Abstract

εκτιμήσαμε την ικανότητα της πακλιταξέλης, ένα από τα ταξάνια, για να προκληθεί ο θάνατος σε δύο γραμμές καρκίνου του προστάτη, LNCaP και PC3. Η πακλιταξέλη οδήγησε σε αποπτωτικό μονοπάτι σε LNCaP, αλλά όχι σε κύτταρα PC3, σε απόκριση προς G2 /M σύλληψης. Η εξέταση των επιπέδων των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών αποκάλυψε ότι Bcl-XL ήταν πολύ υψηλότερη σε κύτταρα PC3 σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP και Bcl2 μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο σε κύτταρα PC3, όχι σε κύτταρα LNCaP. Να χτυπήσει κάτω Bcl-xl ενισχυμένη πακλιταξέλη απόπτωση στα κύτταρα LNCaP, ενώ ήμασταν σε θέση να χτυπήσει κάτω Bcl-XL αποτελεσματικά στα κύτταρα PC3. Σημαντικά, μια σύγκριση του ΑΒΤ-263, ένας ειδικός αναστολέας του Bcl2 και Bcl-XL, με ΑΒΤ-199, ένα Bcl2 εκλεκτικός αναστολέας, αποκαλύπτεται ότι μόνο ΑΒΤ-263, δεν ΑΒΤ-199, θα μπορούσε να επάγει απόπτωση σε LNCaP και PC3 κύτταρα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Bcl-XL έχει έναν προστατευτικό ρόλο έναντι paclitaxel επαγόμενη απόπτωση σε LNCaP και PC3 κύτταρα και υπερέκφραση του προκαλεί την αντίσταση paclitaxel παρατηρείται σε κύτταρα PC3. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε συνδυασμό με πακλιταξέλη ΑΒΤ-263 για τη θεραπεία LNCaP και PC3 κύτταρα απέδειξαν συνεργική ενεργοποίηση της απόπτωσης, υποδεικνύοντας ότι ΑΒΤ-263 θα μπορούσε να ενισχύσει την πακλιταξέλη επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα LNCaP και να ξεπεράσουν Bcl-XL υπερέκφραση για να προκαλέσει paclitaxel απόπτωση σε κύτταρα PC3. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η ενεργοποίηση της απόπτωσης σε κύτταρα LNCaP ήταν πιο αποτελεσματική από ό, τι στα κύτταρα PC3 σε απόκριση προς πακλιταξέλη συν ΑΒΤ-263 ή του ΑΒΤ-263 μόνο του, γεγονός που υποδηλώνει ότι η οδός της απόπτωσης σε κύτταρα PC3 μπορεί να έχει περαιτέρω οι διαφορές από ότι σε κύτταρα LNCaP ακόμη και μετά την Bcl-xl υπερέκφραση λογίζεται

Παράθεση:. Wang C, Huang SB, Yang MC, Lin ΥΤ, Chu IH, Shen ΥΝ, et al. (2015) Ο συνδυασμός πακλιταξέλης με ABT-263 έχει συνεργιστική επίδραση στην πακλιταξέλη ανθεκτικά κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 10 (3): e0120913. doi: 10.1371 /journal.pone.0120913

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Ανδρέας Villunger, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 3, Μάη του 2014? Αποδεκτές: 9 Φλεβάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 26 Μαρτίου του 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η έρευνα υποστηρίχθηκε από Grant EX99-9935EI (με CHC) από τα Εθνικά ερευνητικά Ινστιτούτα Υγείας της Ταϊβάν? Επιχορήγηση KMU-M103005 (σε CW) από το Ιατρικό Πανεπιστήμιο Kaohsiung. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η επίκτητη αντίσταση σε ταξάνη που σχετίζονται με χημειοθεραπεία παραμένει σημαντικό πρόβλημα για τους κακοήθεις όγκους που δείχνουν μια αρχική θεραπευτική όφελος από τη θεραπεία ταξάνης. Τα καρκινικά κύτταρα με αντίσταση ταξάνης μπορούσε υπερεκφράζουν γονίδιο ανθεκτικότητας σε πολλά φάρμακα κωδικοποιούνται για την Ρ-γλυκοπρωτεΐνης αντλία για να αυξηθεί η εκροή του ταξανίου, που οδηγεί σε ελάχιστες ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις ταξανίου [1]. Επιπλέον, αλλοίωση των χαρακτηριστικών των μικροσωληνίσκων, κυρίως με την αύξηση της δυναμικής δραστικότητας των μικροσωληνίσκων μετά τη θεραπεία ταξανίου, μπορεί επίσης να αλλάξει αποκρισιμότητα σε ταξάνες και μειώνουν την αποτελεσματικότητά τους [2,3]. Μεταλλάξεις των γονιδίων τουμπουλίνης στην θέση πρόσδεσης μικροσωληνίσκων ταξανίων μπορεί να αλλοιώσει συγγένεια δέσμευσης ταξάνιο, με αποτέλεσμα σημαντική απώλεια της αποτελεσματικότητας [4,5]. Αποκτήστε-of-λειτουργία για να εξουδετερώσει αποπτωτικά μονοπάτια θα μπορούσε επίσης να συμβάλει στην πολυφαρμακευτική αντίσταση σε καρκίνους [6,7].

