Αφηρημένο

Ιστορικό

γονίδια

Ρολόι αυτοκίνητο περίπου 5-15% της έκφρασης mRNA του γονιδιώματος-ευρεία, και διαταραχή του κιρκάδιου ρολογιού μπορεί να απορρυθμίσει φυσιολογικές βιολογικές λειτουργίες του κυττάρου. Cryptochrome 1 είναι ένας ρυθμιστής κλειδί του κιρκαδικού βρόχο ανάδρασης και παίζει σημαντικό ρόλο σε οργανισμούς. Η παρούσα μελέτη διεξήχθη για να διερευνήσει την έκφραση Cry1 και προγνωστική σημασία της στο ορθοκολικό καρκίνο (CRC). Επιπλέον, η λειτουργία του Cry1 σε ανθρώπινο CRC διερευνήθηκε σε μοντέλα καλλιέργειας κυττάρων.

Μέθοδοι

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR, ανάλυση και ανοσοϊστοχημεία Western blot χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνήσουν έκφραση Cry1 εις το CRC κύτταρο γραμμές και πρωτογενή κλινικά δείγματα CRC. δοκιμασίες ΜΤΤ και σχηματισμού αποικίας χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί αποτελέσματα επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ικανότητα. Το ζωικό μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει την επίδραση Cry1 επί του όγκου κυτταρικό πολλαπλασιασμό ικανότητα

in vivo

. Transwell προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για να ανιχνεύουν την ικανότητα μετανάστευση των κυτταρικών σειρών. Οι στατιστικές αναλύσεις που εφαρμόζεται για την αξιολόγηση της διαγνωστικής αξίας και τις ενώσεις της έκφρασης Cry1 με κλινικές παραμέτρους.

Αποτελέσματα

έκφραση Cry1 ήταν επάνω ρυθμίζεται στην πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών CRC και 168 πρωτοβάθμια CRC κλινική δείγματα σε επίπεδο πρωτεΐνης. Κλινική παθολογική ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση Cry1 συσχετίστηκε σημαντικά με μετάσταση στους λεμφαδένες (

σ

= 0,004) και το στάδιο TNM (

σ

= 0,003). υψηλή έκφραση Cry1 συσχετίστηκε με κακή συνολική επιβίωση σε ασθενείς με CRC (

σ

= 0,010). Πειραματικά, βρήκαμε ότι τα άνω ρύθμιση του Cry1 προήγαγαν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων HCT116, ενώ ρύθμιση προς τα κάτω της Cry1 ανέστειλε το σχηματισμό αποικίας και τη μετανάστευση των κυττάρων SW480.

Συμπεράσματα

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Cry1 πιθανό παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη της CRC andCry1 μπορεί να είναι ένα προγνωστικό βιοδείκτη και ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο για CRC

Παράθεση:. Yu H, Meng Χ, Wu J, Παν C, Ying Χ, Zhou Y, et al. (2013) Cryptochrome 1 υπερέκφραση συσχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου και κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (4): e61679. doi: 10.1371 /journal.pone.0061679

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 10 Ιανουαρίου 2013? Αποδεκτές: 13 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Απρ 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (973 Προγράμματος, Νο 2011CB504805, Νο 2010CB52994), από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30.973.448) και Guangdong Πρόσληψη Πρόγραμμα Δημιουργικής Ομάδας Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κιρκαδικοί ρυθμοί καθημερινά ταλαντώσεις σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες. Τα τελευταία χρόνια, η ρύθμιση του κιρκάδιου ρυθμού έχει γίνει καλύτερα κατανοητή. Ο μοριακός μηχανισμός του κιρκαδικού ταλαντώσεις στον υπερχιασματικό πυρήνες (SCN) και κυττάρων περιφερικού βασίζεται στους βρόχους ανάδρασης από οκτώ πυρήνα κιρκαδικού γονίδια [1], [2]:

περιόδου1 (Per1)

,

περίοδο2 (Per2)

,

Period3 (PER3)

,

Ρολόι

,

BMAL1

,

καζεΐνης κινάση Ι ε (ΟΚΙε)

,

Cryptochrome1 (Cry1) και Cryptochrome2 (Cry2)

. Μεταξύ των οκτώ γονίδια, τα Crys συσσωρεύονται στο κυτταρόπλασμα και στη συνέχεια πληκτρολογήστε τον πυρήνα, προωθώντας το σχηματισμό σταθερών συμπλοκών Ανά /Cry /CK1ε. Μόλις στον πυρήνα, οι Crys διασπάσει το σύμπλοκο μεταγραφικού BMAL1 /Ρολόι-συνδέονται, με αποτέλεσμα την αναστολή της Cry και Per μεταγραφή και αποκαταστολή BMAL1 μεταγραφής. Το μοριακό ρολόι των περιφερικών ιστών συντονίζει τη μεταγραφή των γονιδίων κιρκαδικού. Οι κιρκάδιου γονίδια είναι σε μεγάλο βαθμό ειδικό ιστό και να συνδέσει βασικές λειτουργίες των ιστών με το κιρκαδικό περιβάλλον, επιτρέποντας αυτοί οι σημαντικές λειτουργίες να είναι διαθέσιμες σε συγκεκριμένες ώρες, όταν τους χρειάζονται περισσότερο [3], [4], [5].

