Αφηρημένο

Παραδοσιακά πνεύμονα θεραπείες του καρκίνου περιλαμβάνουν χημικά ή ακτινοβολία θεραπείες μετά τη χειρουργική αφαίρεση του όγκου? Ωστόσο, αυτές οι διαδικασίες συχνά σκοτώνουν τα φυσιολογικά κύτταρα, καθώς και. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι χημειοθεραπείες, όταν συνδυάζεται με παραδοσιακών κινεζικών φαρμάκων, μπορεί να προσφέρει ένα νέο τρόπο για τη θεραπεία του καρκίνου.

χρησιμοποιήθηκαν In vitro

δοκιμές μετρώντας την επαγωγή της αυτοφαγία και /ή την απόπτωση για να εξετάσει την κυτταροτοξικότητα του SBPE, που χρησιμοποιούνται συνήθως για πνευμονική φλεγμονή στο Α549 κυτταρική γραμμή. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα της μεσοκυττάρια ρ62 και Atg12 αυξήθηκαν, LC3-Ι διασπάστηκε σε LC3-ΙΙ, και autophagy προκλήθηκε με μόνο SBPE. Μετά από 24 ώρες, το αποπτωτικό μηχανισμό προκλήθηκε. Εάν η Cisplatin προστέθηκε μετά από τα κύτταρα έφθασαν την κατάσταση αυτοφαγία, παρατηρήσαμε συνεργιστικά αποτελέσματα των δύο θα μπορούσε να επιτύχει επαρκή θάνατο των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, η δοσολογία που χρησιμοποιείται Cisplatin να επάγει απόπτωση θα μπορούσε να μειωθεί κατά το ήμισυ, και ο χρόνος που απαιτείται για να επιτευχθεί η ανασταλτική συγκέντρωση 50% ήταν επίσης το ήμισυ του αρχικού. Εκτός από την πρόκληση αυτοφαγία μέσα σε μια συντομευμένη χρονικό διάστημα, η θεραπεία SBPE και ο συνδυασμός φαρμάκων χημειοθεραπείας ήταν σε θέση να επιτύχει το στόχο της εξάλειψης της ταχείας χαμηλή δόση των καρκινικών κυττάρων. Εκτός αυτού, SBPE εφαρμόστηκε με γεμσιταβίνη ή πακλιταξέλη, και βρέθηκε ότι η θεραπεία συνδυασμού επιτευχθεί πράγματι βελτιωμένη επιδράσεις του καρκίνου του πνεύμονα σκοτώνει. Ωστόσο, SBPE μπορεί επίσης να είναι λιγότερο τοξικές για τα φυσιολογικά κύτταρα

Παράθεση:. Tseng C-Υ, Lin C-H, Wu L-Υ, Wang J-S, Chung M-C, Chang J-F, et al. (2016) Πιθανή Συνδυαστική Anti-Cancer Therapy σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα με την Παραδοσιακή Κινέζικη Ιατρική Απόσπασμα Sun-Bai-Pi και τη σισπλατίνη. PLoS ONE 11 (5): e0155469. doi: 10.1371 /journal.pone.0155469

Επιμέλεια: Ying-Jan Wang, Εθνική Cheng Kung University, Ταϊβάν

Ελήφθη: 29 Φεβ 2016? Αποδεκτές: 30, Απριλίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: May 12, 2016

Copyright: © 2016 Tseng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας (NSC-102 με 2320-B-033-001-my3) στην Ταϊβάν

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στην Ταϊβάν, περίπου 10.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα συμβαίνουν κάθε χρόνο και 7000 άνθρωποι πεθαίνουν από πνεύμονα καρκίνος ετησίως [1], η οποία είναι μεγαλύτερα από αυτά με ορθοκολικό, του τραχήλου της μήτρας, του μαστού, του προστάτη και καρκίνος του στομάχου σε συνδυασμό. Αυτοί οι αριθμοί συνεχίζουν να αυξάνονται ραγδαία κάθε χρόνο. Υπάρχουν πολλές αιτίες του καρκίνου του πνεύμονα, και πρώτα συμπτώματα δεν είναι πάντα προφανής. ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα συχνά δεν γνωρίζουν τα πρώιμα συμπτώματα και τις ευκαιρίες Μεγάλη χαμένη ευκαιρία για την έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία [2]. Σύμφωνα με το Υπουργείο Υγείας στατιστικές, το παθητικό κάπνισμα, ζεστό αναθυμιάσεις πίσσα, ακτινοβολίες, ο αμίαντος, ο καπνός του εργοστασίου, αιθάλη, πρόστιμο αιωρούμενα σωματίδια, και οι θύελλες σκόνης είναι οι κύριες αιτίες του καρκίνου του πνεύμονα [3-14]. καρκίνων του πνεύμονα ταξινομούνται ως μικρών κυττάρων ή μη-μικροκυτταρικό καρκίνωμα ανάλογα με το αν πρόκειται για μη επιθηλιακά ή επιθηλίου που προέρχεται, αντίστοιχα [15]. Μικροκυτταρικά καρκινώματα είναι ιδιαίτερα κακοήθεις και μπορούν εύκολα μετάσταση, ειδικά αν το κύτταρο-μέγεθος είναι εξαιρετικά μικρό [16]. Ως εκ τούτου, η χημική κατεργασία είναι η προτιμώμενη πορεία της θεραπείας για το καρκίνωμα μικρών κυττάρων [17-19]. Πλευρικές περιπτώσεις μπορεί να διαιρεθεί σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, αδενοκαρκίνωμα (συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος βρογχιολοκυψελιδικό, που αναφέρεται επίσης ως καρκίνωμα κυψελιδικών), καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου, αδενικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, καρκινοειδών όγκων, βρογχικό αδενοκαρκίνωμα (συμπεριλαμβανομένων αδενοκυστικό καρκίνωμα ή βλεννώδες καρκίνωμα επιθηλιακού), κ.λπ. [15, 20, 21]. Οι θεραπείες για αυτούς τους τύπους των καρκίνων περιλαμβάνουν χειρουργική εκτομή πρωτίστως συμπληρώνεται με ακτινοβολία και χημειοθεραπεία [22, 23].

