Αφηρημένο

γλοιοβλάστωμα (GBM) είναι ένας επιθετικός, κακοήθης όγκος στον εγκέφαλο συνήθως με αποτέλεσμα το θάνατο του ασθενούς μέσα σε ένα έτος μετά τη διάγνωση? και αυτούς που επιβιώνουν πέρα ​​από αυτό το σημείο συνήθως υπάρχουν με υποτροπή του όγκου μέσα σε δύο χρόνια (5-ετή επιβίωση είναι 5%). Η γενετική ετερογένεια του GBM έχει κάνει το μοριακό χαρακτηρισμό των όγκων αυτών μια περιοχή μεγάλου ενδιαφέροντος και έχει οδηγήσει στην ταυτοποίηση των μοριακών υποτύπων στην GBM. Η διαθεσιμότητα των πλατφορμών αλληλουχίας που είναι τόσο γρήγορο και οικονομικό μπορεί να προωθήσει την υιοθέτηση της αλληλουχίας των όγκων σε κλινικό περιβάλλον, ενδέχεται να οδηγήσει σε ταυτοποίηση των κλινικά προσφυγής γενετικής στόχους. Σε αυτή την πιλοτική μελέτη, που αποτελείται από δείγματα τριπλέτα φυσιολογικό αίμα, πρωτοπαθή όγκο, και επαναλαμβανόμενες δείγματα όγκων από τρεις ασθενείς? συγκρίναμε την ικανότητα της Illumina ολόκληρη αλληλουχίας exome (ExomeSeq) και του Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (CCP) για τον εντοπισμό σωματικών παραλλαγές σε δείγματα πρωτογενούς και υποτροπιάζοντα όγκο ασθενών-ζεύγη. Δεκατρείς γονίδια βρέθηκαν να φιλοξενούν τις παραλλαγές, η πλειοψηφία των οποίων ήταν αποκλειστικά στα δεδομένα ExomeSeq. Παραδόξως, μόνο δύο παραλλαγές πιστοποιήθηκαν με δύο πλατφόρμες και βρίσκονταν εντός του

PTCH1

και

NF1

γονίδια. Αν και προκαταρκτικό χαρακτήρα, το έργο αυτό αναδεικνύει σημαντικές διαφορές στην αναγνώριση παραλλαγή σε δεδομένα που δημιουργούνται από τις δύο πλατφόρμες. Πρόσθετες μελέτες με μεγαλύτερα μεγέθη των δειγμάτων που απαιτούνται για να διερευνήσει περαιτέρω τις διαφορές μεταξύ αυτών των τεχνολογιών και να ενισχύσουν την κατανόησή μας για την κλινική χρησιμότητα των πλατφόρμων που βασίζονται πάνελ στο γονιδιακό προφίλ των όγκων του εγκεφάλου

Παράθεση:. Virk SM, Gibson RM, κινόνες-Mateu ME, Barnholtz-Sloan JS (2015) Προσδιορισμός των παραλλαγών στην Πρωτοβάθμια και Επαναλαμβανόμενες γλοιοβλάστωμα Χρησιμοποιώντας μια ειδική για τον καρκίνο Panel Gene και ολόκληρου exome αλληλουχίας. PLoS ONE 10 (5): e0124178. doi: 10.1371 /journal.pone.0124178

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 7 Φεβ 2015? Αποδεκτές: 19 Φεβ 2015? Δημοσιεύθηκε: May 7, 2015

Copyright: © 2015 Virk et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Illumina ολόκληρη exome δεδομένα αλληλουχίας είναι διαθέσιμα από τον καρκίνο Genome Atlas: https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga. Αναγνωριστικά TCGA που χρησιμοποιούνται σε αυτή την ανάλυση ήταν: TCGA-0957 (UH1), TCGA-1389 (UH2), TCGA-4065 (UH3). Για να εξασφαλιστεί η συμμόρφωση με τις κατευθυντήριες γραμμές για την προστασία των δεδομένων που προέρχονται από ανθρώπινα υποκείμενα, τα δεδομένα Ion AmpliSeq είναι διαθέσιμα από τους συγγραφείς κατόπιν αιτήματος και από το The Brain Tumor Νευρο-ογκολογίας επικεφαλής της ομάδας των Νόσων Οχάιο Δρ Andrew Sloan: [email protected] .

