Αφηρημένο

Σε διαβητικούς ασθενείς πολύπλοκη με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC), η θεραπεία με μετφορμίνη έχει αναφερθεί να έχουν διαφορετικές συσχέτιση με CRC-ειδική θνησιμότητα. Σε εργαστηριακές μελέτες, η μετφορμίνη έχει αναφερθεί να επηρεάζει την επιβίωση των καρκινικών βλαστοκυττάρων (CSCs) σε μαστού και παγκρέατος και γλοιοβλαστώματος. Αν και ΚΕΠ παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην αντίσταση σε 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) χημειοθεραπεία σε ασθενείς CRC, την επίδραση της μετφορμίνης επί ΚΕΠ σε ασθενείς CRC και την συνεργική δράση της μετφορμίνης σε συνδυασμό με 5-FU σε ΚΕΠ δεν αναφέρονται. Στην παρούσα μελέτη παθολογικές εξετάσεις έγιναν σε 86 ασθενείς CRC περιπλέκεται με ΣΔ τύπου 2 οι οποίοι είχαν χωριστεί σε μια ομάδα της μετφορμίνης και ενός μη-μετφορμίνη ομάδα. Συγκρίσεις όσον αφορά παθολογικές τύπου, συχνότητα εμφάνισης μετάστασης, η έκφραση του CD133 και β-κατενίνης διεξήχθησαν μεταξύ των δύο ομάδων. Ερευνήσαμε τις συνεργιστικές επιδράσεις της μετφορμίνης σε συνδυασμό με 5-FU επί του πολλαπλασιασμού, κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και το ποσοστό των CD133 + ΚΕΠ των καρκινικών κυτταρικών σειρών ανθρώπινου ορθοκολικού SW620. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία με μετφορμίνη είχε αντίστροφη συσχετίσεις με το ποσοστό των ασθενών με πτωχά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, το ποσοστό των CD133 + ΚΕΠ σε ασθενείς CRC με ΣΔ τύπου 2. Η μετφορμίνη ενίσχυσε τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της 5-FU επί CD133 + ΚΕΠ σε κύτταρα SW620. Τα ευρήματα αυτά παρέχουν ένα σημαντικό συμπλήρωμα στην προηγούμενη μελέτη. Η αναστολή του πολλαπλασιασμού των CD133 + ΚΕΠ μπορεί να είναι ένας πιθανός μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για τη σύνδεση της χρήσης μετφορμίνης με βελτιωμένα αποτελέσματα CRC σε ασθενείς CRC με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2

Παράθεση:. Zhang Υ, Guan Μ, Zheng Ζ, Zhang Q , Gao F, Xue Υ (2013) Επιδράσεις των μετφορμίνη για CD133 + καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα σε διαβητικούς ασθενείς. PLoS ONE 8 (11): e81264. doi: 10.1371 /journal.pone.0081264

Επιμέλεια: Chunming Liu, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Ιουλίου, 2013? Αποδεκτές: 2 Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 21, Νοεμ, 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την επαρχία Industrial Technology Research anddevelopment Έργα, ΟΧΙ. (2010) 207 και το Ταμείο Έρευνας της Guangdong Φαρμακευτικού Συλλόγου για την φαρμακευτική αγωγή του διαβήτη τύπου 2, NO. 2012C07, Guangdong, Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Διαχείριση των διαβητικών ασθενών περιπλέκεται με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια μεγάλη πρόκληση για τους κλινικούς ιατρούς. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο σακχαρώδης διαβήτης (DM) συνδέεται στενά με τη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου, ιδιαίτερα του γαστρεντερικού κακοήθειας [1,2]. Μια μετα-ανάλυση 15 μελετών στις οποίες συμμετείχαν συνολικά πάνω από 2,5 εκατομμύρια άτομα, έδειξαν ότι ο διαβήτης συσχετίστηκε με 30% περίσσεια κινδύνου CRC [3]. Επιπλέον, ο διαβήτης συνδέεται σημαντικά με αυξημένη συνολική και CRC-ειδική θνησιμότητα [4,5], ενώ η μετφορμίνη (1,1-διμεθυλο υδροχλωρικό διγουανίδιο), η πιο ευρέως ταχθείσας από του στόματος αντιδιαβητικά φάρμακο για ΣΔ τύπου 2 [6,7], μπορεί να μειωθεί κίνδυνο καρκίνου και CRC-ειδική θνησιμότητα σε διαβητικούς ασθενείς [8]. Συσσωρευμένες αποδείξεις υποδεικνύουν ότι η μετφορμίνη μπορεί να είναι ένα δυναμικό φάρμακο για την χημειοπρόληψη του CRC σε διαβητικούς ασθενείς. Στην προηγούμενη μελέτη μας, η μετφορμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη του SW-480 κύτταρα επωάζονται με ή χωρίς τελικά προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (AGEs) και ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση της κυκλίνης D1 και η δράση της τελομεράσης [9,10]. Οι αντινεοπλαστικοί επιδράσεις της μετφορμίνης έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με την ενεργοποίηση του ΑΜΡ-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (ΑΜΡΚ) οδό σηματοδότησης, η βελτίωση της αντίστασης στην ινσουλίνη και υπερινσουλιναιμία [11,12].

