Αφηρημένο

Ο ευνουχισμός ανθεκτικά εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη μετά ανδρογόνων θεραπείες στέρηση παραμένει η πιο κρίσιμη πρόκληση στην κλινική αντιμετώπιση του καρκίνου του προστάτη. Αναζωπύρωση υποδοχέα ανδρογόνων (AR) δραστηριότητα είναι μια καθιερωμένη οδηγός του ευνουχισμού ανθεκτικά εξέλιξης, και προς τα πάνω ρύθμιση του πλήρους μήκους AR (AR-FL) και συστατικώς δραστικές παραλλαγές AR ματίσματος (AR-Vs) έχει ενοχοποιηθεί να συμβάλει στην αναζωπύρωση δραστηριότητα AR. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι ginsenoside 20 (S) -protopanaxadiol-άγλυκο (PPD) μπορεί να μειώσει την αφθονία των δύο AR-FL και AR-Vs. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε επίσης ότι η επίδραση του PPD στον AR έκφρασης και στόχος γονίδια ήταν ανεξάρτητη από ανδρογόνο. θεραπεία PPD οδήγησε σε καταστολή της ανεξάρτητη συνδεσμικού AR μετενεργοποίηση. Επιπλέον, PPD καθυστέρηση ευνουχισμός ανθεκτικά regrowth των LNCaP ξενομοσχεύματος όγκων μετά στέρηση ανδρογόνου και ανέστειλε την ανάπτυξη του ευνουχισμού ανθεκτικών όγκων ξενομοσχεύματος 22Rv1 με ενδογενή έκφραση του AR-FL και AR-Vs. Αυτό συνοδεύτηκε από μία πτώση στα επίπεδα αντιγόνου ορού ειδικού προστατικού καθώς και μια μείωση των επιπέδων AR και μιτώσεις στους όγκους. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι όγκοι ξενομοσχεύματος 22Rv1 ήταν ανθεκτικά στην αναστολή της ανάπτυξης από την επόμενη γενιά αντι-ανδρογόνο enzalutamide. Η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη για να δείξει την αποτελεσματικότητα του προκλινικές PPD στην αναστολή ευνουχισμού ανθεκτικά εξέλιξη και ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη. Τα ευρήματα παρέχουν ένα σκεπτικό για την περαιτέρω ανάπτυξη PPD ή τα ανάλογά της για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Cao Β, Qi Υ, Yang Υ, Liu Χ, Xu D, Guo W, et al. (2014) 20 (S) -Protopanaxadiol αναστολή της εξέλιξης και ανάπτυξης του ευνουχισμού-Resistant τον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (11): e111201. doi: 10.1371 /journal.pone.0111201

Επιμέλεια: Jindan Yu, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Ιουνίου 2014? Αποδεκτές: 23 Σεπτέμβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Cao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας χορηγούν R01CA188609, Υπουργείο Άμυνας χορηγεί W81XWH-12-1-0112 και W81XWH-12- 1-0275, Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Έργα 81272851, 30973587, 81102383, 81302206 και 81430087, Λουιζιάνα Διοικητικού-of-Regents Grant LEQSF (2012-15)-RD-Α-25, Λουιζιάνα Cancer Research Consortium Ταμείο, Tulane Καρκίνου κέντρο Αναπτυξιακής Ταμείο, και Tulane University School of Medicine Pilot Ταμείου και τη Γέφυρα του Ταμείου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, η οποία διαταράσσει τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σηματοδότηση μέσω ευνουχισμός ή AR ανταγωνιστές, είναι η θεραπεία πρώτης γραμμής για τη διάδοση του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, η εξέλιξη στο παρόν ανίατη στάδιο, που ονομάζεται ευνουχισμός ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC), πάντοτε συμβαίνει [1]. Αναζωπύρωση δραστηριότητα AR είναι μια καθιερωμένη οδηγός της θεραπευτικής αποτυχίας και τον ευνουχισμό ανθεκτικά πρόοδο [2], [3]. Ο καρκίνος του προστάτη μπορεί να προσαρμόζεται σε θεραπεία στέρησης ανδρογόνων μεταλλάσσοντας AR, που ενισχύει /υπερεκφράζουν AR, προς τα πάνω ρύθμιση παραλλαγές συστατικώς δραστικές AR ματίσματος (AR-Vs) που δεν έχουν την περιοχή σύνδεσης προσδέματος, ενεργοποιώντας AR με μηχανισμούς ανδρογόνο-ανεξάρτητες, ή /και την αύξηση της ενδο επίπεδα -tumoral ανδρογόνων μέσω

de novo

ανδρογόνων σύνθεση [4] – [17]. Κατά συνέπεια, AR επανενεργοποιείται στο CRPC αν ο όγκος δεν είναι πλέον ανταποκρίνεται σε θεραπεία στέρησης ανδρογόνων.