Στα θηλαστικά, περίπου 5-15% της έκφρασης mRNA γονιδιώματος σε επίπεδο οδηγείται από κιρκαδικού γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των βασικών ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου (όπως

κυκλίνη D1

), ογκογονίδια, και καταστολείς όγκων, όπως

γ Myc έχει

και

wee-1

(ένα είδος κινάσης που εμποδίζει την κυτταρική διαίρεση) [6]. Η διακοπή του κιρκαδικού ρολογιού μπορεί απορρύθμιση φυσιολογικές κυτταρικές βιολογικές λειτουργίες και έχουν σημαντικές επιπτώσεις στην υγεία του ανθρώπου, προκαλώντας συνθήκες όπως διαταραχές του ύπνου, γαστρεντερικών και καρδιαγγειακών παθήσεων, και η κατάθλιψη. Το κιρκαδικό ρολόι συνδέεται επίσης με αυξημένη συχνότητα αρκετών επιθηλιακών καρκίνων [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Σε μοντέλα ποντικού, μεταμοσχευμένων όγκων αυξηθεί δύο φορές πιο γρήγορα σε SCN-αλλοιώσεις ποντικούς όπως στα ζώα ψευδο-αλλοιώσεις [13]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι υπάρχει στενή σχέση μεταξύ του κιρκαδιανού οργάνωση και την ανάπτυξη των διαφόρων μορφών καρκίνου. Οι σχέσεις μεταξύ του κιρκαδιανού γονιδίων και καρκίνος αποδεικνύεται κατά τα τελευταία έτη. Το κιρκαδικό ρολόι ξενιστής έχει αναφερθεί ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ενδογενή έλεγχο της εξέλιξης του όγκου [14] .Cry1, ένα μέλος της οικογένειας Cryptochrome, έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για την αρνητική βραχίονα του βρόχου ανάδρασης κιρκάδιου [15] , [16].

καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις τρεις κύριες αιτίες της θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [17]. ασθενείς CRC συχνά αναπτύσσουν μεταστάσεις λεμφαδένων κατά τα πρώτα στάδια της νόσου. Κατά τη διάρκεια των προχωρημένα στάδια, η πλειονότητα των ασθενών αναπτύσσουν επίσης ήπατος, των πνευμόνων και των μεταστάσεων του περιτοναίου. Οι παράγοντες που εμπλέκονται στην CRC μετάσταση είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη? Ωστόσο, η απορύθμιση της μοριακές διαδικασίες θεωρείται ότι έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη και μετάσταση του CRC. Κατά συνέπεια, η σημασία των δεικτών που προωθούν την ανάπτυξη της CRC έχει τονιστεί, όπως θα μπορούσαν να παρέχουν θεραπευτικούς στόχους [18], [19].

Ωστόσο, οι μελέτες αξιολόγησης των σχέσεων της έκφρασης Cry1 να κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και τα αποτελέσματα σε καρκίνο του παχέος εντέρου δεν έχουν αναφερθεί. Εμείς, ως εκ τούτου, να αξιολογηθούν τα επίπεδα έκφρασης των Cry1 σε ανθρώπινους ιστούς παχέος καρκίνου και συμφωνημένα βλεννογόνο μη καρκινικών και ανέλυσε την κλινική σημασία της έκφρασης Cry1 ασθενών inCRC. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η έκφραση Cry1 είναι συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο ΤΝΜ και την κατάσταση των λεμφαδένων. Έτσι, Cry1 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα νέο δείκτη διάγνωσης και θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και παρακολούθηση

Εκατόν εξήντα οκτώ παχέος εντέρου ασθενείς με καρκίνο του όλα τα στάδια ΤΝΜ στο Αντικαρκινικό Κέντρο της Sun Yat-Κυρ Πανεπιστήμιο μεταξύ Σεπτεμβρίου 1999 και Δεκεμβρίου 2005 συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Δέκα ζεύγη ιστών από τα 168 δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμασία Q-PCR.

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Sun Yat-sen University Cancer Center Θεσμικών Διοικητικού Συμβουλίου, καθώς και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους των ασθενών.

τα κλινικά δεδομένα, όπως η ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, εντόπιση όγκου, προεγχειρητική καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο επίπεδα (CEA) και το αντιγόνο υδατάνθρακα 19-9 επίπεδα (CA199), συλλέχθηκαν από μη επεξεργασμένα αναφορές περιστατικών.

παθολογική παραμέτρους, όπως όγκου επεμβατική βάθος, το βαθμό διαφοροποίησης και ιστολογική μοτίβο συλλέχθηκαν από παθολογικά εκθέσεις και ελέγχονται από παθολόγους. Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν μία φορά κάθε τρεις μήνες για τα πρώτα δύο χρόνια, μία φορά κάθε έξι μήνες κατά τη διάρκεια του τρίτου και του τέταρτου έτους, και μία φορά ετησίως μετά το πέμπτο έτος μετά την επέμβαση.