Πιο πρόσφατα, ένα άλλο πλεονέκτημα της αντινεοπλαστική μετφορμίνη έχει αναφερθεί. Θα μπορούσε να αναστέλλουν την επιβίωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ, ογκογενή βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν: TISCs) στο στήθος, και του παγκρέατος και γλοιοβλαστώματος in vitro [13,14]. Όπως ΚΕΠ έχουν τη δυνατότητα να ξεκινήσει και να στηρίξει την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων, είναι υπεύθυνοι για την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και την επανάληψη των καρκίνων, στην οποία μπορούν να συμμετέχουν Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι [15,16]. CD133-θετικά κύτταρα (CD133 +) που διαχωρίζεται από CRC παρουσιάζουν τις ιδιότητες των ΚΕΠ, όπως αυτο-ανανέωση και υψηλής ογκογόνο δυναμικό. Στον καρκίνο του μαστού, CD133 έχει αναφερθεί ως ένας χρήσιμος δείκτης για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας και της επανάληψης [17]. Παρόμοια ρόλοι του CD133 έχουν επίσης ταυτοποιηθεί σε CRC. Το υψηλό ποσοστό των κυττάρων CD133 + ήταν υψηλή συσχέτιση με κακή συνολική επιβίωση (OS) σε ασθενείς CRC [18]. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία έρευνα για το συσχετισμό μεταξύ της θεραπείας μετφορμίνης και η αναλογία των CD133 + ΚΕΠ σε ασθενείς CRC.

Επιπλέον, δεν υπάρχει καμία έρευνα είτε στη συσχέτιση μεταξύ της θεραπείας και της μετφορμίνης 5-φθοροουρακίλη (5-FU) χημειοθεραπείας. Η μετφορμίνη έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι έχει ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα σε συνδυασμό με κάποια χημειοθεραπεία [19,20]. 5-FU, μια πρώτη γραμμή χημειοθεραπευτικό φάρμακο για τους ασθενείς CRC, χρησιμοποιείται συνήθως σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα για την ενίσχυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας, δεδομένου ότι η αντίσταση σε 5-FU πιθανόν συμβαίνει σε ασθενείς με προχωρημένο CRC και συχνά οδηγεί στην αποτυχία της χημειοθεραπείας [ ,,,0],21]. Ως εκ τούτου, θα πρέπει να διερευνηθεί κατά πόσον η μετφορμίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με 5-FU για την ενίσχυση της αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του 5-FU επί CRC. Λαμβάνοντας υπόψη το σημαντικό ρόλο των ΚΕΠ στην πρόοδο του όγκου υποθέσαμε ότι ο θετικός ρόλος της μετφορμίνης σε CRC μπορεί να συνέβαλε εν μέρει να αντιπολλαπλασιαστική επίδρασή της στην ορθοκολικού ΚΕΠ.

Για να αποσαφηνίσει τον τρόπο με μετφορμίνη επηρεάζει την παθογένεια και την παθολογική εξέλιξη της CRC με ΣΔ τύπου 2, εξετάσαμε τις ενώσεις της μετφορμίνης με την παθολογική είδος και τη συχνότητα της μετάστασης του CRC σε διαβητικούς ασθενείς περιπλέκεται με CRC και το αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα της μετφορμίνης επί του παχέος ΚΕΠ (CD133 +), καθώς και. Για να κατανοήσουμε πώς η μετφορμίνη συνεργικά με 5-FU να επηρεάζει την κυτταρική συμπεριφορά του CRC, εξετάσαμε τις συνεργιστικές επιδράσεις της μετφορμίνης για την έκφραση των κυττάρων CD133 + σε συνδυασμό με 5-FU in vitro.

Υλικά και Μέθοδοι

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Nanfang Νοσοκομείο, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

Η επιτροπή δεοντολογίας της Nanfang Νοσοκομείο παραιτηθεί από την ανάγκη για συγκατάθεση των ασθενών δεδομένου ότι τα δείγματα προέρχονται από την τράπεζα ιστών του τμήματος παθολογίας, Nanfang Νοσοκομείο, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

1.1.1 ασθενείς και το σχεδιασμό της μελέτης

Ένα σύνολο από 187 ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 υποβλήθηκαν σε εκτομή του CRC σε Nanfang Νοσοκομείο, Νότια Ιατρικό Πανεπιστήμιο στο Guangzhou, Κίνα μεταξύ Ιανουαρίου 2010 και Ιουνίου 2012. Τα ιατρικά αρχεία των ασθενών αυτών ανακτήθηκαν για την επιδημιολογική διερεύνηση των δημογραφικών στοιχείων τους και κλινικά χαρακτηριστικά. Η χρήση άλλων διαβητικά φάρμακα (σουλφονυλουρίες, θειαζολιδινοδιόνες, αναστολείς α-γλυκοσιδάσης, ινσουλίνη, και ούτω καθεξής) ερευνήθηκε επίσης. Η μέση ηλικία ήταν 64 χρονών (που κυμαίνονται 29 έως 87 ετών) και 119 (63,64%) των ασθενών ήταν άνω των 60 χρονών. 88 (47,06%) των ασθενών που είχαν πρόσφατα διαγνωστεί ΣΔ τύπου 2. Η διάρκεια της DM λιγότερο από 5 ετών και άνω 5ετίας αντιπροσώπευαν το 26,74% (50/187) και 22.99% (43/187), αντίστοιχα. Οι άλλοι (6/187, 3,21%) δεν είχαν σαφείς πληροφορίες σχετικά με τη διάρκεια της DM. Τέλος, 86 ασθενείς με πλήρη ιατρικά αρχεία εγγράφηκαν στη μελέτη αυτή και χωρίστηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με τη χρήση της μετφορμίνης. Στην ομάδα της μετφορμίνης υπήρχαν 36 ασθενείς που είχαν χρησιμοποιηθεί συστηματικά μετφορμίνη πριν CRC τη διάγνωση και τη μη-μετφορμίνης ομάδα υπήρχαν 50 ασθενείς. Παθολογική δείγματα των 37 ασθενών που είχαν υποβληθεί ούτε χημειοθεραπεία ούτε ακτινοθεραπεία πριν από την εκτομή της CRC ανακτήθηκαν για ανοσοϊστοχημική εξέταση από τις εκφράσεις του CD133 και β-κατενίνης.

