Αφηρημένο

προανθοκυανιδίνες σπόρων σταφυλιού (GSPs), ένα βιολογικά ενεργό συστατικό των σπόρων σταφυλιού, έχουν αναφερθεί ότι κατέχουν ένα ευρύ φάσμα φαρμακολογικών και βιοχημικών ιδιοτήτων. Πρόσφατα, οι ανασταλτικές επιδράσεις της GSPs σε διάφορες μορφές καρκίνου έχουν αναφερθεί, αλλά τα αποτελέσματά τους για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας παραμένουν ασαφείς. Εδώ, ερευνήσαμε την επίδραση της GSPs επί τραχηλικού καρκίνου χρησιμοποιώντας in vitro και in vivo μοντέλα. In vitro, η θεραπεία των κυττάρων HeLa και SiHa με τις GSP οδήγησε σε σημαντική αναστολή της κυτταρικής βιωσιμότητας. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι GSPs οδήγησε στην επαγωγή δοσο-εξαρτώμενη απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα. Ο υποκείμενος μηχανισμός συνδέεται με αυξημένη έκφραση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη Bak-1, μειωμένη έκφραση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2, η απώλεια του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης, και την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, γεγονός που υποδηλώνει ότι GSPS προκαλούμενη του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων απόπτωση μέσω της μιτοχονδριακής οδού. Επιπλέον, η χορήγηση του GSPs (0,1%, 0,2%, και 0,4%, β /ο) ως συμπλήρωμα στο πόσιμο νερό ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων HeLa και SiHa σε αθυμικά γυμνά ποντίκια, και τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων σε εκείνων των όγκων ήταν επίσης αυξηθεί σημαντικά. Λαμβανόμενες μαζί, οι μελέτες μας έδειξαν ότι θα μπορούσε να τις GSP αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου με επαγωγή απόπτωσης μέσω της μιτοχονδριακής οδού, η οποία παρέχει την απόδειξη που δείχνει ότι GSPs μπορεί να είναι ένας δυνητικός χημειοπροληπτικές και /ή χημειοθεραπευτικό παράγοντα για καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Citation : Τσεν Q, Liu XF, Zheng PS (2014) σπόρων σταφυλιού προανθοκυανιδίνες (GSPs) αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας από την επαγωγή της απόπτωσης που διαμεσολαβείται από το μιτοχονδριακό Pathway. PLoS ONE 9 (9): e107045. doi: 10.1371 /journal.pone.0107045

Επιμέλεια: Burton Β Yang, του Πανεπιστημίου του Τορόντο, Καναδά

Ελήφθη: 5, Μάρ 2014? Αποδεκτές: 4 Αυγούστου 2014? Δημοσιεύθηκε: 4η Σεπτεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ταμείο Φυσικών Επιστημών για Διακεκριμένη Νέους Επιστήμονες (Αρ 30725043), μια γενική επιχορήγηση (Νο 81270715) και μια νεολαία επιχορήγησης (Νο 31201118) από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο τρίτος συχνότερος καρκίνος [1] και η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται μεταξύ των γυναικών σε όλο τον κόσμο [2]. Περίπου το 80% των περιπτώσεων καρκίνου του τραχήλου της μήτρας συμβαίνουν στις αναπτυσσόμενες χώρες, όπου περίπου 529.000 νέες περιπτώσεις ανιχνεύονται κάθε χρόνο, με σχεδόν το ήμισυ αυτών των ασθενών πεθαίνουν [3]. Στις αναπτυσσόμενες χώρες, λόγω της έλλειψης ελέγχου και μειωμένη πρόσβαση σε κατάλληλες θεραπευτικές εγκαταστάσεις και τα ναρκωτικά, τη συχνότητα και τα ποσοστά θνησιμότητας του τραχήλου της μήτρας κατάταξη καρκίνο δεύτερο μετά τον καρκίνο του μαστού [4]. Πολλές περιπτώσεις έχουν εξελιχθεί σε επεμβατικές καρκίνων του τραχήλου κατά τη στιγμή της διάγνωσης, και οι ασθενείς δεν αποτελούν πλέον υποψήφιοι για ριζική χειρουργική θεραπεία. Αν και η χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία αποτελούν τους κύριους θεραπείες για διηθητικού καρκίνου του τραχήλου, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης είναι περιορισμένη λόγω της περιορισμένης αποτελεσματικότητας και υψηλή τοξικότητα πολλών αντικαρκινικών φαρμάκων. Ως εκ τούτου, η διερεύνηση και ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών και λιγότερο τοξικές θεραπευτικούς παράγοντες απαιτούνται.

Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η κατανάλωση μιας δίαιτας vegetable- και με βάση τα φρούτα μειώνει σημαντικά τον κίνδυνο καρκίνου του [5], [ ,,,0],6], το οποίο προσφέρει πολλά υποσχόμενη νέες επιλογές για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών χημειοπροληπτική ή χημειοθεραπευτικών στρατηγικών για διάφορους καρκίνους. Πρόσφατα, πολλές φυτοχημικά διαφορετικών χημικών φύσεων που απομονώθηκαν από τα φρούτα και τα λαχανικά έχουν αποκαλυφθεί ότι έχουν δυναμικό χημειοπροληπτική ή /και χημειοθεραπευτικών αποτελέσματα έναντι καρκίνων [7], [8], όπως οι κατεχίνες, βιοφλαβονοειδή, φυτο-οιστρογόνα και προανθοκυανιδίνες [9], [10]. προανθοκυανιδίνες σπόρων σταφυλιού (GSPs), ένα μίγμα πολυφαινολικό, περιέχουν κυρίως το 70% -95% προανθοκυανιδίνες, τα οποία αποτελούν διμερή, τριμερή, τετραμερή, και ολιγομερή /πολυμερή μονομερούς κατεχινών ή /και (-) – επικατεχίνη [11] – [13] . GSPs έχουν αποδειχθεί ότι έχουν ελάχιστη τοξικότητα in vivo και αποτελεσματικές αντικαρκινικές επιδράσεις επί διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων [14], όπως ο καρκίνος του προστάτη στον άνθρωπο [15], τα ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου [16], [17], ανθρώπινα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [ ,,,0],18], [19], του καρκίνου του παγκρέατος [20], και κεφαλής και λαιμού πλακώδους καρκίνου του [21]. Παρ ‘όλα αυτά, προς το παρόν, δεν υπάρχουν μελέτες έχουν εξετάσει τις επιδράσεις της GSPs στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Στη μελέτη αυτή, τις GSP βρέθηκαν να είναι σε θέση να αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας in vitro και in vivo, παρέχοντας πειστικά στοιχεία για τη φαρμακολογική δραστικότητα του GSPs έναντι του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα, τα αντιδραστήρια και τα χημικά

Αντισώματα ειδικά για Bcl-2, Bak-1 και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Δευτερεύουσα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific, Inc. (New York, ΝΥ). Η FITC κιτ ανίχνευσης απόπτωσης V-ανεξίνη ελήφθη από BD Pharmaceuticals (Franklin Lakes, NJ). Η μιτοχονδριακή μεμβράνη κιτ δυναμικό ανίχνευση JC-1 και κασπάσης-3 κιτ ανίχνευσης δραστηριότητας αγοράστηκαν από Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Κίνα), και η in situ κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου αγοράστηκε από την Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, ΣΕ). ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλο-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο), ΡΙ (ιωδιούχο προπίδιο) και DAPI (2- (4-αμιδινοφαινυλ) -6-indolecarbamidine διυδροχλωρική) ελήφθησαν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ). Οι GSPs αγοράστηκαν από Jianfeng Φυσικό Ε Προϊόντων & amp?. Α, Ltd (Tianjin, Κίνα)

κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές SiHa και HeLa αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Invitrogen, Carlsbad, USA) στους 37 ° C σε 5% CO

2. GSPs διαλύθηκαν σε μια μικρή ποσότητα διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO, 100 μΙ) πριν από την προσθήκη στα μέσα ενημέρωσης. Η μέγιστη συγκέντρωση του DMSO στο μέσο δεν υπερέβη το 0,1% (ν /ν), και κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO μόνο χρησίμευσε ως έλεγχος οχήματος.

ΜΤΤ δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας για

Η επίδραση του GSPs στη βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό ΜΤΤ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 96 φρεατίων σε 5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο και επωάστηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις GSP σε διάφορες συγκεντρώσεις για 24, 48 ή 72 ώρες. Στο τέλος του χρόνου διέγερσης, ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Η προκύπτουσα φορμαζάνη κατόπιν διαλύθηκε σε 100 μι διμεθυλσουλφοξειδίου (DMSO), και η απορρόφηση καταγράφηκε στα 540 nm χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad 3350 αναγνώστη μικροπλακός.

κυτταρομετρίας ροής ανίχνευση της απόπτωσης

Οι επιδράσεις του GSPs στην απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το αννεξίνης V-συζευγμένο κιτ ανίχνευσης ΡΙΤΟ απόπτωση (BD, Franklin Lakes, NJ). Εν συντομία, μετά από θεραπεία με τις GSP για 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, τα χρωματισμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις GSPs για 48 ώρες, στη συνέχεια συλλέχθηκαν , πλύθηκε με ψυχρό PBS, και ακολούθησε στερέωση με παγωμένο 70% αιθανόλη όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά πλύση δύο φορές με PBS, τα κύτταρα βάφτηκαν με διάλυμα φθορισμού ανιχνευτή που περιέχει 50 μg /ml ΡΙ και 1 mg /ml RNaseA επί πάγου στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Το κυτταρικό κύκλο αναλύθηκε με κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest.