Για τη θεραπεία των συμβατικών μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα μετά από χειρουργική εκτομή, χημειοθεραπεία σκοτώνει τα φυσιολογικά κύτταρα μαζί με τα καρκινικά . Όσο μεγαλύτερη είναι η χορήγηση χημειοθεραπείας συνεχίζεται, η ισχυρότερη αντίσταση που αναπτύσσεται από τα καρκινικά κύτταρα [24, 25]. Αν και αυτή η μέθοδος θεραπείας μπορεί να παρέχει το επιθυμητό αποτέλεσμα, αυξάνει επίσης τον κίνδυνο για ταυτόχρονη ασθένειες [25]. Υψηλότερες δόσεις των φαρμάκων χημειοθεραπείας που απαιτούνται κατά τη διάρκεια των τελικά στάδια καρκίνων προκειμένου να επιτευχθούν τα ίδια αποτελέσματα χαμηλότερων δόσεων χορηγείται κατά τη διάρκεια των πρώιμων σταδίων της νόσου [20]. Οι παρενέργειες των παραδοσιακών μεθόδων θεραπείας καθιστούν πιο δύσκολη και λιγότερο κατάλληλο για ασθενείς με πιο προχωρημένα στάδια του καρκίνου ή προβλήματα υγείας [26-29]. Με βάση τις παρενέργειες και τις βλάβες που προκαλούνται από αυτές τις θεραπείες, πρόσφατες μελέτες επικεντρώθηκαν στα κύτταρα του όγκου και δοθεί μεγαλύτερη προσοχή στην κυτταρική ανοσοθεραπεία, η γονιδιακή θεραπεία, φαρμακευτική θεραπεία στόχου, κλπ [30-34]. Κάποιες μελέτες προσπάθησαν να εφαρμόσουν κινέζικα φυτικά φάρμακα για τη θεραπεία του καρκίνου [35-38]. Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι πολλά κινέζικα φυτικά φάρμακα, όπως η κινεζική πουρνάρι, Thalictrum τύχη, πλουμπαγκίνη, ή Ganoderma lucidum [39-42], βρέθηκαν να μειώσει ανώμαλη φλεγμονής [43-45] και γρήγορα να προκαλέσουν απόπτωση των καρκινικών κυττάρων [46-48] .

Sun-Bai-Pi (ΣΑΠ) είναι η ρίζα φλοιός του Morus alba L. Σύμφωνα με την Εγκυκλοπαίδεια της Παραδοσιακής Κινέζικης ιατρικής «Επιτομή του Materia Medica,» ΣΑΠ είναι ένα βασικό φάρμακο που χρησιμοποιείται για την απομάκρυνση των υδρατμών από οι πνεύμονες και για τη θεραπεία της αρτηριακής φτύσιμο, θερμαινόμενη δίψα, οίδημα, πληρότητα της κοιλιάς, φούσκωμα, προβλήματα του ουροποιητικού track, ασθενικές πονοκέφαλο, την εσωτερική ανεπάρκεια ενέργειας, βήχας, φλεγμονή, διαβήτη, καρκίνο, ηπατίτιδα, και καρδιακές παθήσεις [49]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τα βασικά συστατικά της Sun-Bai Pi Απόσπασμα (SBPE) περιλαμβάνονται Morusin, Prenylflavonoid και Βενζοφουράνο [50-53]. Αυτά είναι αντιοξειδωτικά που μπορούν να μειώσουν την δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε καρκινικά κύτταρα, προκαλούν κυτταροτοξικότητα, και αναστέλλουν τη μετάσταση του καρκίνου, αλλά ο μηχανισμός δράσης τους παραμένει ακόμα ασαφής [54-57]. Ως εκ τούτου, εκτός από την διερεύνηση των μηχανισμών της SBPE που προκαλείται θάνατο των καρκινικών κυττάρων, πρέπει επίσης να δημιουργήσει ένα κατάλληλο συνεργική θεραπεία του καρκίνου που συνδυάζει κινέζικα φυτικά φάρμακα και τα φάρμακα χημειοθεραπείας. Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε ότι εκτός από την επαγωγή μακροχρόνιας απόπτωση, SBPE επάγεται επίσης αυτοφαγία σε Α549 κύτταρα καρκίνου πνεύμονα. Όταν το φάρμακο χημειοθεραπείας, σισπλατίνη, προστέθηκε στα αυτοφαγικά Α549 κύτταρα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι SBPE βελτίωσε την καρκινικό κύτταρο θανάτωση αποτελεσματικότητας των φαρμάκων χημειοθεραπείας, ακόμη και σε μειωμένες δόσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Chemical

ΣΑΠ που συλλέγονται από Di Lian Sheng Pharmaceuticals (DLSP, Ταϊβάν), το οποίο εξάγεται με ζεστό νερό για 30 λεπτά που ακολουθείται από φυγοκέντρηση, το αποθεματικό αιμοκάθαρση και η εξάντληση των πρωτεϊνών. Το σφαιρίδιο απορρίφθηκε, το υπερκείμενο συλλέγεται και αποθηκεύεται στους 4 ° C. Η σισπλατίνη, γεμσιταβίνη, πακλιταξέλη αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich.

Κυτταροκαλλιέργεια

Το ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυψελιδικά κύτταρα Α549 και φυσιολογικό πνεύμονα ινοβλάστες WI 38VA13 Υποκατηγορία 2RA ελήφθησαν από Bioresource Συλλογή και Κέντρο Ερευνών (BCRC, Ταϊβάν). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Ham F-12Κ (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Gibco) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Για τα πειράματα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SBPE για αρκετές χρονικά σημεία ή σε επεξεργασία με SBPE για 6 ώρες που ακολουθείται από την πρόσθετη έκθεση φάρμακα χημειοθεραπείας για πρόσθετα χρονικά σημεία.

δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας MTS

Η βιωσιμότητα ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας εμπορική δοκιμασία MTS αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI), μετρώντας μιτοχονδριακή ηλεκτρική αφυδρογονάση δραστηριότητα μέσω μετατροπής των MTS και phenazinemethosulfate προς φορμαζάνη. Μετά τη θεραπεία, ένα μίγμα από 10 μι υδατοδιαλυτών αντιδραστήριο κιτ συν 190 μί φρέσκου μέσου προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για επώαση 1 ώρα στους 37 ° C στο σκοτάδι. Τα υπερκείμενα (100 μΐ /φρεάτιο) συλλέχθηκαν, και η απορρόφηση της παραγόμενης φορμαζάνης μετρήθηκε στα 490 nm με microreader.

