Αφηρημένο

Ταξάνης χημειοθεραπεία με βάση το πρότυπο της φροντίδας θεραπεία στον καρκίνο ανθεκτικά ευνουχισμό του προστάτη (CRPC). Υπάρχουν πειστικές αποδείξεις ότι η θεραπεία με ταξάνη επηρεάζει υποδοχέα ανδρογόνων (AR), αλλά οι ακριβείς μηχανισμοί πρέπει να διευκρινιστεί περαιτέρω. Οι μελέτες μας προσδιορίζονται c-jun ως κρίσιμο βασικό παράγοντα που αλληλεπιδρά με AR και έτσι καθορίζει την έκβαση της θεραπείας ταξάνης δεδομένη. Docetaxel (Doc) και πακλιταξέλη (Pac) παραγόντων έδειξε διαφορετικά αποτελέσματα σε LNCaP και LNb4 αποδεικνύεται από αλλαγή στην πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του c-Jun, AR και PSA. Docetaxel επαγόμενη φωσφορυλίωση του c-Jun συνέβησαν πριν φωσφορυλίωση JNK που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση της c-Jun είναι ανεξάρτητο από μονοπάτια ΙΝΚ σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Μια μελέτη έδειξε ότι ξενομόσχευμα ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με Pac και βικαλουταμίδη έδειξε χειρότερη έκβαση υποστηρίζοντας την υπόθεσή μας ότι προς τα πάνω ρύθμιση του c-Jun θα μπορούσε να δράσει ως ισχυρός παράγοντας αντιαποπτωτικών. Παρατηρήσαμε σε in vitro μελέτες μας μια αντίστροφη ρύθμιση των επιπέδων PSA-και AR-mRNA σε κύτταρα LNb4 αγωγή Doc. Αυτό παρατηρήθηκε επίσης για καλλικρεΐνη 2 (KLK 2), το οποίο ακολούθησε το ίδιο μοτίβο. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι η ανταπόκριση στη θεραπεία με ταξάνη μετριέται με μείωση του PSA πρέπει να λάβουμε υπόψη ότι αυτό δεν μπορεί να αντανακλά την πραγματική δραστηριότητα των AR σε CRPC ασθενείς

Παράθεση:. Tinzl Μ, Τσεν Β, ο Τσεν SY, Semenas J , Abrahamsson PA, Dizeyi Ν (2013) Αλληλεπίδραση μεταξύ του c-Jun και ανδρογόνων υποδοχέων καθορίζει την έκβαση της Ταξάνης θεραπείας σε Ευνουχισμός Ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (11): e79573. doi: 10.1371 /journal.pone.0079573

Επιμέλεια: Elad Katz, AMS Biotechnology, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 12 Απριλίου 2013? Αποδεκτές: 25 Σεπτεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Νοεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Tinzl et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτείται από Sandbergs ιδιωτική χρηματοδότηση, Percy Ίδρυμα Falk και τη χρηματοδότηση του καρκίνου του Malmö. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με καρκίνο ανθεκτικό ευνουχισμό του προστάτη (CRPC) είναι ακόμη περιορισμένη. Αν και νέα ελπιδοφόρα φάρμακα όπως αναστολέας CYP17A1 arbiraterone και MDV3100 έχουν εισέλθει στην αγορά, ταξάνη χημειοθεραπεία με βάση εξακολουθεί να θεωρείται παγκοσμίως το πιο σημαντικό ακρογωνιαίο λίθο της θεραπείας όταν θεραπείας στέρησης ανδρογόνων (ADT) έχει αποτύχει [1-4]. Εκτός από τα κλασικά ταξάνες, Docetaxel και πακλιταξέλη, καμπαζιταξέλη χρησιμοποιείται ως χημειοθεραπευτικό παράγοντα στη θεραπεία των ασθενών CRPC, ο τελευταίος κυρίως για τη θεραπεία ασθενών με ανθεκτική νόσο Doc [5].

κύτταρα σύλληψη Ταξάνια στην G2-M φάση από hyperstabilization των μικροσωληνίσκων με αποτέλεσμα τα κύτταρα σε κυτταρικό θάνατο [6]. Εκτός από αυτό περιγράφεται καλά επίδραση στα καρκινικά κύτταρα υπάρχουν πειστικά στοιχεία ότι η θεραπεία με ταξάνη παρεμβαίνει επίσης με υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [7-11]. Η ομάδα μας έχει εντοπίσει c-jun ως σημαντικός παίκτης-κλειδί σε αυτή την αλληλεπίδραση μεταξύ των AR και ταξάνες που επηρεάζει την έκβαση της θεραπείας στην ανθεκτική ευνουχισμό κατάσταση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