Western ανάλυση κηλίδος

Μετά την αγωγή με κύτταρα GSPs, HeLa και SiHa συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS και λύθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Για ανάλυση στυπώματος Western, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF με υγρή μεταφορά. Μετά τον αποκλεισμό με 5% αποβουτυρωμένο γάλα, η μεμβράνη επωάστηκε με το πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά την πλύση, η μεμβράνη επωάστηκε με το κατάλληλο συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα, και οι πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστήρια (Millipore, Billerica, USA) σε φιλμ ακτίνων Χ.

Δοκιμασία για μιτοχονδριακή μεμβράνη δυναμικό

οι αλλαγές στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τις GSP μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης φθορισμού λιπόφιλες κατιονικές ανιχνευτή JC-1 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. JC-1 συσσωρεύεται επιλεκτικά μέσα στα φυσιολογικά μιτοχόνδρια για να σχηματίσουν πολυμερές J-αδρανών υλικών που εκπέμπουν κόκκινο φθορισμό. JC-1 δεν μπορεί συσσωμάτωμα σε μιτοχόνδρια με αλλαγμένη δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και παραμένει στο κυτταρόπλασμα σε μονομερή μορφή, φθορίζουσα πράσινη. Έτσι, το χρώμα των αλλαγών χρώματος από πορτοκαλί σε πράσινο, ανάλογα με το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, και μπορεί να αναλύονται με κυτταρομετρία ροής στο κανάλι FITC.

Η ανίχνευση της κασπάσης-3 δραστικότητα

Η δραστικότητα της κασπάσης-3 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ στόχος apo σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις GSP για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν. Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Δείγματα των κυτταρικών λυμάτων (150 μα πρωτεΐνης ανά δείγμα) αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης και το υπόστρωμα και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C. Η απορρόφηση μετρήθηκε κατόπιν σε 405 nm, και οι αναγνώσεις δείγματος υπολογίζεται με αφαίρεση της απορρόφησης των τυφλών δειγμάτων.

Ζώα και μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

Θηλυκά BALB /C γυμνά ποντίκια (6-7 παλιά εβδομάδων) ελήφθησαν από Slac Laboratory Animal Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα) και στεγάζεται σε διευκόλυνσης των πόρων των ζώων στο Ιατρικό Κολέγιο της Xi’an Jiaotong Πανεπιστημίου, που διατηρήθηκε σε σταθερή θερμοκρασία (22 ° C-25 ° C ) και υγρασία (40-50%). Όλα τα ζώα είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε πόσιμο νερό και τρόφιμα, και έλαβε ανθρώπινη μεταχείριση, σύμφωνα με τις διεθνώς αποδεκτές αρχές για εργαστηριακή χρήση ζώων και τη φροντίδα (κατευθυντήριες γραμμές της Ευρωπαϊκής Κοινότητας, την οδηγία ΕΟΚ του 1986? 86/609 /ΕΟΚ). Το πρωτόκολλο των ζώων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση του Ιατρικού Κολλεγίου του Πανεπιστημίου Xi’an Jiaotong.

Για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της GSPs από την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας in vivo, δύο μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου είχαν χρησιμοποιήθει. Υπόδειγμα 1: Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες με έξι ποντικοί ανά ομάδα, ομάδα 1, ο έλεγχος? Ομάδα 2, τις GSP (0,1%, β /ο)? Ομάδα 3, τις GSP (0,2%, β /ο)? Ομάδα 4, τις GSP (0,4%, β /ο), και τα ποντίκια έλαβαν τις GSP για τουλάχιστον 10 ημέρες πριν από την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Υπόδειγμα 2: Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες με έξι ποντικοί ανά ομάδα, ομάδα 1, ο έλεγχος? Ομάδα 2, τις GSP (0,4%, β /ο), και τα ποντίκια άρχισαν να λαμβάνουν τις GSP την 12η ημέρα μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα HeLa και SiHa κύτταρα (2 χ 10

6 σε 100 μΙ PBS) εγχύθηκαν υποδορίως στο δεξιό πλευρό του κάθε ποντικού, αντίστοιχα. GSPs διαλύθηκε σε απεσταγμένο νερό, και τα ποντίκια έλαβαν τις GSP από το πόσιμο νερό ελεύθερα. Οι ποντικοί ελέγχου έλαβαν το αποσταγμένο νερό. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε τακτικά χρησιμοποιώντας παχύμετρο τη διάρκεια του πειράματος, και οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: Όγκος = (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Στο τέλος του πειράματος, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με αποκεφαλισμό υπό αναισθησία 25% ουρεθάνη, και η μάζα του όγκου συλλέχθηκε και ζυγίστηκε. Ένα τμήμα του ιστού του όγκου εγκλεισμένα σε παραφίνη και το άλλο τμήμα καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο για την περαιτέρω ανάλυση.

Η ιστοπαθολογική εξέταση

Τα τμήματα παραφίνης των ξενομοσχευμάτων όγκου αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν μέσω φθίνουσα συγκεντρώσεις αιθανόλης σύμφωνα με μεθόδους ρουτίνας και βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και εοσίνη (η &? Ε) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Όλες οι τομές εξετάστηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός.