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (www.nih.gov) 5R25CA094186 SMV, National Institutes of Health HHSN261201000057C, και ΝΙΗ /ΝΟΙ 2P30 CA043703-23 ​​ΚΕΑ

ανταγωνιστικά συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γλοιοβλάστωμα (GBM) είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενες πρωτοπαθούς όγκου του εγκεφάλου σε ενήλικες [1].. Αν και θεωρείται μια σπάνια μορφή καρκίνου, με συχνότητα εμφάνισης 2 έως 3 περιπτώσεις ανά 100.000 άτομα στις Ηνωμένες Πολιτείες, αυτός ο όγκος συμβάλλει δυσανάλογα με τη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα του καρκίνου [1, 2]. Η τρέχουσα πρότυπη θεραπεία για τους ασθενείς GBM είναι η χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου ακολουθούμενη από επικουρική ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία (δηλαδή «Stupp» πρωτόκολλο) [3]? Ωστόσο, παρά την επιθετική θεραπεία, GBM επαναλαμβάνεται σε πολλούς ασθενείς μέσα σε δύο χρόνια [4]. Λόγω αυτής της υψηλής πιθανότητας επανάληψης, είναι επιτακτική ανάγκη να ληφθεί μια καλύτερη κατανόηση των γενετικών και μοριακών μεταβολών που συμβαίνουν μετά την πρωτογενή εκτομή του όγκου και τη θεραπεία. Αυτή η πληροφορία θα μπορούσε να είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη νέων θεραπειών που έχουν τη δυνατότητα να αυξήσει την επιβίωση των ασθενών GBM.

Οι γενετικές διαφορές μεταξύ των πρωτογενών και υποτροπιαζόντων όγκων έχουν ακόμη να χαρακτηρίζεται πλήρως, τα οποία έχουν περιορίσει την ανάπτυξη αποτελεσματικών στοχευμένων θεραπείες για την καταπολέμηση της υποτροπιάζουσας GBM [5]. Μεταλλάξεις σε συγκεκριμένα γονίδια έχουν δειχθεί ότι είναι διαδεδομένη σε περιπτώσεις GBM [6, 7]. Που οφείλονται σε γνωστά δια- και ενδο- ατομική ετερογένεια στην GBM [8, 9], σημαντική προσπάθεια έχει γίνει για την αναγνώριση όχι μόνο μεμονωμένα μεταλλαγμένα γονίδια, αλλά να αναπτύξει συστήματα ταξινόμησης για τον χαρακτηρισμό των όγκων από το μοριακό υπότυπο [10, 11]. Ο τελικός στόχος είναι να χρησιμοποιήσετε την ταξινόμηση των όγκων ως μοριακό διαγνωστικό εργαλείο ή προγνωστικός δείκτης της συνολικής επιβίωσης, οδηγώντας τελικά στην ανακάλυψη νέων θεραπευτικών στρατηγικών.

Deep (επόμενη γενιά) αλληλουχίας ανατρέπει εκ βάθρων την κατανόησή μας των σωματικών αλλαγών που συμβαίνουν στο γονιδίωμα του καρκίνου. Οι μελέτες συγκρίνοντας πολλαπλούς τύπους όγκων φωτίζοντας τόσο τη σχέση μεταξύ γενετικών μεταλλάξεων και καρκίνου του τύπου, καθώς και απορρυθμισμένης οδούς που είναι κοινές σε όλη καρκίνοι ή ειδικές για υποσύνολο των τύπων καρκίνου [12-14]. Αν και η Illumina (Illumina, San Diego, CA) βαθιά πλατφόρμα αλληλουχίας είναι ο σημερινός ηγέτης στην κλινική έρευνα του καρκίνου [15], άλλες τεχνολογίες, όπως Ion Torrent (Life Technologies, Carlsbad, CA) [16] είναι κατάλληλα για ευρύτερες μεθόδους διαλογής με βάση για μείωση του χρόνου αλληλουχίας και το κόστος ανά δείγμα [17]. Σε αυτή τη μελέτη αξιολόγησε την ικανότητα του ιόντος AmpliSeq Comprehensive Panel Cancer (Life Technologies, Carlsbad, CA) για να ταυτοποιηθούν οι παραλλαγές σε δείγματα εις τριπλούν (συμφωνημένα αίμα, πρωτογενών και επανεμφανιζόμενων όγκων) από τρεις ασθενείς GBM και συνέκριναν τα αποτελέσματα με τα στοιχεία προσδιορισμού αλληλουχίας ολόκληρο exome λαμβάνονται με τη χρήση της πλατφόρμας Illumina από το έργο του καρκίνου Γονιδιώματος Atlas (TCGA) [18].