Πολλά νέα φάρμακα που στοχεύουν AR επανενεργοποίηση στην CRPC έχουν αναπτυχθεί, και δύο από αυτές έχουν εγκριθεί από το FDA για την θεραπεία του μεταστατικού CRPC,

δηλαδή

, ο αναστολέας βιοσύνθεσης ανδρογόνων αμπιρατερόνη και ο ισχυρός ανταγωνιστής enzalutamide AR [18], [19]. Μπορούν προανήγγειλε μια νέα εποχή θεραπείας του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, πολλοί ασθενείς παρουσιάζονται με ανθεκτική στη θεραπεία της νόσου, και οι περισσότεροι αρχική ανταποκρίθηκαν αναπτύξει αντίσταση εντός μηνών από την έναρξη της θεραπείας, και πάλι συνοδεύεται από αυξημένη ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA), υποδεικνύοντας επανενεργοποιηθεί AR σηματοδότηση [18], [19]. Ένας πιθανός μηχανισμός της αντοχής σε αμπιρατερόνη και enzalutamide έχει αποδοθεί σε αυξημένη έκφραση του πλήρους μήκους AR (AR-FL) και AR-Vs [20] – [24]. Η υπερέκφραση του AR-FL δείχθηκε να ευαισθητοποιήσει τον υποδοχέα σε χαμηλά επίπεδα ανδρογόνων [25] και για την μετατροπή της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη από μια ευνουχισμός ευαίσθητο σε ευνουχισμό ανθεκτικό στάδιο [10]. Αυξημένη έκφραση του AR-Vs δείχθηκε να προσδώσει ευνουχισμό ανθεκτικά ανάπτυξη των όγκων του προστάτη [14], [15], [26] – [28], και να συσχετίζονται με κακή επιβίωση του CRPC ασθενών [29]. Η κατάρριψη AR-FL ή AR-Vs με shRNA σε μοντέλα ξενομοσχεύματος μπορεί να καθυστερήσει την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη σε αντίσταση ευνουχισμό ή /και καταστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη που έχει ήδη προχωρήσει σε ευνουχισμό ανθεκτική κατάσταση [15], [30] , [31]. Ως εκ τούτου, θεραπευτικές προσεγγίσεις που μπορεί να μειώσει τη διαθεσιμότητα των δύο AR-FL και AR-Vs πρέπει να προσφέρουν σημαντικά οφέλη στην πρόληψη και την αναστολή της υποτροπής του καρκίνου του προστάτη μετά από θεραπεία στέρησης ανδρογόνων.

Η ρίζα ginseng είναι ένα από τα πιο commonly- μεταχειρισμένα φαρμακευτικά βότανα στον δυτικό κόσμο, ιδιαίτερα για την παρέμβαση του καρκίνου [32]. Οι Ginsenosides θεωρούνται οι μεγάλες φαρμακολογικά ενεργά συστατικά ginseng [33]. Αναφέραμε προηγουμένως ότι ένα κύριο εντερική μεταβολίτης της ginsenosides, 20 (S) -protopanaxadiol-αγλυκόνη (PPD), είναι αποτελεσματική στην ρύθμιση προς τα κάτω της έκφρασης και της δραστηριότητας του AR, συμπεριλαμβανομένων τόσο AR-FL και AR-VS, σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη [ ,,,0],34]. Η μείωση στην έκφραση AR οφείλεται σε PPD μεσολάβηση μειωμένη μεταγραφή του γονιδίου AR και αυξημένη πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμηση του AR-FL και AR-V πρωτεΐνες [34]. Δείξαμε επίσης ότι PPD ανέστειλε επίσης την έκφραση AR σε όγκους ξενομοσχευμάτων προστάτη αλλά όχι σε κανονικό προστάτη υποδοχής [34]. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε προκλινικά τη δυνατότητα χρήσης PPD για τη βελτίωση της θεραπευτικής έκβασης της θεραπείας στέρησης ανδρογόνων.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

LNCaP και 22Rv1 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection στο Πέρασμα 4. κύτταρα CWR-R1 παρασχέθηκαν από τον Dr. Elizabeth M. Wilson και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται [35]. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν εντός 20 περάσματα (~ 3 μήνες ασυνεχής καλλιέργεια). PPD λήφθηκε από το Εργαστήριο Οργανικής Χημείας στο Πανεπιστήμιο Jilin, Changchun, Κίνα. Ενώσεις της καθαρότητας & gt? 98%, όπως προσδιορίζεται με υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία, χρησιμοποιήθηκαν σε μελέτες κυτταρικής καλλιέργειας, και ότι από & gt? 95% χρησιμοποιήθηκε σε μελέτες σε ζώα. Enzalutamide αγοράστηκε από Σέλεκ Chemicals (Houston, ΤΧ), και η καθαρότητα του & gt? 99% επιβεβαιώθηκε από Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού

Western Blotting

Η διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως [36].. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία και κανονικοποιήθηκε ως προς αφυδρογονάσης γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (GAPDH). Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν:. Αντι-GAPDH (Millipore), αντι-AR (Millipore), και αντι-AR-V7 (Precision Αντίσωμα)

Ποσοτική Reverse Transcription-PCR (qRT-PCR)

qRT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται [37]. Οι qPCR ομάδες εκκινητών-ανιχνευτή για PSA, διαμεμβρανική πρωτεάση, σερίνη 2 (TMPRSS2), και η κυκλίνη Α2 (CCNA2) ήταν από IDT. Οι αλληλουχίες εκκινητών για AR ισομορφές όπως περιγράφεται [15].