Όλοι οι ασθενείς είχαν επικοινωνήσετε μέσω τηλεφώνου για να ελέγξετε την κατάσταση της υγείας τους? η τελευταία παρακολούθηση ημερομηνία ήταν 1 Μαρτίου 2012. Η ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) φορές υπολογίστηκαν από την ημερομηνία λειτουργίας για μετάσταση ή υποτροπή ημερομηνία ή την ημερομηνία του θανάτου, ή την τελευταία φορά λογοκριτή.

Κυτταροκαλλιέργεια

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές SW480 CRC, SW620, HCT116, ΗΤ29, η ανθρώπινη εμβρυϊκή νεφρική κυτταρική γραμμή GP293 και το φυσιολογικό κόλον επιθήλιο κυτταρική γραμμή FHC ελήφθησαν από την American Type Culture Collection . Τα κύτταρα THC8307 ελήφθησαν από το δικό μας εργαστήριο συλλογής. Οι κυτταρικές γραμμές CRC αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα κύτταρα FHC αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ: Ρ12 που περιείχε 0,005 mg /ml ινσουλίνη, 10 ng /ml τοξίνης χολέρας, 100 ng /ml υδροκορτιζόνη και 0,005 mg /ml τρανσφερίνη και έχει συμπληρωθεί με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 ng /ml στρεπτομυκίνη και 100 U /ml πενικιλίνη. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένο θάλαμο με 5% CO

2 και στους 37 ° C.

Ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ

Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ ® (DSBIO, Guangzhou, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συμπληρωματικό DNA (cDNA) συντέθηκε από 2 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Promega, Madison, WI). cDNA ενισχύθηκε με AmpliTaq® Gold ϋΝΑ πολυμεράση (Applied Biosystems, Foster, CA) και ειδικό γονίδιο εκκινητές. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για Cry1, 5′- GAGTATGATTCTGAGCCCTTTG-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-GGTTGTCCACCATTGAGT-3’ (αντίστροφο). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Western Blot ανάλυση

Σύνολο κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα SDS-PAGE, και ανάλυση Western Blot πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τυποποιημένες διαδικασίες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης στην ίδια μεμβράνη. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν συμπεριλαμβάνονται μονοκλωνικό αντι-Cry1 (1:1000, Abcam, USA) και αντι-GAPDH (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, USA). Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με τη χρήση της διαδικασίας ECL (Amersham Biosciences, USA).

διαμόλυνσης κυττάρων

Η κωδικοποιητική αλληλουχία του Cry1 ενισχύθηκε και κλωνοποιήθηκε εντός του

NotI

και

BamHI ιστοσελίδα του pcDNA3.1

+ για να δημιουργήσετε ένα pcDNA3.1

+ – Cry1 φορέα έκφρασης? το προκύπτον κατασκεύασμα επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας. Cry1 siRNA (GCAAGAGAAUUUGCUUAAUTT) και ελέγχου siRNA (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Genepharma ΣΙΑ Ε.Π.Ε. (Σαγκάη, Κίνα).

Για παροδική επιμόλυνση, SW480 κύτταρα (6 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο) και τα κύτταρα HCT116 (5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 60% συρροή και επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ ολιγονουκλεοτιδίων ή 4 μg του πλασμιδίου, χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 ((Invitrogen) σύμφωνα με τον κατασκευαστή οδηγίες. Μετά από 6 ώρες επώασης στους 37 ° C, το μέσο διαμολύνσεως αντικαταστάθηκε με 3 ml πλήρους μέσου που περιείχε 10% FBS. τα κύτταρα συλλέχθηκαν για τη δυτική δοκιμασίες κηλίδος, ο πολλαπλασιασμός και εισβολή σε διαφορετικές χρονικές στιγμές.

Ρετροϊών συσκευασία και την μεταγωγή

Cry1 και controlsequences κλωνοποιήθηκαν στον

Xho

Ι και

Cla

Ι θέση του φορέα. συσκευασία Virus pLNCX2 Ρετροϊών διεξήχθη σε κύτταρα GP293. GP293 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS σε επωαστή 37 ° C με 5% CO

2. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, το υπερκείμενο συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση στα 1000 g για 10 λεπτά. Τα κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε μεταγωγή με ρετροϊό που περιέχει τις Cry1 ή αλληλουχίες ελέγχου πλασμίδια. Σαράντα οκτώ ώρες μετά τη μόλυνση, G418 (600 μg /ml) προστέθηκε στο μέσο για 2 εβδομάδες για την επιλογή των σταθερών κυττάρων που έχουν μολυνθεί με τον ρετροϊό. Western blotting δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της έκφρασης Cry1 σε δύο σταθερές κυτταρικές σειρές, όπως περιγράφεται παραπάνω

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Ο 3- (4, 5-διμεθυλοθειαζολο-2-υλ). – 2, 5-διφαινυλο βρωμιούχο τετραζόλιο (ΜΤΤ) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. κύτταρα HCT116 επιστρώθηκαν σε 96 φρεατίων σε 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο. Η φασματοφωτομετρική απορρόφηση κάθε δείγματος μετρήθηκε στα 490 nm. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές, και ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων υπολογίστηκαν.

Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, κύτταρα HCT116 (4 × 10

3 κύτταρα ανά 10 εκατοστά

2 πλάκα) που υπερεκφράζουν GFP έλεγχο Cry1or και τα κύτταρα SW480 (5 × 10

3 κύτταρα για 10 εκατοστόμετρα

2 πλάκα) προς τα κάτω ρυθμισμένα για την έκφραση Cry1 με siRNA ή αρνητικός μάρτυρας σπάρθηκαν σε πλήρες μέσο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 14 ημέρες στους 37 ° C σε 5% CO

2 υγραμένου αέρα. σχηματισμός αποικίας και ανάπτυξης έγιναν ορατές με χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Οι αριθμοί των αποικιών που περιέχουν & gt? 50 κύτταρα προσδιορίστηκαν, και 12 πεδία μετρήθηκαν

In vitro

μετανάστευση

δοκιμασία

Η ικανότητα μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε σε επικοινωνούντα δοχεία. (8 πόρων μm? BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Το κάτω μέρος του θαλάμου γέμισε με 700 μΐ DMEM που περιείχε 10% FBS. Για τη δοκιμασία της μετανάστευσης, τα καρκινικά κύτταρα (1 χ 10

5 κυττάρων σε ένα συνολικό όγκο 200 μΙ) τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο και επωάστηκε στους 37 ° C σε 5% CO

2 υγροποιημένο αέρα. Μετά από 24 ώρες καλλιέργεια, μη μεταναστεύοντα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης πολυανθρακικού μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες επί 10 λεπτά. Ο αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν προσδιορίστηκε στη συνέχεια από 5 ανεξάρτητα μικροσκοπικά πεδία. Ο μέσος όρος των προσδιορισμών εις τριπλούν για κάθε πειραματική συνθήκη χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση.

Ανοσοϊστοχημική

δοκιμασία

Η έκφραση του Cry1 σε πρωτογενείς όγκους και τις παρακείμενες noncancerous ορθοκολικού βλεννογόνο εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μια ανοσοϊστοχημική δοκιμασία. Η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση πραγματοποιήθηκε εντός πέντε ημερών από την προετοιμασία ενότητα. τομές παραφίνης κόπηκαν σε πάχος 4 um και τοποθετημένα σε σιλανοποιημένη διαφάνειες. Οι τομές στη συνέχεια αποκηρωμένα, ενυδατωμένο και αποκλείστηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3%. αντιγόνα ιστού ανακτήθηκαν με φούρνο μικροκυμάτων κλίβανο ρυθμισμένο στους 95 ° C για 25 λεπτά και ψύχθηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 mmol /κιτρικό νάτριο (ρΗ 6.0). Κάθε φέτα στη συνέχεια πλύθηκε με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και επωάζεται όλη τη νύκτα στους 4 ° C με Cry1 (1:400, κλώνος ab54649, Abcam, Cambridge, UK). Πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν με μείωση φόντο συστατικών (S2022, Dako, Glostrup, Δανία). Το δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε με τον Envision Detection Kit (Dako). Τα πλακίδια χρωματίστηκαν για 2 λεπτά με διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAB) και στη συνέχεια με αιματοξυλίνη. Tissue σε επεξεργασία με διάλυμα αραίωσης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Όλοι οι έλεγχοι απέδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα.

Αξιολόγηση της χρώσης

Τα δείγματα αξιολογήθηκαν από δύο ερευνητές, οι οποίοι δεν γνώριζαν την κλινική έκβαση και που ανεξάρτητα κριτική για τις βάφονται διαφάνειες. Κάθε διαφάνεια αξιολογήθηκε κάτω από μικροσκόπιο σε × 200 μεγέθυνση. Η έκφραση του Cry1 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας H-βαθμολογίες. Τα H-βαθμολογίες αποτελούνταν από μια αξιολόγηση της έντασης της χρώσης και το ποσοστό της περιοχής χρώσης έχει μια δεδομένη ένταση. Μόνο αξιολογήθηκαν χρωματισμένο κακοήθη κύτταρα. Τα δείγματα ομαδοποιούνται στις ακόλουθες τέσσερις κατηγορίες με βάση την ένταση της πυρηνικής χρώσης: κανένας (0), ασθενής (1), μέσο (2) και ισχυρή (3). Το ευρετήριο ποσό αυτό προκύπτει από τον πολλαπλασιασμό του βαθμού έντασης κατά το ποσοστό της χρώσης περιοχής.

Το επίπεδο έκφρασης Cry1 ήταν διαχωρίστηκαν μεταξύ τους, σύμφωνα με DFS και OS από μια καμπύλη ROC. Η τιμή αποκοπής του θετικού ρυθμού ήταν η μεγιστοποιείται άθροισμα των σημείων ευαισθησίας και ειδικότητας.