δοκιμασία TUNEL για απόπτωση των καρκινικών κυττάρων

Η δοκιμασία TUNEL εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης σε κυτταρικό θάνατο situ (Roche Corporation, USA) ακολουθώντας το κατασκευαστή πρωτόκολλο. Εν συντομία, μετά την αποκήρωση και την επανυδάτωση των τμημάτων του όγκου, επωάστηκαν με πρωτεϊνάση Κ στους 37 ° C για 15 λεπτά. Τα διαπερατά τομές επωάστηκαν με μίγμα της αντίδρασης TUNEL στους 37 ° C για 60 λεπτά στο σκοτάδι. Αφού ξεπλύθηκαν 3 φορές με PBS, οι τομές επωάστηκαν με μετατροπέα-POD στους 37 ° C για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από την ανάπτυξη υποστρώματος DAB. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη, και TUNEL-θετικά κύτταρα εξετάστηκαν και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο.

μικροσκοπία φθορισμού εξέταση

Τα αποπτωτικά πυρηνική μορφολογία αξιολογήθηκε με χρώση των κυττάρων με την φθορίζουσα χρωστική δέσμευσης DNA DAPI. Μετά τη θεραπεία του καρκίνου του τραχήλου κυττάρων με τις GSP για 48 ώρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (0,5 mg /ml) για 5 λεπτά στο σκοτάδι, και στη συνέχεια, η πυρηνική μορφολογία παρατηρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Japan).

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD. Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν είτε από απλή μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από

post hoc

δοκιμασία του Tukey και τη δοκιμή Chi-Square, και

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

GSPs ανέστειλε την βιωσιμότητα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων in vitro

Η επίδραση της GSPs στην βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας αρχικά εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια ΜΤΤ δοκιμασία. Οι τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων κυττάρων HeLa και SiHa, υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις τις GSP (0, 20, 40, 60, 80 και 100 μg /ml) για 24, 48 ή 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, η θεραπεία των κυττάρων HeLa με τις GSP οδήγησε σε σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (

ρ

& lt? 0,05). Ειδικότερα, ένα σημαντικό ανασταλτικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία GSP (μείωση 5-85%,

ρ

& lt? 0,05). Επιπλέον, η επίδραση ήταν επίσης εξαρτώμενη από το χρόνο (60 μg /ml GSPs, μείωση 25-90%,

ρ

& lt? 0,05). Παρόμοιες ανασταλτικές επιδράσεις παρατηρήθηκαν σε κύτταρα SiHa σε επεξεργασία με τις GSP (Εικ. 1Β). Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι GSPs θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά την βιωσιμότητα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων.

(Α) HeLa και (Β) κύτταρα SiHa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διάφορες δόσεις GSPs, και η σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία στις 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε όρους ποσοστού κυττάρων ελέγχου ως η μέση τιμή ± SD που λαμβάνονται από 3 ξεχωριστά πειράματα. (Γ) Η αναστολή της ανάπτυξης και μορφολογικές μεταβολές των κυττάρων HeLa και SiHa αγωγή με τις GSP για 48 ώρες σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (μη-GSPs-θεραπεία). Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν με ανεστραμμένη μικροσκοπία αντίθεσης (μεγέθυνση, 40 φορές).

Η

Επιπλέον, η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων SiHa και HeLa μετά από θεραπεία GSPs παρατηρήθηκε επίσης κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C, μετά από 48 ώρες θεραπείας GSPs, η πυκνότητα των δύο κυτταρικές σειρές ήταν σημαντικά μειωμένη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. θεραπεία GSPs επίσης αξιοσημείωτα μετέβαλε την μορφολογία των αυχενικών καρκινικών κυττάρων. Μετά την επεξεργασία GSPs, τα κύτταρα HeLa και SiHa μειωθεί σε μέγεθος, ανασύρεται από τους γείτονές τους, έχασαν επίπεδη και πολυγωνικό σχήμα τους, και τελικά αποσπώνται από το τρυβλίο καλλιέργειας, γεγονός που υποδηλώνει ότι GSPS ανέστειλαν βιωσιμότητα του τραχήλου της μήτρας των καρκινικών κυττάρων μέσω επαγωγής κυτταρικού θανάτου.

GSPs επαγόμενη διακοπή κύκλου κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας

Για σαφές εάν η αυχενική βιωσιμότητα αναστολή των καρκινικών κυττάρων του GSPs εμπλέκεται στην αλλοίωση στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, εκτελέστηκε η ανάλυση κυτταρικού κύκλου. HeLa και SiHa κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόση GSPs για 48 ώρες, η κατανομή των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και Β, η θεραπεία των κυττάρων HeLa με τις GSP οδήγησε σε σημαντική συσσώρευση των κυττάρων στο G2 /M φάση σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (40 μg /ml και 80 μg /ml,

ρ

& lt? 0,01). Παρόμοια με τα αποτελέσματα των κυττάρων HeLa, ένα σημαντικό σύλληψη των κυττάρων στο G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα SiHa στα 40 και 80 μg /συγκέντρωση του GSPs ml (Σχ. 2C και D,

ρ

& lt? 0,01). Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι GSPs θα μπορούσε να προκαλέσει τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου σε G

2 /M φάση, η οποία μπορεί να σχετίζεται με την ανασταλτική επίδραση της GSPs επί του τραχήλου της μήτρας των καρκινικών κυττάρων.