Reporter Gene Assay

Το στοιχείο που αποκρίνονται στο ανδρογόνο (ARE) -luciferase πλασμίδιο αναφοράς, που περιέχει τρεις επαναλήψεις της περιοχής συνδέονται σε παράλληλα με το πυγολαμπίδας ανταποκριτή λουσιφεράσης [38], χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της AR

trans

-activating δραστηριότητα. Ήταν συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς εντός κυττάρων με το pRL-ΤΚ

Renilla

κατασκεύασμα λουσιφεράσης (Promega) σε 20:01 αναλογία όπως περιγράφεται [39]. διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης διεξήχθη ανά εντολή κατασκευαστή (Promega), και η δραστικότητα του λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας κανονικοποιήθηκε με εκείνο του

Renilla

λουσιφεράσης.

Μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου

Αρσενικό γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από το Κέντρο παραγωγής NCI ζώα στο 5-6 εβδομάδων. Για τον ευνουχισμό ανθεκτικό μοντέλο εξέλιξης των όγκων LNCaP, τα ποντίκια εμβολιάσθηκαν υποδορίως με 4 × 10

6 LNCaP κύτταρα αιωρούνται σε 50% Matrigel στη δεξιά πλευρά μετά από μία εβδομάδα προσαρμογής. Όταν το μέγεθος του όγκου έφτασε ~ 100 mm

3, ο ευνουχισμός έγινε

μέσω

μια οσχέου προσέγγιση. Την ημέρα μετά τον ευνουχισμό, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες και έλαβαν 40 mg /kg PPD σε ελαιόλαδο ή ελαιόλαδο ως έλεγχος μέσω στοματικού καθετήρα 6 ημέρες την εβδομάδα. Για το μοντέλο όγκου 22Rv1 ευνουχισμός ανθεκτικά, ποντικοί χειρουργικά ευνουχισμένα μετά από μία εβδομάδα προσαρμογής, και αφέθηκαν να ανανήψουν για 3 ημέρες πριν από την εμβολιάσθηκαν υποδορίως με 4 × 10

6 22Rv1 κύτταρα στη δεξιά πλευρά. Την ημέρα μετά τον εμβολιασμό, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν και τοποθετήθηκαν στις ίδιες αγωγές θεραπείας όπως περιγράφεται για το μοντέλο LNCaP. Οι διαστάσεις του όγκου και τα σωματικά βάρη μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα και κάθε εβδομάδα, αντίστοιχα. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως

0,524 x πλάτος

2 x μήκος

[40]. Στο τέλος του πειράματος, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη /ξυλαζίνη, το αίμα συλλέγεται για τον προσδιορισμό PSA ορού χρησιμοποιώντας ποσοτική ELISA (United Biotech), και υποβάλλονται σε ευθανασία με CO

2. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν, ζυγίστηκαν, και στερεώθηκαν σε 10% φορμαλίνη για εμβάπτιση σε παραφίνη και ιστολογική ανάλυση. Όλες οι διαδικασίες ζώων είχαν εγκριθεί από το Θεσμικό Animal Care and Use Επιτροπής του Πανεπιστημίου Tulane.

AR Ανοσοϊστοχημική Αναλύσεις

Η ανοσοϊστοχημεία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Ως αρνητικός έλεγχος, το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε με ένα μη-άνοσο IgG στην ίδια συγκέντρωση, και δεν ανιχνεύθηκε αντιδραστικότητα. Βιτρώ τμήματα σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας το Aperio ScanScope σαρωτή, και ψηφιοποιημένα εικόνες αναλύθηκαν με τις Aperio WebScope ολοκληρωμένη αλγορίθμων. Για χρώση AR, εικόνες ελήφθησαν δείγματα διαδοχικά σε όλη κάθε τμήμα με περιοχές νέκρωσης, αντικείμενα προετοιμασία, και τις άκρες αποφεύγεται. Η ένταση της πυρηνικής χρώσης κατηγοριοποιήθηκε σε ισχυρές, ασθενείς ή αρνητική όπως προσδιορίζεται από τον αλγόριθμο Aperio Nuclear V9. χρώση Η3 φωσφο-ιστόνης μετρήθηκε ποσοτικά όπως περιγράφεται [41]. Πέντε τυχαία μικροσκοπικά πεδία συνελήφθησαν για κάθε τμήμα του όγκου σε μεγέθυνση 10x, και ο αριθμός των φωσφο-ιστόνης Η3-θετικών κυττάρων με το χέρι μετρήθηκαν.

Στατιστική Ανάλυση

δύο-tailed t του Student δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των μέσων διαφορές μεταξύ της θεραπείας και ελέγχου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM.