Autophagy ανοσοφθορισμού

Μετά την στερέωση και διαπερατοποίηση, μη ειδική αντιδραστικότητα αποκλείστηκε από προσθήκη 2% φυσιολογικό ορό κατσίκας με 0,02% NaN

3. Τα Α549 κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντι-LC3 (Abcam) και αντι-LAMP-1 (Abcam) μονοκλωνικά αντισώματα σε μία αραίωση 1: 200 για 24 ώρες, 4 ° C. επισημασμένο με Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ή Alexa Fluor 594 (Invitrogen) δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε και διαφάνειες καλύφθηκαν με Παρατείνει Gold (Invitrogen) αντι-fade μέσα στερέωσης πριν από τη χρήση. Όλες οι εικόνες παρατηρούνται σε ένα μικροσκόπιο Olympus IX51.

Μέτρηση της δραστικότητας κασπάσης 3

δραστικότητα Caspase εκτιμήθηκε με τη χρήση του κιτ προσδιορισμού 3/7 Caspase-Glo (Promega). Μετά την επεξεργασία SBPE, οι πλάκες καλλιέργειας απομακρύνθηκαν από τον επωαστήρα και αφέθηκαν να ισορροπήσουν σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 30 λεπτά, στη συνέχεια το 3/7 αντιδραστήριο ανιχνεύσεως Caspase-Glo (200 μλ /φρεάτιο) εφαρμόστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μονάδα σχετική φωτεινότητα (RLU) που εκπέμπεται από το προϊόν μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα microreader.

κηλίδος Western

Πρωτεΐνες (40 μg /φρεάτιο /δείγμα) διαχωρίζεται electrophorectically επί πηκτωμάτων SDS μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Η μη ειδική αντιδραστικότητα των μεμβρανών αποκλείσθηκε, και πρωτογενείς αντι-Ρ62 (Abcam), αντι-ΑΤG-12 (Cell Signaling), αντι-ρ53 (Abcam), αντι-LC3 (Abcam), αντι Bcl-2 (κυτταρική σηματοδότηση) , αντι-Βαχ (κυτταρική σηματοδότηση), αντι-Bad (Cell Signaling), αντι- α-τουμπουλίνης (Abcam) ανιχνεύθηκαν με κατάλληλες αραιώσεις. Δευτερογενής κατσίκα IgG αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού IgG συζευγμένο με HRP χρησιμοποιήθηκαν, και οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Promega ™ ECL Western Blotting Substrate) και αναλύθηκαν σχετικά με το σύστημα Οδύσσεια Infrared απεικόνισης (LI-COR Biosciences) (Lincoln, ΝΕ).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Μετά τις αγωγές, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένη αιθανόλη 75% για όλη τη νύχτα στους -20 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 300 χ g για 5 λεπτά και επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) που εργάζονται διάλυμα (100 μg /mL ΡΙ και 100 μg /mL RNaseA) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACScan κυτταρόμετρο ροής και αναλύθηκαν με χρήση λογισμικού ModFit (Becton Dickinson, CA).

Στατιστικά

Για στατιστική ανάλυση, κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές . Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσοι όροι ± SD για τρία ανεξάρτητα πειράματα, και οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Student t-τεστ με GraphPad λογισμικό στατιστικής. *, ** Και *** υποδεικνύει ρ & lt? 0,05, ρ & lt? 0,01, και ρ & lt? 0,001 σημαντική διαφορά, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο. # Και ## δείχνουν p & lt? 0,05 και p & lt?. 0.01, αντίστοιχα, σε σύγκριση με δείγματα με ή χωρίς SBPE-θεραπεία

Αποτελέσματα

τηλέφωνα Βιωσιμότητας

Χρησιμοποιήσαμε το MTS δοκιμή για την ανίχνευση της SBPE επιπτώσεις είχε στη βιωσιμότητα των κυττάρων WI 38VA13 Υποκατηγορία 2RA, φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών πνεύμονος, και Α549 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, βρήκαμε ότι 24 ώρες μετά την χορήγηση SBPE, η ζωτικότητα των κυττάρων Α549 μειώθηκε καθώς η δόση αυξήθηκε SBPE. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά την χορήγηση 5 mg /ml ήταν 85%, η IC50 επιτεύχθηκε μετά από χορήγηση 9 mg /ml, και το κύτταρο βιωσιμότητα μετά την χορήγηση 10 mg /ml ήταν 23%. Αντιθέτως, SBPE δεν έδειξε σημαντική τοξικότητα προς τα φυσιολογικά κύτταρα WI38 στη χαμηλότερη δόση που δοκιμάστηκε, αλλά σημαντική κυτταρικός θάνατος επήλθε μέσα σε 24 ώρες μετά την αγωγή με SBPE στα 5 και 10 mg /mL. Εάν δόσεις SBPE των 5 mg /mL και 10 mg /mL χρησιμοποιήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία, βρήκαμε ότι SBPE προκάλεσε σημαντική κυτταρικό θάνατο μέσα σε 24 ώρες.

(α) Οι έλεγχοι που έγιναν βιωσιμότητα κυττάρου με χορήγηση διαφορετικών συγκεντρώσεων SBPE να WI38 και τα κύτταρα Α549. (Β) Χορήγηση 5 mg /mL και 10 mg /mL του SBPE να Α549 και επωάζονται τα κύτταρα για διάφορα χρονικά σημεία. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε το αντιδραστήριο MTS να δοκιμάσουν βιωσιμότητες τους.