Υλικά και Μέθοδοι

Μελέτη ασθενείς και την επεξεργασία του δείγματος

ασθενών GBM προοπτικά προσληφθεί ως μέρος της συνεχιζόμενης Οχάιο Brain Tumor μελέτη (OBTS), μία προοπτική μελέτη ασθενών πρωτοβάθμιας καλοήθων και κακοήθων όγκων του εγκεφάλου από τις τέσσερις μεγάλες ακαδημαϊκά κέντρα στην πολιτεία του Οχάιο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς κατά τη διάρκεια της εγγραφής τους σε OBTS, η οποία συνέβη πριν από τη συλλογή του δείγματος. Όλα τα θέματα πρωτοκόλλων και διαδικασιών ανθρώπινου εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο κριτική Θεσμικών στο Πανεπιστήμιο Νοσοκομεία υπόθεση Ιατρικό Κέντρο, Κλίβελαντ, Οχάιο. δείγματα αίματος προ-θεραπεία μαζί με πρωτογενών και επανεμφανιζόμενων ιστών καταψύχθηκαν ταχέως όγκου (δείγματα τριπλή) συλλέχθηκαν από τρεις ενήλικες ασθενείς. Το Σχήμα 1 παρέχει μια επισκόπηση των διαδικασιών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Οι ιστοί καταψύχθηκαν μέσα σε 15 με 30 λεπτά μετά την εκτομή. Δείγματα και κλινικές πληροφορίες συλλέχθηκαν και αρχειοθετούνται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από τον καρκίνο Genome Atlas [18] και η καθαρότητα των όγκων ήταν προσβάσιμες από ιστολογική εξέταση από σκάφους επικυρωμένο νευροπαθολόγο. Δύο τομές ελήφθησαν από κάθε δείγμα ασθενούς (3 δείγματα /ασθενή Χ2) και μία συλλογή δειγμάτων τριπλέτας από όλους τους τρεις ασθενείς υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας σε κάθε μία από τις δύο πλατφόρμες αλληλούχισης.

Ο προσδιορισμός αλληλουχίας των δειγμάτων AmpliSeq CCP έγινε με τη χρήση του Ion 318 Chip και αλληλούχιση ολόκληρη exome προσχηματίστηκε χρησιμοποιώντας το γονιδίωμα Analyzer II ή HiSeq 2000, τόσο από Illumina.

η

Ελήφθη αίμα σε σωληνάρια PAXgene DNA και το DNA εξάγεται χρησιμοποιώντας κιτ PAXgene DNA Blood (Qiagen , Valencia, CA). Ολικό DNA απομονώθηκε από τα δείγματα όγκου εγκεφάλου καταψύχθηκαν χρησιμοποιώντας το Maxwell 16 DNA κιτ καθαρισμού (Promega, Madison, WI). DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας Nanodrop ND-100 (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) και qubit 2.0 φθοριόμετρο (Life Technologies, Carlsbad, CA). δείγματα DNA τριπλέτα ασθενή-ζεύγη από τρεις ασθενείς υποβλήθηκαν σε αλληλούχιση χρησιμοποιώντας (i) αλληλουχίας ολόκληρη exome για την Illumina GA-IIX ή HiSeq 2000 [ExomeSeq] (Σχήμα 1), ως μέρος του έργου του καρκίνου Γονιδιώματος Atlas, όπως αναφέρεται στο [18] και ( ii) ο Ίων AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (Ίων AmpliSeq ΚΚΚ, Life Technologies). Για το σκοπό αυτό, τέσσερις πισίνες αμπλικόνιο ανά δείγμα που καλύπτει 409 γονίδια που εμπλέκονται στον καρκίνο ήταν ποσοτικά (2100 Bioanalyzer DNA 7500, Agilent Technologies), που παρασκευάζεται και εμπλουτίζεται για αλληλούχιση στο Ion Σφαίρα Σωματίδια (ISP) με χρήση του Ion OneTouch 200 Template Kit v2 (Life Technologies ) στην OneTouch ™ 2 Σύστημα ιόντων (Life Technologies). Templated ISPs ποσοτικοποιήθηκαν (qubit 2.0, Life Technologies) και φορτώθηκαν σε ένα ιόν 318 Chip (ϋίβ Technologies) που θα αλληλουχία στο Ion PGM χρησιμοποιώντας το Ion PGM Sequencing 200 v2 Kit (Life Technologies). Η μέση απόδοση φόρτωσης στο Ion Torrent PGM ήταν 88% σε όλες τις εννέα Ion 318 chips με μέσο όρο 5,9 εκατ διαβάζει ανά δείγμα. Μεμονωμένα δείγματα κατά μέσο όρο ανά 5,8 εκατομμύρια χαρτογραφηθεί αλληλουχία διαβάζει, με μέση διαβάσει μήκος 109 ζευγών βάσεων. Η μέση κάλυψη του στόχου στον Ion Torrent PGM ήταν 315x και 377x για τα δείγματα αίματος και όγκου, αντίστοιχα. Στην περίπτωση του TCGA Illumina αλληλούχιση ολόκληρο exome, η μέση κάλυψη στόχος ήταν 121x και 138x για τα δείγματα αίματος και όγκου, αντιστοίχως. Επεξεργασία σήματος και τη βάση κάλεσμα των δεδομένων ακολουθίας που παράγεται από το Ion Torrent PGM έγινε με Torrent Analysis Suite έκδοση 3.4.2. Υψηλής ποιότητας διαβάζει (μια ποιότητα βαθμολογία & gt? 20) από τα αρχεία FASTQ που δημιουργούνται από το Ion Torrent PGM διακομιστή κόπηκαν από τον προσαρμογέα, το barcode, και αλληλουχίες εκκινητή πριν από την ευθυγράμμιση με το συγκρότημα ανθρώπινο γονιδίωμα 19 ακολουθία (Hg19)