Αποτελέσματα

PPD Ελάττωση του AR-FL και AR-Vs σε ανδρογόνα στέρηση Κατάσταση

Θα αξιολογηθεί πρώτα η επίδραση της PPD σε AR-FL και τα επίπεδα της πρωτεΐνης AR-V σε ευνουχισμό-ανθεκτικά κύτταρα 22Rv1 και CWR-R1 καλλιεργούνται σε ανδρογόνα στερούνται κατάσταση. Αυτά τα δύο μοντέλα κυττάρων εκφράζουν AR-FL μαζί με τρεις ~ 80-KDa μεγάλες AR-Vs, δηλαδή AR-V7, AR-V1 (aka AR4), και AR-V4 (aka AR5) [15], [16]. αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει όλες τις ισομορφές AR ή ειδικό για AR-V7. Ως το πιο άφθονο και ενεργό AR-V στα κύτταρα [15], AR-V7 είναι η μόνη AR-V στο οποίο έχει αναπτυχθεί ένα ειδικό αντίσωμα. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 1Α και 1Β, PPD μειωτικά τόσο AR-FL και AR-Vs σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, με την αλλαγή στο AR-Vs παρόμοια με εκείνη του AR-FL σε 22Rv1 κύτταρα αλλά ελαφρώς πιο σημαντική από εκείνη του AR -FL στα κύτταρα CWR-R1. Στη συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση της PPD στα επίπεδα mRNA των διαφορετικών ισομορφών AR σε αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ανδρογόνα στερούνται κατάσταση με qRT-PCR. Όπως παρουσιάζεται στα Σχήματα 1Γ και 1Δ, θεραπεία PPD μείωσε επίσης AR-FL και AR-V μεταγραφές και στα δύο μοντέλα κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια μικρή αλλά στατιστικά σημαντική αύξηση της έκφρασης AR-V1 παρατηρήθηκε κατά το πρώιμο χρονικό σημείο σε κύτταρα 22Rv1. Ωστόσο, η αύξηση δεν διατηρήθηκε με μακρύτερη θεραπεία. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PPD μπορεί να αναστέλλει την έκφραση του AR-FL και AR-Vs σε ανδρογόνα-στερηθεί κατάσταση

& amp.? Η ανάλυση στυπώματος Western Β πρωτεϊνών AR με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει όλες τις ισομορφές AR ή ειδικό για AR-V7 σε 22Rv1 (Α) ή κύτταρα CWR-R1 (Β). Οι αριθμοί στους πίνακες υποδηλώνουν σχετική ομαλοποιημένη εντάσεις των ζωνών πρωτεΐνης AR σε σύγκριση με την τιμή ελέγχου 100. C. qRT-PCR ανάλυση των επιπέδων mRNA του AR-FL και AR-Vs σε 22Rv1 κύτταρα. *,

P

& lt? 0.05 από τον έλεγχο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ανδρογόνα στερούνται κατάσταση. PPD, 20 μg /ml. Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM.

Η

PPD καταστολή των ανδρογόνων-Ανεξάρτητων AR Δραστηριότητα

AR-Vs στερούνται το πεδίο σύνδεσης συνδετήρα και έχουν ανδρογόνων-ανεξάρτητη συστατική δραστηριότητα [15], [16 ], [42]. PPD προς τα κάτω ρύθμιση του AR-Vs θα αναμένεται να οδηγήσει σε καταστολή του ανεξάρτητου από ανδρογόνο AR μετενεργοποίηση. Εμείς ως εκ τούτου, εκτίμησε την επίδραση του PPD στη δραστηριότητα AR σε κύτταρα 22Rv1 καλλιεργήθηκαν σε ανδρογόνα-στέρησε την κατάσταση με τη δοκιμασία γονιδίου αναφοράς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, ανεξάρτητου από ανδρογόνο AR διενεργοποίησης είχε συμπιεσθεί με PPD ως συνάρτηση του χρόνου. Στις 6 και 12 ώρες μετά τη θεραπεία PPD, η δραστικότητα αναστάλθηκε κατά 36% και 66%, αντίστοιχα. Προχωρήσαμε να εξετάσει την επίδραση της PPD επί ενδογενών γονιδίων AR-στόχο, η κανονική στόχους PSA και TMPRSS2 καθώς επίσης και η AR-V-ειδική CCNA2 στόχος [20], [43], με qRT-PCR υπό τις ίδιες συνθήκες. Σύμφωνα με το αποτέλεσμα γονίδιο αναφοράς, όλοι οι στόχοι (Σχήματα 2Β & amp? 2C) έδειξε μια εξαρτώμενη από το χρόνο μείωση της έκφρασης. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα κατέδειξαν την ικανότητα του PPD να αναστέλλουν ανεξάρτητο από ανδρογόνο AR-FL και AR-V δραστηριότητες.