Η

SBPE επαγόμενη Autophagy Επίδραση Cancer Cell

Για την αξιολόγηση του μηχανισμού, υποθέτουμε ότι πριν από την θάνατο των κυττάρων, προκαλεί SBPE τα καρκινικά κύτταρα για να γίνει αυτοφαγικά. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2α και 2β, οι παρατηρήσεις μικροσκοπία φθορισμού έδειξε ότι ανεξάρτητα από τη δοσολογία SBPE. Όταν τα επάλληλα και ποσοτικοποιούνται τα δύο φθορίζοντα χρώματα, τα περιεχόμενα autolysosome σταδιακά αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου. Ως εκ τούτου, ο λόγος των autolysosome σχηματισμού για κύτταρα χορηγούνται με SBPE 10 mg /mL αυξήθηκε σημαντικά ως συνάρτηση της δόσης SBPE (Σχήμα 2β). Μετά την ενίσχυση αναλογία, η autophagosome και λυσόσωμα επικαλύπτει, υποδεικνύοντας ότι SBPE μπορεί πράγματι να μιμηθεί κύτταρα Α549 να γίνει αυτοφαγικά (Σχήμα 2γ). Η στατιστική διάγραμμα που φαίνεται στο Σχ 2d έδειξαν ότι μέσα σε 8 ώρες από SBPE (10 mg /mL) θεραπεία, το 70% των κυττάρων Α549 που παράγονται λυσοσωματικής αυτοφαγία, και ότι το ποσοστό αυξήθηκε σε 90% σε 12 ώρες. Western blots (Σχήμα 2e) έδειξε ότι η πρωτεΐνη ρ62 αυξήθηκε σημαντικά τέσσερις φορές εκείνη της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 2στ) επί 8 ώρες, και LC3-Ι διασπάστηκε σε LC3-ΙΙ κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου. Τα αποτελέσματα αυτά σημαίνουν ότι η θεραπεία SBPE που προκαλείται από τα καρκινικά κύτταρα για να γίνει αυτοφαγικά, η οποία κορυφώθηκε μέσα σε οκτώ ώρες. Επιπλέον, με τη χρήση αναστολέα αυτοφαγία, χλωροκίνη (CQ) συν SBPE (10 mg /ml), βρήκαμε το κυτταρική βιωσιμότητα ήταν σημαντικά την αποκατάσταση σε 6 ώρες και 24 ώρες μετά τη θεραπεία (S1 Σχήμα).

SBPE 5 mg /mL (α) και 10 mg /mL (β) προσετέθησαν αντίστοιχα τα κύτταρα και επωάστηκαν για 2, 4, 6, 12, και 24 ώρες. Η ανοσοχρώση χρησιμοποιήθηκε για την επισήμανση του LC3 πρωτεΐνη autophagy (πράσινο), LAMP-1 (κόκκινο), και ϋΑΡΙ (μπλε) των καρκινικών κυττάρων. Η μεγέθυνση ήταν 400Χ. (Γ) σε μεγέθυνση τα κύτταρα επωάστηκαν για έξι ώρες στους 630Χ να παρατηρηθεί η κατανομή αυτοφαγία. (Δ) Επικάλυψη του πράσινου φθορισμού (LC3) και το κόκκινο φθορισμό (LAMP-1), και υπολογίζεται ο αριθμός των κυττάρων με αυτοφαγικά λυσοσώματα. Ο κάθετος άξονας αντιπροσωπεύει τον συνολικό αριθμό των κυττάρων ανά μονάδα επιφανείας διαιρείται με τον αριθμό των κυττάρων με αυτοφαγικά λυσοσώματα. (Ε) Western blots χρησιμοποιήθηκαν για να παρατηρήσουν τα αποτελέσματα SBPE είχαν σχετικά με τη ρύθμιση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με αυτοφαγία Α549 κυττάρων, και διαπίστωσε ότι η προκαλούμενη SBPE αυτοφαγία των κυττάρων, η οποία αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου και κορυφώθηκε σε οκτώ ώρες. Όλες οι πηκτές έχουν τρέξει κάτω από τις ίδιες πειραματικές συνθήκες. (Στ) Στατιστικές αναλύσεις για τις πρωτεΐνες παραστάσεις.

Η

SBPE απόπτωση που επάγεται από

SBPE ήταν κυτταροτοξική και ο ρυθμός της επαγωγής αυτοφαγία να ενισχυθεί ως το χρόνο δοσολογία και χορήγηση αυξηθεί. Ωστόσο, παραμένει άγνωστο αν η διοίκηση της SBPE περισσότερο από 12 ώρες μπορεί να προκαλέσει τα καρκινικά κύτταρα για να γίνει αποπτωτικά. Ως εκ τούτου, η αποπτωτική πρωτεΐνη δείκτης Caspase3 /7 ανιχνεύθηκε για να διαπιστώσει εάν παράγεται πάροδο του χρόνου. Σχήμα 3α δείχνει ότι η ικανότητα απόδοσης των Caspase3 /7 στο εσωτερικό των κυττάρων Α549 είχε συμπληρώσει και ο χρόνος χορήγησης SBPE αυξηθεί. Ωστόσο, η ενίσχυση άρχισε στις 12 ώρες και έφτασε στο απόγειο ικανότητα απόδοση σε 24 ώρες. Με βάση τα αποτελέσματα παραίτηση, SBPE μπορεί πράγματι ενεργοποιήσει τον μηχανισμό της απόπτωσης μετά από 12 ώρες και μπορεί να προωθήσει των καρκινικών κυττάρων αυτοφαγία μέσα σε οκτώ ώρες. Western blots (Σχήμα 3β) έδειξε ότι οι εκδηλώσεις της ρ53 προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, Bax και Bad αυξημένη πάροδο του χρόνου, ενώ η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 μειώθηκαν σημαντικά. Σύμφωνα με το Σχ 3d, αφού τα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SBPE (10 mg /ml) για διαφορετικές χρονικές περιόδους, ένας κυτταρομετρητής ροής χρησιμοποιήθηκε για να τηρήσει την κατάσταση κατανομής των κυττάρων κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αυξημένη χρόνος έκθεσης, ο αριθμός των κυττάρων που παραμένουν στο στάδιο G1 έτεινε να αυξηθεί, και η αναλογία των κυττάρων S φάσης αυξήθηκε καθώς ο χρόνος προχωρούσε, αλλά μειώνεται μετά την επίτευξη της κορυφής στις 12 ώρες.

(α) μετά τη χορήγηση του SBPE 10 mg /mL? το αντιδραστήριο Caspase3 /7 χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει τις εμφανίσεις τους. (Β) Οι επιδράσεις που έχει SBPE για τους παράγοντες ελέγχου της πρωτεΐνης που σχετίζονται με την Α549 κυτταρική απόπτωση και αντι-απόπτωσης. Όλες οι πηκτές έχουν τρέξει κάτω από τις ίδιες πειραματικές συνθήκες. (Γ) Στατιστική διάγραμμα για την απόδοση της πρωτεΐνης. αναλύσεις (δ) FACS για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου, και η χρήση του λογισμικού ModFit LT για να αναλύσει τη διανομή του κυτταρικού κύκλου.