In vivo

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

Γυναίκα χωρίς θύμο αδένα BABL /c γυμνά ποντίκια ( 4-5 εβδομάδων) αγοράστηκαν από το Ιατρικό Κέντρο ζώων επαρχία Γκουανγκντόνγκ (Guangdong, Κίνα). Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν inaccordance με useguidelines ζώων ΝΙΗ και η κινεζική κανονισμούς και standardson τη χρήση των πειραματόζωων. Για τον προσδιορισμό της ικανότητας πολλαπλασιασμού του κυττάρου linesstably υψηλής έκφρασης Cry1

in vivo

, συνολικά 1 × 10

6 κύτταρα ενέθηκαν υποδορίως στην αριστερή γυμνών ποντικών και την ομάδα αρνητικού ελέγχου ενέθηκαν στην δεξιά (n = 9). Ο όγκος του όγκου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:. Tumorvolume = 4π /3 × (πλάτος /2)

2 χ (μήκος /2) εβδομάδες μετά την ένεση .Four, τα ζώα θυσιάστηκαν

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Μια ζεύγη

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τη δοκιμή για τις διαφορές στην έκφραση Cry1 μεταξύ συμφωνημένα όγκου και καλοήθεις βλεννογόνο. Η στατιστική σημαντικότητα των

in vitro

μελέτες αναλύθηκαν με τη χρήση του Student

t-test

. Kaplan-Meier και log-rank τεστ της ισότητας των επιζώντων χρησιμοποιήθηκαν για να σχεδιάσετε τις καμπύλες επιβίωσης με υψηλά έναντι χαμηλών βαθμολογιών Cry1 IHC (όπως ορίζεται από την καμπύλη ROC). Όλα

σ

τιμές ήταν δύο όψεων, και

P

& lt? 0.05 ήταν το επίπεδο στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SPSS, έκδοση 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά των ασθενών και των όγκων

Ένα σύνολο από μελετήθηκαν 168 ασθενείς που έλαβαν ριζική εκτομή μεταξύ Ιανουαρίου 1999 και Δεκεμβρίου 2005. Τα χαρακτηριστικά όλων των ασθενών που συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 54,6 έτη (SD, 14,3). Η διάμεση διάρκεια παρακολούθησης ήταν 84 μήνες (εύρος, 4-146). Ογδόντα πέντε όγκους (50,6%) βρίσκονταν στο κόλον. Δέκα από τα 168 όγκων (6,0%) ήταν Τ1 ή Τ2. Ενενήντα τέσσερις όγκοι ήταν ΤΝΜ σταδίου Ι-ΙΙ (56.0.0%). Ο διάμεσος αριθμός των αλιευόμενων λεμφαδένων ήταν 19 (εύρος από 0 έως 48). τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Cry1 χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Cry1 χρωματίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα και την πυρηνική περιοχές των κυττάρων. έκφραση πρωτεΐνης High Cry1 ανιχνεύθηκε σε 101 δείγματα (60,1%) και ασθενή ή αρνητική χρώση παρατηρήθηκε σε 67 δείγματα όγκου (39,9%, Εικόνα 1).

Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημική εικόνες ορθοκολικού δειγμάτων καρκινικού ιστού που δείχνει αρνητικά ή ασθενώς ανιχνεύσιμη χρώση Cry1 (Α και Β)? μέτρια χρώση Cry1 (C)? και ισχυρή χρώση Cry1 (D) δείχνονται. Η μεγέθυνση είναι χ 200 (Α, Β, Γ και Δ).

Η

Cry1 υπερεκφράζεται σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς

έκφραση Cry1 mRNA σε καρκίνο του παχέος εντέρου διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας RT- PCR? αναλύσεις των Cry1 mRNA εκτελέστηκαν σε δέκα ζεύγη του παχέος δείγματα καρκίνου και των γειτονικών δειγμάτων noncancerous ιστού. Cry1 mRNA εκφράστηκε σε υψηλότερα επίπεδα σε οκτώ από τα δείγματα ορθοκολικού καρκίνου ιστού από ότι σε γειτονικό noncancerous ιστούς. Η διαφορική υψηλή έκφραση κυμαίνονταν από 1,1 φορές έως 13,1 φορές (Σχήμα 2D). Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, Cry1 πρωτεΐνη επίσης επάνω ρυθμίζονται σε ορθοκολικούς καρκίνους σε σύγκριση με τα αντίστοιχα δείγματα ιστών ελέγχου (Σχήμα 2Α-C).

(Α) Ένα αντιπροσωπευτικό εικόνας της χρώσης Cry1 σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς δείχνεται. (Β) Ένα αντιπροσωπευτικό της εικόνας της χρώσης Cry1 σε παρακείμενες noncancerous ιστούς δείχνεται. επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης (C) Cry1 ήταν υψηλότερη σε ιστούς όγκου σε σύγκριση με γειτονικό ιστό ελέγχου όπως ανιχνεύεται με ανοσοστύπωμα (μέση ± SEM? n = 109? * **

P

& lt? 0.001). (Δ) Μέσο T /N αναλογίες της έκφρασης mRNA σε Cry1 ζευγαρωμένα ορθοκολικό καρκίνο (Τ) και τους ιστούς normalmucosa (Ν) ποσοστώθηκαν με qPCR και ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση της μέσης τιμής (SD) που υπολογίζεται από τρία παράλληλα πειράματα. Η μεγέθυνση είναι × 200.

Η

Σύνδεσης μεταξύ της έκφρασης Cry1 και κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές

Η συσχέτιση της έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικών μεταβλητές Cry1 αναλύθηκε περαιτέρω. έκφραση Cry1 και όλα τα άλλα κλινικοπαθολογικών παραμέτρων διαχωρίστηκαν μεταξύ τους σε δύο ομάδες. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Cry1 και τόσο το στάδιο ΤΝΜ (

σ

= 0,003) και λεμφαδένα κατάσταση (

σ

= 0,004).

