Abstract

Ο μετασχηματισμός του αυξητικού παράγοντα-β1 (ΤΟΡ-β1) και -β2 συσχετίζονται με χειρότερη πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο (GC), οι οποίες δρουν τόσο όγκου και κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος. Ωστόσο, οι εκφράσεις τους σε προκαρκινικά και καρκινικά-κυττάρου αλληλεπιδράσεις με μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) παραμένουν ασαφείς. Τα επίπεδα πρωτεΐνης της ΤΟΡ-β1 και -β2 αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία και τα αντίστοιχα επίπεδα του mRNA προσδιορίσθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε 93 χειρουργικές και δείγματα βιοψίας. Ορός συγκέντρωση ΤΟΡ-β ανιχνεύθηκε με δοκιμασίες ενζυμο-συνδεδεμένες ανοσορροφητικές. κυτταρικές σειρές AGS και ΜΚΝ45 άμεσα ή έμμεσα συν-καλλιεργήθηκαν με PBMCs

in vitro

. ΤΟΡ-β και τα μόρια Smad ανιχνεύθηκαν μετά συνκαλλιέργειες και τα αυξήσεις των κυττάρων GC και τα PBMCs αξιολογήθηκε με δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου. Τα αποτελέσματα έδειξαν θετική χρώση για τον ΤΟΡ-β1 ανιχνεύθηκε στο 20% των δειγμάτων ελέγχου, 52,3% των προκαρκινικών, 59,1% των πρόωρων GC και 66,7% των προηγμένων δειγμάτων GC, συσχετίζεται με την πρόοδο της βλάβης (χ

2 = 9.487,

P

= 0,002). Όλοι οι ιστοί ήταν θετικοί για τον ΤΟΡ-β2. ΤΟΡ-β1 mRNA επίπεδα ήταν αυξημένα σε προχωρημένους καρκίνους, ενώ ο ΤΟΡ-β2 αυξημένη νωρίτερα. ΤΟΡ-β1 mRNA επίπεδα ήταν υψηλότερα σε όγκο από ό, τι σε peritumor, η οποία συσχετίζεται θετικά με Smad2 και Smad7. Ορός TGF-β επίπεδα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με πρώιμη και προχωρημένους καρκίνους σε σύγκριση με τους μάρτυρες (TGF-β1:50.08 ± 4.38 και 45.76 ± 5.00 έναντι 27.78 ± 6.11 ng /mL? TGF-β2:133.61 ± 21.90 και 111.34 ± 15.76 έναντι 59,41 ± 15,42 ng /mL, τόσο

P

& lt? 0,05). Τα επίπεδα του TGF β1-mRNA και έκκριση κυτοκινών ήταν υψηλότερα στα κύτταρα GC μετά από άμεση συγκαλλιέργεια σε σύγκριση με την έμμεση καλλιέργεια. ΤΟΡ-β1 ήταν μειωμένη και ΤΟΡ-β2 ήταν αυξημένη σε PBMCs μετά συγκαλλιέργειες. Επιπλέον, ΤΟΡ-β1 ανέστειλε τη βιωσιμότητα των PBMCs αλλά όχι των καρκινικών κυττάρων. Συλλογικά, νεοπλασματικό μετασχηματισμό μπορεί να είναι ένα πρώιμο συμβάν που περιλαμβάνει την αύξηση του ΤΟΡ-β1 στο γενικό και τοπικό περιβάλλον. παραγωγή TGF-β1 προωθείται από την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων GC και PBMCs, η οποία θα μπορούσε να διευκολύνει την ανάπτυξη του καρκίνου

Παράθεση:. Ma GF, Miao Q, Zeng XQ, Luo TC, Ma LL, Liu ΥΜ, κ.ά. . (2013) του μετασχηματισμού αυξητικού παράγοντα-β1 και -β2 στο γαστρικό και τα προκαρκινικά στάδια του καρκίνου και ρόλοι σε Αλληλεπιδράσεις καρκινικών κυττάρων με μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος

In Vitro

. PLoS ONE 8 (1): e54249. doi: 10.1371 /journal.pone.0054249

Επιμέλεια: Noriko Gotoh, Ινστιτούτο Ιατρικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο του Τόκιο, Ιαπωνία

Ελήφθη: 16 Αυγούστου 2012? Αποδεκτές: 10, Δεκεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 14 Γενάρη του 2013

Copyright: © 2013 Ma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Xinjiang Uygur Αυτόνομη Περιφέρεια Επιστήμης και Τεχνολογίας Πρόγραμμα υποστήριξης (No.200991127) (https://www.kjzj.gov.cn/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Γαστρικό καρκίνο (GC) είναι μία από τις πιο καταστροφικές ανθρώπινους καρκίνους, με μια υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης που συμβαίνουν σε Ανατολική Ασία [1]. Μετασχηματισμός β παράγων ανάπτυξης (ΤΟΡ-β) παίζει σημαντικό ρόλο στην κακοήθη προόδου των όγκων [2] – [4]. Η οικογένεια ΤΟΡ-β περιλαμβάνει TGF-β1, TGF-β2, και ΤΟΡ-β3, τα οποία εμφανίζουν διαφορετικά και μη επικαλυπτόμενα δράσεις in vitro [5]. ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 συμβάλλουν κυρίως στην εξέλιξη του καρκίνου δρώντας στις δύο καρκινικά κύτταρα και στρωματικά κύτταρα [6], [7], και μια απώλεια της ευαισθησίας σε αναστολή της ανάπτυξης από τον TGF-β πιστεύεται ότι συμβαίνει στα περισσότερα καρκινικά κύτταρα. Εν τω μεταξύ, τα καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν πλεονέκτημα με επιλεκτική αναγωγή του όγκου-κατασταλτική δραστηριότητα του ΤΟΡ-β και η επαύξηση της ογκογόνο δραστικότητα της [8], [9]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο TGF-β1 αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα συσχετίζεται με το στάδιο του όγκου και χειρότερη πρόγνωση [5], 10,11. Ωστόσο, οι καταστάσεις των πρωτεϊνών ΤΟΡ-β και του mRNA και τους ρόλους τους στην μετατροπή από γαστρικό προκαρκινικά (PC) σε καρκίνωμα παραμένουν ασαφείς.