HeLa και SiHa κύτταρα ήταν επεξεργασία με διάφορες δόση GSPs για 48 ώρες, και συλλέχθηκαν. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. (A, C) Οι αντιπροσωπευτικές ιστογράμματα κυτταρικού κύκλου HeLa και SiHa. (Β) Η επεξεργασία των κυττάρων HeLa με τις GSP ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση κυττάρων σε G

2 /M φάση. (Δ) Η επεξεργασία των κυττάρων SiHa με τις GSP οδήγησε στη συσσώρευση των κυττάρων στο G

2 /M φάση. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD, *

ρ

& lt? 0,05

vs

ελέγχου.? **

σ

& lt?.. 0.01

vs

έλεγχο

Η

GSPs προκάλεσε την απόπτωση του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα

Για να προσδιορίσετε αν GSPs που προκαλείται η απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του τραχήλου, παρατηρήσαμε τη μορφολογική αλλαγή του κυτταρικού πυρήνα χρησιμοποιώντας χρώση ϋΑΡΙ (Σχ. 3Α). Ένας αριθμός των κυττάρων HeLa και SiHa αγωγή με διάφορες δόσεις GSPs για 48 ώρες βρέθηκαν να εμφανίζουν κλασσική αποπτωτικά αλλαγές, όπως η συμπύκνωση της χρωματίνης, και ο σχηματισμός καρυοπυκνώσεως αποπτωτικά σώμα. Ωστόσο, οι μη επεξεργασμένο έλεγχο SiHa και HeLa κύτταρα που εμφανίζονται σπάνια αυτά τα χαρακτηριστικά, υποδηλώνοντας ότι η αγωγή μπορεί να επάγει GSP την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας.

HeLa και SiHa κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες δόσεις GSPs για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για την ανάλυση απόπτωσης. (Α) Οι μορφολογικές αλλαγές των πυρήνων εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας χρώση ϋΑΡΙ. Το βέλος δείχνει πυρηνική συμπύκνωση και μία αποπτωτική σώμα (μεγέθυνση, 40 φορές). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής αννεξίνης V-FITC /ΡΙ διπλό χρωματίστηκαν HeLa (Β) και κύτταρα SiHa (C). Το χαμηλό δεξιά (LR) τεταρτημόριο των ιστογραμμάτων δείχνει τα πρώιμα αποπτωτικών κυττάρων και η άνω δεξιά (UR) τεταρτημόριο δείχνει τα τέλη αποπτωτικά κύτταρα. Η θεραπεία της HeLa (Β) και κύτταρα SiHa (C) με τις GSP οδηγεί σε σημαντικές αυξήσεις στα ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων (συμπεριλαμβανομένων πρώιμο στάδιο και όψιμου σταδίου). Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD τριών πειραμάτων εις διπλούν, *

ρ

& lt? 0,05

vs

ελέγχου.? **

σ

& lt?.. 0.01

vs

έλεγχο

Η

Για περαιτέρω ποσοτική ανάλυση της απόπτωσης που προκαλείται από τις GSP, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με διάφορες δόσεις GSPs ήταν αναλύονται με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας διπλή χρώση αννεξίνης V-FITC /ΡΙ. Αποπτωτικών κυττάρων θα μπορούσε να είναι δακτυλογραφημένες σε πρώιμα στάδια απόπτωσης (αννεξίνη V