παράγοντα μεταγραφής c-Jun είναι μια πρωτόκολλα ογκογονίδιο και ανήκει στην οικογένεια ΑΡ-1 το οποίο αποτελείται από τα Jun, fos και ATF-2 υπο-οικογένειες [12,13]. πρωτεΐνες ΑΡ-1 ομο- ή ετεροδιμερή πριν σύνδεσης προς θέση στόχο DNA τους. Οι πρωτεΐνες ΑΡ-1 είναι πολυλειτουργικές και εμπλέκεται στη ρύθμιση σήματα απόκρισης στρες, την ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση [12]. Παρ ‘όλα αυτά, υπάρχουν στοιχεία που υποδεικνύουν έντονα ότι η c-Jun αυξητικού παράγοντα και πρωτο-ογκογονιδίου [14,15]. Shemshedini και συνεργάτες έδειξαν ότι, παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται με άλλους AR συνενεργοποιητές, c-Jun μπορεί να μεσολαβήσει αλληλεπίδραση AR Ν-to-C για την ενίσχυση της δέσμευσης του DNA [16,17]. Επιπλέον, φωσφορυλιωμένη c-Jun συχνά υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους καρκίνους [18,19] και έχει συνδεθεί με την επεμβατική ιδιότητες του προστάτη και του καρκίνου του μαστού [18,20,21]. Ωστόσο, ο ρόλος της ενεργοποίησης c-Jun και πιθανή αλληλεπίδραση με AR στην κυτταρική μοίρα μετά από έκθεση σε Doc είναι μέρος ενός πολύπλοκου δικτύου και παραμένει να διευκρινιστεί. Αυτή η μελέτη διεξήχθη για να διερευνηθεί η συνέπεια της αλληλεπίδρασης του c-Jun και AR σε θεραπεία ταξάνης ανθεκτικών ευνουχισμού κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Για τη βελτιστοποίηση της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας με ταξάνες θα πρέπει να προσδιορίσει ένα συγκεκριμένο μόριο ή οδός η οποία μπορεί να προσδώσει απάντηση ή αντίστασης. Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να εξετάσει την επίδραση των ταξάνες ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με βικαλουταμίδη στο AR και συμπαράγοντας της c-jun

in vitro

και

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και Αντιδραστήρια

Το ανθρώπινο καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές LNCaP και PC-3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassass, VA ). κύτταρα LNb4 παρήχθησαν στο εργαστήριο μας από κύτταρα LNCaP που εκτίθενται σε βικαλουταμίδη (5 μΜ σε ορό μειώνεται στο 5%). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI (LNCaP) και Hams-F12 (PC-3) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Life Technologies, Paisley, UK). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με docetaxel (ντοσεταξέλη, Sanofi Aventis) και πακλιταξέλη (Paclitaxel®, Actavis, Hafnarfjordeur, Ισλανδία) στη συγκέντρωση δηλώνεται σε κάθε σχήμα. Διυδροτεστοστερόνη (DHT) αγοράστηκε από Steraloids Inc. (Newport, RI) και βικαλουταμίδη από την AstraZeneca (London, UK). Όλα τα αντιδραστήρια κηλιδώσεως Western αγοράσθηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) εκτός αναστολέα JNK XIV SR 3306 (Calbiochem, Darmstadt, Germany).

Επιμόλυνση και μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

Παροδική επιμολύνσεις με c-jun, c-jun μετάλλαξη (c-jun Ala63 /73) και τα πλασμίδια AR (όλα τα ευγενικά από Shao-Yong Chen, Harvard Medical School) στο PC-3 προστάτη καρκινικά κύτταρα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας FuGENE 6 (Roche Diagnostics , Mannheim, Germany), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Το μεταλλαγμένο c-Jun (c-jun Ala63 /73), που αναφέρεται εδώ ως Juna, που χρησιμοποιούνται σε πειράματα φέρει μία μετάλλαξη στη θέση σερίνη 63/73 (Ala63 /73), η οποία είναι ο κύριος στόχος της φωσφορυλίωσης με ερεθίσματα άγχους. Για τα πειράματα siRNA, κύτταρα LNCaP PC-3 και μορφομετατράπηκαν για 48 ώρες με 100 ηΜ siRNA c-jun ή μη στόχευση siRNA (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA). Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης X-tremeGENE siRNA (Roche Diagnostics) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών.

Πολλαπλασιασμός

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με αποκλεισμό trypan blue (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). PC-3, LNCaP και LNb4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 25.000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Μετά από 24 και 48 ώρες επεξεργασίας με Doc ή DMSO (Sigma-Aldrich) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις επιπλέοντα και συνδεδεμένα κύτταρα συλλέχθηκαν με τρυψινοποίηση. Ίσες ποσότητες των κυτταρικών αιωρημάτων και 0,4% trypan blue αναμίχθηκαν, και ο αριθμός των βιώσιμων, trypan blue-εξαιρουμένων κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. Το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων ανά 100 των συνολικών κυττάρων (μέση ± SD). επιμολυσμένα κύτταρα PC-3 αξιολογήθηκαν περαιτέρω με δοκιμασία MTS. Μετά από 48 ώρες την επιμόλυνση τα κύτταρα εκτέθηκαν σε Doc ή παρέμειναν χωρίς θεραπεία για περαιτέρω 48 ώρες. Μετά από επώαση στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 4 ώρες, ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2 – (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο (MTS) δοκιμασία (δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού One-λύση ΟθΙΙϋίθΓ 96 Υδατικό, Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός με πολλές εκβαθύνσεις (Model 680, Bio-Rad, Richmond, CA, USA), με τα φρεάτια που περιέχουν μόνο μέσον που χρησιμεύει ως κενό ελέγχους.

Η κυτταρομετρία ροής για τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση αναλύσεις

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Εν συντομία, επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Doc για 48 ώρες και μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο για 40 λεπτά. Τα βιώσιμα κύτταρα περίφραξη, και το περιεχόμενο DNA τουλάχιστον 10 000 επισημασμένα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκε με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογέα. Η απόπτωση προσδιορίστηκε με Annexin V συζευγμένη με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) και χρώση 7-AAD (Βϋ Pharmingen του BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Doc για 48 και 72 ώρες και χρωματισμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής σε ένα FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) μέσο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ελήφθησαν από δύο ανεξάρτητα πειράματα εις διπλούν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FCS Express (DENOVO Software, Los Angeles, CA, USA).