ΤΟΡ-β είναι ένας ισχυρός ανοσοκατασταλτικός κυτοκίνη που παράγεται από το ανοσοποιητικό και μη ανοσοκύτταρα , συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του όγκου [12], [13]. ΤΟΡ-β μπορεί να προάγει την ανάπτυξη του όγκου με διέγερση επιθηλιακά κύτταρα να υποβληθούν σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση [14]. Η αναστολή της σηματοδότησης ΤΟΡ-β έχει αναφερθεί να αποτρέψει την εξέλιξη και τη μετάσταση ορισμένων προηγμένων όγκων [15], [16], ενώ ο ΤΟΡ-β1 έχει αποδειχθεί ότι μειώνει την ανοσολογική απόκριση [17], [18] και διεγείρει την αγγειογένεση [19 ] σε μικροπεριβάλλον του όγκου. Smad πρωτεΐνες, όπως ενδοκυτταρική τελεστές της ΤΟΡ-β σηματοδότηση, ενεργοποιούνται από υποδοχείς και μετατοπίζονται στον πυρήνα για τη ρύθμιση της μεταγραφής [20]. Ωστόσο, η Smad-εξάρτηση του ΤΟΡ-β σηματοδότηση σε γαστρικό PC και πρώιμο καρκίνο δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητός.

ΤΟΡ-β παίζει σημαντικούς ρόλους σε μικροπεριβάλλον του όγκου, με τη συμμετοχή όχι μόνο αλληλεπιδράσεων μεταξύ του ανοσοποιητικού και μη ανοσοκύτταρα , αλλά και εναλλαγή ενός μέρους της παραγωγής κυτοκινών. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) αποτελούν βασικούς ανοσοκύτταρα που εκκρίνει κυτοκίνη, και τις αλληλεπιδράσεις τους με τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να προκαλέσουν ή να καταστείλει τον καρκίνο ειδικές ανοσολογικές αποκρίσεις, συμπεριλαμβανομένης της επαγωγής της απόπτωσης και της παραγωγής κυτοκίνης, η οποία συμβάλλει κυρίως στην εξέλιξη του όγκου [12], [21 ], [22]. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και PBMCs συμβαίνουν σε δύο βασικούς τρόπους: μέσω της άμεσης επαφής κυττάρου-προς-κύτταρο, και μέσω έμμεσης κυτοκίνη-εξαρτώμενη μέση. Αν και μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι διάφορα καρκινικά κύτταρα μπορούν να παράγουν CD4 + CD25 + ρυθμιστικά Τ κύτταρα από το περιφερικό αφελή κύτταρα Τ CD4 + μέσω της έκκρισης του ΤΟΡ-β [23], [24], [25], εκτός απέδειξε ότι τα επίπεδα των κυτοκίνες ΤΝΡ-α, ιντερλευκίνη (IL) -1β, ΙΡΝ-γ αυξήθηκαν κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης μεταξύ των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου και λεμφοκυττάρων [26]. Ωστόσο, οι δύο μέθοδοι επαφής δεν συγκρίθηκαν με αυτές τις μελέτες, και το κύριο είδος της αλληλεπίδρασης έτσι παραμένει άγνωστη.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του TGF-β1, TGF-β2, και άλλα μόρια συσχετίζονται σε χειρουργικές και ενδοσκοπική δείγματα από ασθενείς με καρκίνο και τα προκαρκινικά στάδια, για να αναλύσει τους ρόλους τους στην καρκινογένεση. Μπορούμε επίσης συνκαλλιεργημένα GC κύτταρα με PBMCs για να διαπιστώσετε αν αλληλεπιδρά μέσω της άμεσης κύτταρο προς κύτταρο εξαρτώμενη από την επαφή ή έμμεση κυτοκίνη-εξαρτώμενη μέσα σε μια προσομοίωση μικροπεριβάλλον του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενών δείγματα

Ένα σύνολο των 93 υποθέσεων που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη, η οποία περιλαμβάνει 30 χειρουργικά πρωτογενή δείγματα GC, 43 νεοπλασματικών και καρκινικά δείγματα που λαμβάνονται από ενδοσκοπική εκτομή υποβλεννογόνια (ESD), και 20 δείγματα βιοψίας ελέγχου από την κανονική-εμφάνιση γαστρικού βλεννογόνο σε ασθενείς χωρίς νεοπλασματικές ή φλεγμονώδεις νόσους. Χαρακτηριστικά των ασθενών αναλύθηκαν ως εξής: 20 φυσιολογικούς ιστούς (12 άνδρες, 8 γυναίκες? Μέση ηλικία = 45,20 ± 14,01 χρόνου, χτύπησε 28-63 ετών), 21 PC περιλαμβάνει κυρίως χαμηλού βαθμού ή υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (15 άνδρες , 6 θηλυκά? μέση ηλικία = 65,86 ± 7,81 χρόνια, εύρος 57-79 έτη), 22 αρχές του GC (EGC) ορίζεται ως επιφανειακή όγκου εισβολή όχι περισσότερο από υποβλεννογόνιο (14 άνδρες, 7 γυναίκες? μέση ηλικία = 63,50 ± 13,82 χρόνου, εύρος 41-81 χρόνια), και 30 προηγμένη GC (AGC) (21 άνδρες, 9 γυναίκες? μέση ηλικία = 59,48 ± 10,75 χρόνου, εύρος 30-70 έτη). Όλοι οι ασθενείς επιβεβαιώθηκαν με παθολογική εξέταση. Ιστολογικό τύπο αξιολογήθηκε σύμφωνα με την κατάταξη της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας [27]. Οι ομάδες που μελετήθηκαν ήταν δημογραφικά συγκρίσιμη με την ομάδα ελέγχου (

P

& gt? 0,05).