+ και PI

-) και προχωρημένου σταδίου απόπτωση (αννεξίνη V

+ και PI

+), τα οποία παρουσιάζονται, αντίστοιχα, στην κάτω δεξιά (LR) και άνω δεξιά (UR) τεταρτημόρια των ιστογραμμάτων FACS (Εικ. 3Β και Δ, αριστερό πάνελ). Τα αποτελέσματα απόπτωση (συμπεριλαμβανομένων πρώιμου σταδίου και όψιμου σταδίου) σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές συνοψίζονται περαιτέρω στο Σχήμα 3 C και Ε Το ποσοστό της συνολικής αποπτωτικών κυττάρων σε κύτταρα HeLa ήταν 1,5% σε κύτταρα ελέγχου (αρχικών σταδίων: 0,69% και όψιμη φάση: 0,81%), 3,1% σε κύτταρα κατεργασμένα με 20 μg /GSPs ml (αρχικών σταδίων: 0,95% και όψιμου σταδίου: 2.15%), 17,51% σε κύτταρα κατεργασμένα με 40 μg /ml (πρώιμο στάδιο: 4,21% και τελευταίο στάδιο: 13.30%) και 25,6% στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 80 μg /ml (σε πρώιμο στάδιο: 8,33% και τελευταίο στάδιο: 17.27%). Ομοίως, εκείνα τα κύτταρα SiHa ήταν 1,37% σε κύτταρα ελέγχου (αρχικών σταδίων: 0,63% και όψιμου σταδίου: 0.74%), 3,08% σε κύτταρα κατεργασμένα με 20 μg /ml GSPs (αρχικών σταδίων: 1,43% και προχωρημένου σταδίου : 1,65%), 3,56% σε κύτταρα κατεργασμένα με 40 μg /ml (σε πρώιμα στάδια: 1,62% και όψιμου σταδίου: 1.94%) και 9,56% σε κύτταρα κατεργασμένα με 80 μg /ml (σε πρώιμα στάδια: 3,25% και αργά -Στάδιο: 6,31%). Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι GSPS επάγεται σημαντικά την απόπτωση (συμπεριλαμβανομένων πρώιμο και όψιμο στάδιο απόπτωσης,

ρ

& lt? 0,01) από του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων

GSPs επάγεται την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας κατευθείαν. η προς τα κάτω ρύθμιση της Bcl-2 και η προς τα πάνω ρύθμιση του Bak-1

Τόσο οι πρωτεΐνες Bcl-2 και Bak-1 παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης [25], [26]. Έτσι, η έκφραση του Bcl-2 και Bak-1 εξετάστηκε με στύπωση Western για να προσδιοριστεί κατά πόσον οι δύο αυτές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην επαγωγή του καρκίνου του τραχήλου κυτταρικής απόπτωσης από τις GSP. Οι αντιπροσωπευτικές κηλίδες για τα κύτταρα HeLa και SiHa φαίνεται στο Σχ. 4Α και C, αντίστοιχα, και η σχετική έκφραση αυτών των πρωτεϊνών υπολογίστηκε περαιτέρω μέσω ομαλοποίηση σε β-ακτίνη έκφρασης και συνοψίζεται στην Εικόνα 4 Β και D, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του Bcl-2 σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με τις GSP για 48 ώρες μειώθηκε σημαντικά σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Β,

ρ

& lt?. 0.05). Αντιστρόφως, η έκφραση του Bak-1 ήταν σημαντικά αυξημένη (Σχήμα 4Β,

ρ

& lt?. 0.05). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και με κύτταρα SiHa (Σχήμα 4D,

σ

& lt?. 0.05). Ως εκ τούτου, τις GSP επάγεται την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας μέσω του κάτω ρύθμιση του Bcl-2 και στην ανοδική ρύθμιση του Bak-1.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις GSPs για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν . Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. (Α) Η επεξεργασία των κυττάρων HeLa με τις GSP οδήγησε σε εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της έκφρασης Bcl-2 και αύξηση των Bak-1 έκφρασης. (Β) Η σχετική έκφραση του Bcl-2 και Bak-1 πρωτεϊνών σε κύτταρα HeLa υπολογίστηκαν με βάση β-ακτίνης έκφρασης, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) GSPs μείωσε σημαντικά την έκφραση του Bcl-2 και αύξησε την έκφραση του Bak-1 σε κύτταρα SiHa. (Δ) Η σχετική των επιπέδων έκφρασης του Bcl-2 και Bak-1 σε κύτταρα SiHa συνοψίζονται. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες φαίνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα, και οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. *

σ

& lt? 0,05

vs

ελέγχου.? **

σ

& lt?.. 0.01

vs

έλεγχο

Η

GSPs που προκαλείται από την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα και ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κασπάση-3

είναι καλά γνωστό ότι η ενδοκυτταρική μετατόπιση του Bcl-2 και Bak-1 μπορεί να προκαλέσει την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, η οποία συνδέεται με την έναρξη και την ενεργοποίηση της αποπτωτικής διεργασίας στα κύτταρα [27], [28 ]. Για να διερευνηθεί η επίδραση της GSPs στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, η ακεραιότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρώση με JC-1, ένα κατιονικό λιπόφιλη χρωστική. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α και C, HeLa και SiHa κύτταρα επεξεργασμένα με τις GSP για 48 ώρες αναλύθηκαν με FACS. Το μέσο ποσοστό πράσινου φθορισμού-θετικών κυττάρων HeLa ήταν 3,10% στα 0,00 μg /ml, 5,27% στα 20 μg /ml, 6,90% στα 40 μg /ml και 10.83% σε 80 μg /ml (Εικ. 5Β), ενώ η των κυττάρων SiHa ήταν 0,45% στα 0,00 μg /ml, 1,55% στα 20 μg /ml, 8,35% στα 40 μg /ml και 35.47% σε 80 μg /ml (Σχ. 5D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αύξηση στο πράσινο φθορισμό-θετικών κυττάρων με αυξανόμενες δόσεις GSPs (

ρ

& lt? 0,01), γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να διεγείρει τις GSP τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα να χάνουν το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Ως εκ τούτου, τις GSP επάγεται την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας μέσω της διακοπής του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης.