Οι δύο ομάδες συγκρίθηκαν σε σχέση με δημογραφικά, κλινικά χαρακτηριστικά και εργαστηριακά ευρήματα. δημογραφικά στοιχεία του ασθενούς και τα κλινικά χαρακτηριστικά περιλαμβάνονται η ηλικία κατά τη διάγνωση, το φύλο, τη διάρκεια του σακχαρώδη διαβήτη, δείκτη μάζας σώματος (ΒΜΙ), συστολική /διαστολική αρτηριακή πίεση (ΣΑΠ /ΔΑΠ). Εργαστηριακά ευρήματα περιλαμβάνονται η γλυκόζη πλάσματος νηστείας (FPG), αιμοσφαιρίνη A1c (HbA1c), ούρα αίμα αζώτου (BUN), κρεατινίνη (CR), τριγλυκερίδια (TG), της ολικής χοληστερόλης (Τ-Chol), χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης χοληστερόλης (LDL), πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης χοληστερόλης (VLDL) και χοληστερόλη λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL), καθώς και οι πληροφορίες που αφορούν τη διάγνωση CRC, περιλαμβανομένης της ιστολογίας, διαφοροποίησης και μετάσταση. Η ημερομηνία της CRC διάγνωση ορίστηκε ως η ημέρα της οριστική παθολογική διάγνωση.

1.1.2 Ανοσοϊστοχημική Εξετάσεις

δείγματα ιστού από κάθε ασθενή από τους 37 ασθενείς είχαν καθοριστεί σε φορμόλη και ενσωματωμένο σε παραφίνη. Επόμενη οι τομές παραφίνης αποπαραφινοποιήθηκαν πριν, αυτά θερμάνθηκαν επί 20 λεπτά στους 105 ° C σε ρυθμιστικό ανάκτηση αντιγόνου (Jinqiao Zhongshan BioTech, Πεκίνο, Κίνα). Μετά από αποκλεισμό με 10% ορό κατσίκας, τα πλακίδια επωάστηκαν με πρωτογενή μονοκλωνικά αντισώματα αντίστοιχα έναντι CD133 (BIOS, Κίνα, αραίωση 1: 150) και β-κατενίνης (Cell Signaling Technology, USA, αραίωση 1: 200) όλη τη νύκτα στους 4 ° C ακολουθούμενη από σημασμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Και έπειτα, τα πλακίδια αναπτύχθηκαν με diaminoben-zidine τετραϋδροχλωρική (DAB), και με αιματοξυλίνη.

1.1.3 Ανοσοϊστοχημική Εκτίμηση

Για κάθε slide, τουλάχιστον 5 πεδία (εντός του όγκου) και & gt? 500 κύτταρα αναλύθηκαν με υψηλής ισχύος (400 × μεγέθυνση) μικροσκοπία από δύο παθολόγους. Τα δείγματα ορίστηκαν ως θετικά για έκφραση CD133 αν καρκινικά κύτταρα σαφώς χρωματίστηκαν από τα αντισώματα αντι-CD133. Τα αποτελέσματα ταξινομήθηκαν σε δύο επίπεδα: & lt? 10% και ≥10% CD133-θετικά κύτταρα.

Οι εκφράσεις του β-κατενίνης επί της κυτταρικής μεμβράνης και στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες καταγράφηκαν. Α & gt? 70% έκφραση του β-κατενίνης επί της κυτταρικής μεμβράνης θεωρήθηκε φυσιολογικό, καταγράφονται ως αρνητικό (-), ενώ a & gt? 10% έκφραση του β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες θεωρήθηκε ανώμαλη, καταγράφονται ως θετικό (+ ).

1.2.1 κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων

Το ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική γραμμή SW620 αποκτήθηκε από την ATCC (USA) και διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 μέσο συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο 10% ορού (FBS? PPA, Αυστρία) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2 στους 37 ° C. 5-FU και μετφορμίνη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA. Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της μετφορμίνης σε συνδυασμό με 5-FU, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς μετφορμίνη (5 mM) για 24 ώρες, και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, εν συνεχεία αγωγή με 5-FU (5μΜ) για ένα άλλο 48 ώρες.