Δήλωση Ηθικής

Οι ασθενείς που έλαβαν ακτινοχημειοθεραπεία, υπέφερε από άλλους καρκίνους, ή οι οποίοι είχαν οικογενειακό ιστορικό GC αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα θέματα. Το σχέδιο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας του Zhongshan νοσοκομείο [28].

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

TGF-β1 και TGF-β2 επίπεδα πρωτεΐνης εξετάστηκαν από την IHC σε 4-μm- πάχους τομών παραφίνης κόβονται από ένα ενιαίο επιλεγμένο μπλοκ που περιέχει νεοπλασματικών και μη νεοπλασματικών γαστρικών ιστών. Δείγματα ρουτίνας αποκηρωμένα και ενυδατωμένο. Μετά τον αποκλεισμό της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης, αντιγόνα ανακτώνται από θέρμανση με αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (ρΗ = 9.0). Τα αντιγόνα στη συνέχεια ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας μια πρότυπη διαδικασία χρώσης (EnVision Detection Kit ™, Dako, CA, USA). Πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 (Όλες οι αραιώσεις 1:100? Santa Cruz Biotechnology, CA). Για τους ελέγχους αντίσωμα-αρνητική, οι πρωτογενή αντισώματα υποκαταστάθηκαν με φυσιολογικό ορό κουνελιού. Περιπτώσεις θεωρήθηκαν θετικά αν τουλάχιστον το 5% των δυσπλαστικών ή καρκινικών κυττάρων εμφανίζεται κυτταροπλασματική χρώση για τον ΤΟΡ-β1 ή ΤΟΡ-β2 στους × 100 μεγέθυνση.

ποσοτική πραγματικού χρόνου Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-)

Ολικό RNA απομονώθηκε από βιοψία και χειρουργικά δείγματα, ή από καλλιεργημένα κύτταρα, χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, USA). Συμπληρωματικό DNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ολίγο

αΤ εκκινητές σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται με το αντιδραστήριο Primer Script ™ RT (Takara, Tokyo, Japan). Τα επίπεδα έκφρασης του TGF-β1, TGF-β2, Smad2, Smad3, Smad4 και Smad7 mRNAs επιβεβαιώθηκαν από SYBR® Πράσινο II qRT-PCR χρησιμοποιώντας Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Hamburg, Germany) με δύο σταδίων, στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα και μετά 60 ° C για 1 λεπτό, επαναλαμβάνεται για 40 κύκλους. Δείγματα των προϊόντων της PCR αναλύθηκαν με τις καμπύλες τήξης να δοκιμαστεί η εξειδίκευσή τους. Όλες οι εκκινητές, περιλαμβανομένων των ΤΟΡ-β1, ΤΟΡ-β2, Smad2, Smad3, Smad4 και Smad7, δοκιμάστηκαν για αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης και ομαλοποιήθηκε ως προς τα επίπεδα του mRNA της γλυκεραλδεϋδο-3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) (Πίνακας S1). Όλα τα πειράματα qRT-PCR πραγματοποιήθηκαν από τον ίδιο ερευνητή, χωρίς τη γνώση των αντίστοιχων κλινικών δεδομένων.

Cells and Cell Culture

κυτταρικές σειρές AGS και ΜΚΝ45 GC αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιολογίας Κυττάρου , κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε μέσο ϋΜΕΜ (Gibco, Invitrogen, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Gibco) σε 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C.

Απομόνωση των PBMC

PBMCs απομονώθηκαν από φλεβικό αίμα ασθενών GC ή ελέγχους, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [29]. Εν συντομία, 3 mL αίματος αραιώνεται αμέσως σε 3 mL φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά και επιστρώθηκε σε 3 mL Ficoll-Paque Plus ™ (Amersham Healthcare, Aylesbury, UK). Μετά τη φυγοκέντρηση, PBMCs ανακτήθηκαν από το στρώμα μεσόφαση, επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο καλλιέργειας και καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες για να επιτραπεί η σύνδεση των προσκολλημένων κυττάρων, όπως τα δενδριτικά κύτταρα.

Κυττάρων συγκαλλιέργεια Μοντέλο

Transwell πλακών (Corning, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκαν ως έμμεση μοντέλο συγκαλλιέργειας, τα οποία περιέχουν κάτω θαλάμους και την κορυφή θαλάμους με 0,4-μm πόρους του φίλτρου μεμβράνης που δεν επιτρέπουν τα κύτταρα GC να περάσει μέσα αλλά επιτρέπουν μέσου να ανταλλάσσουν ελεύθερα. Συν-επώαση των δύο τύπων κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ως άμεσο μοντέλο συγκαλλιέργειας. Ενιαία καλλιέργεια κυττάρων GC ορίστηκε ως μονο-πολιτισμό. κύτταρα GC ρυθμίστηκαν σε 5 × 10

5 κύτταρα /mL, σπάρθηκαν στα κάτω διαμερίσματα των πλακών 6-φρεατίων και επωάστηκαν για 8 ώρες για να επιτραπεί η σύνδεση. Ενθέματα που περιέχει 5 × 10