μεταξύ των ασθενών 168 ορθοκολικό καρκίνο, δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Cry1 και το φύλο, την ηλικία, την τοποθεσία του πρωτογενούς μάζα, το μέγεθος του όγκου, του όγκου βαθμό διαφοροποίησης, ιστολογικό τύπο, Προεγχειρητική CA199 ή το επίπεδο CEA (

p

& gt?. 0.05)

σύνδεσης μεταξύ της έκφρασης και την επιβίωση Cry1

η εφαρμογή της έκφρασης Cry1 ως προγνωστικός δείκτης για ασθενείς CRC ερευνήθηκε επίσης. Στο τέλος της περιόδου παρακολούθησης (Μάρτιος την 1η, 2012), 32 ασθενείς είχαν πεθάνει από καρκίνο του παχέος εντέρου που συνδέονται με ασθένειες. Το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης της DFS ήταν 74,7% για την ομάδα υψηλής έκφρασης Cry1. Αυτό το ποσοστό ήταν σημαντικά χαμηλότερο από το ποσοστό επιβίωσης (89,1%) για την ομάδα χαμηλής έκφρασης (

σ

= 0,011). Ομοίως, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης του OS ήταν 77,6% στην ομάδα υψηλής έκφρασης Cry1 και 92,3% στην ομάδα με χαμηλή έκφραση (

σ

= 0,010) (Πίνακας 2 και Σχήμα 3).

Kaplan-Meier καμπύλες με μονοπαραγοντική ανάλυση (log-rank) για τους ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου με υψηλή έκφραση Cry1 (n = 101) έναντι χαμηλή ή καθόλου έκφραση Cry1 για τη συνολική επιβίωση (n = 67) (Α) και απαλλαγμένη από την ασθένεια επιβίωση (n = 67) (Β) δείχνονται. Υψηλότερη έκφραση της Cry1 συσχετίζεται θετικά με τις φτωχές patientoutcomes.

Η

Cry1 εκφράζεται έντονα στις περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές CRC

Για να διερευνήσουν τον πιθανό ρόλο των Cry1 στην ογκογένεση του καρκίνου του παχέος εντέρου, η έκφραση του Cry1 mRNA και της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε για πέντε κυτταρικές γραμμές CRC (SW480, ΗΤ29, SW620, HCT116 THC8307 και) και μια κανονική κυτταρική σειρά επιθηλίου του παχέως εντέρου, FHC. έκφραση Cry1 mRNA ήταν το πολύ 10 φορές υψηλότερη στους ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές από ότι στο FHC κύτταρα (Σχήμα 4Α). Cry1 πρωτεΐνη εκφράζεται έντονα στα ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές και μόνο ασθενώς εκφράζεται στα κύτταρα FHC (Σχήμα 4Β).

Η έκφραση του Cry1 mRNA και της πρωτεΐνης σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (SW480, SW620, ΗΤ29, THC8307, και HCT116) και FHC εξετάστηκαν με qPCR (Α) και κηλίδωση Western (Β). Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιούνται σε GAPDH. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση της μέσης (SD) που υπολογίζεται από τρεις παράλληλες πειραμάτων, *,

P

& lt? 0,05

Η

Cry1 προωθεί την ανάπτυξη του όγκου και τον πολλαπλασιασμό

στη συνέχεια, μελετήσαμε τις συνέπειες της χειραγώγησης Cry1 (μέσω κέρδος-of-λειτουργίας και απώλεια-του-λειτουργία) για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων.

εξωγενώς υπερεκφράζεται Cry1 στα κύτταρα HCT116, τα οποία έχουν χαμηλότερες ενδογενούς έκφρασης. Ο αντίκτυπος της Cry1 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ και κλωνογενείς δοκιμασίες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του Cry1 μπορεί να προωθήσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε ακαριαίο επιμόλυνση τα κύτταρα HCT116 (

ρ

& lt? 0.001, Σχήμα 5Β).. Σε αντίθεση, η ομάδα ελέγχου δεν έδειξαν καμία σημαντική επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Οι δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας έδειξε επίσης ότι η υπερέκφραση του Cry1 αύξησε σημαντικά τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν μετά από 14 ημέρες καλλιέργειας σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

σ

= 0,033, σχ. 5C, D). Η σχέση μεταξύ Cry1 και της ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων περαιτέρω με τη χρησιμοποίηση προσδιορισμών σχηματισμού αποικίας μετά Cry1 νοκ ντάουν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Ε και 5F, knockdown έκφρασης ενδογενούς Cry1 με siRNA οδήγησε σε δραματική αναστολή του σχηματισμού κλώνου από SW480 κύτταρα (

σ

= 0,007)

(Α) τα επίπεδα πρωτεΐνης Cry1 ήταν υπερεκφράζεται στα κύτταρα HCT116 και προς τα κάτω σε κύτταρα SW480. (Β) δοκιμασίες ΜΤΤ σε κύτταρα HCT116 24, 48, και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με Cry1 ή ελέγχου GFP (***, ρ & lt? 0.001). (C-D) δοκιμασία σχηματισμού αποικίας των κυττάρων HCT116 επιμολυσμένα με Cry1 ή τον έλεγχο GFP (*,

σ

= 0,033). (Ε-ΣΤ) Αναστολή της ικανότητας σχηματισμού αποικιών κυττάρων SW480 από Cry1 siRNA σε σχέση με τον έλεγχο (**,

σ

= 0,007). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, και τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα παρουσιάζονται?