Η

Η σισπλατίνη και SBPE Συνδυαστική θεραπεία μπορεί να μειώσει Cancer Cell Βιωσιμότητας

Σύμφωνα με το σχήμα 4, μεταξύ 24 και 48 ώρες μετά την σισπλατίνη χορηγήθηκε σε Α549 κύτταρα καρκίνου πνεύμονα, κυτταροτοξικά αποτελέσματα του ενισχύθηκε ως η συγκέντρωση Cisplatin αυξήθηκε. Ωστόσο, τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να φθάσουν μόνο IC50 48 ώρες μετά την 25 μΜ της Cisplatin χορηγήθηκε, και η θεραπεία θα μπορούσε να προκαλέσει μόνο 33% κυτταρικό θάνατο στο σημάδι 24 ώρες. Ως εκ τούτου, υιοθετήσαμε τη μέθοδο θεραπείας συνδυασμού με την οποία SBPE χορηγήθηκε για έξι ώρες και η Σισπλατίνα χορηγήθηκε για 24 ώρες. Ο στόχος ήταν να χρησιμοποιήσει τη θεραπεία Cisplatin για να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα μετά κυττάρων αυτοφαγία έχει διεγερθεί με την ελπίδα ότι αυτή η μέθοδος συνδυασμού μπορεί να ενισχύσει σημαντικά την κυτταροτοξική δράση με παράλληλη μείωση της δόσης Cisplatin. Όπως φαίνεται στο Σχ 4α, με χορήγηση 10 μΜ και 25 μΜ σισπλατίνης για 48 ώρες μετά, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με SBPE (5 mg /mL) για έξι ώρες, η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων μπορεί να μειωθεί κατά 52% και 37%, αντίστοιχα . Σε σύγκριση με τα αποτελέσματα, βρήκαμε ότι τα κύτταρα προ-επεξεργασμένο με SBPE μόνο που χρειάζεται Cisplatin 10 μΜ σε 48 ώρες για την επίτευξη IC50, η οποία είναι η ίδια απόδοση που μπορεί να επιτευχθεί από σισπλατίνη 25 μΜ και μόνο στο ίδιο χρονικό σημείο. Εάν η συγκέντρωση σισπλατίνης είναι αυξήθηκε σε 25 μΜ, το κύτταρο όγκου θανάτωσης αποτελέσματα βελτιώνονται. Όπως φαίνεται στο Σχ 4b, αν SBPE 10 mg /mL προστέθηκε πριν από την αγωγή σισπλατίνης για 24 ώρες, βρήκαμε ότι ο καρκίνος των κυττάρων βιωσιμότητες μετά από 5 μΜ, 10 μΜ και 25 θεραπείες μΜ Σισπλατίνη μπορεί να μειωθεί στο 58%, 50%, και 36%, αντίστοιχα. Σισπλατίνη 25 μΜ και μόνο μπορεί να επιτευχθεί μόνο συγκέντρωση IC50 σε 48 ώρες στην απουσία SBPE. Οι κυτταροτοξικές επιδράσεις της Cisplatin 10 μΜ μπορεί να επιτύχει IC50 μετά από θεραπεία για 48 ώρες. Τα στοιχεία έδειξαν ότι η προ-επεξεργασία SBPE μπορεί πράγματι να ενισχύσει σημαντικά τις καρκινικές κυτταρικές κυτταροτοξικές επιδράσεις της Cisplatin ενώ μειώνει τη δοσολογία ή θεραπεία ώρα Cisplatin.

ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων του όγκου Α549 αναλύσεις μετά από 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ , και 25 μΜ Cisplatin χορηγήθηκε και επωάστηκε για 24 και 48 ώρες. Το αντιδραστήριο MTS χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει τα ποσοστά επιβίωσης. Προ-αγωγή με τη χρήση SBPE 5 mg /mL (α) και SBPE 10 mg /mL (β) προστέθηκε και επωάστηκε για 24 και 48 ώρες δόσεις Cisplatin. Το αντιδραστήριο MTS χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει τα ποσοστά επιβίωσης.

Η

απόπτωση που επάγεται από την σισπλατίνη και η SBPE Θεραπεία Συνδυασμού

στυπώματα Western χρησιμοποιούνται για την παρατήρηση πως η θεραπεία συνδυασμού άλλαξε την ρύθμιση της απόπτωσης πρωτεΐνες (Σχήμα 5α)? και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών ρ53 (Σχήμα 5b), Βαχ (Εικόνα 5d), και Bad (Σχήμα 5e) αυξήθηκε καθώς ο χρόνος προχωρούσε μέσα σε 24 ώρες. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για ρ53, οι οποίες αυξήθηκαν σημαντικά μετά από μόνο 12 ώρες. Η αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, Bcl-2, μείωσε σημαντικά καθώς ο χρόνος προχωρούσε (Σχήμα 5c) και μειώθηκε κατά 32% μετά από 24 ώρες, το οποίο επέτυχε τα αποτελέσματα μια μέρα νωρίτερα από το ποσοστό μείωσης 37% που επιτυγχάνεται μετά από 48 ώρες όταν μόνο σισπλατίνη χορηγείται.

Apopthsis επάγεται από την θεραπεία συνδυασμού SBPE και Cisplatin (α) 6 ώρες μετά την αγωγή με χρήση 10 mg /mL του SBPE και 25 μΜ Cisplatin προστέθηκε και επωάστηκε για 24 και 48 ώρες. Western blots χρησιμοποιήθηκαν για να παρατηρήσουν τα αποτελέσματα για τα συνοδά φαινόμενα κυτταρικής απόπτωσης πρωτεϊνών (p53, Bcl-2, Bax και Bad). Όλες οι πηκτές έχουν τρέξει κάτω από τις ίδιες πειραματικές συνθήκες. γράφημα ποσοτικού προσδιορισμού για p53 (b)? BCL-2 (γ)? Βαχ (δ)? Bad (ε).