Η συγκεκριμένη απόπτωση κανονιστικό πρότυπο σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι ένας κρίσιμος παράγοντας που καθορίζει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε πολλαπλές ποικιλόμορφη παράγοντες χημειοθεραπείας [8]. Εγγενής ή μιτοχονδριακή απόπτωση εμφανίζεται συνήθως σε καρκινικά κύτταρα ανταποκρίνονται σε προκαλούμενη από χημειοθεραπεία διακοπή του κυτταρικού κύκλου, περιλαμβανομένων προκαλούμενη από φάρμακα μιτωτική σύλληψη [9,10]. Η οικογένεια Bcl2, που αποτελείται από τρεις ομάδες των πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένων των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, και ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες, είναι απαραίτητη για αυτό το εγγενές απόπτωση [9]. Bcl2, Bcl-XL, Mcl-1 και Bfl1 είναι αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών. Τόσο Bax και Bak είναι προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών. ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες περιλαμβάνουν Bad, Bik, Bim, Bid, Noxa, HRK και BMF. Οι αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών περιέχουν όλα τέσσερα συντηρημένα μοτίβα αλληλουχίας, τα ομολογίας Bcl-2 (ΒΗ), τα οποία περιλαμβάνουν ΒΗ1, ΒΗ2, ΒΗ3 και ΒΗ4 [10]. Ο ρόλος τους είναι να διατηρηθεί η ακεραιότητα των μιτοχονδρίων για την υποστήριξη της κυτταρικής επιβίωσης. Οι προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών μοιράζονται αξιοσημείωτη ομοιότητα με τα αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, ειδικά στα δομικά χαρακτηριστικά των τεσσάρων BH περιοχές, ενώ διαταράσσουν μιτοχονδριακή ακεραιότητα για να προκαλέσει απόπτωση. Τέλος, οι ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες έχουν μόνο μια περιοχή ΒΗ3 να μοιράζονται μεταξύ τους και με τα αντι-αποπτωτικά και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών [11]. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτή η κοινή περιοχή ΒΗ3 των ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες αποτελεί περίπου το 26-υπόλειμμα αμινοξέων και σχηματίζει μία αμφιπολική α-έλικα για να αλληλεπιδρούν με και την αδρανοποίηση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών [12]. Δεσμεύει ενδεχομένως επίσης παροδικά Βαχ και Bak για την ενεργοποίηση τους [13].

Πρόσφατα, αρκετές ενώσεις έχουν αναπτυχθεί ως ΒΗ3 μιμητικά να επάγει απόπτωση μέσω αναστολής των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών [12,14]. Μέχρι στιγμής, οι πιο ισχυροί αναστολείς είναι οι Bad-όπως μιμητικά ΒΗ3, ΑΒΤ-737 και το στόμα δραστικό ανάλογο της, ΑΒΤ-263 [15-17]. Συνδέονται με Bcl-2, Bcl-XL και Bcl-w με πολύ υψηλή συγγένεια, αλλά με πολύ μικρότερη συγγένεια προς Mcl-1 ή Bcl2A1 [14,18]. Προκλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι τόσο ΑΒΤ-737 και ΑΒΤ-263 μπορεί να εκτοπίσει τα προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών από τα αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, συνεπής με BH3-μιμητική μηχανισμός θανάτωσης [19]. Η απόπτωση που επάγεται από ΑΒΤ-737 μέσω ΒΑΧ ή ΒΑΚ προτείνεται να είναι ένα on-στόχο δραστηριότητα [20]. Επιπλέον, η ευαισθησία της κυτταρικής απόκρισης στα πεπτίδια ΒΗ3 των ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες συσχετίζεται ιδιαίτερα με την ευαισθησία των κυττάρων που απειλούνται με ΑΒΤ-737 απόπτωση [21]. Σημαντικά, κλινικές δοκιμές της ΑΒΤ-263 έχουν πραγματοποιηθεί και κάποιο όφελος έχει παρατηρηθεί, κυρίως σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [22]. Επιπλέον, τόσο ΑΒΤ-737 και ΑΒΤ-263 μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εργαλεία για μηχανιστικές μελέτες της απόπτωσης [14,23]. Πρόσφατα, μια νέα ΑΒΤ, ΑΒΤ-199, έχει αναπτυχθεί με καταδειχθεί εκλεκτικότητα ειδικά για Bcl2 [24].