Επεξεργασία δεδομένων και παραλλαγή Αναγνώριση

Πριν από την παραλλαγή ανάλυσης, αρχεία FASTQ που δημιουργούνται από τις δύο πλατφόρμες υποβλήθηκαν σε διάφορα στάδια προεπεξεργασία. αρχεία FASTQ ευθυγραμμίστηκαν με την Human Genome Consortium Αναφορά χτίσει 37 (Hg19) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Burroughs-Wheeler Ευθυγράμμιση όπως εφαρμόζεται στο πακέτο v.0.7.2 λογισμικού BWA, με αποτέλεσμα την παραγωγή των αρχείων BAM του ευθυγραμμιστεί διαβάζει. Μετά την ευθυγράμμιση του γονιδιώματος, η v.3.2.2 Γονιδιώματος Analysis Toolkit χρησιμοποιήθηκε για να επαναπροσδιορίσουμε διαβάζει γύρω από την εισαγωγή /διαγραφές και αναβαθμονομήσει βαθμολογίες ποιότητας βάση τόσο για ExomeSeq και τα δεδομένα AmpliSeq. Η ExomeSeq διαβάζει υποβλήθηκαν σε διπλές σήμανση και την αφαίρεση πριν από την επανευθυγράμμιση και τη βάση βήματα επαναβαθμονόμηση. αρχεία BAM ταξινομήθηκαν στην συντονίζει τάξη και τα αρχεία δείκτη BAM παρήχθησαν χρησιμοποιώντας Picard v.1.119. Παραλλαγή κλήση έγινε σε στοίχιση διαβάζει σε συνδυασμό με δείγματα ασθενών, δηλαδή, του αίματος (κανονική) έναντι πρωτογενή ή υποτροπιάζοντα ιστό του όγκου, χρησιμοποιώντας MuTect v.1.1.4 [19] μαζί με dbSNP 138. Παραλλαγές σχολιάστηκαν με ANNOVAR v.111214 (http : //www.openbioinformatics.org/annovar/) και διαβάστε ευθυγραμμίσεις απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας IGV v2.3.2 (https://www.broadinstitute.org/igv/). Παραλλαγή ανάλυση περιορίστηκε σε παραλλαγές που συμβαίνουν σε περιοχές exome.

Αποτελέσματα

δημογραφικά στοιχεία των ασθενών και τη θεραπεία

Ανάμεσα στους τρεις ασθενείς που περιλαμβάνονται αυτή τη μελέτη, ο μέσος όρος ηλικίας ήταν 45 έτη και η μέση συνολική επιβίωση ήταν 441 ημέρες (Πίνακας 1). Όλοι εκτός από έναν ασθενή ήταν άνδρες και όλοι ήταν άσπρο (ένας ασθενής επίσης αυτο-προσδιορίζονται ως ισπανόφωνων). Κάθε ασθενής έλαβε την ίδια μεταχείριση, η οποία αποτελείτο από συνολική εκτομή ακολουθούμενη από επικουρική τεμοζολομίδη και εξωτερική ακτινοβολία. Επιπλέον, όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε μία δεύτερη χειρουργική επέμβαση κατά την υποτροπή. Η καθαρότητα των δειγμάτων πρωτογενούς όγκου ήταν μεγαλύτερη από ό, τι σε δείγματα υποτροπιάζοντα όγκο, που κυμαίνονται από 80-90% έως 65-75%, αντίστοιχα (Πίνακας 1).