5 κύτταρα /κ.εκ καλλιεργημένα PBMCs στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στην αρχή θαλάμους και καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες σε FBS χωρίς όρους μέσο ή πλήρες μέσο. Ως αρνητικοί έλεγχοι, ένθετα με PBMCs τοποθετήθηκαν σε φρεάτια με το ίδιο μέσο καλλιέργειας με την απουσία των καρκινικών κυττάρων, και τα φρεάτια με τα κύτταρα GC έμειναν χωρίς ένθετα. Ο αριθμός των κυττάρων στην ομάδα μονοκαλλιέργεια ήταν διπλάσιο από εκείνο στην ομάδα συγκαλλιέργειας, για να εξασφαλιστεί παρόμοιοι αριθμοί κυττάρων σε όλες τις ομάδες. Υπερκείμενα και τα κύτταρα συλλέχθηκαν ξεχωριστά μετά από 24 ώρες για περαιτέρω χρήση.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Μια πλατφόρμα κυττάρων καλλιέργειας κυττάρων-IQ (Chip-Man Technologies, Τάμπερε, Φινλανδία), που είναι εξοπλισμένα με μια φάση -contrast μικροσκόπιο (Nikon CFI αχρωματικός στόχος αντίθεσης φάσης με μεγέθυνση × 10, Nikon, Ιαπωνία) και μια φωτογραφική μηχανή, χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της αύξησης των καρκινικών κυττάρων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, τα κύτταρα GC καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β1 (Peprotech, USA) σε 25 ng /mL. Οι ομάδες ελέγχου αφέθηκαν χωρίς θεραπεία. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για περαιτέρω 72 ώρες στο σύστημα κυττάρων IQ. Εικόνες συνελήφθησαν σε διαστήματα 30 λεπτών για 72 ώρες, ελεγχόμενη από λογισμικό εικόνας (Chip-Man Technologies), και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ελεύθερα διανεμόμενο λογισμικό εικόνας (McMaster Βιοφωτονική Διευκόλυνσης, Hamilton, ON), χρησιμοποιώντας το εγχειρίδιο παρακολούθησης plug-in που δημιουργούνται από Fabrice Cordeliéres (Institut Curie, Orsay, Γαλλία). Το σύστημα κυττάρων-IQ διακρίσεις αυτόματα το διαχωριστικό και σταθερή στάδια των κυττάρων, και υπολογίζει το συνολικό αριθμό των κυττάρων κατά τη διάρκεια του πολλαπλασιασμού. Οκτώ εικόνες αναλύθηκαν για εκάστη ομάδα.

Η κινητικότητα των λεμφοκυττάρων καθιστά δύσκολη την παρακολούθηση και τον υπολογισμό των αριθμών των κυττάρων με ακρίβεια χρησιμοποιώντας το σύστημα κυττάρου-IQ. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται μία δοκιμασία κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Kumamoto, Japan) για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των PBMCs, σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Εν συντομία, καλλιεργημένα PBMCs σπάρθηκαν σε 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΟΡ-β1 ή αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ως μάρτυρες. Μετά από 72 ώρες, CCK-8 αντιδραστήρια προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν για 4 ώρες. Οι μετρήσεις των κυττάρων προσδιορίζεται τότε για πέντε φρεάτια ανά πειραματική ομάδα, με βάση την απορρόφηση στα 450 nm του ανηγμένου CCK-8 αντιδραστήριο, χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη automicroplate (Flexstation 3, Molecular Devices, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε σχέση με τις μετρήσεις των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές. Τα δεδομένα υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο και ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχθηκε.

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

επίπεδα

ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 σε συστήματα μονοκαλλιέργεια και συγκαλλιέργεια προσδιορίστηκαν με sandwich ELISA χρησιμοποιώντας Quantikine ανθρώπινο ανοσοδοκιμασία ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-ανοσοδοκιμασίες β2 (R &? D Systems, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα σύνολο 100 μΐ κυτταρικού υπερκείμενα από τις άμεσες και έμμεσες ομάδες καλλιέργειας, αντίστοιχα, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΙ 1 Μ ΗΟΙ για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από εξουδετέρωση με 20 μί 1.2 Μ ΝαΟΗ. Τα δείγματα στη συνέχεια με πιπέττα σε φρεάτια μικροπλακών προεπικαλυμμένα με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για ΤΘΡ-β1, και επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Ένα ένζυμο-συνδεδεμένη πολυκλωνικό αντίσωμα ειδικό για ΤΘΡ-β1 στη συνέχεια προστέθηκε στα φρεάτια και επωάστηκαν για άλλες 2 ώρες για να σάντουιτς ο συνδετήρας ΤΟΡ-β1. Ένα διάλυμα υποστρώματος που αποτελείται από υπεροξείδιο του υδρογόνου και τετραμεθυλοβενζιδίνη προστέθηκε και η ένταση του χρώματος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη automicroplate (Flexstation 3, Molecular Devices). Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές και κάθε σημείο του δείγματος εκτιμήθηκε εις τριπλούν, και ήταν κατά μέσο όρο δεδομένων.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS 16.0 για Windows (SPSS, Chicago, USA). Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσο ± SD. Chi-Square τεστ χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της αντιστοιχίας μεταξύ χρώση ΤΟΡ-β και τα κλινικά παθολογικά χαρακτηριστικά. δοκιμές Kruskall-Wallis χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση των τιμών μεταξύ των διαφόρων ομάδων, και Mann-Whitney τεστ χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει συγκεκριμένες διαφορές μεταξύ δύο ομάδων χρησιμοποιώντας μία διορθωμένη τιμή α. Ζεύγη Wilcoxon signed rank δοκιμές έγιναν για να συγκρίνουν τα επίπεδα mRNA σε όγκων και περιογκική ιστούς. Συγκεντρώσεις του ΤΟΡ-β σε υπερκείμενο του ορού και των κυττάρων αναλύθηκαν με ANOVA. Διμεταβλητή ανάλυση συσχέτισης διεξήχθη για να εξετάσει τις ενώσεις μεταξύ των καθεστώτων του mRNA του TGF-β1, TGF-β2, και Smads μόρια.