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε τις αποπτωτικά μονοπάτια σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη σε απόκριση σε πακλιταξέλη, ABT- 199, ΑΒΤ-263 και πακλιταξέλη συν ABT-263, χρησιμοποιώντας LNCaP και PC3 κύτταρα. LNCaP και PC3 αντιπροσωπεύουν το ανδρογόνο απόκριση και ανδρογόνο-ανεξάρτητων καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι η πακλιταξέλη πρώτα προκαλείται G2 /M σύλληψης στις δύο LNCaP και PC3 κύτταρα, αλλά απόπτωση οδήγησε μόνο σε κύτταρα LNCaP. Επιπλέον, παρατηρήσαμε Bcl2 και Bcl-XL υπερέκφραση σε κύτταρα PC3 σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP, τα οποία έχουν χαμηλά και μη ανιχνεύσιμα επίπεδα του Bcl-XL και Bcl2 αντίστοιχα. Η knockdown siRNA της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-XL αυξημένη απόπτωση σε LNCaP, αλλά δεν μπορούσε να knockdown σε κύτταρα PC3 αποτελεσματικά. Συγκρίναμε την ικανότητα των ΑΒΤ-199 και ΑΒΤ-263 για να επάγει απόπτωση και διαπίστωσε ότι μόνο ABT-263, δεν ΑΒΤ-199, θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση. Δείξαμε επίσης ότι η πακλιταξέλη σε συνδυασμό με ΑΒΤ-263 είχε συνεργιστικά αποτελέσματα επί της απόπτωσης στις δύο LNCaP και PC3 κύτταρα. Αυτό υποδηλώνει ότι ΑΒΤ-263 θα μπορούσε να βελτιώσει τα θεραπευτικά αποτελέσματα και για τις δύο paclitaxel ευαίσθητα και πακλιταξέλη ανθεκτικά καρκίνοι του προστάτη. Η ενεργοποίηση της απόπτωσης ήταν πιο αποτελεσματική σε κύτταρα LNCaP από κύτταρα PC3 σε απόκριση προς πακλιταξέλη συν ΑΒΤ-263 ή ΑΒΤ-263 μόνο του, γεγονός που υποδηλώνει ότι η οδός της απόπτωσης σε κύτταρα PC3 μπορεί να διαφέρουν περαιτέρω από ότι σε κύτταρα LNCaP, ακόμη και μετά Bcl-XL είναι λογιστικά .

Υλικά και Μέθοδοι

Ενώσεις

Paciltaxel (Sigma-Aldrich), ABT-199 (Σέλεκ) και ABT-263 (Σέλεκ) αγοράστηκαν από εμπορικές πηγές όπως υποδεικνύεται . Οι ενώσεις διαλύθηκαν σε DMSO πρώτα και αραιώνεται με μέσο καλλιέργειας σε περαιτέρω πειράματα.

Κυτταρική καλλιέργεια και συγχρονισμός

PC3 και LNCaP κύτταρα αγοράστηκαν από την Bioresource Συλλογή και Research Center (BCRC) στην Ταϊβάν . Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 4 Χ 10

5-6 × 10

5 κύτταρα ανά τρυβλίο Petri (10 cm) σε RPMI 1640 με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και αναπτύχθηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO

2. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν είτε μη συγχρονισμένα ή σε συγχρονισμό. Για το συγχρονισμό, τα κύτταρα PC3 σπάρθηκαν σε RPMI 1640 με 2 mM θυμιδίνης ορού πλούσια και επωάστηκαν για 19 ώρες. Τα κύτταρα που απελευθερώνονται από πλύση τρεις φορές με PBS και επανα-τροφοδοτήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο χωρίς ορό πλούσιο για 8 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επανα-τροφοδοτήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 2 mM θυμιδίνης για 16 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές πριν τα επόμενα στάδια. LNCaP κύτταρα στερήθηκαν τροφής εντός RPMI χωρίς ορό 1640 για 48 ώρες αφού σπάρθηκαν σε μέσο άνευ ορού πλούσια για 24 ώρες.

ροής κυτομετρική ανάλυση κυτταρικού κύκλου

PC3 και LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με paclitaxel στις υποδεικνυόμενες χρονικά σημεία μετά συγχρονισμού στο G1 /S φάσης. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και /ή διαχωρίζεται σε προσκολλημένα και αποσπασμένων κλάσματα. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν, πλύθηκαν με PBS και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη 70% επί 30 λεπτά, πλύθηκαν με PBS και φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν υπερκείμενο. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 0,05% Triton Χ-100 και RNase Α (40 μg /mL) και επωάστηκε στους 37 ° C για 1 ώρα, και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) προστέθηκε στο κυτταρικό εναιώρημα σε μία τελική συγκέντρωση 50 μg /mL για άλλη επώαση 1 ώρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, πλύθηκαν με PBS και φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν υπερκείμενο. Τέλος, τα κύτταρα επανα-ανασταλεί με PBS και αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences) με το λογισμικό (BD Biosciences).

ανάλυση ανοσοφθορισμού με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο

Περίπου 5 × 10

4 PC3 και 1 × 10

κύτταρα LNCaP 5 απλώθηκαν σε αποστειρωμένα γυάλινα καλύμματα 18 mm. Τα κύτταρα συγχρονίστηκαν υπό τις συνθήκες που περιγράφονται παραπάνω στην ενότητα συγχρονισμό κυττάρου. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με διαφορετικές ενώσεις στις ενδεικνυόμενες χρονικές πορείες, στερεώθηκαν σε μεθανόλη (-20 ° C, 10 min) και διάτρητη με 0.1% triton Χ100 (25 ° C, 2 min). Τα κύτταρα αποκλείστηκαν σε 3% βόειο ορό αλβουμίνης-TBS και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με πρωτεύον μονοκλωνικό αντίσωμα α-τουμπουλίνης (Sigma-Aldrich) που ακολουθείται από δευτερογενή αντισώματα, συζευγμένα με φθορισμοφόρο (Invitrogen). Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με αντιξεθωριάσματος αντιδραστήριο με ϋΑΡΙ (Invitrogen) ανάποδα σε γυάλινες πλάκες. Ομοεστιακή εικόνες μικροσκόπιο ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ομοεστιακού μικροσκοπίου (Olympus) και ενισχύεται από εκατό φορές.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Περίπου 1 × 10