ανάλυση Western Blot και Ανοσοκαταβύθιση

Για Western ολικής πρωτεΐνης ανάλυση κηλίδος εξήχθη χρησιμοποιώντας δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό (50 mmol /L Tris-HCl, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1 % ΝΡ40, 0,1% SDS, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF και 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο) συμπληρωμένο με το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης Complete Mini (Roche, Mannheim, Germany). Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία BCA πρωτεΐνης (Pierce, Rockford, IL). Δείγματα πρωτεΐνης (20-30 μg) φορτώθηκαν σε 4-12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης δοκιμασία Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφορητική ανάλυση και στύπωση. Οι μεμβράνες ανιχνεύτηκαν για όλη τη νύχτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-AR (441 και Ν-20), αντι-c-jun, αντι-ρ-cJun (ser 63/73), και αντι-β-ακτίνης, όλα αγοράστηκαν από την Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, CA), αντι-PSA (Dako, Glostrup, Denmark), ρ-ΙΝΚ από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Δευτερογενή αντισώματα (IRDye 680, IRdye 800) ελήφθησαν από το Li-Cor Βιοτεχνολογίας (Νεμπράσκα, ΗΠΑ) και πρωτεΐνες ανιχνεύονται από το σύστημα απεικόνισης Odyssey® υπερύθρων.

Για τα κύτταρα ανοσοκατακρήμνιση υποβλήθηκαν σε θεραπεία, όπως αναφέρεται και συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Τα κυτταρολύματα ομογενοποιήθηκαν, μετρούμενη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη και 500 μg του προδιαυγασθέντος πρωτεΐνης επωάστηκε με αντίσωμα αντι-AR στους 4 ° C όλη τη νύχτα με συνεχή ανάδευση. Ίσες ποσότητες IgG ποντικού χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος. Protein G σφαιρίδια (Pierce, Rockford, IL, USA) προστέθηκαν στη συνέχεια σε κάθε δείγμα και επωάστηκαν στους 4 ° C για 2 ώρες. Τα δείγματα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 2000 χ g 2 λεπτά και ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli (30 μl) χωρίς β-μερκαπτοαιθανόλη προστέθηκε και το μίγμα επωάζεται στους 65 ° C για 15 λεπτά για να εκλουσθεί δεσμευμένες πρωτεΐνες. Κλάσματα έκλουσης φυγοκεντρήθηκαν στα 2000 χ g, προστέθηκε 1 μΙ β-μερκαπτοαιθανόλης και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western όπως περιγράφεται παραπάνω. Η έκφραση πρωτεΐνης αξιολογήθηκε σε σχέση με την β-ακτίνη έκφραση με ανάλυση πυκνομετρίας.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα LNCaP και LNb4 χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen, West Sussex, UK) ακολουθώντας το πρωτόκολλο των κατασκευαστών και επεξεργασμένο με RNase-free DNase (δεοξυριβονουκλεάση Ι? Amersham Pharmacia Biotech, Sollentuna, Σουηδία) για την απομάκρυνση ενδεχόμενων γενωμικού μολυντές DNA. Κάθε cDNA συντέθηκε με αντίστροφη μεταγραφή από 1 μg του ολικού RNA χρησιμοποιώντας το StrataScript First-Strand Synthesis System και τυχαία εξαμερών εκκινητών (Stratagene? Διαγνωστικά ΑΗ, Στοκχόλμη, Σουηδία). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με SYBR Green QPCR κύριο μείγμα (iScript από BioRad) σε ένα σύστημα ανίχνευσης MX 3000P (Stratagene) με ένα στάδιο έναρξης στους 95 ° C για 10 λεπτά ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 56 ° C για 1 λεπτό και 72 ° C για 1 λεπτό.

Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές για κάθε γονίδιο: PSA (F5′-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 ‘και R5′-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3′), AR (F 5’-GTACCTGTCAGCCCCTGAAC-3 ‘και R5’ GGAGAGCTGCT TTCG- CTTAG-3 ‘), GAPDH (5’ -CGA CCA CTT TGT CAA GCT CA-3 ‘και 5′-ΑΟΟ GGT CTA CAT GGCAACTG-3′), c-Jun (F 5’-GCATGAGGAACCGCA- TCGCTGCCTCCAAGT-3 και R5 ‘GCGACCAAGTCCTTCCCACTCGTGCA- CACT-3 ‘), NKX3.1 (F 5′- GTACCTGTCGGCCCCTGAACG-3’και R5′-GCT- GTTA TACACGGAGACCAGG-3′), c-Myc (F 5′-3′ και GGCGGGCACTTTGCACTGGA-R5′- TCGCGGGAGGCTGCTGGTTT-3′), KLK2 (F 5′-AGATGAAGACTCC-AGCCAT-3’και R 5′-GATACCTTGAAGCACACCA -3′), β-ακτίνη (F 5′-CGTGG- GGCGCCCCAG -3′ και R 5′-TTGGCCTTGGGGTTCAGGGGG – 3’).

το ποσό mRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική C

μέθοδο Τ. Τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα σε σχέση με την έκφραση του mRNA σε έλεγχο μη επεξεργασμένων που ορίστηκε σαν μία τιμή αναφοράς.