A. δοκιμασία γονιδίου αναφοράς δείχνει PPD αναστολή των ανδρογόνων-ανεξάρτητο

trans

-activating δραστηριότητα του AR. 22Rv1 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το κατασκεύασμα ARE-λουσιφεράσης και το μόρφωμα ρΡΙ_-ΤΚ, και τη δραστικότητα της λουσιφεράσης πυγολαμπίδας ομαλοποιήθηκε με εκείνη του

Renilla

λουσιφεράσης. B & amp? αναλύσεις C. qRT-PCR δείχνει PPD μειώσουν την έκφραση της κανονικής στόχων AR PSA και TMPRSS2 (Β) και το AR-V-ειδική CCNA2 στόχου (C) σε 22Rv1 κύτταρα. *,

P

& lt? 0.05 από τον έλεγχο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ανδρογόνα στερούνται κατάσταση. PPD, 20 μg /ml. Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM.

Η

PPD Αναστολή της Ευνουχισμός-Resistant Εξέλιξη των LNCaP όγκοι

Στη συνέχεια, αξιολόγησε την επίδραση της PPD σχετικά με την επανεμφάνιση του καρκίνου του προστάτη μετά από θεραπεία στέρησης ανδρογόνων στο μοντέλο LNCaP ξενομόσχευμα . LNCaP είναι ένα ανδρογόνο-εξαρτώμενη κυτταρική γραμμή ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και εκφράζει κυρίως AR-FL [44]. Η ανάπτυξη του LNCaP ξενομοσχεύματος όγκων απαιτεί ανδρογόνα, και ο ευνουχισμός προκαλεί μια αρχική επιβράδυνση ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων [45], [46]. Ωστόσο, παρόμοια με ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη, τα ξενομοσχεύματα τελικά να γίνουν ανθεκτικά ευνουχισμό και να συνεχίσετε την ανάπτυξη [45] – [49]. Αρσενικοί γυμνοί ποντικοί εμφυτεύθηκαν με κύτταρα LNCaP στη δεξιά ραχιαία πλευρά. Ο ευνουχισμός έγινε όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 100 mm

3. Οι ευνουχισμένοι ποντικοί στη συνέχεια χωρίζονται σε δύο ομάδες που έλαβαν είτε το ελαιόλαδο ως έλεγχος ή 40 mg /kg PPD μέσω στοματικού καθετήρα 6 ημέρες την εβδομάδα. Η αγωγή άρχισε την ημέρα μετά τον ευνουχισμό.

Σε σύγκριση με LNCaP όγκων που αναπτύσσονται σε γονάδων-ανέπαφο ποντικούς [45], [46], υπήρξε μια επιβράδυνση της ανάπτυξης του όγκου και στις δύο ομάδες κατά τη διάρκεια των πρώτων δύο εβδομάδων θεραπείας, όπως μια πρώτη απάντηση σε ευνουχισμό (Εικόνα 3Α). Οι όγκοι στην ομάδα ελέγχου επανέλαβε την ανάπτυξη ξεκινώντας από την ημέρα 17 της αγωγής, ως αποτέλεσμα της απόκτησης ανθεκτικότητας ευνουχισμό, ενώ οι όγκοι στην ομάδα PPD παρέμεινε μικρή. Από την ημέρα 25, η διαφορά στο μέσο μέγεθος όγκου μεταξύ των δύο ομάδων έγινε στατιστικά σημαντική. Στο τέλος του πειράματος, το μέσο μέγεθος όγκου ήταν 1000 mm

3 στην ομάδα ελέγχου, αλλά 330 mm

3 στην ομάδα PPD, υποδεικνύοντας -67% αναστολή του όγκου από regrowth PPD. Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, ο μέσος όρος των βαρών των όγκων ήταν 0,76 g και 0,32 g σε έλεγχο και PPD ομάδες, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β). Κατά τη διάρκεια της περιόδου 42 ημερών της θεραπείας, PPD δεν φάνηκε να προκαλεί τοξικότητα σε ποντικούς όπως φαίνεται από καμία μείωση του σωματικού βάρους σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 3C).

κύτταρα LNCaP εμβολιάστηκαν σε γονάδων ανέπαφο γυμνά ποντίκια, και ο χειρουργικός ευνουχισμός πραγματοποιήθηκε όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 100 mm

3. Η θεραπεία με 40 mg /kg PPD μέσω στοματικού καθετήρα 6 ημέρες την εβδομάδα ξεκίνησε την επομένη ευνουχισμό (n = 10). όγκοι του όγκου Α Mean. βάρη των όγκων B. Ατομική κατά την ολοκλήρωση του πειράματος. σωματικά βάρη Γ Μέση ποντίκι. Δ μέσο επίπεδο PSA στον ορό προσδιορίζεται με ELISA, ομαλοποιήθηκε από τα βάρη των όγκων, κατά την ολοκλήρωση της μελέτης. *,

P

& lt? 0,05 από την ομάδα ελέγχου. Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM.