5 PC3 κύτταρα ή 2 × 10

5 κύτταρα LNCaP σπάρθηκαν σε ένα δίσκο petri 10 cm. Αμφότερα τα κύτταρα PC3 και LNCaP συγχρονίστηκαν και εκτέθηκαν σε ενδεικνυόμενης ένωσης θεραπείες για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και διαχωρίζεται σε προσκολλημένα και αποσπασμένων κλάσματα. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν και χρωματίστηκαν σε 100 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης V με 100 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου και 100 μg /mL συζευγμένο με FITC Annexin V αντισώματος (Strong Biotech) επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την ανάλυση FACS.

Ανοσοκηλίδωση

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (250 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% ΝΡ-40, 1 mM EDTA, 10 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 0,1 mM Να

3νο

4Η, 1 δισκίο αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ, 1 mM NaF, 50 mM HEPES, ρΗ7.4, 50 ml). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με BCA Protein Assay Kit (Pierce). Περίπου 100 μg πρωτεΐνης ανά πηγάδι υποβλήθηκε σε SDS-PAGE. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Οι μεταφέρονται μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% (w /v) σκόνη άπαχου γάλατος ή 5% (w /v) BSA σε TBS (0.5 Μ NaCl, 20 mM Tris-HCl, ρΗ 7,4) με 0,1% (ν /ν) Tween 20 και ανιχνεύτηκαν για το πρώτο αντίσωμα, που ακολουθείται από επώαση με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (αντι-κουνελιού, αντι-ποντικιού? Jackson ImmunoResearch) και οπτικοποίηση με ένα κιτ ανίχνευσης (Pierce) με ανάπτυξη φωτογραφικό φιλμ. Τα πρώτα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν ως ακολούθως: αντι-ακτίνης αντίσωμα (Millipore), αντι-αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) και -α-τουμπουλίνης αντίσωμα (GeneTex), αντι-ΒοΙ-Χι αντισώματος (Abcam), Αντι-Bak, -Bax, -Bcl2, -Bim, -caspase 3, -caspase 3 (Α), – κασπάσης 7 (Α), – Mcl-1, -πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) και-PARP (C) αντίσωμα (κυτταρική σηματοδότηση). εικόνες Ανοσοστύπωμα ποσοτικοποιήθηκαν με ποσοτική λογισμικού (ΝΙΗ).

Συνανοσοκατακρήμνιση

Σύνολο κυτταρολύματα των LNCaP ή PC3 κύτταρα πακλιταξέλη αγωγή ή τον έλεγχο παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό Chaps (5 mM MgCl

2, 137mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Chaps, 20mM Tris-HCl (ρΗ 7.5)), και αναστολείς πρωτεάσης. Περίπου 500 μg πρωτεϊνών ανοσοκαταβυθίστηκαν με Bcl-XL αντίσωμα (Abcam) στους 4 ° C για 2 ώρες. Τα ανοσοϊζήματα συλληφθεί από 50 μΐ του πολτού σφαιριδίων Α-μαγνητικό πρωτεΐνης (Millipore) σε ρυθμιστικό Chaps στους 4 ° C για όλη τη νύχτα. Τα ανοσοϊζήματα στη συνέχεια ανακτήθηκαν με μαγνητική βάση και πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμιστικό 1% Chaps. Ανοσοκαταβύθισης εκλούστηκαν με ρυθμιστικό δείγματος SDS-PAGE, υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και στη συνέχεια ανοσοστύπωση.

Bcl-XL, Bim και Mcl-1 γκρεμίζω με siRNA

PC3 ή LNCaP κύτταρα ήταν σπάρθηκαν σε 4 Χ 10

5-6 × 10

5 κύτταρα ανά τρυβλίο Petri (10 cm) για 24 ώρες σε 7 ml RPMI 1640 με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και αναπτύχθηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO

2. Bim (Qiagen), Bcl-XL και η MCL-1 (Invitrogen) siRNA προεπωάστηκε σε μέσο καλλιέργειας 1 ml χωρίς ορό πριν από την επιμόλυνση, και στη συνέχεια 40 μΙ αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Qiagen) προστέθηκε στο ίδιο μέσο καλλιέργειας, αναμίχθηκαν με στροβιλισμό και επωάστηκαν για 5 ~ 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να επιτραπεί ο σχηματισμός συμπλοκών διαμόλυνσης. Η τελική συγκέντρωση siRNA ήταν περίπου 5 έως 10 nm μετά την προσθήκη τα σύμπλοκα στάγδην σε PC3 και LNCaP κύτταρα. Μετά από 24 ώρες, PC3 και LNCaP κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ηΜ πακλιταξέλης και συλλέχθηκαν στις υποδεικνυόμενες χρονικές πορείες.