Ζώα και τον εμβολιασμό του όγκου

παλιό Τέσσερις έως έξι εβδομάδες NMRI αρσενικών Γυμνοί ποντικοί από την Taconic Ευρώπη (Lille Skensved, Denmark) χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα. Το μοντέλο ξενομοσχεύματος διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο αυτό έχει εγκριθεί ρητώς από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Lund (αριθμός έγκρισης Μ 239 – 10). Τα ποντίκια διατηρούνται σύμφωνα με τις κατευθύνσεις που δόθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας Malmö-Lund. LNCaP κύτταρα (2×10

6 κύτταρα) ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές με αποτέλεσμα δύο όγκους ανά ποντικό. Μετά ανέπτυξαν όγκους διεξήχθη χειρουργικό ευνουχισμό. Τα ζώα χωρίστηκαν σε 6 ομάδες: ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, Doc, Pac ή βικαλουταμίδη ως μονοθεραπεία και Doc ή Pac συνδυασμό με βικαλουταμίδη. Τα φάρμακα χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς (ε.π.) (20 mg /kg) σε όγκο 100 μλ μία φορά την εβδομάδα για 5 εβδομάδες με εξαίρεση βικαλουταμίδης που χορηγήθηκε δύο φορές την εβδομάδα. Στο χρονικό σημείο που ορίζεται εβδομάδα 0, ξεκίνησε θεραπεία και ποντικοί θυσιάστηκαν μία εβδομάδα μετά την τελευταία θεραπεία. Οι όγκοι συλλέχθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε φορμαλίνη και εμβαπτίστηκαν σε παραφίνη για ανοσοϊστοχημική ανάλυση.

Ανοσοϊστοχημεία

ανατμηθέντες όγκους ξενομοσχεύματος μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και εν συνεχεία ενσωματώνονται σε παραφίνη. Τέσσερις μm πάχους τομές αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και μικροκύματα αγωγή για 10 λεπτά σε υψηλό ρΗ διάλυμα ανάκτησης στόχου (Dako, Glostrup, Denmark) προτού υποβληθούν σε επεξεργασία σε αυτόματο Techmate 500 μηχανή χρώση ανοσοϊστοχημείας (Dako) με τη χρήση αντισωμάτων έναντι AR, c-jun, σ -cjun, και Ki-67 (Dako). DAB (3,3′-διαμινοβενζιδίνη) χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο υπόστρωμα και πλακίδια με αιματοξυλίνη. Τα δείγματα εξετάζονται με μια Ολύμπου AX 70 μικροσκόπιο σε μεγέθυνση x 10. Μια αυθαίρετη ημιποσοτική βαθμολόγησης εφαρμόστηκε για την αξιολόγηση των σημάτων χρώση και σκόραρε σε τρεις κατηγορίες? αρνητική χρώση (0), αδύναμο αλλά ανιχνεύσιμη χρώση μερικών ή όλων των κυττάρων (1), μέτρια χρώση (2) ή ισχυρή χρώση (3). Τουλάχιστον δύο τμήματα ανά καρκίνωμα προσδιορίστηκαν και τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά για τουλάχιστον το 70% της έκτασης του ιστού που αναλύθηκαν.

Υπο-κυτταρική κλασματοποίηση

Κυτταρική κλασματοποίηση διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται με τα NE-PER αντιδραστήρια πυρηνική και κυτταροπλασματική εκχύλισης (Pierce, Rockford, IL). LNCaP κύτταρα εκτέθηκαν σε Doc ή Pac για 6, 24 και 48 ώρες ή παρέμειναν χωρίς θεραπεία. Τα κλάσματα βρασμένο με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS, υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανιχνεύθηκαν όπως υποδεικνύεται με πρωτεύοντα αντισώματα σε Ar, β-ακτίνη ή λαμίνη Α, όλα από την Santa Cruz, που ακολουθείται από δευτερογενή αντισώματα (IRDye 680, IRdye 800), τα οποία ελήφθησαν από Li-Cor Βιοτεχνολογίας (Nebraska, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν από το Σύστημα Απεικόνισης Odyssey® υπερύθρων.

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τουλάχιστον τρία πειράματα που πραγματοποιήθηκαν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με t-test unpaired Student. Οι τιμές των p & lt? 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Αποτελέσματα

c-jun υπερέκφραση επάγεται αντίσταση στη θεραπεία Doc

Η λειτουργία του c-Jun ως παράγοντας μεταγραφής που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό έχει αναφερθεί σε καρκίνο του προστάτη πριν από τις [22 ]. Για τη διερεύνηση της επίπτωσης του c-Jun επί του καρκίνου του προστάτη κύτταρα κατεργασμένα Doc, τα πειράματα διεξήχθησαν σε LNCaP, LNb4 και PC-3 κύτταρα. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με Doc ήταν πιο ανθεκτικά στη θεραπεία σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία σε σύγκριση με κύτταρα PC-3 (30% έναντι 9%, ρ = 0,003) (Σχήμα 1Α). Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε ανιχνεύσει μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των LNCaP και LNb4 θα μπορούσαμε να δούμε μια τάση ότι η μακροχρόνια θεραπεία με βικαλουταμίδη αυξάνει την αντίσταση (Εικόνα 1Α). Περαιτέρω ανάλυση απόπτωσης διεξήχθη με χρήση αννεξίνης V /7ΑΑΌ επιβεβαιώνοντας λιγότερο απόπτωση σε κύτταρα που εκτίθενται σε LNb4 Doc σύγκριση με τη μητρική LNCaP κύτταρα