Η

Καθιέρωση βέλτιστη συγκέντρωση SBPE για την πρόκληση του καρκίνου κυτταροτοξικότητα κυττάρων και μια καταλληλότερη χρονική στιγμή για τη χορήγηση πρόσθετων φαρμάκων χημειοθεραπείας

κυτταροτοξικότητα μας αναλύσεις έδειξαν ότι οι συγκεντρώσεις SBPE και τους χρόνους αγωγής αυξήθηκε έτσι έκανε κυτταροτοξική δράση τους. Ως εκ τούτου, έχουμε δημιουργήσει μια σχέση μεταξύ καρκίνου του Α549 κύτταρα, οι συγκεντρώσεις SBPE, και χρόνους έκθεσης, προκειμένου να παρακινηθεί βέλτιστο Α549 κυττάρων αυτοφαγία (Σχήμα 6). Χρησιμοποιώντας το Matlab 2015a, πραγματοποιήσαμε μια τρισδιάστατη ποσοτικοποίηση των υφιστάμενων (α) οι τιμές κυτταρικής βιωσιμότητας? (Β) συγκεντρώσεις SBPE? και ώρες (γ) SBPE έκθεσης, προκειμένου να αποκαλύψει οποιεσδήποτε σχέσεις. Σύμφωνα με το Σχ 2, βρήκαμε ότι όταν το ποσοστό βιωσιμότητας κυττάρων ήταν στο 70%, περίπου 70% των κυττάρων επάχθηκαν για να γίνει αυτοφαγικά. Σε αυτό το σημείο, σισπλατίνη θα μπορούσε στη συνέχεια να προστεθεί για να επιταχύνει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της θεραπείας. Σε μια κυτταρική βιωσιμότητα 70%, μπορούμε στη συνέχεια πήρε δέκα χρονικά σημεία σε αυτό δοσολογία και προέρχονται μια σχεσιακή έκφραση που χρησιμοποιείται για να εκτιμηθεί ο συσχετισμός μεταξύ του χρόνου και SBPE δοσολογία. Η σχεσιακή έκφραση για τον χρόνο και τη δοσολογία του SBPE επί Α549 καρκίνος του πνεύμονα συν-επώασης ήταν ως εξής: Όπου

y

αντιπροσωπεύει την συγκέντρωση παράγοντα που δίδεται με τα κύτταρα,

x

αντιπροσωπεύει το χρόνο υλοποίησης και 5,7665 είναι η συνεχής υπολογισμός.

η τιμή ανίχνευσης τεστ κυτταροτοξικότητας MTS εισήχθη στο λογισμικό MATLAB μαθηματική ανάλυση μέσω ενός στατιστικού λογισμικού για να δημιουργήσετε ένα τρισδιάστατο διάγραμμα συντεταγμένων για τη σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης, του χρόνου, και τη βιωσιμότητα . XYZ ήταν οι μεταβλητές. Χ-άξονας αντιπροσωπεύει SBPE συγκέντρωση X = [x, x1]? μήτρες Χ και Χ1 παριστάνουν τις συγκεντρώσεις SBPE 0 mg /mL, 1 mg /mL, 5 mg /mL, 10 mg /mL, 25 mg /mL, και 50 mg /mL? Υ-άξονας αντιπροσωπεύει το χρόνο δράσης SBPE Υ = [Y, y1]? μήτρες Υ και το Υ1 αντιπροσωπεύει 24 και 48 ώρες? Ζ-άξονας αντιπροσωπεύει κυτταρική βιωσιμότητα Ζ = [Ζ, Ζ1]? και πίνακες Ζ και Ζ1 αντιπροσωπεύουν βιωσιμότητες μετά τη χορήγηση SBPE για 24 και 48 ώρες. Οι μήτρες δεδομένα που εισάγονται χρησιμοποιώντας τις εντολές surf και ένα τρισδιάστατο διάγραμμα επιφάνεια χαράσσεται. Τα χρώματα αντιπροσωπεύουν τις σχέσεις δράση μεταξύ των τριών.

Η

Επαλήθευση της βέλτιστης δοσολογίας και συγκέντρωση για SBPE να προκαλέσουν καρκίνο κυττάρων Autophagy

Σύμφωνα με το Σχήμα 2, βρήκαμε ότι όταν η βιωσιμότητα των κυττάρων ποσοστό ήταν στο 70%, περίπου 70% των κυττάρων επάχθηκαν για να γίνει αυτοφαγικά. Η σισπλατίνη μπορεί να προστεθεί αυτή τη στιγμή να επιταχύνουν τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα. Σύμφωνα με το Σχ 6 και τον τύπο που δείχνεται, για τα κύτταρα να επιτευχθεί ένα αυτοφαγικά κατάσταση, πρέπει να δοθεί τα κύτταρα SBPE για ένα ορισμένο χρονικό διάστημα για να μπορέσουν να επιτύχουν ποσοστό επιβίωσης 70%. Έχουμε διεξαγάγει δοκιμασίες MTS για SBPE 5 mg /mL (32 h), 6,25 mg /mL (30 ώρες), 7,5 mg /mL (16 ώρες), και 10 mg /mL (6 ώρες) για να επαληθεύσει ότι αυτό το χρονικό πλαίσιο παρείχε την βέλτιστη δοσολογία και συγκέντρωση για SBPE να προκαλέσουν καρκίνο των κυττάρων αυτοφαγία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων θα μπορούσε να διατηρηθεί στο 70%, όπως φαίνεται στο Σχ 7a. Πραγματοποιήσαμε μικροσκοπία φθορισμού και διαπίστωσε ότι LC3 επικαλύπτονται με LAMP-1 όταν SBPE χορηγήθηκε σε αυτές τις 4 συγκεντρώσεις. Η παρατήρηση αυτή αντιπροσώπευε μια επικάλυψη του autophagosome και λυσόσωμα. Ως εκ τούτου, η χορήγηση SBPE για ένα συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, μπορεί πράγματι να τονώσει Α549 αυτοφαγία των κυττάρων (Σχήμα 7β).