Στατιστική ανάλυση

Α paired t-test χρησιμοποιήθηκε για να δείξει την στατιστική σημαντικότητα των τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας SigmaPlot 10. ** P Μετά την αγωγή με πακλιταξέλη, παρατηρήσαμε ότι ορισμένες LNCaP ή PC3 κύτταρα αποκολλώνται από τον πυθμένα του δίσκου καλλιέργειας. Έτσι συλλεγμένα κύτταρα μετά από επώαση με τις ενώσεις σε διαφορετικές χρονικές πορείες, και συλλέγονται και αναλύονται τα προσκολλημένα και αποκολλημένα κύτταρα χωριστά. Κοιτάξαμε στην υποβάθμιση της PARP στα τηρούνται και αποσπασμένων κλάσματα των LNCaP και PC3 κυττάρων σε διαφορετικές χρονικές πορείες. Η μορφή διάσπαση της PARP εμφανίστηκε στα προσκολλάται και αποκολλήθηκαν κλάσματα των κυττάρων LNCaP (Εικ. 2Β). Αυτή η μορφή εμφανίστηκε μόνο στην μονοκατοικία κλάσμα των κυττάρων PC3 σε 48 ώρες (Εικ. 2Β).

Θα πραγματοποιηθεί, επίσης, Annexin-V-FITC χρώση /PI για την αξιολόγηση του κυτταρικού θανάτου σε LNCaP ή κύτταρα PC3. Τα περισσότερα προσκολλημένα κύτταρα PC3 παρέμειναν ζωντανοί, ενώ ο προσκολλημένα κλάσμα των κυττάρων LNCaP έδειξε ένα σημαντικό ποσοστό που εμπίπτουν σε πρώιμη απόπτωση (S1 Εικ.). Για την αποσπαστούν κλάσμα, LNCaP και PC3 κύτταρα εμφανίστηκαν στα τέλη της απόπτωσης και νέκρωσης (S1 Εικ.).

Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η χρονική στιγμή της πρώιμη απόπτωση στο τηρούνται κλάσμα των κυττάρων LNCaP αντιστοιχεί στην G2 /M σύλληψη, ενώ τα κύτταρα PC3 έδειχνε πράγματι ένα φαινότυπο αντίστασης σε αγωγή με πακλιταξέλη. Ο θάνατος των μονοκατοικιών κλάσματα LNCaP και PC3 φαινόταν σχετίζονται με κύτταρο απόσπαση καθώς και κυτταρική στρες που προκαλείται από την πακλιταξέλη.

Έκφραση Bim, Bak, Βαχ, Bcl2, Bcl-XL και Mcl-1 σε LNCaP και κύτταρα PC3 μετά τη θεραπεία με πακλιταξέλη

για να ρωτήσετε γιατί 3-εξαρτώμενη κασπάσης απόπτωση συμβαίνει σε LNCaP, αλλά όχι σε κύτταρα PC3, απαντώντας σε G2 /M σύλληψη, ελέγξαμε το επίπεδο της πρωτεΐνης του Bim, Bak, Βαχ, Bcl2, Bcl-XL και Mcl-1. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το επίπεδο πρωτεΐνης Bim μειώθηκε με την πάροδο του χρόνου μετά τη θεραπεία paclitaxel σε LNCaP και PC3 κύτταρα (Σχ. 3Α). Αντίθετα, το επίπεδο πρωτεΐνης Bak, Βαχ, Bcl-XL και Mcl-1 δεν μετέβαλε σημαντικά κάτω από τις ίδιες συνθήκες (Σχ. 3Α και Β). Εμείς δεν θα μπορούσε να ανιχνεύσει οποιεσδήποτε πρωτεΐνες Bcl2 στα κύτταρα LNCaP (Σχ. 3Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα PC3 εξέφρασαν μια σημαντική ποσότητα πρωτεϊνών Bcl2 με ή χωρίς αγωγή με πακλιταξέλη (Σχ. 3Β). Στη συνέχεια συγκρίνεται το επίπεδο πρωτεΐνης Bim, Bcl-XL και Mcl-1 μεταξύ LNCaP και PC3 κύτταρα. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η έκφραση του Bcl-XL και Mcl-1 σε κύτταρα PC3 είναι πολύ υψηλότερη από ό, τι στα κύτταρα LNCaP (Σχ. 3C). Ως εκ τούτου, η υπερέκφραση του Bcl2, Bcl-XL και Mcl-1 σε κύτταρα PC3 θα μπορούσε να συμβάλει στην αντοχή paclitaxel τους.

(Α) Η έκφραση του ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη Bim και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών συμπεριλαμβανομένων τόσο Bak και Bax, σε LNCaP και PC3 κύτταρα. (Β) Η έκφραση των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων Bcl2, Bcl-XL και Mcl-1 σε LNCaP κύτταρα ή PC3. Η ανάλυση ανοσοστυπώματος των κυτταρικών λυμάτων από LNCaP ή PC3 κύτταρα επεξεργασμένα με πακλιταξέλη συναρτήσει του χρόνου όπως υποδεικνύεται. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. (Γ) σύγκριση των Bim, Bcl-XL και Mcl-1 μεταξύ LNCaP και PC3 κύτταρα με /χωρίς θεραπεία paclitaxel. Η ανάλυση ανοσοστυπώματος των κυτταρικών λυμάτων από LNCaP ή κύτταρα PC3 αγωγή για 48 ώρες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. Ανοσοστύπωμα εικόνες Bim, Bcl-XL, Mcl-1 και α-τουμπουλίνης σε LNCaP και PC3 με /χωρίς αγωγή με πακλιταξέλη ποσοτικοποιήθηκαν με ImageJ. Οι αναγνώσεις, που ορίζεται ως αυθαίρετες μονάδες φωτός, του Bim, Bcl-XL και Mcl-1 κανονικοποιημένο για την ένδειξη του α-τουμπουλίνης φαίνονται στην δεξιά πλευρά. (**) Στατιστική σημαντικότητα μεταξύ δύο αναγνώσεις.