Η

οι παραλλαγές που προσδιορίζονται τόσο από ExomeSeq και AmpliSeq CCP

από τεχνολογίες αλληλουχίας ολόκληρη exome έχουν την ικανότητα να καλύψει όλα τα γονίδια που κωδικοποιούν εντός του γονιδιώματος, ενώ κάθε πάνελ προσέγγιση βασισμένη θα πρέπει να περιορίζεται σε ένα υποσύνολο της κωδικοποίησης γονιδιώματος, για να κάνει την πιο κατάλληλη σύγκριση μεταξύ των δύο τεχνολογιών που περιορίζεται μας ανάλυση των 409 γονιδίων που περιλαμβάνονται στον πίνακα AmpliSeq. Επιπλέον, δεδομένου ότι ήμασταν ενδιαφέρονται περισσότερο για παραλλαγές μέσα σε περιοχές κωδικοποίησης, εστιάσαμε επίσης στην ανάλυση των παραλλαγών μέσα σε μόνο εξώνια. Παραλλαγές εντοπίστηκαν σε 13 (3%) των 409 γονιδίων που αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Η πλειοψηφία των παραλλαγών βρέθηκαν στα δεδομένα ExomeSeq και μόνο δύο παραλλαγές του γονιδίου μοιράστηκαν μεταξύ των δύο πλατφορμών (Σχήμα 2).

Τα γονίδια που περιέχουν παραλλαγές και οι σχετικές πλατφόρμες αλληλουχίας που φαίνεται. Οι περισσότερες παραλλαγές που σχετίζονται με τα δεδομένα ExomeSeq και υπήρχαν συνολικά 409 γονιδίων στο AmpliSeq ΚΚΚ.

Η

Οι παραλλαγές που βρέθηκαν από τις δύο πλατφόρμες ήταν στα γονίδια

PTCH1

(patched 1) και

NF1

(νευροφιμπρομίνης 1). Λεπτομερής ανάλυση των

PTCH1

παραλλαγή αποκάλυψε παρόμοια κάλυψη της μεταλλαγμένης βάσης (Σχήμα 3Α), τόσο τα δεδομένα AmpliSeq και ExomeSeq σε 26 και 24 διαβάζει, αντίστοιχα? και ο πίνακας AmpliSeq είχαν χαμηλότερο ποσοστό (23% έναντι 38%) διαβάζει περιέχει την εναλλακτική βάση. Το άλλο κοινόχρηστο παραλλαγή βρέθηκε στο

NF1

γονιδίου (Σχήμα 3Β) και σε αυτή την περίπτωση οι δύο πλατφόρμες διέφεραν σε μεγάλο βαθμό όσον αφορά την κάλυψη ανάγνωσης του μεταλλαγμένου βάσης. Στα δεδομένα ExomeSeq, υπήρχαν 38 διαβάζει καλύπτει τη βάση της παραλλαγής και 18 (47%) περιείχαν την παραλλαγή? ενώ 360 διαβάζει τα δεδομένα AmpliSeq καλύπτει τη βάση και το 20% (71 αναγνώσεις) περιείχε την παραλλαγή.

NF1

ήταν επίσης μία από τις τέσσερις παραλλαγές που προσδιορίζονται σε ένα επαναλαμβανόμενο δείγμα όγκου

(Α) Προβολή εμφανίζεται ανοίγματα CHR9:. 98,209,620-98,209,640 του

PTCH1

? παραλλαγή βάση είναι το G σε Α μετάλλαξη που βρίσκεται στη βάση 98.209.634 σε πρωτοπαθή όγκο των UH1 ασθενούς. (Β) Προβολή εμφανίζεται ανοίγματα chr17: 29,585,500-29,585,530 του

NF1

? παραλλαγή είναι το G σε Α μετάλλαξη που βρίσκεται στη βάση 29.585.518 σε υποτροπιάζοντα όγκο των UH3 ασθενούς. Η βάση παραλλαγή βρίσκεται μεταξύ των δύο κάθετες γραμμές που διασχίζουν το διαβάζει.