(Α) Cell βιωσιμότητα εξετάστηκε με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου σε LNCaP (LN), LNb4 και PC -3 κύτταρα. (Β) Προσδιορισμός της απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής. Μετά την κατεργασία των κυττάρων με Doc, η έκταση της απόπτωσης αξιολογήθηκε με προσδιορισμό αννεξίνης V /7AAD. (Γ) MTS δοκιμασία σε PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα όπως υποδεικνύεται στην εικόνα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία 48 ώρες με 5 ηΜ Doc. (D) Γραφήματα από κυτταρομετρία ροής σε κύτταρα που αναφέρονται στο (C) του πληθυσμού που αποδεικνύουν κύτταρο ποδηλασία βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Doc για 48 ώρες ή παρέμειναν χωρίς θεραπεία και ταξινομούνται σε διαφορετικά στάδια της μίτωσης με κυτταρομετρία ροής. (Ε) ανάλυση κηλίδωσης Western για να δείξει την έκφραση της πρωτεΐνης σε επιμολυσμένα κύτταρα που αναφέρονται στο (C). (F) ανάλυση της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης καθορίζεται με ανοσοκαθίζηση με την παρουσία ή απουσία Doc ή Pac σε κύτταρα LN και LNb4. Τα κύτταρα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-AR (441) αντίσωμα και μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-c-jun. Για τον έλεγχο, 20 μg του κυτταρικού λύματος χρησιμοποιήθηκε ως πρώτη ύλη και η ίση φόρτωση έγινε confimed με αντίσωμα AR.

Η

(Εικόνα 1Β). Για να εξεταστεί αν c-jun ενέχεται στην απόκριση σε θεραπεία Doc, κύτταρα PC-3 επιμολύνθηκαν με c-jun, c-jun μετάλλαγμα (Juna) και συν-επιμολύνθηκαν με AR (AR /cJun, AR /Juna, αντίστοιχα) πλασμίδια και δοκιμασία MTS διεξάγεται. PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με Juna έδειξε στατιστικά σημαντική αύξηση (ρ = 0,01, Juna vs ελέγχου) στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 1 C) ενώ επιμόλυνση με AR μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων συγκρίσιμη με Doc επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Αν και δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων ελέγχου αγωγή Doc και c-jun επιμολυσμένα PC-3 κύτταρα υπήρχε μια σαφής τάση για αυξημένη βιωσιμότητα στο τελευταίο. Είναι ενδιαφέρον ότι, συν-επιμόλυνσης των AR σε PC-3 κύτταρα που υπερεκφράζουν του c-jun ή Juna δεν καταργεί αυτό το αποτέλεσμα επί του πολλαπλασιασμού (Σχήμα 1 C) υποδεικνύοντας έναν ρόλο της c-jun ως ισχυρός παράγοντας αντιαποπτωτικών. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου συνέχεια διεξάγεται και εμφανίζονται κυτταρικού κύκλου σε φάση G2-M σε κύτταρα κατεργασμένα Doc PC-3 (Σχήμα 1 D). Παρατηρήσαμε ότι PC-3 κύτταρα επιμολυσμένα με AR ή Juna παρουσίασε μια παρόμοια τάση με μια αξιοσημείωτη μείωση του ποσοστού των κυττάρων σε φάση G2-M (18,6% και 19,9%, αντίστοιχα), ενώ η φάση S αυξήθηκε (43 , 4% και 43,5%, αντίστοιχα), γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση της c-Jun διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κυτταρική απόκριση σε Doc (Εικόνα 1D).

Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης στα επιμολυσμένα κύτταρα PC-3. Ανάλυση Western blotting έδειξε αξιοσημείωτη αύξηση στην AR πρωτεΐνης σε κύτταρα συν-επιμολυσμένα με AR /cJun σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με AR μόνη ή AR /Juna (Σχήμα 1 Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ AR και c-jun εξαρτάται από την διαθέσιμη θέση φωσφορυλίωση 63/73. Για την περαιτέρω αξιολόγηση της επίδρασης των παραγόντων ταξανίου στην ενδογενή c-Jun και AR ανοσοκατακρήμνιση πραγματοποιήθηκε σε LNCaP και LNb4. Βρήκαμε μια αλληλεπίδραση μεταξύ AR και c-jun και στους δύο τύπους κυττάρων, η οποία ενισχύεται από Doc και θεραπεία Pac (Σχήμα 1 F). Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώνουν ότι υπάρχει μία φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ c-Jun και AR που ρυθμίζει την επίδραση της θεραπείας ταξάνης σε κύτταρα PC.

Επιπτώσεις του c-Jun siRNA με την ανταπόκριση Doc

Για να διερευνηθεί αν c-Jun προς τα κάτω ρύθμιση μπορεί να αλλάξει την απόκριση του κυττάρου PC σε Doc έχουμε επιμολυσμένα κύτταρα PC-3 και LNCaP με siRNA ή μη στοχευόμενους siRNA, το οποίο χρησίμευσε ως μάρτυρας (Σχήμα 2Α). Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε Doc για 24 ή 48 ώρες και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία MTS. c-jun ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω, αν και όχι εντελώς μειωθεί στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Α). LNCaP κύτταρα σιγήσει με siRNA παρουσίασε σαφή μείωση στην βιωσιμότητα μετά από 24 ώρες από την έκθεση Doc συγκριτικά με γονικά κύτταρα LNCaP (p = 0,002). Σε κύτταρα PC-3 δεν παρατηρήσαμε σημαντική μεταβολή στην βιωσιμότητα των κυττάρων κατά την ίδια χρονική στιγμή. Μετά από 48 ώρες η επίδραση των c-Jun σίγηση μειώθηκαν και τα κύτταρα ανακτήθηκαν, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β.