1.2.2 προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

κύτταρα SW620 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων πριν από την επεξεργασία με ή χωρίς μετφορμίνη ακολουθούμενη από 5-FU για 24, 48 και 72 ώρες αντίστοιχα. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με την 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ? 5 mg /ml? Sigma, ΜΟ, USA) δοκιμασίας. Μετά κατάλληλο χρόνο θεραπείας, ΜΤΤ προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 1 mg /mL, και το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε για 3 ώρες στους 37 ° C. Οι προκύπτοντες κρύσταλλοι διαλύθηκαν σε 0.04% HCl σε ισοπροπανόλη και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 562 nm. Κάθε αγωγή διεξήχθη εις τριπλούν και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

1.2.3 προσδιορισμούς κυτταρικού κύκλου

κύτταρα SW620 προ-αγωγή με μετφορμίνη για 24 ώρες ή όχι, και στη συνέχεια επεξεργάστηκε με 5-FU για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε φάση εκθετικής ανάπτυξης, και μονοκύτταρους αιωρήματα που περιέχουν 1χ106 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% αλκοόλη. κυτταρικού κύκλου παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση των πυρήνων. Ο φθορισμός του DNA δεσμευμένου ΡΙ σε κύτταρα μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με ModFit 3,0 λογισμικού (Verity Software House, Topsham, ΜΕ). Το πείραμα διεξήχθη τρεις φορές. Η αναλογία των κυττάρων στην G0 /G1, ενδο-S, και G2 /M φάσεις εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD.

1.2.4 Εκτίμηση της απόπτωσης

Η απόπτωση ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής μέσω εξέτασης της αλλαγμένης πλάσματος συσκευασία φωσφολιπιδίων μεμβράνης με λιπόφιλη βαφή Annexin V. εν συντομία, τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS πριν επαναιωρήθηκαν σε συγκέντρωση 1 χ 106 κύτταρα /mL σε ρυθμιστικό σύνδεσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Αηηβχίην: FITC Η απόπτωση Detection Kit, BD Pharmingen, CA, USA). Στη συνέχεια, 5 μΐ αννεξίνης V-FITC και 5 μί ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) προστέθηκαν σε 100 μι κυτταρικού εναιωρήματος και επωάζονται για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά την προσθήκη 400 μL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης, σημασμένα κύτταρα μετρήθηκαν μέσα σε 30 λεπτά από τη ροή FACS Calibur κυτταρομετρητή (Becton-Dickinson, Mountain View, Καλιφόρνια). Πρόωρη κύτταρα απόπτωση (Αννεξίνη V-θετικά, ΡΙ-αρνητικά), νεκρωτικά /αργά κύτταρα απόπτωση (διπλό θετικό), όπως επίσης και τα ζωντανά κύτταρα (διπλό αρνητικό) μετρήθηκαν πριν την επακόλουθη ανάλυση με λογισμικό Cell Quest (Becton-Dickinson).

1.2.5 Ανίχνευση CD133 θετικών κυττάρων

Μετά SW620 κύτταρα παρασκευάστηκαν και κατεργάστηκαν όπως περιγράφεται, τα κύτταρα του όγκου συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-CD133 (μονοκλωνικό IgG ποντικού, 1: 10 , Milteny Biotec) ή αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου IgG1 (Milteny Biotec) για 30 λεπτά στο σκοτάδι στους 2-8 ° C. χρώση CD133 αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, San Jose, CA). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η αναλογία των κυττάρων CD133 + εκφράστηκε ως μέση τιμή ± SD.

1.3 Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος + τυπική απόκλιση (SD) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS v.16.0 στατιστικού λογισμικού (Abbott Laboratories, North Chicago, IL). Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και, στη συνέχεια, unpaired Student του

t-test

χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστούν οι επιδράσεις των διαφορετικών μεταβλητών. Οι ενώσεις μεταξύ των εκφράσεων του CD133 και β-κατενίνης και κλινικοπαθολογοανατομικές παράμετροι αναλύθηκαν με τη χρήση του chi-square του Pearson (χ

2) δοκιμής και ακριβή δοκιμασία του Fisher.

P

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

2.1.1 δημογραφικά στοιχεία των ασθενών και κλινικά χαρακτηριστικά

δημογραφικά στοιχεία των ασθενών και κλινικά χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον πίνακα 1. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μετφορμίνη και μη μετφορμίνης ομάδων όσον αφορά την ηλικία κατά τη διάγνωση, την αρτηριακή πίεση, ΒΜΙ, διάρκεια του σακχαρώδη διαβήτη, FPG, HbA1c, BUN, CR, ALB, TG, T-Chol, HDL , ή τα επίπεδα VLDL στη γραμμή βάσεως, αλλά το επίπεδο της LDL ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα της μετφορμίνης σε σχέση με την μη-μετφορμίνης ομάδα (p = 0,024). Όσο για τα παθολογικά χαρακτηριστικά μεταξύ των δύο ομάδων, το ποσοστό των ασθενών με πτωχά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα στην ομάδα της μετφορμίνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στο μη-μετφορμίνης ομάδα (2,78% έναντι 16,0%, ρ = 0,048). Επιπλέον, το μακρινό ποσοστό μετάσταση στην ομάδα της μετφορμίνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στην ομάδα μη-μετφορμίνη (5,60% έναντι 21,6%, p = 0,035). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων στο μετάσταση λεμφαδένα (πίνακας 2).