Η

προστάτη υποτροπής του όγκου μετά τον ευνουχισμό σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα του PSA στον ορό [50]. Μετρήσαμε τα επίπεδα του PSA στον ορό ποντικού χρησιμοποιώντας ELISA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, PPD συμπλήρωση οδήγησε σε πτώση περίπου 50% στο μέσο επίπεδο του PSA στον ορό, από 173 ng /ml /g στην ομάδα ελέγχου σε 97 ng /ml /g στην ομάδα PPD. Τα επίπεδα ομαλοποιήθηκαν κατά βάρος του όγκου. Έτσι, η πτώση δεν ήταν συνέπεια της αναστολής της ανάπτυξης του όγκου, αλλά μάλλον μια ένδειξη της καταστολής PPD του AR επανενεργοποίησης στους όγκους. Στη συνέχεια μετράται η έκφραση της πρωτεΐνης AR με ανοσοϊστοχημεία σε μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη ιστούς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, η θεραπεία PPD μείωσε το ποσοστό των κυττάρων με ισχυρή χρώση AR ενώ αυξάνεται το ποσοστό των κυττάρων με αρνητική χρώση. Συνεπώς, τα δεδομένα επιβεβαιώθηκαν μας

in vitro

αποτελέσματα, που δείχνουν την αποτελεσματικότητα της PPD σε προς τα κάτω ρύθμιση επιπέδου AR και δραστικότητα σε CRPC κύτταρα

in vivo

.

Οι όγκοι συλλέχθηκαν στο τέλος του πειράματος της Εικόνας 3. Α AR ανοσοϊστοχημική χρώση των τμημάτων του όγκου. Αριστερό πλαίσιο, ποσοτικοποίηση των δεδομένων. Δεξιά πάνελ, εκπρόσωπος εικόνες. Β φωσφο-ιστόνης Η3 ανοσοϊστοχημική χρώση των τμημάτων του όγκου. Αριστερό πλαίσιο, ποσοτικοποίηση των δεδομένων. Δεξιά πάνελ, εκπρόσωπος εικόνες. C. Η &? Ε χρώση των τμημάτων του όγκου. *,

P

& lt? 0,05 από την ομάδα ελέγχου. Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM.

Η

Αξιολογήσαμε περαιτέρω την επίδραση της PPD επί μίτωσης στους όγκους μέσω ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον φωσφο-ιστόνης Η3, έναν δείκτη της μίτωσης [41]. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, PPD συμπλήρωση προκάλεσε σημαντική μείωση του μέσου αριθμού των μιτώσεων ανά πεδίο εικόνας. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση των ιστών δεν έδειξε καμία εμφανή ιστοπαθολογική μεταβολή των όγκων μετά τη θεραπεία PPD (Σχήμα 4C). Συλλογικά, τα δεδομένα υποδεικνύουν τη δυνατότητα χρήσης PPD για την πρόληψη της υποτροπής του καρκίνου του προστάτη μετά από θεραπεία στέρησης ανδρογόνων.

PPD αναστολή της ανάπτυξης του ευνουχισμού-Resistant 22Rv1 Ξενομοσχεύματος Όγκων

Είμαστε δίπλα αξιολόγησε την ικανότητα της PPD, σε σύγκριση με την επόμενη γενιά αντιανδρογόνο enzalutamide, να αναστέλλουν την ανάπτυξη των όγκων του προστάτη που είναι ήδη ανθεκτικά χρησιμοποιώντας το μοντέλο ξενομοσχεύματος 22Rv1 ευνουχισμό. 22Rv1 κύτταρα εμβολιάσθηκαν στο δεξιό ραχιαίο πλευρό των ευνουχισμένων αρσενικών γυμνών ποντικών. Χορήγηση 40 mg /kg PPD ή 10 ή 30 mg /kg enzalutamide μέσω στοματικού καθετήρα 6 ημέρες την εβδομάδα ξεκίνησε όταν οι όγκοι φτάνουν περίπου 100 mm

3. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, PPD ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των όγκων 22Rv1. Κατά την ολοκλήρωση του πειράματος, το μέσο βάρος των όγκων ήταν 0,35 g στην ομάδα PPD, αλλά 0,54 g στην ομάδα ελέγχου, υποδεικνύοντας -35% αναστολή της ανάπτυξης του όγκου με PPD (Σχήμα 5Β). Αυτό συνδέθηκε επίσης με ~ 50% μείωση στα επίπεδα PSA ορού (Σχήμα 5D), καθώς και σημαντική μείωση στο σήμα ανοσοχρώση AR ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα παν-AR (Σχήμα 6Α) και ο αριθμός των μιτώσεων (Σχήμα 6Β) στους όγκους . Ανάλυση κηλίδας Western έδειξε περαιτέρω PPD ρύθμιση προς τα κάτω των δύο AR-FL και AR-Vs στους όγκους (Σχήμα 6C). PPD δεν προκάλεσε μείωση στα σωματικά βάρη των ποντικών (Σχήμα 5C) ή φαινομενική ιστοπαθολογική μεταβολή των όγκων (Σχήμα 6D).