(Α) ανάλυση στυπώματος Western που δείχνει την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης του siRNA c-jun στα δύο κύτταρα PC-3 και LNCaP. (Β) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων σε LNCaP (άνω πάνελ) και κύτταρα επιμολυσμένα με c-Jun siRNA ή μη στοχευόμενους (έλεγχος), φορέας PC-3 (κάτω πίνακας). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Doc για 24 και 48 ώρες. LNCaP κύτταρα φιλοξενούν c-jun siRNA έδειξαν μια σημαντική μείωση σε πολλαπλασιασμό (p = 0,002), ενώ PC-3 κύτταρα δεν επηρεάστηκαν.

Η

Ταξάνης επαγόμενη έκφραση ρ-cJun είναι ανεξάρτητη από JNK οδού σε κύτταρα PC

Έχει αναφερθεί ότι Doc χημειοθεραπεία επάγει δράση του μέσω επιλεκτική ενεργοποίηση ΙΝΚ σε καρκινικά κύτταρα [23] . Μόλις ενεργοποιηθεί, JNK φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί μια σειρά από παράγοντες μεταγραφής όπως c-jun. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα αναλύσαμε αν σηματοδοτικό μονοπάτι JNK έχει ένα ρόλο στο έγγραφο που προκαλείται προστάτη θάνατο των καρκινικών κυττάρων. κύτταρα PC-3 και LNCaP υπέστησαν επεξεργασία με 500 ηΜ του αναστολέα JNK για 2 ή 8 ώρες, ενώ Doc και Pac επεξεργασμένα κύτταρα πραγματοποιείται σε χρονικά σημεία 2, 4, 8 και 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α c-Jun φωσφορυλίωση προκλήθηκε 2 ώρες μετά την έκθεση σε Doc σε PC-3 κύτταρα, ενώ η φωσφορυλίωση JNK εμφανίστηκε 24 ώρες μετά την έκθεση σε κύτταρα PC-3 μόνο (Σχήμα 3Α). Σε κύτταρα LNCaP που εκτίθενται σε Doc δεν παρατηρήθηκε σημειώνονται αλλαγές στα JNK φωσφορυλίωση σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο της φαρμακευτικής αγωγής (Σχήμα 3Β). Αυτό υποδηλώνει ότι η ενεργοποίηση ΙΝΚ μπορεί να είναι ένα δευτερεύον αποτέλεσμα της θεραπείας Doc και φωσφορυλίωση c-Jun είναι ο πρωταρχικός στόχος της Doc. Ειδικά σε AR κύτταρα που εκφράζουν LNCaP, μία άμεση αλληλεπίδραση με AR που προκαλούν ταχεία επαγωγή της φωσφορυλίωσης c-Jun δεν μπορεί να αποκλειστεί. Επιπλέον, παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν στα προαναφερθέντα κύτταρα που εκτίθενται σε Pac (δεν δεικνυομένη). Αξίζει να σημειωθεί ότι ένα βασικό επίπεδο ρ-cJun σε μη επεξεργασμένα κύτταρα εκφράστηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.

κηλίδωση Western ανάλυση των PC-3 και (Β) LNCaP κύτταρα (Α) εκτίθενται σε Doc ( 5 ηΜ) για έως 24 ώρες ή παρέμειναν χωρίς θεραπεία (0). PC-3 και LNCap κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 50.000 κυττάρων ανά φρεάτιο και κατεργάστηκαν με Doc και Pac ή σε συνδυασμό με 500 ηΜ αναστολέα JNK (SB) όπως υποδεικνύεται.

Η

Ταξάνης παράγοντες μεταβάλλουν τα επίπεδα της πρωτεΐνης του AR και PSA

Περαιτέρω πειράματα αποκλειστικά διενεργείται μόνο σε κύτταρα LNCaP και LNb4. Με βάση την ανωτέρω αποτέλεσμα μας εξεταστεί περαιτέρω ο τρόπος ταξανίου θεραπεία επηρεάζει την έκφραση του AR ρυθμισμένων γονιδίων όπως PSA σε επίπεδο πρωτεΐνης. Παρατηρήσαμε μια ταυτόχρονη αύξηση του AR και της πρωτεΐνης PSA επίπεδα σε LNCaP κύτταρα σε επεξεργασία Doc (ρ = 0,01, Doc 24 vs ελέγχου) (Σχήμα 4Α). Ωστόσο, σε Pac επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP μια σταδιακή μείωση του AR πρωτεΐνης παρατηρήθηκε ταυτόχρονα με επίπεδα PSA μετά από 48 ώρες (Εικόνα 4Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, η αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης AR σε κύτταρα LNb4 ήταν πιο έντονη από τη θεραπεία Doc, ενώ το επίπεδο της πρωτεΐνης PSA ήταν σαφώς μειωμένη μετά από 48 ώρες (p = 0.02, Doc 24 vs Doc 48). Η έκθεση των κυττάρων σε LNb4 Pac οδήγησε σε αισθητά μειωθεί στο AR και PSA έκφραση της πρωτεΐνης (Σχήμα 4Β). Η έκφραση του ρ-cJun διέφεραν σε LNCaP και LNb4 (Σχήμα 4C, D). Σε κύτταρα LNCaP θεραπεία Doc αυξημένη έκφραση ρ-cJun σταδιακά (ρ = 0,04, Doc 6 vs Doc 48), ενώ σε Pac κατεργασμένων κυττάρων μία αύξηση στις 24 ώρες παρατηρήθηκε, η οποία ακολουθήθηκε από μια αξιοσημείωτη μείωση στις 48 ώρες (Εικόνα 4C) . Ωστόσο, τα κύτταρα σε LNb4 θεραπεία Pac οδήγησε σε εξαρτώμενη από το χρόνο επαγωγής της ρ-cJun, ενώ η αγωγή Doc παρέλειψε να το πράξει (Εικόνα 4D). Δεν αξιοσημείωτες αλλαγές σε c-Jun επίπεδα παρατηρήθηκαν σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές και κάτω από όλες τις συνθήκες που εξετάστηκαν.