Αποτελέσματα

Αλλαγές στη TGF-β1 και TGF-β2 Έκφραση σε δυσπλασία -carcinoma Ακολουθία

Θετικές ΤΟΡ-β1 ήταν παρούσα όχι μόνο στην δυσπλαστικών ή κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα στο πάνω μέρος του αδένα, δίπλα στον αυλό, αλλά επίσης έντονα σε ινοβλάστες ακτίνη των λείων μυών που εκφράζουν (Σχήμα 1Α-1C) . Θετική χρώση για την ενδοκυτταρική μορφή του ΤΟΡ-β1 σημειώθηκαν σε 20% των δειγμάτων ελέγχου, 52,3% των PC, 59,1% των EGC, και 66.7% των δειγμάτων AGC. Γραμμικό τεστ τάση έδειξε ότι θετικούς ρυθμούς ανοσοχρώση για TGF-β1 σχετίστηκαν θετικά με την εξέλιξη της βλάβης (χ

2 = 9.487,

P

= 0,002). Η ιστολογία του GC στη συνέχεια διαιρέθηκε σε «εντερική» και «διάχυτη» τύπων, σύμφωνα με τα κριτήρια του Lauren [31]. Μεταξύ των δειγμάτων GC, 64,1% του εντερικού τύπου έδειξαν ισχυρή ανοσολογική αντίδραση και 63,6% του διάχυτου τύπου ήταν ασθενώς χρωματισμένο. Όλοι οι ιστοί χρωματίσθηκαν θετικά για τον ΤΟΡ-β2 (Σχήμα 1 D). Δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση του TGF-β1 σε σχέση με το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (

Hp)

λοίμωξη, ταξινόμησης ή της λέμφου συμμετοχή Lauren τον κόμβο (Πίνακας 1).

(Α) Θετική χρώση για TGF-β1 σε περίπτωση γαστρικής προκαρκινικά στάδια. (Β) Ισχυρή κυτταροπλασματική χρώση σε κύτταρα όγκου περιορίζεται στο βλεννογόνο σε περίπτωση πρόωρης γαστρικού καρκίνου και ασθενής χρώση σε ορισμένες στρωματικά κύτταρα. (C) έκφραση TGF-β1 σε περίπτωση εντερικού τύπου προχωρημένο γαστρικό καρκίνο, σύμφωνα με την κατάταξη της Lauren. (D) κυτταροπλασματική χρώση για τον ΤΟΡ-β2 σε μια περίπτωση του προχωρημένου γαστρικού καρκίνου. (Όλες οι φωτογραφίες που εμφανίζονται στο × 200 μεγέθυνση).

Η

Αλλαγές στη TGF-β1 και TGF-β2 mRNA σε γαστρική PC και καρκινικούς ιστούς

επίπεδα TGF-β1 mRNA αυξήθηκαν σε AGC, ενώ τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 ενισχύθηκαν σε EGC. επίπεδα TGF-β1 mRNA αυξήθηκε σημαντικά από τον έλεγχο, PC, EGC και AGC στάδια (Σχήμα 2Α?

P

& lt? 0,05). Υπο-ανάλυση έδειξε ότι τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα σε AGC σε σύγκριση με τις ομάδες Υ και ελέγχου (

P

& lt? 0,05), ενώ τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 αυξήθηκαν σε EGC και AGC, σε σύγκριση με το ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 mRNA ήταν υψηλότερα σε όγκο από ό, τι σε peritumor (

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 2C)? Ωστόσο, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 κατέδειξε την αντίθετη τάση (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 2D). Επιπλέον, η ανάλυση συσχέτισης προσδιόρισε θετικές συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων mRNA του TGF-β1 και Smad2 (

r =

0.346,

P =

0.025) και Smad7 (

r =

0.461,

P =

0,002) (Εικόνα 2Ε και 2F). ΤΟΡ-β2, ωστόσο, δεν έδειξε συσχέτιση με Smad2 ή Smad7 και ούτε ΤΟΡ-β1 ούτε ΤΟΡ-β2 συσχετίστηκε με Smad3 ή Smad4. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο TGF-β1 και ΤΟΡ-β2 θα μπορούσε να παίζουν διαφορετικούς ρόλους στην πρόοδο του όγκου.

(Α) Τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 mRNA στην αλληλουχία από τους ελέγχους (

n =

20), τα προκαρκινικά στάδια (PC) (

n

= 21), στις αρχές του γαστρικού καρκίνου (EGC) (

n

= 22), με προχωρημένο καρκίνο του στομάχου (AGC) (

n

= 30). Τα δεδομένα δίδονται ως μέσοι ± SD των επιπέδων μεταγραφής κανονικοποιημένη προς GAPDH. (Β) αντίστοιχα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 mRNA με την ίδια σειρά. (C) και (D) Τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 είχαν απορυθμίζεται και τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε ιστούς όγκων, σε σύγκριση με περιογκική ιστούς από τους ίδιους ασθενείς. Επίπεδα κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. Τα δεδομένα από qRT-PCR σε 20 ζεύγη περιπτώσεις δείχνονται. (Ε) και (F) Σημαντικές θετικές συσχετίσεις μεταξύ ΤΟΡ-β1 και Smad2 /Smad7, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο διμεταβλητή συσχέτιση. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα μεταγραφής σε 36 περιπτώσεις GC μετά από κανονικοποίηση για GAPDH. (G) Οι συγκεντρώσεις στον ορό του ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 μετρήθηκαν με ELISA ήταν σημαντικά υψηλότερα στην πρώιμη και προχωρημένη GC σύγκριση με τους μάρτυρες (

F =

4.745 και

Ρ = 0,018

?