Η Μετφορμίνη ομάδα (n = 36)

Μη μετφορμίνη ομάδα (n = 50)

p

Ηλικία κατά τη διάγνωση (ετών) 66.19 ± 9.8863.22 ± 9.940.725DM διάρκεια (έτη) 4,99 ± 3.685.75 ± 4.700.334BMI (kg /m

2) 22.39 ± 3.4125.09 ± 3.450.894SBP ( mmHg) 144.72 ± 21.82137.66 ± 19.230.199DBP (mmHg) 80.11 ± 9.7277.98 ± 17.720.306BUN (mmol /L) 6,92 ± 9.836.42 ± 3.780.430CR (mmol /L) 92.61 ± 69.2197.94 ± 108.490. 253ALB (g /L) 34,96 ± 6.9333.71 ± 5.760.063FBG (mmol /L) 8,63 ± 2.099.27 ± 2.950.080HbA1c (%) 6,78 ± 1.067.61 ± 1.990.083TG (mmol /L) 1,75 ± 1,282. 51 ± 3.070.132T-Chol (mmol /L) 4,44 ± 0.835.42 ± 4.260.173HDL (mmol /L) 1,25 ± 0.251.27 ± 0.850.203LDL (mmol /L) 2.27 ± 0.522.41 ± 1.070.024VLDL ( mmol /L) 0,88 ± 0.490.95 ± 0.540.741Table 1. δημογραφικά στοιχεία των ασθενών και κλινικά χαρακτηριστικά κατά την έναρξη.

CSV CSV Κατεβάστε

Η μετφορμίνη ομάδα (n = 36)

μη μετφορμίνη ομάδα ( n = 50)

σ

Παθολογικός characteristicsWell διαφοροποιούνται adenocarcinoma12 (33,33%) 13 (26,0%) 0.460moderately διαφοροποιούνται adenocarcinoma21 (58,33%) 22 (44,0%) 0.190poorly διαφοροποιούνται adenocarcinoma1 (2,78%) 8 (16,0%) 0.048mucinous adenocarcinoma2 (5,56%,) 6 (12,0%,) 0.310signet κυττάρων δαχτυλίδι carcinoma01 (2,0%,) Metastasislymph node7 (19,44%) 14 (28,0%) 0.257distant2 (5,60%) 11 (21,6%) 0.035Table 2. παθολογικές χαρακτηριστικά και μετάσταση σε δύο ομάδες.

CSV Λήψη CSV

2.1.2 εκφράσεις του CD133 και β-κατενίνης σε δείγματα CRC

Ανοσοϊστοχημική πρότυπα CD133 και β-κατενίνης εκφράσεις αναλύθηκαν δείγματα CRC . CD133 καφετί σήματα παρατηρήθηκαν στην κυτταρική μεμβράνη, ειδικά σε αυλού του και βασική επιφάνεια. Σε γενικές γραμμές, υψηλότερη ένταση χρώσης του CD133 δείχνει μεγαλύτερο ποσοστό κυττάρων όγκου CD133 + (Σχήμα 1, πλαίσιο 1). Στην ομάδα της μετφορμίνης, 15 από τους 19 CRC δείγματα (78,9%) περιείχε λιγότερο από 10% CD133-θετικά κύτταρα όγκου ενώ το άλλο 4 (21.1%) περιείχαν περισσότερο από 10% καρκινικά κύτταρα CD133-θετική. Παρά το γεγονός ότι το ήμισυ των δειγμάτων CRC (9/18, 50,0%) στην μη-μετφορμίνης ομάδα περιείχε περισσότερο από 10% καρκινικά κύτταρα CD133-θετικό,

η διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων δεν έφτασε ένα σημαντικό επίπεδο

(

p = 0,065

). (Πίνακας 3)

(Α): ασθενώς θετική ή εστιακά θετική χρώση σε 10% των κυττάρων? (Β): μέτρια ή έντονα θετική χρώση που περιλαμβάνει 10% ή περισσότερο των κυττάρων? (Γ) και (Δ): η χρώση του CD133 στην επιφάνεια του αυλού και τη βασική επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων. Πίνακας 2: (Α): κυτταροπλασματική ή πυρηνική έκφραση της β-κατενίνης ήταν απών? (Β): πυρηνική έκφραση της β-κατενίνης ήταν μικρότερη από το 10% των καρκινικών κυττάρων? (C) και (D):. Διαδεδομένη πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης

Η θετική έκφραση

*

μετφορμίνη ομάδα (n = 19)

Μη μετφορμίνη ομάδα (n = 18)

p-Value

CD1334 (21,1%) 9 (50,0%) 0.065β-catenin7 (36,8%) 13 (72,2%) 0.031Table 3. Οι εκφράσεις του CD133 και β-κατενίνης σε δύο ομάδες.