HeLa (Α) και SiHa κύτταρα (C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις GSPs για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν, χρωματισμένο με JC-1 βαφή, και τελικά αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. GSPs είχε ως αποτέλεσμα σημαντική απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε HeLa (Β) και κύτταρα SiHa (D). Caspase-3 δραστικότητα σε κύτταρα HeLa και SiHa μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία χρωματομετρικού πρωτεΐνη, και τη θεραπεία των HeLa (Ε) και τα κύτταρα SiHa (F) με τις GSP οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη αύξηση της δραστηριότητας της κασπάσης-3. GFP: Πράσινο φθορισμού θετική. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα, *

ρ

& lt? 0,05

vs

ελέγχου.? **

σ

& lt? 0,01

vs

έλεγχο

Η

Λόγω της απώλειας του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, το κυτόχρωμα c απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα, η οποία ενεργοποιεί.. προκασπάσης 9 στο αποπτωσώματος και οδηγεί στην διάσπαση της κασπάσης-3 [29]. Στη συνέχεια, ενεργός διασπασμένη κασπάση 3 μπορεί να διασπάσει ένα ευρύ φάσμα πρωτεϊνών στόχων και τέλος να οδηγήσει σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Για να εξεταστεί κατά πόσον η απόπτωση που επάγεται από τις GSP εμπλέκεται στην ενεργοποίηση καταρράκτη, οι δραστηριότητες της κασπάσης-3 προσδιορίστηκε με χρωματομετρική δοκιμασία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία τόσο των κυττάρων HeLa και SiHa με τις GSP για 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της κασπάσης-3 με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5Ε και F), γεγονός που υποδηλώνει ότι η απόπτωση των αυχενικών καρκινικών κυττάρων που επάγεται από GSPs προκύψει με την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 οδού.

GSPs ανέστειλε την έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου του τραχήλου in vivo

Επειδή GSPs θα μπορούσε να επάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας in vitro, ήταν αναγκαίο να ελεγχθεί αν τις GSP μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου και την έναρξη του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων in vivo. Για να δοκιμαστούν τα αποτελέσματα GSPs για την έναρξη και την εξέλιξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας, γυμνά ποντίκια τράφηκαν GSPs για 10 ημέρες πριν από τον εμβολιασμό με καρκίνο του τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Η ανάπτυξη των όγκων παρακολουθήθηκε από την άποψη του όγκου του όγκου κάθε τρεις ημέρες. Στο τέλος του πειράματος, οι όγκοι αποκόπηκαν μετά θυσιάστηκαν τα ποντίκια, και προσδιορίστηκαν τα υγρά βάρη των όγκων.

Πρώτον, βρήκαμε ότι ο σχηματισμός όγκου από κύτταρα HeLa στην ομάδα ελέγχου εμφανίστηκαν σε 12 ημέρες μετά τον εμβολιασμό? Ωστόσο, ο σχηματισμός όγκου στην ομάδα αγωγής GSPs (GSPs, 0,2% και 0,4%) εμφανίστηκε περίπου στις 15 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα SiHa, υποδηλώνοντας ότι GSPs ανέστειλε την έναρξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Δεύτερον, ο ρυθμός αύξησης των ξενομοσχευμάτων όγκου HeLa και SiHa σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με τις GSP ήταν σημαντικά βραδύτερη από εκείνη των ελέγχων (Εικ. 6Α και Β), που πρότεινε ότι GSPs ανέστειλε την ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας ξενομοσχευμάτων καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς. Τελικά, το μέσο υγρό βάρος ξενομοσχευμάτων όγκου που αποτελούνται από κύτταρα HeLa μετά από θεραπεία GSPs ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη του ελέγχου (

ρ

& lt? 0,01, Σχήμα 6C και Ε.). Ομοίως, η χορήγηση του GSPs επίσης είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στο υγρό βάρος του ξενομοσχευμάτων όγκου SiHa (

ρ

& lt?. 0.01, Σχήμα 6D και F). Επιπλέον, η ιστοπαθολογική εξέταση των καρκινικών ξενομοσχευμάτων πραγματοποιήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6G και Η, παρατηρήθηκαν εμφανείς μορφολογικές αλλαγές στα GSPs αγωγή ομάδες. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, οι ιστοί του όγκου του GSPs αγωγή ομάδων, ιδιαίτερα 0.4% ομάδα GSPs, παρουσιάζονται διαδεδομένη καρυοπυκνώσεως, σχηματισμός αποπτωτικά σώμα και διάσπαση των κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ότι GSPs οδήγησε στην αποπτωτικών και νεκρωτικό θάνατο του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι θα μπορούσε να αναστείλει τις GSP την έναρξη και την ανάπτυξη του τραχήλου της μήτρας ξενομοσχεύματα καρκίνου, παρουσιάζει ένα αποτέλεσμα χημειοπροληπτική έναντι του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Οι ποντικοί

