση των κυττάρων έγινε δια κατεργασίας με υπερήχους σε ρυθμιστικό που περιέχει 0.1% Triton Χ-100 και τα κυτταρικά θραύσματα καταβυθίστηκε με φυγοκέντρηση σε 20 000

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το διαυγασμένο λύμα φορτώθηκε σε μία στήλη Ταχείας Ροής Q-Sepharose (GE Healthcare, Μόναχο, Γερμανία) και ρέει διαμέσου περιέχουν GST-C2IN-p53 συλλέχθηκε. Στη συνέχεια, το δείγμα εγχύθηκε σε μία στήλη ηπαρίνης-σεφαρόζης (GE Healthcare Γερμανία) και εκλούεται με μία γραμμική βαθμίδωση άλατος που κυμαίνεται από 0 έως 1 Μ NaCl. Τα κλάσματα με GST-C2IN-p53 στη συνέχεια ομαδοποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι ενός ρυθμιστικού διαλύματος που αποτελείται από 20 mM HEPES /ΚΟΗ ρΗ 7,4, 50 mM NaCl και 5 mM DTT. Πρωτεΐνη ταυτότητα των απομονωμένων GST-C2IN-p53 επιβεβαιώθηκε με 10% SDS-PAGE και εν συνεχεία ανάλυση Western Blot χρησιμοποιώντας ένα πολύκλωνο αντίσωμα C2IN αναπτύχθηκε σε κουνέλια [10], ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ρ53 (DO-1? Santa Cruz Biotechnology, Χαϊδελβέργη, Γερμανία ) και ένα αντίσωμα GST (BD Biosciences, Heidelberg, Γερμανία), αντίστοιχα. Για την ανάλυση της χρονο-εξαρτώμενη έκφραση του GST-C2IN-p53, δείγματα 100 μΐ βακτηριακής καλλιέργειας συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε 10% SDS-PAGE ακολουθούμενη από χρώση με Coomassie και ανοσοστύπωμα όπως περιγράφεται παραπάνω.

Έκφραση και καθαρισμός C2IN και C2IIa

C2IN (-26 kDa) και C2II (~81 kDa) εκφράστηκαν ως GST-tagged πρωτεΐνες στο

Ε. coli BL21

και καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας γλουταθειόνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [1], [10]. Μετά την απομόνωση των πρωτεϊνών, το τμήμα GST απομακρύνθηκε με θρομβίνη διάσπασης και C2II (~61 kDa) ενεργοποιήθηκε με θρυψίνη πέψη για να δώσει C2IIa όπως αναφέρθηκε [1]. Η καθαρότητα των πρωτεϊνών αναλύθηκε με 12.5% ​​SDS-PAGE και επακόλουθη χρώση με Coomassie.

δεσμευτικός ρ53 DNA δοκιμασία

Η ειδική DNA-σύνδεσης του GST-tagged C2IN-p53 προσδιορίστηκε με ηλεκτροφορητική δοκιμασία μετατόπισης κινητικότητας (EMSA). Για το σκοπό αυτό, ένα ολιγονουκλεοτίδιο διπλής όψης που φιλοξενούν μια θέση ρ53-σύνδεσης του υποκινητή MDM2 χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [47]. Η δέσμευση του C2IN-p53 με τα αποτελέσματα διπλό ολιγονουκλεοτίδιο σε σύμπλοκα υψηλού μοριακού βάρους DNA-p53 με μειωμένη ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Αυξανόμενες ποσότητες GST-C2IN-p53 (0-2000 ng πρωτεΐνης) προ-επωάστηκαν σε ρυθμιστικό δέσμευσης DNA για 10 λεπτά ακολουθούμενη από την προσθήκη του με βιοτίνη άκρου σημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο διπλής όψης (6 ηΜ). Ο σχηματισμός συμπλέγματος αφέθηκε να λάβει χώρα για επιπλέον 20 λεπτά πριν από τον τερματισμό της αντίδρασης με την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης EMSA επί πάγου. Τα δείγματα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με 6% (w /v) αυτοφυή PAGE και μεταφέρθηκαν πάνω σε μια θετικά φορτισμένη μεμβράνη νάιλον (GE Healthcare, Μόναχο, Γερμανία) με semidry blotting. Στη συνέχεια, η μεμβράνη σταθεροποιήθηκε για 60 λεπτά στους 90 ° C και αποκλείονται με 2% (w /v) BSA σε PBS-T. Ελεύθερη βιοτινυλιωμένα σύμπλοκα ολιγονουκλεοτιδίου και του DNA-C2IN-p53 ανιχνεύθηκαν με στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση (1:15,000) χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια.

SDS-PAGE και immunoblot ανάλυση

Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS- PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Whatman, Dassel, Germany) σε ένα θάλαμο υγρής-blot (GE Healthcare, München, Germany). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% (w /v) μη λιπαρό ξηρό γάλα σε PBS που περιέχει Tween-20 [0,1% (ν /ν), PBS-T] για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Ακολούθως, η μεμβράνη επωάστηκε με το αντίστοιχο πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε PBS-T για 1 ώρα σε RT. Μετά την πλύση της μεμβράνης 3 φορές με PBS-T, αυτό επεσημάνθη με το κατάλληλο δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany) για 1 ώρα. Μετά από περαιτέρω στάδια έκπλυσης, πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας το Immobilon Western χημειοφωταύγειας HRP Substrate (Millipore, Schwalbach, Germany).

Κυτταροκαλλιέργεια

HeLa καρκινώματος του τραχήλου της μήτρας και των πνευμόνων Α549 κύτταρα αδενοκαρκινώματος διατηρήθηκαν σε 37 ° C και 5% (ν /ν) CO

2 σε ελάχιστο βασικό μέσο (ΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) απενεργοποιημένο με θέρμανση ορό εμβρύου μόσχου (FCS), L-γλουταμινικό (2 mM), 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. Saos-2 κύτταρα οστεοσαρκώματος διατηρήθηκαν σε μέσο 5Α τροποποιημένο McCoy συμπληρωμένο με 2 mM Ε-γλουταμίνη, 10% θερμοαπενεργοποιημένο FCS και αντιβιοτικά. Τα κύτταρα συνήθως σε επεξεργασία με θρυψίνη και επανακαλλιεργήθηκαν τρεις φορές την εβδομάδα.

Digitonin με βάση κύτταρο κλασματοποίησης

Κυττάρων κλασμάτωση HeLa, Α549 ή Saos-2 κυττάρων διεξήχθη βασικά όπως περιγράφεται προηγουμένως [13], [ ,,,0],48]. Εν συντομία, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων όλη τη νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ένα σύμπλοκο GST-C2IN-p53 (2,5 μg /ml) και C2IIa (5 μg /ml) για τα χρονικά σημεία που υποδεικνύονται. Ως έλεγχος, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή επωάστηκαν με GST-C2IN-p53 απουσία C2IIa. Το μέσο στη συνέχεια αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με PBS.