* μεγαλύτερη ή ίση με το 10% έκφραση του CD133 στα κύτταρα καταγράφηκε ως θετική? & Gt? 10% έκφραση του β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες καταγράφηκε ως θετική. CSV Λήψη CSV

Η έκφραση της β-κατενίνης ήταν σαφώς εμφανής στα κυττάρου-κυττάρου όρια και κυτταρόπλασμα στην πλειοψηφία των δειγμάτων CRC, ενώ σε κάποια από τα κύτταρα παρατηρήθηκε πυρηνική συσσώρευση της πρωτεΐνης β-κατενίνης (Σχήμα 1, πλαίσιο 2 ). Υπήρχε μια σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων στο θετικό ρυθμό έκφρασης πρωτεΐνης β-κατενίνης (p = 0.031). Ο ρυθμός πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης σε περισσότερο από το 10% των κυττάρων του όγκου ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα της μετφορμίνης σε σχέση με την ομάδα μη-μετφορμίνη (7/19, 36,8% vs 13/18, 72,2%? P = 0,031) . (Πίνακας 3)

Υπάρχει μια σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ CD133 και της έκφρασης της β-κατενίνης (p = 0,028).

Η έκφραση του CD133 συσχετίζεται με την παθολογική τύπο του CRC, αλλά δεν καταλήξουν σε σημαντικό επίπεδο (p = 0,056

). Δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ της β-κατενίνης και την παθολογική τύπο του CRC (p = 0.335).

2.2.1 αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα μόνο των 5-FU και σε συνδυασμό με μετφορμίνη σε κύτταρα SW620

In vitro, SW620 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία αντίστοιχα με μόνη 5-FU και με έναν συνδυασμό 5-FU και μετφορμίνης. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων SW620 και στις δύο ομάδες αυξήθηκε με την παράταση του χρόνου. Παρατηρήσαμε ότι προκατεργασία μετφορμίνη ακολουθούμενη από 5-FU κατεργασία ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW620 σε σύγκριση με την θεραπεία του 5-FU μόνο (1,019 ± 0,181 έναντι 1,218 ± 0,090, ρ = 0,058 για 24 έκθεση h? 1,075 ± 0,118 vs 1.644 ± 0,219, p = 0,001 για την έκθεση 48 ώρες? 1.299 ± 0.147 έναντι 1.786 ± 0.109, p & lt? 0.001 για 72 έκθεση h). (Σχήμα 2Α)

Β: Η αναλογία των κυττάρων SW620 είτε G0 /G1 ή G2 /M φάση δεν είχε προφανώς αλλάξει μεταξύ των τριών ομάδων (ρ = 0,06 και ρ = 0,248 αντίστοιχα), αλλά η μετφορμίνη προεπεξεργασία μείωσε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων SW620 σε φάση S (24,14 ± 6,01 έναντι 39,62 ± 0,88, Ρ = 0,003). **, Ρ & lt?. 0.01 για τις συγκρίσεις της θεραπευτικής αγωγής ΜΕΤ + 5-FU, αντίστοιχα με τη θεραπεία και τον έλεγχο της 5-FU

Η

2.2.2 Συνεργική επίδραση της μετφορμίνης και 5-FU επί του κυτταρικού κύκλου των SW620 κύτταρα

για να διερευνηθεί η επίδραση της μετφορμίνης σε συνδυασμό με 5-FU επί του κυτταρικού κύκλου, έχουμε προεπεξεργασμένα SW620 κυττάρων με μετφορμίνη για 24 ώρες πριν από την 5-FU κατεργασία. Στη συνέχεια, οι αναλογίες των κυττάρων SW620 σε G0 /G1, S, G2 και /φάσεις Μ αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Παρατηρήσαμε ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων στο ποσοστό των κυττάρων SW620 σε G0 /G1 ή G2 /Μ φάση (ρ & gt? 0,05), ενώ η προεπεξεργασία μετφορμίνη μείωσε σημαντικά ότι στη φάση S σε σύγκριση με την 5-FU μόνη θεραπεία (24.14 ± 6.01% έναντι 39,62 ± 0,88%, p = 0,003) (Εικόνα 2Β).

2.2.3 Επίδραση της θεραπείας ΜΕΤ + 5-FU στην απόπτωση των κυττάρων SW620

Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά από την προεπεξεργασία μετφορμίνης που ακολουθείται από κατεργασία με 5-FU σε σύγκριση με 5-FU μόνη θεραπεία (Early ρυθμός απόπτωσης: 3,50 ± 0,44% έναντι 2,33 ± 0,38%, ρ = 0,029? Late ρυθμός απόπτωσης: 11,80 ± 4,15% έναντι 5,30 ± 2,10%, ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 3Α).

*, p & lt? 0,05 και ***, σ & lt? 0.001 για συγκρίσεις μεταξύ της ομάδας ΜΕΤ + 5-FU και η μόνη ομάδα 5-FU. Β: Το ποσοστό των κυττάρων CD133 + μειώθηκε σημαντικά από το ΜΕΤ + 5-FU θεραπεία σε σύγκριση με το 5-FU μόνη θεραπεία (15.13 ± 3.43 vs 21,30 ± 1,40? P = 0,027). Οι τιμές δίνονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

2.2.4 Επιδράσεις της ΚΟΑ + 5-FU θεραπεία σε αναλογία των κυττάρων CD133 +

Το ποσοστό των κυττάρων CD133 + προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. 27,63 ± 2,58% των κυττάρων SW620 εξέφρασαν το αντιγόνο μεμβράνης CD133 και τόσο η 5-FU μόνη της και θεραπείες ΜΕΤ + 5-FU μείωσε σημαντικά την αναλογία των CD133-θετικά κύτταρα. Επιπλέον, η μετφορμίνη προεπεξεργασία επί 24 ώρες ακολουθούμενη από 5-FU θεραπεία για 48 ώρες ενίσχυσε σημαντικά την ανασταλτική δράση της 5-FU μόνη θεραπεία για την αναλογία του CD133-θετικών κυττάρων (15,13 ± 3,43 έναντι 21,30 ± 1,40? P = 0,027) (Σχήμα 3Β).