22Rv1 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε ευνουχισμένα γυμνούς ποντικούς. Όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 100 mm

3, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 40 mg /kg PPD μέσω στοματικού καθετήρα 6 ημέρες την εβδομάδα (η = 11). όγκοι του όγκου Α Mean. B. Ατομική βάρος του όγκου κατά την ολοκλήρωση του πειράματος. σωματικά βάρη Γ Μέση ποντίκι. Δ μέσο επίπεδο PSA στον ορό προσδιορίζεται με ELISA, ομαλοποιήθηκε από τα βάρη των όγκων, κατά την ολοκλήρωση της μελέτης. *,

P

& lt? 0,05 από την ομάδα ελέγχου. Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM.

Η

Οι όγκοι συλλέχθηκαν στο τέλος του πειράματος του σχήματος 5. Α AR ανοσοϊστοχημική χρώση των τμημάτων του όγκου. Αριστερό πλαίσιο, ποσοτικοποίηση των δεδομένων. Δεξιά πάνελ, εκπρόσωπος εικόνες. Β φωσφο-ιστόνης Η3 ανοσοϊστοχημική χρώση των τμημάτων του όγκου. Αριστερό πλαίσιο, ποσοτικοποίηση των δεδομένων. Δεξιά πάνελ, εκπρόσωπος εικόνες. Η ανάλυση στυπώματος Western Γ των όγκων χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα παν-AR. Η ποσοτικοποίηση των δεδομένων που παρουσιάζονται κάτω από τις κηλίδες. D. Η &? Ε χρώση των τμημάτων του όγκου. *,

P

& lt? 0,05 από την ομάδα ελέγχου. Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM.

Η

Είναι ενδιαφέρον, enzalutamide, σε καμία από τις δύο δόσης, ήταν ικανή να αναστείλει την ανάπτυξη των όγκων 22Rv1 (Σχήμα 7Α), καταστέλλει τα επίπεδα PSA ορού στους ποντικούς (Σχήμα 7D), αναστέλλουν τη μίτωση (Σχήμα 8Α), ή προκαλούν εμφανή ιστοπαθολογική μεταβολή των όγκων 22Rv1 (Σχήμα 8Β). Κατά την ολοκλήρωση του πειράματος, υπήρχε μια τάση μείωσης στο βάρος του όγκου με την αύξηση της δόσης του enzalutamide (Σχήμα 7Β). Ωστόσο, η μείωση δεν ήταν στατιστικά σημαντική, πιθανώς λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος του πειράματος. Παρ ‘όλα αυτά, η μείωση που παρατηρήθηκε με 10 mg /kg enzalutamide, η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη δόση enzalutamide η οποία είναι αποτελεσματική κατά των μοντέλων ευνουχισμό ανθεκτικών LNCaP ξενομοσχεύματος [27], [51], [52], ήταν μάλλον οριακή. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα υποδεικνύουν τη δυνατότητα χρήσης PPD να αναστέλλουν την ανάπτυξη του CRPC.

22Rv1 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε ευνουχισμένα γυμνούς ποντικούς. Όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 100 mm

3, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 ή 30 mg /kg enzalutamide μέσω στοματικού καθετήρα 6 ημέρες την εβδομάδα (η = 4). όγκοι του όγκου Α Mean. B. Ατομική βάρος του όγκου κατά την ολοκλήρωση του πειράματος. σωματικά βάρη Γ Μέση ποντίκι. Δ μέσο επίπεδο PSA στον ορό προσδιορίζεται με ELISA, ομαλοποιήθηκε από τα βάρη των όγκων, κατά την ολοκλήρωση της μελέτης. Enz, enzalutamide. Καμία από τις ομάδες θεραπείας έδειξαν στατιστική διαφορά από την ομάδα ελέγχου σε καμία από τις παραμέτρους. Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM.

Η

Οι όγκοι συλλέχθηκαν στο τέλος του πειράματος του σχήματος 7. Α Phospho-ιστόνης Η3 ανοσοϊστοχημική χρώση των τμημάτων του όγκου. Αριστερό πλαίσιο, ποσοτικοποίηση των δεδομένων. Δεξιά πάνελ, εκπρόσωπος εικόνες. B. Η &? Ε χρώση των τμημάτων του όγκου. Enz, enzalutamide. Οι ράβδοι σφάλματος, το SEM.

Η

Συζήτηση

Δείξαμε προηγουμένως ότι PPD καταστέλλει ανδρογόνων σηματοδότηση μέσω της μείωσης της έκφρασης και των δύο AR-FL και AR-Vs [34]. Στην παρούσα μελέτη, επεκτείναμε τις παρατηρήσεις ανδρογόνων-στερηθεί την κατάσταση, δείχνοντας ανδρογόνα-ανεξάρτητους προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης AR και διενεργοποίησης από PPD. Το πιο σημαντικό, η παρούσα μελέτη κατέδειξε, για πρώτη φορά, η δυνατότητα χρήσης PPD για τη βελτίωση της θεραπευτικής έκβασης της θεραπείας στέρησης ανδρογόνων. Δείξαμε, σε μοντέλα ξενομοσχεύματος, ότι PPD εμποδίζει ή καθυστερεί την ανάπτυξη των CRPC μετά στέρησης ανδρογόνων και αναστέλλει την ανάπτυξη του ευνουχισμού-ανθεκτικών όγκων του προστάτη με ενδογενή έκφραση του AR-FL και AR-Vs.