(α) Συγκέντρωση και έλεγχος χρόνου κατά βιωσιμότητα διεξήχθη σύμφωνα με τις μαθηματικές τιμές ανάλυσης που δημιουργείται από τα στατιστικά MATLAB λογισμικό που φαίνεται στο Σχήμα 6. Οι συγκεντρώσεις SBPE των 5 mg /ml, 6,25 mg /mL, 7.5 mg /ml και 10 mg /mL? χρονοδιαγράμματα ήταν 32, 30, 16, και 6 ώρες? και αντιδραστηρίου MTS χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει τις δραστηριότητές τους. (Β) Η ανοσοχρώση για την επισήμανση της πρωτεΐνης αυτοφαγία, LC3? λυσοσωμική δείκτη, LAMP-1? και την πυρηνική δείκτη, DAPI. Τα κύτταρα επωάστηκαν για οκτώ ώρες και μεγεθύνονται κατά 630X να παρατηρηθεί η κατανομή αυτοφαγία. Τα βέλη δείχνουν αυτοφαγοσώματα (επικαλύπτεται με πράσινο και κόκκινο).

Η

Τα αποτελέσματα που Συνδυάζοντας SBPE με φάρμακα χημειοθεραπείας γεμσιταμπίνη και πακλιταξέλη έχουν στο Cancer Cell Βιωσιμότητας Βαθμολογήστε

Σύμφωνα με το Σχήμα 8, η κυτταροτοξική επιδράσεις της γεμσιταβίνης και πακλιταξέλης μέσα σε 72 ώρες μπορεί να βελτιωθεί η συγκέντρωση SBPE αυξάνεται. Ωστόσο, γεμσιταβίνη απαιτείται χορήγηση 100 μΜ για μέχρι 72 ώρες και πακλιταξέλη απαιτείται χορήγηση 100 μΜ για έως και 48 ώρες, προκειμένου να επιτευχθεί IC50. Παρόμοια με σισπλατίνη, εμείς προ-επεξεργασμένα των κυττάρων με SBPE για έξι ώρες και στη συνέχεια προστέθηκε η γεμσιταβίνη ή συνδυασμός πακλιταξέλη για να παρατηρηθεί αν SBPE μπορεί να αυξήσει σημαντικά τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του γεμσιταβίνη ή πακλιταξέλη, ενώ, επίσης, μείωση της δοσολογίας τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά τη θεραπεία με χρήση 50 μΜ γεμσιταβίνη και πακλιταξέλη για 48 ώρες, τα ποσοστά επιβίωσης ήταν αποτελεσματικά μειώνεται από 78% σε 44% και 65% έως 45%, αντίστοιχα. Σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα αποτελέσματα (Σχήμα 8α και 8ε), οι SBPE προ-επεξεργασμένα κύτταρα απαιτείται μόνο τη μισή ποσότητα γεμσιταβίνη ή πακλιταξέλη σε 48 ώρες για να επιτευχθεί IC50.

(α) ανάλυση κυτταρικής βιωσιμότητας Α549 καρκινικών μετά τη χορήγηση της γεμσιταβίνης. Μετά από 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, 50 μΜ και 100 μΜ γεμσιταβίνη χορηγήθηκε για 24 και 48 ώρες, το αντιδραστήριο MTS χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει τις δραστηριότητές τους. Δεύτερον, μετά από 6 ώρες θεραπείας με 10 mg /mL του SBPE? Η γεμσιταβίνη προστέθηκε για 24 ώρες (β), 48 ώρες (γ) και 72 ώρες (δ). ανάλυση (ε) Α549 καρκινικών κυτταρικών βιωσιμότητα μετά την αγωγή με 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, 50 μΜ και 100 μΜ πακλιταξέλη και επωάστηκαν για 24 και 48 ώρες. Το αντιδραστήριο MTS χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει τις δραστηριότητές τους. Δεύτερον, μετά από 6 ώρες θεραπείας με 10 mg /mL του SBPE? αγωγή με πακλιταξέλη προστέθηκε επί 24 ώρες (f), 48 ώρες (ζ) και 72 ώρες (h).

Η

Συζήτηση

Υπάρχουν πολυάριθμες παρενέργειες που σχετίζονται με τις υπάρχουσες παραδοσιακές φάρμακα χημειοθεραπείας [26-29]. Για παράδειγμα, σισπλατίνη, ένα φάρμακο χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται συνήθως για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα έχει μια μακρά χρόνο απόκρισης, είναι επιρρεπής σε αντοχή φαρμάκου, και η μακροχρόνια εφαρμογή μπορεί να αναστέλλει την απόπτωση ή παράγουν δυσάρεστες παρενέργειες για τους ασθενείς [58]. Ένα άλλο φάρμακο χημειοθεραπείας, γεμσιταβίνη, μπορεί να προκαλέσει δυσάρεστα συμπτώματα όπως ζάλη, έμετο, λευκοπενία, θρομβοκυτταροπενία, και νεφρική τοξικότητα [59]. Παραδοσιακά κινέζικα φυτικά φάρμακα έχουν αρχίσει να εμφανίζονται ως αντικαρκινικά φάρμακα [35-38]. Επί του παρόντος, περίπου τα δύο τρίτα των ασθενών με καρκίνο βρίσκονται στο μέσα στο τελευταίο στάδιο της διάγνωσης τους, λόγω των διαγνωστικών περιορισμούς τεχνικής και μείωσε χειρουργική ευκαιρίες [2, 15-23]. Οι ασθενείς κατά τη διάρκεια αυτών προχωρημένα στάδια είναι πολύ σωματικά αδύναμος για να αντέχει το τραύμα της χειρουργικής επέμβασης και τις τοξικές παρενέργειες της χημειοθεραπείας. Συμβατική χειρουργική επέμβαση για καρκίνο, ακτινοβολία, και χημειοθεραπεία μέθοδοι όλες έχουν περιορισμούς, όπως η έκταση της παθολογίας των ασθενών, ο χρόνος θεραπείας, την ηλικία, τη φυσική κατάσταση, την ύπαρξη επιπλοκών, και αλλεργίες φαρμάκων. Μερικοί ασθενείς μπορεί να είναι απρόθυμοι να δεχτούν αυτές τις μεθόδους θεραπείας ή θα σταματήσει τη θεραπεία λόγω των παρενεργειών [2, 15-23]. Κινέζικα φυτικά φάρμακα δεν έχουν αυτούς τους περιορισμούς και μπορεί να χρησιμοποιηθεί αναλόγως [60, 61]. Τα πλεονεκτήματα των κινεζικών φυτικά φάρμακα είναι περισσότερο από απλώς κυτταροτοξική δράση εναντίον των καρκινικών κυττάρων, μπορούν επίσης να ενισχύσει τα οφέλη από τη φυσική κατάσταση, την επαγωγή ανοσολογικής κυτοκίνες, και να ενισχύσει την κυτταρική ανοσία? έτσι, που παρέχουν προστασία κατά του καρκίνου. Ωστόσο, δεν υπάρχουν κλινικές δοκιμές μεγάλης κλίμακας με τη χρήση παραδοσιακών κινεζικών φαρμάκων που επανειλημμένα αποδείξει τους «τεκμηριωμένης ιατρικής» αποτελεσματικότητα. Ως εκ τούτου, κινέζικα φυτικά φάρμακα εξακολουθούν να χαρακτηρίζονται ως δευτερεύοντα και εναλλακτικά φάρμακα για τη θεραπεία του καρκίνου.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε εάν η παραδοσιακή ιατρική των βοτάνων, SBPE, μπορεί να προκαλέσει καρκινικών κυττάρων αυτοφαγία. Εμείς χορηγείται περαιτέρω Cisplatin να παρατηρήσει αν SBPE μπορεί να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, ενώ, επίσης, μείωση Cisplatin δόσεις. Τέλος, σε σύγκριση με τα αποτελέσματα που παράγονται από άλλα φάρμακα χημειοθεραπείας με την ελπίδα να δημιουργήσει μια κινεζική-Δυτική θεραπεία συνδυασμού θεραπείας. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι SBPE δεν θα παράγει σημαντική κυτταροτοξικότητα σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα, αλλά θα προκαλέσει το θάνατο του καρκίνου του πνεύμονα, υπό τις ίδιες συγκεντρώσεις. Βρήκαμε επίσης ότι ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα θα φθάσουν IC50 τους μετά από θεραπεία με 10 mg /mL SBPE για 24 ώρες. Αν και ο μηχανισμός της χαμηλότερης κυτταροτοξικότητα SBPE απέναντι φυσιολογικά κύτταρα παραμένει άγνωστος, τα αποτελέσματα αυτά σημαίνουν ότι SBPE μπορεί να σκοτώσει αποτελεσματικά τον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα χωρίς να βλάπτουν τα φυσιολογικά κύτταρα.