Η

Το επίπεδο Bim των LNCaP ή κυττάρων PC3 μειώθηκε δραματικά μετά την αγωγή με πακλιταξέλη, και συσχετίζεται με τον κυτταρικό θάνατο (Εικ. 3Α). Ρωτήσαμε γιατί το επίπεδο των Bim μειώθηκε σημαντικά μετά την αγωγή με πακλιταξέλη. Και πάλι, θα συλλέγονται και αναλύονται τα δεδομένα για τους τηρούνται και αποσπασμένων κύτταρα ξεχωριστά. Μειωμένη Bim εμφανίστηκε μόνο στο αποσπαστεί κλάσμα, ενώ παρέμεινε σταθερός στο προσκολλημένο κλάσμα τόσο LNCaP και PC3 κύτταρα μετά την αγωγή με πακλιταξέλη (S2 Εικ.). Έτσι, το μειωμένο επίπεδο Bim ενδέχεται να μην σχετίζονται με το ρόλο της στην αποπτωτική παθολογική οδό.

Στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν Bim εμπλέκει σε paclitaxel επαγόμενη μονοπάτι απόπτωσης σε καρκίνους προστάτη με RNAi knockdown και Συνανοσοκατακρήμνιση, αφού είναι ένα Bim κύρια ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνης που απαιτείται για την πακλιταξέλη-επαγόμενη απόπτωση σε καρκίνους του μαστού [25]. Διαφορετικό από καρκίνους του μαστού, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι Bim knockdown δεν μπορεί να επηρεάσει την πακλιταξέλη επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα LNCaP (S3 Εικ.). Επιπλέον, καμία σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ Bim και Bcl-XL παρατηρήθηκε σε ΙΡ (S3 Εικ.). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι Bim μπορεί να μην είναι ένα ουσιαστικό ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνη υπεύθυνη για την πακλιταξέλη-επαγόμενη απόπτωση σε καρκίνους του προστάτη.

Bcl-XL ή Mcl-1 knockdown ενισχύει την απόπτωση σε κύτταρα LNCaP, αλλά όχι τα κύτταρα PC3

θα ήθελα να ρωτήσω αν η υπερέκφραση του Bcl2, Bcl-XL και Mcl-1 σε κύτταρα PC3 θα μπορούσαν να συμβάλουν στην αντοχή πακλιταξέλη τους, πρέπει πρώτα να διερευνηθεί ποια από αυτά θα μπορούσαν να συμμετάσχουν στο αποπτωτικό μονοπάτι. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Bcl-XL knockdown με siRNA αύξησε σημαντικά την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και της υποβάθμισης της PARP σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 4). Mcl-1 knockdown αύξησε επίσης την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και την υποβάθμιση του ΡΑΚΡ σε κύτταρα LNCaP, αλλά η επίδρασή της δεν ήταν τόσο καλή όσο Bcl-XL knockdown (Εικ. 4). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι Bcl-XL θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την πακλιταξέλη επαγόμενη αποπτωτική παθολογική οδό σε κύτταρα LNCaP.

Bcl-XL και Mcl-1 knockdown προκάλεσε αυξημένη απόπτωση όπως αξιολογείται από την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και PARP αποικοδόμηση σε κύτταρα LNCaP, αλλά όχι σε κύτταρα PC3. LNCaP ή PC3 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με Bim, Bcl-XL ή Mcl-1 siRNA ή ομελέτα siRNA για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με /χωρίς 50 ηΜ πακλιταξέλης για 48 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδος. Κασπάσης 3 (α): η δραστική μορφή της κασπάσης 3. PARP (c): υπό μορφή διάσπασης της PARP. Bcl-XL (s): η σύντομη έκθεση εικόνας του Bcl-XL. Bcl-XL (L): η μεγάλη εικόνα έκθεση του Bcl-XL. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. Οι αντίστοιχες αναγνώσεις των εικόνων ανοσοστυπώματος του Bcl-XL, Mcl-1 και κασπάσης 3 (α) κανονικοποιημένη προς α-τουμπουλίνης σε κύτταρα LNCaP δείχνονται στο κάτω μέρος. Μόνο νοκ ντάουν με /χωρίς θεραπεία πακλιταξέλη μετρήθηκε ποσοτικά. (**) Στατιστική σημαντικότητα μεταξύ δύο αναγνώσεις.

Η

Στη συνέχεια εκτελούσε τις ίδιες δοκιμασίες σε κύτταρα PC3. Είχαμε δυσκολία να χτυπήσει κάτω Bcl-xL αποτελεσματικά σε κύτταρα PC3, πιθανώς λόγω του υψηλού επιπέδου αυτής της πρωτεΐνης (Εικ. 4). Αντίθετα, το επίπεδο της πρωτεΐνης των Mcl-1 μειώθηκε σημαντικά από siRNA της, αλλά αυτό knockdown δεν είχε καμία επίδραση στην ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και της υποβάθμισης των ΡΑΚΡ σε κύτταρα PC3 (Εικ. 4).