Συζήτηση

Στους ασθενείς CRC περιπλέκεται με διαβήτη τύπου 2, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η μακρινή ποσοστό μετάσταση στην ομάδα της μετφορμίνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σχέση με το μη-μετφορμίνης ομάδα (5.60% vs 21.6%, ρ = 0,035) και το ποσοστό των ασθενών με πτωχά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα ήταν σημαντικά μικρότερη στην ομάδα της μετφορμίνης σε σχέση με την μη-μετφορμίνης ομάδα (2,78% έναντι 16,0%, ρ = 0,048). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ένα άλλο πλεονέκτημα της μετφορμίνης σε ασθενείς CRC. Κατά την τελευταία δεκαετία, επιδημιολογικές μελέτες και μεγάλες, τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες δοκιμές (RCT), όπως θεσπίζοντας (A Diabetes Αποτέλεσμα Δίκη Progression) και RECORD (ροσιγλιταζόνη αξιολογούνται για καρδιαγγειακά συμβάματα και Ρύθμιση της γλυκαιμίας στον Διαβήτη), έχουν προτείνει μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ μετφορμίνης χρήση και τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου, ιδιαίτερα τον κίνδυνο ορθοκολικού καρκίνων (CRC), σε σύγκριση με άλλα αντιδιαβητικά θεραπείες [22,23]. αγωγή με μετφορμίνη οδήγησε σε μειωμένο κίνδυνο συνολικής θνησιμότητας και CRC-ειδική θνησιμότητα σε CRC ασθενείς με διαβήτη [24]. Μια μελλοντικά τυχαιοποιημένη μελέτη έδειξε ότι η θεραπεία με μετφορμίνη μείωσε τον αριθμό των ορθού φυσιολογικών κρυπτών εστίες (ACF), μια ενδοσκοπική υποκατάστατος δείκτης της CRC, σε ασθενείς χωρίς διαβήτη [25]. Σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές και ζωικά μοντέλα, θεραπεία με μετφορμίνη εξασκεί antiinvasive και antimetastasis επιδράσεις [26-29]. Ωστόσο, λίγες μελέτες απευθύνονται τις συσχετίσεις της θεραπείας μετφορμίνης με τη μετάσταση καρκίνου και με την παθολογική τύπο των καρκίνων σε ανθρώπινους πληθυσμούς. Η παρούσα μελέτη είναι μια διστακτική προσπάθεια μας να διερευνήσει αυτές τις ερωτήσεις. Η δύναμη αυτής της έρευνας είναι η παθολογική μας παρατήρηση μια υποομάδα ασθενών με διαβήτη CRC ταυτόχρονη τύπου 2, οι οποίοι λάμβαναν θεραπεία με μετφορμίνη. Βρήκαμε στερεά παθολογικά στοιχεία που να υποστηρίζουν μια αξιοσημείωτη συσχέτιση της μετφορμίνης με βελτιωμένα αποτελέσματα σε αυτούς τους ασθενείς, η οποία προκάλεσε περαιτέρω μελέτη μας σε μερικά από τους μηχανισμούς που διέπουν τη σύνδεση.

Στην προηγούμενη μελέτη μας, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων SW480 ήταν σημαντικά αναστέλλεται με κατεργασία μετφορμίνη σε μία δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο που μπορεί να οφείλεται στο κάτω ρύθμιση της έκφρασης κυκλίνης D1 και την δραστικότητα τελομεράσης με μετφορμίνη [ ,,,0],9,10]. Στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι η μετφορμίνη έχει συνεργιστικά αποτελέσματα με 5-FU στον κύκλο πολλαπλασιασμού και των κυττάρων των κυττάρων SW620. Η σημαντική ανασταλτική της ανάπτυξης και της προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της μετφορμίνης σε καρκινικά κύτταρα πιθανώς οφείλεται στην ενεργοποίηση του LKB1 /ΑΜΡΚ και την βελτίωση της αντίστασης στην ινσουλίνη [19,20,30]. Επιπλέον, Ras /Raf /μονοπάτι ΜΑΡΚ και αναγωγική μεταβολισμός γλουταμίνης έχουν επίσης αναφερθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην αντινεοπλασματική δράση της μετφορμίνης [19]. Πιο πρόσφατα, η μετφορμίνη έχει αναφερθεί ότι επηρεάζουν την επιβίωση των ΚΕΠ σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [13,14]. Οι ΚΕΠ ταυτοποιηθεί ως θεραπευτικοί στόχοι για την εξέλιξη του όγκου [31], επειδή παίζουν σημαντικό ρόλο στη γένεση και την επανάληψη των όγκων, της μετάστασης και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία ως αποτέλεσμα δύο κρίσιμες ιδιότητες: ικανότητα αυτο-ανανέωσης και διαφοροποιούνται δυναμικού σε απεριόριστη ετερογενείς πληθυσμοί των καρκινικών κυττάρων. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την επίδραση της θεραπείας μετφορμίνης στις παχέος CSCs σε CRC ασθενείς, χρησιμοποιώντας παθολογικά δείγματα τους. Βρήκαμε έτσι μια αντίστροφη συσχέτιση της θεραπείας με μετφορμίνη με CD133 + ΚΕΠ σε ασθενείς CRC. CD133 έχει πιστεύεται ότι είναι η πιο ισχυρή δείκτη επιφάνειας για ορθοκολικό ΚΕΠ. Οι ασθενείς με CD133-υψηλή έκφραση φάνηκε να έχει ένα πολύ χαμηλότερο ποσοστό του 5-ετή OS και περισσότερες πιθανότητες Τ3, 4 εισβολή όγκου, θετική Ν και η αγγειακή εισβολή από αυτούς με CD133-χαμηλή έκφραση [32].