F =

4.939 και

P =

0,015, αντίστοιχα). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ της πρώιμης και προηγμένες GC.

Ctrl

: ελέγχει εθελοντές?

EGC

: πρώιμο γαστρικό καρκίνο?

AGC

:. Προχωρημένο γαστρικό καρκίνο

Η

TGF-β Επίπεδα ορού

Για να διερευνήσουν περαιτέρω την εμφάνιση του TGF-β στο γενικό περιβάλλον, σε σύγκριση με τις συγκεντρώσεις στον ορό του ΤΟΡ-β σε ασθενείς με EGC ή AGC με εκείνες των ελέγχων. Οι συγκεντρώσεις στον ορό του ΤΟΡ-β1 σε ελέγχους και σε ασθενείς με EGC και AGC ήταν 27,78 ± 6,11, 50,08 ± 4,38 και 45,76 ± 5,00 ng /mL, αντίστοιχα, ενώ οι αντίστοιχες τιμές για τον ΤΟΡ-β2 ήταν 59,41 ± 15,42, 133,61 ± 21,90 , και 111.34 ± 15.76 ng /mL, αντίστοιχα. Επίπεδα των δύο ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με EGC ή AGC σε σύγκριση με εκείνες των ελέγχων (

F =

4.745 και

Ρ = 0,018

?

F =

4.939 και

P =

0.015). Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ασθενών με πρώιμο και όψιμο στάδιο της GC (Σχήμα 2G). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μη φυσιολογική κατάσταση του ΤΟΡ-β σε γαστρική καρκινογένεση μπορεί να είναι μία συστημική απόκριση που περιλαμβάνει όχι μόνο το μικροπεριβάλλον του όγκου, αλλά επίσης το γενικό κυκλοφορικό σύστημα.

συγκαλλιέργεια In Vitro

Α συγκαλλιέργεια μοντέλο καθιερώθηκε για να προσδιοριστεί εάν απευθείας κύτταρο προς κύτταρο επαφή ή έμμεση κυτοκίνη-εξαρτώμενη επαφή είναι ο κύριος μηχανισμός που μιμείται σε μικροπεριβάλλον του όγκου. Πρώτον, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα αποτελέσματα του ΤΟΡ-β1 και τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 mRNA σε κύτταρα GC σε άμεση μοντέλο συγκαλλιέργειας, χρησιμοποιώντας PBMCs που απομονώθηκαν από ασθενείς GC ή μάρτυρες (Σχήμα 3Α), και ως εκ τούτου αυτά τα δεδομένα ομαδοποιήθηκαν για ανάλυση. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις του ΤΟΡ-β1 στο υπερκείμενο κυττάρων συγκαλλιεργειών ήταν σημαντικά αυξημένες σε σύγκριση με εκείνες σε PBMCs ή GCs καλλιεργήθηκαν μόνο σε μια FBS περιβάλλον χωρίς (

P

& lt? 0,05) και τα επίπεδα της στην άμεση συγκαλλιέργεια ομάδα ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στην έμμεση ομάδα (

P = 0,029

)? Ωστόσο, αν και τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 αυξήθηκαν επίσης σε άμεση συνκαλλιέργειες, οι διαφορές μετά συγκαλλιέργειες δεν ήταν σημαντικές (Σχήμα 3Β).

επίπεδα (Α) ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 mRNA σε κύτταρα GC μετά από άμεση συγκαλλιεργειών αυξήθηκαν σε σύγκριση με μονοκαλλιέργεια, αλλά δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα ΤΟΡ-β1 και τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 mRNA σε κύτταρα GC, ανεξάρτητα από την προέλευση του PBMCs (ασθενείς GC ή μάρτυρες). (Β) ΤΟΡ-β1concentrations στο υπερκείμενο κυττάρων συγκαλλιεργειών ήταν σημαντικά αυξημένες σε σύγκριση με εκείνες σε PBMCs ή GCs καλλιεργήθηκαν μόνο σε μια FBS περιβάλλον χωρίς (

P

& lt? 0,05). τα επίπεδα της στο άμεσο ομάδα συγκαλλιέργεια ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες στην έμμεση ομάδα (

P =

0,029). επίπεδα ΤΟΡ-β2 αυξήθηκαν επίσης σε άμεση συνκαλλιέργειες, αλλά οι διαφορές μετά συγκαλλιέργειες δεν ήταν σημαντικές. (C) Τα επίπεδα παραγωγής κυτοκίνης ήταν σημαντικά αυξημένα σε έμμεσες ομάδες συγκαλλιέργεια μετά την προσθήκη του FBS (

P

& lt? 0,05), αλλά καμία προφανής αλλαγή ανιχνεύθηκε σε άμεση αυτά συγκαλλιέργεια. Το πείραμα διεξήχθη δύο φορές. Όλα τα στοιχεία παρουσιάζονται ως μέσο ± SD του τριπλούν. (D) Προέλευση των κυτοκινών. Σε κύτταρα GC, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 mRNA αυξήθηκαν περίπου 3-φορές στην άμεση συγκαλλιέργεια και αυξημένη κατά 2 φορές στην έμμεση σχέση με μονοκαλλιέργειες? ΤΟΡ-β2 mRNA επίπεδα ήταν σημαντικά αυξημένα μετά από άμεση συγκαλλιέργεια αλλά δεν άλλαξε στατιστικά μετά έμμεση. Σε PBMCs, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 mRNA ήταν σημαντικά μειωμένα και τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 ήταν αξιοσημείωτα αυξημένο μετά συγκαλλιέργειες. Επίπεδα ομαλοποιήθηκαν σε GAPDH, και τα επίπεδα στην ομάδα μονοκαλλιέργεια ορίστηκαν ως 1.0. Όλα τα στοιχεία παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. (Ε) Τα επίπεδα mRNA του Smad2 και Smad3 σε κύτταρα GC αυξήθηκαν σημαντικά μετά συγκαλλιέργειες (