Η

παραλλαγές που προσδιορίζονται από ExomeSeq αλλά όχι από AmpliSeq ΚΚΚ

Υπήρχαν συνολικά 10 παραλλαγές σε οκτώ γονίδια που υποτίθεται ότι περιλαμβάνονται στην AmpliSeq ΚΣΕ που εντοπίστηκαν μόνο από την προσέγγιση ExomeSeq. Δύο από αυτά τα γονίδια ήταν

PTEN

(φωσφατάση και tensin ομόλογο) και

TP53

(πρωτεΐνη όγκου p53), δύο εκ των οποίων βρέθηκαν στην πρωτογενή και επαναλαμβανόμενες όγκους UH3 ασθενούς. Και τα δύο από αυτά τα γονίδια είναι συχνά μεταλλάσσεται σε GBM και πολλές άλλες μορφές καρκίνου. Στον πρωτογενή όγκο, το εξόνιο που περιέχει το μεταλλαγμένο βάσης στο

PTEN

καλύφθηκε ευρέως από τα ExomeSeq διαβάζει και το μεταλλαγμένο βάση καλύφθηκε κατά 26 διαβάζει, εκ των οποίων το 65% περιείχε την παραλλαγή? Ωστόσο, το ίδιο εξώνιο καλύφθηκε μόνο εν μέρει από διαβάζει από το κανένα AmpliSeq ΚΚΚ (Σχήμα 4Α) εκ των οποίων κάλυψε την μεταλλαγμένη βάση. Ομοίως, μια μετάλλαξη στο

ΤΡ53

γονίδιο καλύφθηκε με 98 ExomeSeq διαβάζει, 53% περιείχε την βάση παραλλαγή, ενώ δεν AmpliSeq CCP διαβάζει καλύπτεται αυτή την περιοχή του εξονίου (Εικόνα 4Β). Ανάλυση της κάλυψης ανάγνωσης του

ΡΤΕΝ

και

ΤΡ53

στον υποτροπιάζοντα όγκο του UH3 ασθενής βρέθηκε μια αύξηση στον αριθμό των διαβάζει καλύπτει την βάση παραλλαγή σε σύγκριση με τον πρωτογενή όγκο και για τα δύο γονίδια σε 68 και 121, αντίστοιχα. Όσον αφορά την αναλογία των διαβάζει καλύπτει τη βάση που επίσης μεταλλαγμένο, υπήρχε μια μείωση για

PTEN

στο 40% και για το

TP53

, το ποσοστό ήταν σχεδόν το ίδιο με το πρωτογενούς όγκου στο 54%. Επιπλέον, τα δεδομένα AmpliSeq για την υποτροπιάζοντα όγκο παρήγαγε μια απλή ανάγνωση που καλύπτει την μεταλλαγμένη βάση στο

TP53

, αυτό διαβάστε περιείχε επίσης την παραλλαγή.

Τα στοιχεία AmpliSeq δεν παράγει οποιοδήποτε διαβάζει καλύπτει η παραλλαγή βάσης στο

PTEN

? Ωστόσο, ένα μόνο δεν διαβάζουν φαίνεται στο γραφικό έκανε καλύψει τη βάση παραλλαγή στο

TP53

στον υποτροπιάζοντα όγκο. Τα δεδομένα από πρωτογενείς όγκους φαίνεται. (Α) View εμφανίζεται ανοίγματα chr10: 89,653,700-89,653,900 του

PTEN

? παραλλαγή είναι Τ σε G μετάλλαξη που βρίσκεται στη βάση 89653783. (Β) Άποψη του

TP53

εμφανίζει την περιοχή της chr17: 7,578,400-7,578,600? παραλλαγή είναι το G σε Α μετάλλαξη που βρίσκεται στη βάση 7578475. Η τοποθεσία της βάσης παραλλαγή υποδεικνύεται από την κάθετη γραμμή που διασχίζουν το διαβάζει.

Η

Το

PIK3CG

(φωσφατιδυλινοσιτόλης-4,5-διφωσφορικής 3-κινάσης, καταλυτική υπομονάδα γ) του γονιδίου ήταν το μόνο γονίδιο βρέθηκε να μεταλλαχθεί σε περισσότερα από ένα ασθενή, ειδικά αυτό το γονίδιο περιείχε δύο διαφορετικές παραλλαγές και ένα από το καθένα ήταν παρούσα στις πρωτογενείς όγκους των δύο UH1 και UH3 άτομα (Πίνακας 2). Είναι ενδιαφέρον ότι, δύο παραλλαγές εντοπίστηκαν στο

γονίδιο LLP

(τομέα ΕΑΥ περιέχει προτιμώμενο συνεργάτη μετατόπιση σε λίπωμα), τόσο στον πρωτογενή όγκο των UH2 ασθενούς (Πίνακας 2). Αυτές οι δύο παραλλαγές που βρίσκονται σε παρακείμενες βάσεις. Εξέταση όλων των γονιδίων AmpliSeq ΚΚΚ που περιέχονται παραλλαγές μόνο στα δεδομένα ExomeSeq αποκάλυψε το

LLP

γονίδιο να έχει τη μεγαλύτερη κάλυψη με 1388 και 1403 διαβάζει για το πρώτο και δεύτερο παραλλαγή, αντίστοιχα. Και στις δύο περιπτώσεις, το 80% των αναγνώσεις μεταλλάχθηκαν.