Western blotting ανάλυση της έκφρασης του AR και PSA σε κύτταρα (Α) LNCaP και (Β) LNb4. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 5 ηΜ Doc, 5 ηΜ Pac ή 10 ηΜ DHT για έως και 48 ώρες ή παρέμειναν χωρίς θεραπεία. Τα ίδια προϊόντα λύσης χρησιμοποιήθηκαν για να αναλυθεί η έκφραση του ρ-cJun και c-jun σε (C) LNCaP και (D) κύτταρα LNb4. επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση (κάτω πάνελ).

Η

Επίδραση της θεραπείας ταξάνης στην έκφραση c-Jun και AR mRNA

Για να διερευνήσει τις αλλαγές RNA λόγω της θεραπείας ταξάνη, QRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα LNCaP και LNb4. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 5. Αν και παρατηρήσαμε μια αρχική επαγωγή AR-και PSA mRNA σε κύτταρα LNCaP αγωγή Doc, αυτό δεν συνέβη σε θεραπεία Pac. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα LNb4 έδειξαν συνεχή αύξηση της έκφρασης AR mRNA σε ένα χρόνο εξαρτώμενο τρόπο όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με Doc, ενώ PSA mRNA σχετίστηκε αρνητικά για έκφραση AR mRNA (Σχήμα 5Α). Υπήρξε μια στατιστικώς σημαντική διαφορά στο επίπεδο AR και PSA mRNA σε 24 και 48 ώρες έκθεσης σε Doc (ρ = 0,05 και ρ = 0,003, αντίστοιχα). Ωστόσο, σε Pac κατεργασμένα κύτταρα LNb4 παρατηρήσαμε μια αρχική επαγωγή AR και PSA mRNA το οποίο μειώθηκε σε σημαντικό επίπεδο μετά από 48 ώρες. Αντιθέτως, η έκφραση του mRNA c-Jun αυξήθηκαν σημαντικά το Pac αγωγή LNb4 κύτταρα (p = 0.03), η οποία δεν μπορούσε να αποδειχθεί σε κύτταρα κατεργασμένα Doc (Σχήμα 5Β). Όπως ήταν αναμενόμενο η έκφραση KLK2 mRNA έδειξε ένα παρόμοιο μοτίβο όπως PSA mRNA σε όλα τα κύτταρα θεραπεία. Περαιτέρω αναλύσεις για c-myc και NKX3.1 διεξήχθη όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β. Τα αποτελέσματα δεν δείχνουν καμία σημαντική τάση στην έκφραση c-Myc mRNA ανεξάρτητα από ταξανίου που χρησιμοποιείται και του χρόνου της θεραπείας. Παρ ‘όλα αυτά παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση του mRNA NKX3.1 σε όλα τα κύτταρα σε επεξεργασία Doc, ενώ αυτή ήταν λιγότερο έντονη στην Pac επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5Β).

Εκφραση (Α) AR και PSA και (Β) γ -Jun, KLK2, NKX3.1 και c-Myc mRNA επίπεδα σε απόκριση προς Doc ή Pac αξιολογήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR). Η σχετική μέση επίπεδο έκφρασης του mRNA του AR ρυθμισμένων γονιδίων μετρήθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR εις τριπλούν.

Η

Για να συνοψίσουμε τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια σαφή συσχέτιση μεταξύ AR, c-Jun και PSA σε κύτταρα επεξεργασμένα ταξάνη. Το αποτέλεσμα της θεραπείας εξαρτάται από την κατάσταση του υποδοχέα AR και mRNA έκφραση c-jun και του ταξανίου που χρησιμοποιείται.

ζωικό μοντέλο

Για να εκτιμηθεί η θεραπευτική ανταπόκριση της κυτταρικής γραμμής καρκίνου του προστάτη LNCaP in vivo δημιουργήσαμε ένα ζωικό μοντέλο όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 5. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με Doc ή Pac ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με βικαλουταμίδη. Μια statisitically σημαντική μείωση στο μέγεθος του όγκου των ποντικών που έλαβαν μόνο Doc δείχθηκε (ρ = 0,04, Doc vs CTR) (Σχήμα 6Α). Στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με Pac σταθεροποίηση αλλά όχι μείωση στον όγκο του όγκου παρατηρήθηκε (Σχήμα 6Α). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά που παρατηρείται μεταξύ ποντικών και ποντικών που υπέστησαν αγωγή Doc που λαμβάνουν συνδυασμένη θεραπεία με βικαλουταμίδη (Σχήμα 6C). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι όγκοι σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με Pac και όγκους βικαλουταμίδη άρχισαν να αναγεννηθούν μετά από μία αρχική σταθεροποίηση (Σχήμα 6C). Υπήρξε μια στατιστικά σημαντική μείωση του μεγέθους των όγκων στο Doc /BIC σε σύγκριση με το Pac /BIC ποντίκια που έλαβαν θεραπεία (p = 0,003).