μπαρ

, SD *,

P

& lt?. 0,05? **

P

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.001

Η

Cry1 προωθεί themigration του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων

Όσο για την έκφραση Cry1 συσχετίστηκε με την κατάσταση των λεμφαδένων, η επίδραση της Cry1 για τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία transwell να εξεταστούν οι επιδράσεις της υπερέκφρασης Cry1 ή διαγραφή. Στις δοκιμασίες Transwell, κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με Cry1 ή πλασμίδια ελέγχου GFP σπάρθηκαν εντός των θαλάμων, και το δυναμικό της μετανάστευσης τους προσδιορίστηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι αναλύσεις έδειξαν ότι η ικανότητα μετανάστευσης των κυττάρων HCT116 που υπερεκφράζουν Cry1 αυξήθηκε κατά 112% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

σ

= 0.019, Σχ. 6Α).

(Α) δοκιμασίες Μετανάστευση κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με Cry1 ή τον έλεγχο GFP. (N = 3, *,

σ

= 0,019) (Β) δοκιμασίες μετανάστευση κυττάρων SW480 επιμολυσμένα με Cry1-siRNA ή αρνητικό μάρτυρα. (N = 3, ***

σ

& lt? 0.001). Αντιπροσωπευτικά εικόνες φαίνεται παραπάνω, και ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά πεδίο στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία παρουσιάζονται παρακάτω. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Επιβεβαίωση ότι Cry1 προώθησε τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου αξιολογήθηκαν από την επιμόλυνση των κυττάρων με SW480 Cry1-siRNA ή αρνητικό siRNA. Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας, η ικανότητα μετανάστευσης των knock-down κύτταρα Cry1 SW480 μειώθηκε κατά 52,4% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

σ

& lt?. 0,001, σχήμα 6Β).

Cry1 προώθησε την ανάπτυξη CRC

in vivo

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις ογκογόνων ιδιοτήτων των Cry1

in vivo

, κατασκευάσαμε ένα φορέα ρετροϊού overexpressingCry1 και καθιέρωσε δύο σταθερές κυτταρικές σειρές, η οποία ήταν που ονομάζεται ctrl-HCT116 και Cry1-HCT116 (Εικ. 7Α). Αυτές οι δύο κυτταρικές γραμμές ήταν injectedsubcutaneously στα πλευρά γυμνών ποντικών. Η πρόοδος του όγκου μελετήθηκε πάροδο του χρόνου. Σε 4 εβδομάδες μετά την εμφύτευση, τα ποντίκια θανατώθηκαν, και οι όγκοι αφαιρέθηκαν. Όπως shownin Εικ. 7Β-C, ο όγκος και το βάρος των όγκων που προκύπτουν από την έγχυση των κυττάρων Cry1-HCT116 ήταν σημαντικά μεγαλύτερα και βαρύτερα από εκείνα που προέρχονται από τα κύτταρα ctrl-HCT116. Takentogether, αυτές οι παρατηρήσεις είναι συνεπείς με τις

in vitro

αποτελέσματα και δείχνουν ότι Cry1 έχει τη δυνατότητα να προωθήσει την ανάπτυξη των κυττάρων CRC

in vivo

.

(Α) Η έκφραση της Cry1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε σταθερή κυτταρική γραμμή Cry1-HCT116 σε σύγκριση με τον έλεγχο σταθερή κυτταρική γραμμή ctrl-HCT116. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) Εκπρόσωπος εικόνες των όγκων που προέρχονται από Cry1-HCT116 ή ctrl-HCT116, μετά από υποδόρια μεταμόσχευση ξένου μοσχεύματος σε άτριχα ποντίκια (Γ) Η υπερέκφραση του Cry1 προωθείται παχέος την ανάπτυξη του καρκίνου. Κύτταρα όγκου εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από 4 εβδομάδες, και ο όγκος κάθε όγκου μετρήθηκε κάθε 4 ημέρες. Μπαρ, ± SEM? *