Η

παραλλάγματα προσδιορίζονται αποκλειστικά από AmpliSeq ΚΚΚ

Σε αντίθεση με τις παραλλαγές μοναδική για τα δεδομένα ExomeSeq, τρεις παραλλαγές σε τρεις διαφορετικές γονίδια εντοπίστηκαν από το AmpliSeq ΚΚΚ αλλά όχι από ολόκληρο αλληλούχιση exome (Εικόνα 2 και Πίνακας 2). Και οι τρεις παραλλαγές ανιχνεύθηκαν σε πρωτογενείς όγκους των δύο ασθενείς (UH1 & amp? UH2), ειδικά στο

DPYD

(διυδροπυριμιδίνης αφυδρογονάση),

MCL1

(v-myc μυελοκυτομάτωσης ιικό ογκογονίδιο ομόλογο 1, καρκίνωμα του πνεύμονα που προέρχονται [γρίπης]), και

TNK2

(κινάσης τυροσίνης, μη-υποδοχέα, 2) γονίδια. Καμία από τις τρεις παραλλαγές μοναδική για AmpliSeq ΚΚΚ ορίστηκαν ως «καλύπτονται» από το λογισμικό MuTect, δείχνει λιγότερο από 80% ισχύ για να ανιχνεύσει αυτές τις παραλλαγές σε 0,3 κλάσμα αλληλομόρφων.

Συζήτηση

Deep αλληλουχίας μεθοδολογίες έχουν ξεσηκώσει πολλές βιολογικές και βιοϊατρικές πεδία με τον καρκίνο, ιδιαίτερα διαγνωστικών και θεραπευτικών στρατηγικών, είναι ένα από τα πιο κρούση [20, 21]. Μεγάλη προσπάθεια έχει δοθεί στην αλληλούχιση ολόκληρων γονιδιωμάτων ή ολόκληρων exomes για τον εντοπισμό κρίσιμων καρκίνου που σχετίζονται με μεταλλάξεις που μπορεί να οδηγήσουν εξατομικευμένες και στοχευμένες θεραπείες [22]. Δυστυχώς, παρόλο που η πρόσβαση σε τεχνολογίες βαθιά αλληλουχίας έχει αυξηθεί σημαντικά κατά τα τελευταία χρόνια, η συνεχιζόμενη σχετικά υψηλό κόστος της αλληλουχίας και την πολυπλοκότητα της ανάλυσης ώθησε την ανάπτυξη των πιο προσιτές όργανα και μεθοδολογίες, μαζί με την απλοποίηση του αριθμού των γονιδίων σε να αναλυθεί. Ο Ίων AmpliSeq ΚΚΚ αναπτύχθηκε σε ακολουθία all-εξόνιο κάλυψη των 409 γονιδίων που εμπλέκονται στον καρκίνο, δηλαδή, πάνω από το 50% του Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Gene Απογραφή (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/census ). Σε αυτή την πιλοτική μελέτη χρησιμοποιήσαμε το AmpliSeq ΚΚΚ στην ακολουθία ταιριάζει στο αίμα, πρωτοβάθμιας και επαναλαμβανόμενες όγκους από τρεις ασθενείς GBM και συνέκριναν τα αποτελέσματα με τα στοιχεία της αλληλουχίας ολόκληρη exome λαμβάνονται χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina από το έργο του καρκίνου Γονιδιώματος Atlas (TCGA).

Συνολικά, λίγα γονίδια βρέθηκαν να περιέχουν παραλλαγές σε αυτή τη μελέτη (13 γονίδια) και μεταξύ αυτών, μόνο δύο παραλλαγές κοινού προσδιορίζεται από τα δύο προσεγγίσεις αλληλουχίας (ExomeSeq και AmpliSeq ΚΚΚ). Μια παραλλαγή στο

PTCH1

γονίδιο εντοπίστηκε στον πρωτογενή όγκο από UH1 ασθενή. Αυτό λειτουργεί ογκοκατασταλτικό γονίδιο στο μονοπάτι σηματοδότησης Hedgehog και να έχει εμφάνιση που πρόκειται να μεταλλαχθεί σε παιδιατρικούς μυελοβλάστωμα [23]. Η δεύτερη παραλλαγή ήταν εντός του γονιδίου

NF1

(επίσης ένα ογκοκατασταλτικό), το οποίο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη νευροφιμπρομίνης 1 και αποτελεί συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο σε GBM [18]. Αυτές οι δύο παραλλαγές ήταν το μόνο δύο καλύπτονται από το λογισμικό MuTect, γεγονός που καθιστά αποτελεσματικά

PTCH1

και

NF1

τα πιο αξιόπιστα προσδιορίζονται παραλλαγές στα δεδομένα AmpliSeq ΚΚΚ.