sc

εμβολιάσθηκαν στο δεξιό πλευρό με 2 × 10 κύτταρα

6 όγκου. (Α και Β) Μέση όγκων του όγκου σε κάθε ομάδα μετρήθηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα. Στο τέλος του πειράματος, η μάζα του όγκου συλλέχθηκε (C και D), και το υγρό βάρος του όγκου καταγράφηκε (Ε και F). (G και H) Η ιστοπαθολογική εξέταση των καρκινικών ξενομοσχευμάτων πραγματοποιήθηκε υπό το φως μικροσκόπιο (μεγέθυνση, 40 ×). Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD, και η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών αναλύθηκε με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από τη δοκιμή Tukey. *

σ

& lt? 0,05

vs

ελέγχου.? **

σ

& lt?.. 0.01

vs

έλεγχο

Η

χημειοθεραπευτικό αποτέλεσμα των GSPs για τραχήλου της μήτρας ξενομοσχεύματα καρκίνου

Για την αξιολόγηση του θεραπευτικού αποτελέσματος από τις GSP επί των εγκατεστημένων όγκων, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις GSP (0,4%, β /ο) στο 12

ης ημέρας μετά την εμφύτευση, αφού οι όγκοι είχαν ήδη σχηματιστεί. Η ανάπτυξη των όγκων παρακολουθήθηκε τακτικά, και βρήκαμε ότι η θεραπεία με τις GSP οδηγούν σε σημαντική μείωση του ρυθμού ανάπτυξης του όγκου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α και Β, οι όγκοι του όγκου των ποντικών που GSPs αγωγή είχαν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου, γεγονός που υποδηλώνει ότι GSPs θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων όγκου HeLa και SiHa. Επιπλέον, κατά τον τερματισμό του πειράματος, η μέτρηση του όγκου υγρού βάρους αποκάλυψε ότι το υγρό βάρος των όγκων στην ομάδα GSPs αγωγή ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 7C και D,

p

& lt? 0,01), και η ιστοπαθολογική εξέταση διαπίστωσε επίσης ότι η μορφολογική αλλαγή των ξενομοσχευμάτων όγκου στην ομάδα GSPs αγωγή ήταν επίσης αξιοσημείωτη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 7Ε και ΣΤ).. Ως εκ τούτου, αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν περαιτέρω το ανασταλτικό αποτέλεσμα του GSPs έναντι του τραχήλου της μήτρας εξέλιξη του καρκίνου.

Στην ομάδα GSP-αγωγή, οι ποντικοί χορηγήθηκαν τις GSP (0,4%) επί του 12

ης ημέρας μετά την εμφύτευση του κύτταρα όγκου. (Α και Β) Οι όγκοι των όγκων καταγράφηκαν κάθε 3 ημέρες, και η χορήγηση του GSPs ανέστειλε την ανάπτυξη των HeLa (Α) και SiHa (Β) ξενομοσχεύματα όγκου. (Γ και Δ) Η μάζα του όγκου συλλέχθηκε στο τέλος του πειράματος, και το υγρό βάρος του όγκου μετρήθηκε. Η χορήγηση GSPs οδήγησε σε σημαντική μείωση του βάρους του όγκου υγρού. (Ε και F) Η προφανής μορφολογική αλλαγή του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου παρατηρήθηκε στον ιστό του όγκου της ομάδας GSPs-θεραπεία, αλλά όχι στην ομάδα ελέγχου, (μεγέθυνση, 40 φορές). Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD, **

ρ

& lt?.. 0.01

vs

ελέγχου

Η

GSPs επαγόμενη απόπτωση κυττάρων του τραχήλου της μήτρας από ξενομοσχεύματα καρκίνου in vivo

Η αντίσταση στην απόπτωση είναι ένα από τα σημαντικά χαρακτηριστικά γνωρίσματα των κακοηθών όγκων. Για να καθοριστεί εάν αναστέλλουν τις GSP τραχήλου πρόοδο του καρκίνου με διέγερση της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων, αξιολογήσαμε την απόπτωση χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TUNEL για ιστούς όγκων που αποτελούνται από κύτταρα SiHa και HeLa με ή χωρίς θεραπεία GSPs στο μοντέλο 1. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας δείχνονται στο Σχ . 8Α και συνοψίζονται ποσοτικά στο Σχ. 8Β. Το ποσοστό των TUNEL θετικών κυττάρων σε ιστούς όγκων από κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με 0,4% GSPs ήταν περίπου τρεις φορές υψηλότερο από εκείνο του ελέγχου, και εκείνη των κυττάρων SiHa σε επεξεργασία με 0,4% GSPs ήταν τέσσερις φορές μεγαλύτερη από εκείνη του μάρτυρα. Όπως φαίνεται στο Σχ.