P

& lt? 0,05, **

σ

= 0.01

Η

Συζήτηση

Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που. αξιολογούν τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Cry1 σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Σαφώς, η έκφραση Cry1 ήταν υψηλότερη σε καρκινικούς ιστούς και τα κύτταρα από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς και τα κύτταρα. Μελετήσαμε επίσης τη σχέση των επιπέδων έκφρασης των Cry1 με τα αποτελέσματα των ασθενών και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση του γονιδίου Cry1 μπορούσε να αποτελέσει χρήσιμο προγνωστικό δείκτη του λεμφαδένα μετάσταση, το στάδιο TNM και η κακή έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν συγκρίνει τα επίπεδα έκφρασης των Cry1 μεταξύ των ιστών του καρκίνου και των παρακείμενων φυσιολογικού βλεννογόνου. Μια μελέτη διαπίστωσε ότι Cry1 και άλλα κιρκαδικού γονίδιο (Cry2, Per2 και BamlI) επίπεδα έκφρασης του mRNA ήταν παρόμοιες σε καρκίνο του παχέος εντέρου και γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο [20]. Μια άλλη μελέτη διαπίστωσε ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της Cry2 και Per2 ήταν κάτω ρυθμίζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυτή η μελέτη διαπίστωσε επίσης υψηλότερη έκφραση Cry1 στο βλεννογόνο του όγκου των καρκίνων που βρίσκεται στην άπω παχέος τμήματα. επίπεδα Cry1mRNA σε ιστούς CRC ήταν επίσης σημαντικά που συνδέονται με την ηλικία και το φύλο [21] του ασθενούς. Σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών του ανθρώπου, το επίπεδο έκφρασης του mRNA Cry1 ήταν σαφώς υψηλότερη σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς [22]. Τα ευρήματά μας είναι σε μερική διαφωνία με αυτές τις μελέτες. Στη μελέτη μας, τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του γονιδίου Cry1 ήταν υψηλότερες σε καρκινικούς ιστούς από ότι σε γειτονικό noncancerous ιστό. Τα ίδια αποτελέσματα σε κύτταρα όγκου του ορθού και φυσιολογικών κυττάρων, και η υπερέκφραση του Cry1 βρέθηκε για την προώθηση της ανάπτυξης και τη μετανάστευση σε κύτταρα όγκου του ορθού. Ωστόσο, δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Cry1 και το φύλο, την ηλικία, την τοποθεσία του πρωτογενούς μάζα, το μέγεθος του όγκου, του όγκου βαθμό διαφοροποίησης, ιστολογικό τύπο, προεγχειρητική CA199 ή το επίπεδο CEA (

σ

& gt? 0,05). Τα αποτελέσματα αυτά φαίνεται να είναι λογικό για τον ακόλουθο λόγο. τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Cry1 μπορεί να σχετίζεται με ασυνέπεια με τα επίπεδα έκφρασης mRNA για αυτά τα περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ωστόσο, οι πρωτεΐνες παίζουν τον πιο σημαντικό ρόλο στις βιολογικές επιδράσεις, και εντοπίζουμε πρωτεΐνη έκφραση Cry1 στους ιστούς CRC.

Εξετάσαμε, επίσης, τις σχέσεις της έκφρασης Cry1 με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και την έκβαση των ασθενών. Τα επίπεδα πρωτεΐνης Cry1 συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με το στάδιο AJCC /ΤΝΜ (με τα υψηλότερα επίπεδα ανιχνεύθηκαν σε TNM στάδια III-IV) και η εμπλοκή λεμφαδένα (με τα υψηλότερα επίπεδα ανιχνεύθηκαν σε περίπτωση θετικών λεμφαδένων). έχουν κιρκαδικούς γονίδια εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [23]. Cry1 μεταλλαγμένα ποντίκια έχουν ένα αυξημένο επίπεδο Wee1 σε πολλούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων του ήπατος. Wee1 μπλοκ κινάσης κυτταρικής διαίρεσης με την παρεμπόδιση της μετάβασης G2-M. Υψηλή έκφραση Cry1 μπορεί να αναστέλλει την ικανότητα των Wee1 να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, παρέχοντας έτσι ένα πλεονέκτημα επιβίωσης για CRC [24] · επιπλέον, τα η πρωτεΐνη Cry1 είναι γνωστό συγκρότημα με αδενυλική κυκλάση, και η υπερέκφραση του Cry1 μειώνει την παραγωγή cAMP σε απόκριση προς PGE2, ισοπροτερενόλη, και ακόμη και η άμεση adenylyl ενεργοποιητή κυκλάσης, φορσκολίνη [25]. Μελέτες έχουν αναφέρει ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις του cAMP μπορούν να αναστείλουν την μετανάστευση και τη μετάσταση ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη. ΡΚΑ είναι μία κινάση πρωτεΐνης που σχετίζεται με το μονοπάτι σηματοδότησης cAMP. Μελέτες έχουν δείξει ότι αναστέλλει την ΡΚΑ δραστικότητα και λειτουργία του RhoA [26], [27]. RhoA είναι ένα βασικό μέλος της οικογένειας Rho των μικρών πρωτεϊνών ΟΤΡ-δέσμευσης και μεσολαβεί σηματοδότησης που σχετίζονται με κυτταροσκελετικές διευθέτηση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμό και γονιδιακή έκφραση [28], [29], [30]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι επεμβατική ανάπτυξη και μετάσταση κατεστάλησαν σε μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων (συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων CRC) όταν δραστηριότητα RhoA αναστάλθηκε [26], [31]. Τα τρέχοντα ευρήματα δείχνουν ότι ένα Cry1-cAMP /PKA-RhoA μονοπάτι με τη μεσολάβηση εμπλέκεται στη μετανάστευση και την μετάσταση της CRC.

δεδομένα ανοσοχρώση μας συμφωνούν με αυτές τις μελέτες. Υψηλότερες στάδιο TNM και η παρουσία της μετάστασης λεμφαδένα συσχετίζονταν σημαντικά με υψηλότερα επίπεδα έκφρασης Cry1, γεγονός που υποδηλώνει ότι Cry1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για τον προσδιορισμό της εξέλιξης της CRC.