Άνοδος στον ορό επίπεδο PSA χρησιμοποιείται ως δείκτης για βιοχημικής υποτροπής μετά τη θεραπεία. Δείξαμε ότι PPD συμπλήρωση οδηγεί σε μείωση των επιπέδων του PSA στον ορό. Επιπλέον, η μείωση αυτή δεν είναι απλά μια συνέπεια της μείωσης των μεγεθών του όγκου με PPD, δεδομένου ότι το αποτέλεσμα παραμένει σημαντικό μετά από κανονικοποίηση κατά βάρος του όγκου. Τα δεδομένα, αντίθετα, δείχνουν την ικανότητα του να καταστέλλει PPD AR επανενεργοποίησης σε όγκους υποτροπιάσει μετά από στέρηση ανδρογόνου και σε όγκους που είναι ανθεκτικοί ευνουχισμό, ως εκ τούτου παρέχοντας μια μηχανιστική βάση για την ικανότητα του να αναστέλλει PPD αντίσταση ευνουχισμό.

Η δόση της PPD που χρησιμοποιήθηκε στις μελέτες ξενομοσχεύματος μας ήταν 40 mg ανά kg σωματικού βάρους του ποντικού. Με βάση την μετατροπή επιφάνεια σώματος [53], το ανθρώπινο ισοδύναμο της δόσης των 40 mg /kg PPD είναι 3,24 mg /kg. Αυτό ισοδυναμεί με μία ημερήσια δόση των 194 mg για 60 kg ενήλικα. Ημερήσια συμπλήρωση των 2 g του εκχυλίσματος ginseng σε ενήλικες με μέσο βάρος 60 kg έδειξε καμία δυσμενή επίδραση σε ανθρώπινες κλινικές δοκιμές [54], [55]. Δεδομένου ότι η περιεκτικότητα ginsenosides του εκχυλίσματος ήταν 14,5% [54], η ημερήσια δόση των ginsenosides σε αυτές τις δοκιμές ήταν 290 mg. Έτσι, η δόση που χρησιμοποιήσαμε στις μελέτες σε ζώα μας είναι επιτεύξιμη σε άνθρωπο.

Παρά τη μακρά εκτίμηση της σημασίας της στόχευσης σηματοδότηση AR για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη, καμία θεραπεία έχει αναπτυχθεί μέχρι σήμερα για τη στόχευση AR απευθείας σε μειώσει τη διαθεσιμότητά του. Εκτός από την PPD, διάφορες άλλες ενώσεις έχουν δειχθεί προ-κλινικά για να μειώσει τα επίπεδα του AR-FL και AR-Vs και να αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων CRPC [26], [56] – [61]. Οι ενώσεις αυτές μπορούν να χρησιμεύσουν ως ένα αποτελεσματικό αντίδοτο για την υπέρβαση αντίσταση σε θεραπεία αποστέρησης ανδρογόνων, ιδιαίτερα για την αντίσταση που οφείλεται σε υπερέκφραση του AR-Vs. Λόγω της έλλειψης του πεδίου σύνδεσης συνδετήρα, AR-Vs δεν μπορεί να στοχεύονται από τις τρέχουσες θεραπείες ανδρογόνων στέρηση, συμπεριλαμβανομένου του νέου αμπιρατερόνη ναρκωτικών και enzalutamide. Αυτό αντικατοπτρίζεται από τα στοιχεία μας δείχνουν την αναποτελεσματικότητα του enzalutamide έναντι της ανάπτυξης του AR-V-εκφράζουν όγκους ξενομοσχεύματος 22Rv1 σε ευνουχισμένους ξενιστή. Από την άλλη πλευρά, η ανάπτυξη αυτών των όγκων μπορεί να ανασταλεί με PPD σε μία φαρμακολογικά επιτεύξιμη δόση. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν τη δυνατότητα χρήσης PPD σε συνδυασμό με αυτά τα νέα φάρμακα για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη. Ο καθορισμός των συνδυαστική απόδοση των και τις καλύτερες σειρές των θεραπειών είναι μια περιοχή της συνεχιζόμενης έρευνας μας. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα από την παρούσα μελέτη, όχι μόνο παρέχει ένα σκεπτικό για την περαιτέρω ανάπτυξη PPD ή το ανάλογο του για την παρέμβαση του CRPC, αλλά και να τεκμηριώσει τη μείωση AR-FL και διαθεσιμότητα AR-V ως μια βιώσιμη προσέγγιση για τη βελτίωση θεραπευτικό αποτέλεσμα της θεραπείας στέρησης ανδρογόνων .

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Elizabeth M. Wilson από το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας για την παροχή κύτταρα CWR-R1.