(Α) της καμπύλης ανάπτυξης των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με Doc ή Pac μόνο, Doc vs CTR (p = 0.04). (Β) Αντίστοιχες ανοσοϊστοχημική χρώση του ιστού του όγκου. καμπύλη (C) Ανάπτυξη των ποντικών με συνδυασμένη θεραπεία, Doc /βικαλουταμίδη (BIC) vs Pac /Bic (p = 0,003). (D) Αντίστοιχες ανοσοϊστοχημική χρώση του ιστού του όγκου. Σημειώστε ότι ρ-cJun ήταν διαφορικά εκφραζόμενα σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με Doc και Pac. Κί67 έκφραση ήταν υψηλότερη σε Pac σύγκριση με τα ποντίκια έλαβαν Doc.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση του c-Jun, π-cJun, πρωτεΐνες AR και Ki67 στους ιστούς του όγκου που συλλέγονται για να εκτιμηθεί η επίδραση της θεραπείας από τα ναρκωτικά. Υπήρξε μια σημαντική αλλαγή στην πυρηνική AR επίπεδα σε ζώα που έλαβαν Doc μόνη ή Doc /BIC (Σχήμα 6Β και 6D, αντίστοιχα). Και στις δύο ομάδες θεραπείας περίπου 60% του πληθυσμού κυττάρων που εμφανίζεται κυτταροπλασματική μετατόπιση του AR, σε σύγκριση με τα ποντίκια της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 6Β). Σε αντίθεση, οι ποντικοί που έλαβαν θεραπεία με Pac ή θεραπεία συνδυασμού η κυτταροπλασματική μετατόπιση του AR ήταν λιγότερο έντονη. Ωστόσο, η έκφραση του ρ-cJun σε ιστούς από ζώα ελέγχου επέδειξαν έντονη χρώση, ενώ παρατηρήσαμε ότι η πυρηνική ρ-cJun ήταν περισσότερο διακριτή σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή Pac σύγκριση με ζώα που έλαβαν αγωγή Doc όπου επίσης βρέθηκε μια κυτταροπλασματική έκφραση (Σχήμα 6Β). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή του τρόπου διεξαγωγής της έκφρασης c-jun παρατηρήθηκε σε έλεγχο και μεταχείρισης των ζώων. έκφρασης Κί67 ήταν πιο έντονη στην Pac ποντίκια με αγωγή η οποία αντανακλά την κακή αντίδραση των όγκων σε αυτή την ταξάνη in vivo.

Για να επιβεβαιώσετε την κυτταροπλασματική μετατόπιση του AR από θεραπεία με ταξάνη in vitro, Δυτική πειράματα κηλίδωσης διεξήχθησαν σε κύτταρα LNCaP ( Εικόνα S1). Σε συμφωνία με τα δεδομένα in vivo αποδείξαμε ότι ανεξάρτητα επί του ταξανίου που χρησιμοποιείται AR ήταν μετατοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Η μετατόπιση ήταν πιο έντονη στα κύτταρα αντιμετωπίζονται Doc (άνω πάνελ) σε σύγκριση με κύτταρα που κατεργάζονται Pac (κάτω πάνελ), ιδιαίτερα μετά από 48 ώρες θεραπείας.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, θα διευκρινιστεί η ρόλος του AR και συνενεργοποιητή c-jun του στο κύτταρο PC απόκριση σε θεραπεία με ταξάνη. Έχουμε δείξει ότι η c-Jun υπερέκφραση σε κύτταρα PC-3 παρέχει μια στατιστικώς σημαντική μεγαλύτερη αντίσταση στη θεραπεία Doc σύγκριση με τα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με AR /c-jun ή AR μόνο. LNCaP κύτταρα ήταν πιο ανθεκτικά στην Doc παρουσία ή απουσία της βικαλουταμίδης σε σύγκριση με κύτταρα PC-3. Η επιμόλυνση με μεταλλαγμένο Juna αυξημένη βιωσιμότητα, υποδηλώνοντας ότι η c-Jun και την θέση φωσφορυλίωσης 63/73 αποτελεί βασικό ρυθμιστή της κυτταρικής απόκρισης προς ταξάνια σε PC. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι Doc και Pac θεραπεία επηρεάζει διαφορετικά πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του AR και PSA σε γονική LNCaP και LNb4 κύτταρα. Αυτές οι διαφορές αυτές αντανακλούν ανάπτυξης όγκου στο μοντέλο ποντικού. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ αποδεικνύουν ότι η επίδραση της θεραπείας ταξάνης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την c-Jun και AR κατάσταση της κυτταρικής σειράς που χρησιμοποιείται και από το φάρμακο που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία.

Είναι γνωστό ότι η ΑΡ-1 μεταγραφικού παράγοντα είναι πολυλειτουργικό και μερικές φορές αμφιλεγόμενα συζητηθεί στη βιβλιογραφία [24]. c-jun έχει αποδειχθεί ότι μετάγει ένα μιτογόνο απόκριση και να προωθήσει την ανάπτυξη των κυττάρων ως ένα μοναδικό γονίδιο ή σε συνεργασία με ένα ενεργοποιημένο ras γονίδιο [25,26]. Κατά συνέπεια, έχουμε βρει ότι c-Jun υπερέκφραση (μεταλλαγμένο Juna) προσδίδει ανθεκτικότητα στην PC-3 κύτταρα σε θεραπεία Doc. Είναι ενδιαφέρον, Juna βρέθηκε να είναι περισσότερο ισχυρές στην παρεμπόδιση του κυτταρικού θανάτου σε σύγκριση με AR που υποδηλώνει ότι η περιοχή φωσφορυλίωση 63/73 είναι κρίσιμη για την αλληλεπίδραση και τη σταθεροποίηση του AR και c-jun συγκροτήματα. Η διαπίστωση αυτή είναι σύμφωνη με προηγουμένως αναφερθεί μελέτες που δείχνουν ότι η c-Jun μπορεί να δράσει ως αντιαποπτωτικού παράγοντας και όχι προ-αποπτωτικών στο πλαίσιο με την έκθεση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [14,27].