Όταν συμβεί αυτοφαγία, LC3-επισημασμένο αυτοφαγοσώματα σχηματίζουν αυτοφαγικά λυσοσώματα με LAMP-1 σημασμένο λυσοσώματα. Βρήκαμε ότι SBPE θα μπορούσε να προκαλέσει την αυτοφαγία των κυττάρων Α549 και αυτό έγινε πιο εμφανής καθώς ο χρόνος προχωρούσε. Οι αυτοφαγικά λυσοσώματα στα επεξεργασμένα κύτταρα έφθασαν ένα μέγιστο όγκο οκτώ ώρες μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. Η έκφραση της επισημασμένης, λυσοσωμικής πρωτεΐνης, ρ62, και η επισημασμένη, autophagosomal πρωτεΐνη, Atg12, επαληθευμένα δεδομένα φθορισμού μας. Οκτώ ώρες μετά τη χορήγηση του φαρμάκου, LC3-Ι διασπαστεί το μέγιστο ποσό της LC3-II. Μετά από 12 ώρες, ο καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων άρχισε σε απόπτωση, αποδεικνύεται από την αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης της αποπτωτικών και προ-αποπτωτικών δεικτών και της μειωμένης έκφρασης του αντι-αποπτωτική δείκτη. Με βάση τα αποτελέσματα που συζητούνται παραπάνω, μπορεί να διεγείρει SBPE καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικής απόπτωσης μετά αυτοφαγία. Ωστόσο, αν και ο αριθμός των κυττάρων σε φάση G1 είχαν την τάση να αυξάνουν μετά από 24 ώρες κατά τη διάρκεια της ανάλυσης κυτταρικού κύκλου, ο αριθμός των κυττάρων σε G2 /M φάση δεν άλλαξε και δεν υπήρχε σημάδι που δείχνει ότι SBPE μπορεί να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου για τα καρκινικά κύτταρα . Είναι ενδιαφέρον ότι, ο αριθμός των κυττάρων στη φάση S αυξήθηκε από 31% σε 38%, όπως ο χρόνος θεραπείας SPBE προχώρησε, αλλά έπεσε πίσω στο 30% μετά από 24 ώρες. Η αιτία αυτού του αποτελέσματος είναι άγνωστος, αλλά εκτιμάται ότι τα περισσότερα από τα κύτταρα μετακινήθηκαν προς απόπτωση και ένα μικρό τμήμα των κυττάρων κινείται προς τη σύλληψη φάση G1 μετά από 24 ώρες.

Σύμφωνα με το σχήμα 4, χρειάστηκαν 48 ώρες για να φτάσουν IC50 μετά την επεξεργασία των κυττάρων Α549 με το φάρμακο χημειοθεραπείας, σισπλατίνη. Περαιτέρω έρευνα διαπιστώθηκε ότι οι προ-θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα με κύτταρα 10 mg /mL SBPE για έξι ώρες προκάλεσε το 30% των κατεργασμένων κυττάρων να πεθάνουν και επάγεται αυτοφαγία σε 50% αυτών των κυττάρων. ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων του καρκίνου έτειναν να μειωθούν σε κύτταρα προ-αγωγή με SBPE σε σύγκριση με τις ομάδες που δεν είχαν προ-θεραπεία. Επιπλέον, η συγκέντρωση Cisplatin και θεραπεία χρόνο που απαιτείται για την επίτευξη IC50 ήταν σημαντικά μειωμένη. Το διάγραμμα τάση στο σχήμα 6 έδειξαν ότι όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση και SBPE θεραπεία του χρόνου, η ισχυρότερη τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα εντός 24 ωρών. Σύμφωνα με το διάγραμμα μας ανάλυση Matlab, βρήκαμε ότι όταν τα επίπεδα συγκέντρωσης έφθασε την μπλε περιοχή στο διάγραμμα, η κυτταροτοξικότητα ήταν σχεδόν 80%. Θεραπεία με 5 mg /mL SBPE για 24 ώρες μειώνεται κυτταρικής βιωσιμότητας έως και 80%.