P

& lt? 0,05), οι οποίες ήταν υψηλότερες στην άμεση συγκαλλιέργεια από εκείνες στην έμμεση, αλλά δεν υπήρξε καμία στατιστική διαφορά στα επίπεδα του Smad4. (F) Cell-IQ έδειξαν ότι η προσθήκη εξωγενούς ΤΟΡ-β1 (25 ng /mL) σε κύτταρα GC κατέστειλε την ανάπτυξη και τη διαίρεση των καρκινικών κυττάρων, αλλά χωρίς σημαντική διαφορά. Οκτώ εικόνες από διαφορετικές οπτικές πεδίο αναλύθηκαν για εκάστη ομάδα. (G) Cell Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) προσδιορισμού έδειξαν ότι ο TGF-β1 (25 ng /mL) ανέστειλε την βιωσιμότητα των PBMCs σημαντικά στις 72 ώρες. Η γραμμή δείχνει την αναλογία αναστολής του ΤΟΡ β1-διεγερμένα κύτταρα σε σύγκριση με μη κατεργασμένους ελέγχους.

GC:

καρκίνο του στομάχου?

PMBC:

περιφερικών μονοπύρηνων κυττάρων αίματος?

Dir-co:

άμεση συγκαλλιέργεια?

Ind-co:

έμμεση συν-καλλιέργεια?

Mono:

μονοκαλλιέργεια?

FBS:

ορό εμβρύου βοός.

ns,

δεν είναι σημαντική? *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια διερευνήθηκε η επίδραση του ορού για την αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και PBMCs. Παραδόξως, ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 συγκεντρώσεις στην έμμεση ομάδα, σε σύγκριση με εκείνη στην FBS χωρίς προϋπόθεση, ήταν αντιστρόφως υψηλότερες από εκείνες στην άμεση ομάδα μετά την προσθήκη του FBS. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις του ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 στο υπερκείμενο των κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένα σε έμμεσες ομάδες (

P

& lt? 0,05), αλλά ήταν μόνο ελαφρώς αυξημένη σε άμεση ομάδες (

P & gt?

0,05), με την προσθήκη του FBS (Σχήμα 3C). Αυτό υποδηλώνει ότι ένα εμπλουτισμένο περιβάλλον μπορεί να διευκολύνει την παραγωγή κυτοκινών σε έμμεσες όχι σε άμεση επικοινωνία.

Επιπλέον, για να καθορίσουν την προέλευση των κυτοκινών, τα επίπεδα TGF-β1 και TGF-β2 mRNA μετρήθηκαν σε κύτταρα GC και PBMCs αντίστοιχα . Σε σύγκριση με μονοκαλλιέργεια, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 mRNA αυξήθηκαν περίπου 3-φορές στην άμεση ομάδα και 2-φορές στην έμμεση ομάδα στα κύτταρα GC μετά συγκαλλιέργεια με PBMCs? επίπεδα του ΤΟΡ-β2 mRNA ήταν σημαντικά αυξημένα στα κύτταρα GC μετά από άμεση συγκαλλιέργεια αλλά δεν άλλαξε στατιστικώς μετά έμμεση συγκαλλιέργεια. Εν τω μεταξύ, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 mRNA μειώθηκαν σημαντικά και τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 mRNA αυξήθηκαν περισσότερο από 5 φορές σε PBMCs μετά συνκαλλιέργειες (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 3D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα αυξημένα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 στο υπερκείμενο των κυττάρων θα μπορούσε να προέρχεται από κύτταρα GC, ενώ ο ΤΟΡ-β2 θα μπορούσε να προέρχεται από PBMCs. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα επίπεδα του mRNA της Smad2 και Smad3 σε κύτταρα GC επίσης αυξήθηκαν σημαντικά μετά συνκαλλιέργειες, οι οποίες ήταν υψηλότερες στην άμεση συγκαλλιέργεια από εκείνες στην έμμεση, αλλά δεν υπήρξε καμία στατιστική διαφορά στα επίπεδα του Smad4 (Εικόνα 3Ε). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι οι κυτοκίνες παραγωγή κυρίως εξαρτάται από την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και PBMCs, και ΤΟΡ-β /Smad2 /3 σηματοδότηση θα μπορούσε να προωθηθεί κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας.

Τέλος, για να διερευνήσει περαιτέρω ΤΟΡ-β1 ρόλους σε κύτταρα GC και PBMCs, η ικανότητα ανάπτυξης των κυττάρων από τους δύο τύπους των κυττάρων ανιχνεύθηκαν με προσθήκη εξωγενούς ΤΟΡ-β1 σε μονοκαλλιέργειες PBMCs ή κυττάρων GC. Κυττάρων-IQ έδειξε ότι ο μέσος αριθμός τόσο των συνολικών και διαιρούμενα κύτταρα μειώθηκαν? ανασυσταθέν ΤΟΡ-β1 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων GC σε 72 ώρες, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική (Σχήμα 3F), ενώ εξωγενούς ΤΟΡ-β1 επηρέασε σημαντικά τη βιωσιμότητα των PBMCs (Σχήμα 3G). Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι τα αυξημένα TGF-β1 ανέστειλε κυρίως τη λειτουργία των μονοπύρηνων κυττάρων, αλλά όχι των καρκινικών κυττάρων.

Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά στο τμήμα κατέδειξαν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και PBMCs συμβαίνει κυρίως μέσω άμεσης κυτταρικής -να-κύτταρο επαφή, αλλά με κάποια συμβολή από κυτοκίνη που εξαρτώνται από την επαφή. Επιπλέον, εμπλουτισμένο συνθήκες προάγουν την παραγωγή κυτοκινών όπως ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2. ΤΟΡ-β1 έδρασε κυρίως αναστέλλοντας την λειτουργία του PBMCs αλλά όχι των κυττάρων GC.

Συζήτηση

Ανωμαλίες στο αυξητικού παράγοντα και έκκριση κυτοκινών, ειδικά ΤΟΡ-β, παίζουν ρόλους κλειδιά στην ανάπτυξη καρκίνου [ ,,,0],3], [32]. Ωστόσο, εξ όσων γνωρίζουμε, οι πρωτεΐνες και καταστάσεις mRNA του TGF-β1 και ΤΟΡ-β2 σε προκαρκινικά δεν έχουν καλά μελετηθεί, και η παραγωγή των κυτοκινών κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης μεταξύ των κυττάρων του όγκου και PBMCs παραμένει ασαφής. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη καθορίζονται τα προφίλ των TGF-β1 και TGF-β2 στο γαστρικό και τα προκαρκινικά στάδια του καρκίνου, και διερεύνησε τη φύση της αλληλεπίδρασης (άμεση ή έμμεση) μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και PBMCs και την επίδρασή της στην παραγωγή κυτοκινών.

Προηγούμενες μελέτες διαπιστώθηκε ότι τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 συνδέθηκαν με χειρότερη πρόγνωση [5], [11], και τα επίπεδα του ΤΟΡ β1-mRNA και πρωτεΐνης αυξήθηκαν σε δυσπλαστικές και GC ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς γαστρική ιστούς [33], [34]? Αντίθετα, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 mRNA σε ιστούς GC ήταν συγκρίσιμα με τους ελέγχους [33]. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης επιβεβαιωθούν και να επεκταθούν οι προηγούμενες παρατηρήσεις? επίπεδα του ΤΟΡ-β1 mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα σε AGC, ενώ τα επίπεδα του ΤΟΡ-β2 ήταν υψηλότερα σε δυσπλασία και EGC. Επιπλέον, τα επίπεδα του ΤΟΡ-β1 mRNA ήταν υψηλότερα σε όγκο από ό, τι σε peritumor, ενώ ο ΤΟΡ-β2 έδειξαν την αντίθετη τάση. ΤΟΡ-β1 επίπεδα πρωτεΐνης έδειξε με IHC ήταν συνεπή με αυτά τα αποτελέσματα. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι νεοπλασματικό μετασχηματισμό θα μπορούσε να είναι ένα πρώιμο συμβάν που περιλαμβάνει την αύξηση του ΤΟΡ-β1, μαζί με την απώλεια του ΤΟΡ-β2.

Αν και μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι το 80% των δειγμάτων GC εντερικού-τύπου που εκφράζεται ΤΟΡ -β1 σε σύγκριση με μόνο το 43% του διάχυτου τύπου [10], βρήκαμε καμία διαφορά στην έκφραση του TGF-β1 σε σχέση με το

Hp

λοίμωξη, η ταξινόμηση της Lauren, ή λέμφος εμπλοκή κόμβο. Ενεργοποιημένος ΤΟΡ-β1 ήταν άφθονο στον βλεννογόνο του

Hp

-μολυσμένα ασθενείς, ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με

Hp

-αρνητική ασθενείς [35]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας έδειξαν επίσης ότι ορισμένα στρωματικά κύτταρα χρωματίστηκαν θετικά για ΤΟΡ-β1. Παρομοίως, τα μονοπύρηνα κύτταρα σε υμένα αναφέρθηκαν να είναι η κύρια πηγή του ΤΟΡ-β1 [36]. Comerci

et al

[37] αποκάλυψε ότι ο TGF-β1 εκκρίνεται εντός ή παράγονται με την υποστήριξη στρωματικά στοιχεία μπορεί να προωθήσει έμμεσα την εξέλιξη του όγκου. Ottaviano

et al

[38] έδειξε ότι η στιχομυθία μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και στρωματικά στοιχεία που διαμεσολαβείται από TGF-β1 επηρεάζεται κυττάρων επιφανειακά και περικυτταρικό μήτρας εξευτελιστική δυναμικό

in vitro

. Ως εκ τούτου, συμπεραίνουμε ότι η έκκριση του ΤΟΡ-β από κύτταρα όγκου και στρωματικά κύτταρα μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στη φύση και τη διατήρηση του μικροπεριβάλλοντος του όγκου.

Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι ο ΤΟΡ-β επίσης έντονη στο περιφερικό σύστημα, δεδομένου οι συγκεντρώσεις στον ορό του ΤΟΡ-β1 και ΤΟΡ-β2 σε ασθενείς GC ήταν υψηλότερες από εκείνες στους ελέγχους. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ των συγκεντρώσεων στον ορό του ΤΟΡ-β1 και κλινικοπαθολογικών χαρακτήρες είναι αμφιλεγόμενη. Προηγούμενες μελέτες βρέθηκε ότι οι συγκεντρώσεις του ΤΟΡ-β1 σε ασθενείς GC ορού ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά στους ελέγχους, και σχετίστηκαν θετικά με τη μάζα του όγκου, εισβολή, μετάσταση, και το κλινικό στάδιο [39], [40].