Μετά την διαπίστωση αυτή μας τη σύνδεση των αγωγή με μετφορμίνη με το ποσοστό του CD133 + ΚΕΠ σε CRC από αυτούς τους ασθενείς, θα διερευνηθεί περαιτέρω η συνεργιστική δράση της μετφορμίνης σε συνδυασμό με θεραπεία με 5-FU σχετικά με το ποσοστό των κυττάρων CD133 + και την έκφραση της β-κατενίνης πρωτεΐνης στα κύτταρα SW620. Εμείς αποκάλυψε ότι η μετφορμίνη σε συνδυασμό με 5-FU μειώθηκε σημαντικά τόσο την αναλογία των κυττάρων CD133 + και την έκφραση της πρωτεΐνης β-κατενίνης, υποδεικνύοντας μετφορμίνη μπορεί να έχει μια συνεργιστική αντινεοπλαστική δράση για την CRC με inhibting τον πολλαπλασιασμό των ΚΕΠ μέσω της οδού β-κατενίνης. Ένα παρόμοιο αντινεοπλασματική δράση της μετφορμίνης έχει αναφερθεί στον καρκίνο του μαστού [20]. Αν και 5-FU είναι η πιο κοινή χημειοθεραπευτικό παράγοντα για τη θεραπεία της CRC, η αντίσταση σε αυτό το φάρμακο είναι πολύ κοινό σε χημειοθεραπεία ασθενών CRC. Η ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt /β-κατενίνης σε CD133 (+) ορθοκολικό ΚΕΠ μπορεί να είναι υπεύθυνη για την αντίσταση της χημειοθεραπείας σε CRCs [15,16,33]. Πρόσφατα, ΑΜΡΚ ενεργοποιητές έχουν αναφερθεί για την καταστολή του τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με αναστολή Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι [34]. Αναστολή της Wnt /β-κατενίνης οδού με AMPK μπορεί να είναι υπεύθυνη για την συνεργιστική δράση της μετφορμίνης σε συνδυασμό με 5-FU επί του πολλαπλασιασμού του ορθοκολικού ΚΕΠ. Είναι αξιοσημείωτο ότι βρήκαμε τη συνδυασμένη θεραπεία της μετφορμίνης συν 5-FU είχε σημαντικά καλύτερη αντινεοπλαστική δράση από τη θεραπεία του και μόνο 5-FU, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συνδυασμένη θεραπεία θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός κλασική χημειοθεραπεία για ασθενείς CRC, ιδιαίτερα για εκείνους που είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στην 5-FU. Φυσικά, περαιτέρω έρευνες, τόσο κλινικές δοκιμές και εργαστηριακά πειράματα, είναι απαραίτητες για την επαλήθευση αυτής της υπόθεσης.

Εν κατακλείδι, η μελέτη μας επιβεβαιώνει περαιτέρω ότι η μετφορμίνη δεν είναι μόνο ένα αντιδιαβητικό φάρμακο, αλλά επίσης μια δυνητική αντικαρκινική αγωγή. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν αντίστροφη συσχετίσεις της θεραπείας μετφορμίνης με την επίπτωση των μακρινών μεταστάσεων και κακώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, το θετικό ρυθμό CD133 και την έκφραση της πρωτεΐνης β-κατενίνης σε ασθενείς CRC με ΣΔ τύπου 2. Έχουμε αποδείξει επίσης τα συνεργιστικά αποτελέσματα της μετφορμίνης σε συνδυασμό με 5-FU επί της κυτταρικής βιολογίας και της αναλογίας των κυττάρων CD133 + in vitro. Ωστόσο, ο μηχανισμός της μετφορμίνης παρεμβαίνει με τον πολλαπλασιασμό των ΚΕΠ παραμένει υποτιμάται. Στο μέλλον, οι μελλοντικοί τυχαιοποιημένες μελέτες για τη διερεύνηση της επίδρασης της μετφορμίνης σε συνδυασμό με 5-FU για την πρόγνωση των ασθενών CRC και οι υποκείμενοι μηχανισμοί θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον καθηγητή Yanqing Ding, ο διευθυντής του Τμήματος Παθολογίας και Hongfen Shen, έναν τεχνικό στο Cancer Research Institute, Ιατρικό Πανεπιστήμιο της Νότιας Ευρώπης, Guangzhou, Κίνα. Αναγνωρίζουμε επίσης τα χρήσιμα σχόλια και τις αναθεωρήσεις αυτού του χειρογράφου από τον καθηγητή Ping Allen Liang.