Η υπερέκφραση της Bcl-XL συνέβαλαν τα μέγιστα στην ανθεκτική πακλιταξέλη φαινότυπο σε κύτταρα PC3

από τη στιγμή που δεν θα μπορούσε αποτελεσματικά γκρεμίζω Bcl-xl να αξιολογήσει τα αποτελέσματά της στην πακλιταξέλη απόπτωση στα κύτταρα PC3, εναλλακτική προσέγγιση μας ήταν να χρησιμοποιήσει ABT -263 για χημική knockdown του Bcl2 και Bcl-XL ταυτόχρονα. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε ΑΒΤ-199, ένας ειδικός αναστολέας του Bcl2, να γίνει διάκριση μεταξύ Bcl2 και Bcl-XL σε κύτταρα PC3. Χρησιμοποιώντας ΑΒΤ-263 που επάγεται την αποικοδόμηση της PARP και την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 σε αμφότερα LNCaP και PC3 κύτταρα (Εικ. 5Α). Ωστόσο, η επίδραση της ΑΒΤ-263 σε κύτταρα LNCaP ήταν περίπου 3 φορές μεγαλύτερη από ό, τι για PC3 από την άποψη της κασπάσης 3 ενεργοποίησης (Εικ. 5Α). Σημαντικά, ΑΒΤ-199, δεν εμφανίζει καμία αποπτωτική επίδραση ούτε LNCaP και PC3 κύτταρα, αποκλείοντας ένα αντι-αποπτωτικό ρόλο των Bcl2 σε PC3.

(Α) ΑΒΤ-263, αλλά όχι ΑΒΤ-199, θα μπορούσε ενεργοποιούν αποτελεσματικά αποικοδόμηση ΡΑΚΡ σε LNCaP και PC3 κύτταρα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά θα μπορούσε να ενεργοποιήσει μόνο κασπάσης 3 σε ένα ανιχνεύσιμο επίπεδο σε κύτταρα LNCaP. Η ανάλυση ανοσοστυπώματος των κυτταρικών λυμάτων από LNCaP ή κύτταρα PC3 αντιμετωπίζονται από ΑΒΤ-199 ή ΑΒΤ-263 μόνος επί 48 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις αναλύθηκαν όπως υποδεικνύεται. Κασπάσης 3 (α): η ενεργοποιημένη μορφή της κασπάσης 3. Caspase 7 (α): η μορφή ενεργοποίηση της κασπάσης 7. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. Οι αναγνώσεις της κασπάσης 3 (α) ρυθμίζεται σύμφωνα με GAPDH μεταξύ LNCaP και PC3 κύτταρα σε επεξεργασία με 5 μΜ του ΑΒΤ-263 δείχνονται στο κάτω μέρος. (**) Στατιστική σημαντικότητα μεταξύ δύο αναγνώσεις. (Β) Ο συνδυασμός των 50 ηΜ πακλιταξέλης με διάφορες συγκεντρώσεις ΑΒΤ-263 είχε μια συνεργιστική επίδραση επί της απόπτωσης τόσο LNCaP και PC3 κύτταρα. Η αποτελεσματικότητα της ΑΒΤ-263 σε συνδυασμό με πακλιταξέλη σε κύτταρα LNCaP ήταν υψηλότερη από ό, τι στα κύτταρα PC3. Η ανάλυση ανοσοστυπώματος των κυτταρικών λυμάτων από LNCaP ή κύτταρα PC3 θεραπεύονται με paclitaxel σε συνδυασμό με ΑΒΤ-263 ή ΑΒΤ-263 μόνος επί 48 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις αναλύθηκαν όπως υποδεικνύεται. Κασπάσης 3 (α): η ενεργοποιημένη μορφή της κασπάσης 3. Caspase 7 (α): η μορφή ενεργοποίηση της κασπάσης 7. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται. Οι αντίστοιχες αναγνώσεις της κασπάσης 3 (α) κανονικοποιημένη με τον εσωτερικό έλεγχο, α-τουμπουλίνης ή GAPDH σε LNCaP ή PC3 με LNCaP φαίνονται στο κάτω μέρος. (**) Στατιστική σημαντικότητα μεταξύ δύο αναγνώσεις.

Η

Συλλογικά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η Bcl-XL είναι ο πιο σημαντικός παράγοντας στην απόπτωση και υπερέκφραση του συμβάλλει με τον φαινότυπο αντίστασης σε αγωγή με πακλιταξέλη σε κύτταρα PC3. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι τα κύτταρα PC3 εμφανίζουν μερική αντίσταση στη θεραπεία ΑΒΤ-263 εάν η απόκριση του LNCaP στην ίδια θεραπεία θεωρείται ως πλήρες απόκριση.

Ο συνδυασμός της ΑΒΤ-263 με πακλιταξέλη επέδειξε μια συνεργική επίδραση στην απόπτωση τόσο LNCaP και PC3 κύτταρα

Έχουμε δείξει ότι ΑΒΤ-263 μόνο μπορεί να οδηγήσουν paclitaxel ευαίσθητη και πακλιταξέλη ανθεκτικά κύτταρα προς απόπτωση, αν και η πακλιταξέλη ευαίσθητη LNCaP κυτταρική γραμμή δείχνει καλύτερα αποτελέσματα από ό, τι το paclitaxel- ανθεκτική PC3 κυτταρική γραμμή. Αξιολογήσαμε περαιτέρω την επίδραση του συνδυασμού ΑΒΤ-263 με paclitaxel. Σημαντικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ΑΒΤ-263 σε συνδυασμό με πακλιταξέλη είχε μια συνεργική επίδραση επί της απόπτωσης τόσο LNCaP και PC3 κύτταρα (Εικ. 5Β). Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα αυτής της θεραπείας συνδυασμού ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα LNCaP ό, τι σε PC3 κύτταρα (Σχ. 5Β).

Η συνέργεια μεταξύ πακλιταξέλης και ΑΒΤ-263 για την ενεργοποίηση της απόπτωσης αποδεικνύεται σαφώς ότι ΑΒΤ-263 μπορεί να εξουδετερώσει Bcl-XL στην πακλιταξέλη ευαίσθητα και πακλιταξέλη ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Στόχευση αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τη χημειοθεραπεία για καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, η διαφορά στην ενεργοποίηση της απόπτωσης μεταξύ LNCaP και PC3 κύτταρα μόνο για ΑΒΤ-263 ή ΑΒΤ-263 σε συνδυασμό με πακλιταξέλη πρότεινε ότι η οδός της απόπτωσης σε κύτταρα PC3 μπορεί να διαφέρουν περαιτέρω από ότι σε κύτταρα LNCaP, ακόμη και μετά Bcl-XL είναι λογιστικά.

Συζήτηση

σε πακλιταξέλη μελέτη μας προκάλεσε πρώιμη απόπτωση στο προσκολλημένα κλάσμα των κυττάρων LNCaP σε απάντηση G2 /M σύλληψη. Αντίθετα, η πρώιμη απόπτωση δεν μπορούσε να ανιχνευθεί στην ίδια κλάσμα των κυττάρων PC3 σε όλη την πορεία του χρόνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα PC3 δεν ανταποκρίνονται στην G2 /M συλλήψεως για την κίνηση αυτού του προγράμματος το θάνατο. Είναι ενδιαφέρον, PC3 κυττάρων θάνατος επήλθε σε μια μονοκατοικία κατάσταση μετά την αγωγή με πακλιταξέλη, κυρίως μέσω της νέκρωσης. Επιπλέον, το επίπεδο Bim μειώθηκε μόνο στο μονοκατοικιών κλάσμα των δύο κυττάρων μετά την αγωγή με πακλιταξέλη. Αν η μείωση των επιπέδων Bim σχετίζεται με κυτταρικό θάνατο σε μονοκατοικία συνθήκες παραμένει προς επίλυση. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι Bim knockdown στον προστάτη και κύτταρα καρκίνου του μαστού που προκαλείται κυτταρική αποκόλληση και τελικά απόπτωση [26]. Ωστόσο, εμείς δεν παρατηρούμε το φαινόμενο που περιγράφεται στην εν λόγω έκθεση.

Είτε κυττάρων απόσπαση μπορεί να συμβεί

in vivo

σε αντι-μιτωτική θεραπείες είναι ένα ενδιαφέρον ζήτημα που μένει να καθοριστεί. Λογικά, τα καρκινικά κύτταρα που περιβάλλεται από τους συνδετικούς ιστούς μπορεί να είναι πολύ δύσκολο να αποκολληθούν από καρκινικό ιστό μετά αντι-μιτωτικές χημειοθεραπεία. Έτσι, θάνατο κυττάρου σε απόκριση προς G2 /M σύλληψης σε μια προσκολλημένη κατάσταση γίνεται το κρίσιμο σημείο για να κρίνει εάν τα κύτταρα είναι ευαίσθητα ή ανθεκτικά στην θεραπεία με πακλιταξέλη. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι τα κύτταρα LNCaP εμφανίζουν ευαισθησία στην αγωγή με πακλιταξέλη, ενώ PC3 κύτταρα εμφανίζουν αντοχή.

έδειξαν επίσης ότι η υπερέκφραση του Bcl-XL θα μπορούσαν να συμβάλουν στην απόπτωση ανθεκτικά φαινοτύπου των κυττάρων PC3. Φαίνεται ότι το σήμα απόπτωση που επάγεται από την αγωγή με πακλιταξέλη θα μπορούσε να μην επαρκεί για να αντισταθμίσει την υπερέκφραση της αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών όπως Bcl-XL σε κύτταρα PC3. Αυτό εικασίες υποστηρίζεται περαιτέρω από το συνδυασμό του paclitaxel με ΑΒΤ-263 η οποία είχε συνεργιστικά αποτελέσματα σχετικά με την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 και την υποβάθμιση της PARP σε σύγκριση με πακλιταξέλη ή ΑΒΤ-263 μόνο. ​​

Πράγματι, μια μελέτη έχει επισημάνει ότι η υπερέκφραση του Bcl-XL σε καρκίνωμα προστάτη υψηλής ποιότητας συνδέεται με μια ορμόνη-πυρίμαχο φαινότυπο [27].