Δεν υπήρχε επίσης, μικρή επικάλυψη των παραλλαγών μεταξύ μεμονωμένων ασθενών και τύπους όγκων. Το μόνο γονίδιο που ταυτοποιείται ως παραλλαγή σε περισσότερους από έναν ασθενή ήταν

PIK3CG

, το οποίο μεταλλάχθηκε σε πρωτογενείς όγκους από ασθενείς UH1 & amp? UH3. Αυτό το γονίδιο που περιέχεται διαφορετικές παραλλαγές στις δύο όγκους και ήταν παρούσα μόνο στα δεδομένα ExomeSeq. Τα γονίδια

PTEN

και

TP53

περιείχε το μόνο παραλλαγές του γονιδίου που προσδιορίζονται τόσο στην πρωτογενή όσο και επαναλαμβανόμενων όγκων του ίδιου του ασθενούς, UH3. Παρά το γεγονός ότι και τα δύο γονίδια είναι μεταξύ εκείνων που συχνά μεταλλάσσεται σε GBM, αυτές οι παραλλαγές ήταν επίσης αποκλειστικά στα δεδομένα ExomeSeq. Περαιτέρω επιθεώρηση των ευθυγραμμίσεων στις βάσεις παραλλαγή αποκάλυψαν μόνο μερική κάλυψη της παραλλαγής που περιέχει εξόνια από το AmpliSeq διαβάζει, το οποίο είναι ένα πιθανό συνεισφέρων με την παραλλαγή δεν ανιχνεύεται από αυτόν τον πίνακα.

Αναμενόταν ότι θα υπάρχει είναι οι διαφορές στις παραλλαγές που προσδιορίζονται από τα δεδομένα ExomeSeq και AmpliSeq ΚΚΚ. Σε μια προσπάθεια να περιορίσει τις διαφορές αυτές, έχουμε περιορίσει την ανάλυση ώστε να περιλαμβάνει μόνο τα γονίδια που ήταν στη λίστα του γονιδίου της AmpliSeq ΚΚΚ. Οι διαφορετικές τεχνολογικές προσεγγίσεις της αλληλουχίας ενός ολόκληρου exome έναντι αλληλούχιση ένα εστιασμένο υποσύνολο των γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο, θα μπορούσε πιθανόν να οδηγήσει στην εύρεση λιγότερων μεταλλαγμένα γονίδια χρησιμοποιώντας την πιο εστιασμένη προσέγγιση, όπως παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Ένα άλλο σημείο που πρέπει να λαμβάνει υπόψη της ότι ενδονεοπλαστική ετερογένεια είναι ένα χαρακτηριστικό πολλών μορφών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του GBM. Η ανάλυση που αναφέρονται εδώ έγινε χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά τεμάχια από κάθε όγκου του ασθενούς και παρατηρούνται διαφορές μας στην ταυτοποίηση παραλλαγή θα μπορούσε να προέλθει από την εγγενή ενδονεοπλαστική ετερογένεια στην GBM.

Αυτή η ανάλυση αποδεικνύει ότι τα γονίδια

PTCH1

και

NF1

μπορεί να ανιχνευθεί αξιόπιστα σε δείγματα ασθενών και ότι η έλλειψη ευρείας κάλυψης εξόνιο μπορεί να επηρεάσει παραλλαγή ανίχνευσης σε αυτές τις περιοχές. Τα γονίδια που περιλαμβάνονται στο AmpliSeq ΚΚΚ επιλέχθηκαν να είναι αντιπροσωπευτικά της μια μεγάλη ποικιλία τύπων καρκίνου και πάνελ γονιδίων πιο ειδικά για όγκους του εγκεφάλου και του εγκεφάλου μπορεί να βελτιώσει την ανίχνευση παραλλαγή στην GBM. Αν και μερικές μελέτες έχουν αξιολογήσει τη χρήση βαθιά πάνελ αλληλουχίας που βασίζεται για την ταχεία προσδιορισμό του γονότυπου του καρκίνου [23, 24], πιλοτική μελέτη μας δείχνει τις δυνατότητες για την Ion AmpliSeq ΚΚΚ να συμβάλει στην ανίχνευση μεταλλάξεων στη βασική και κλινική έρευνα για τον καρκίνο. Περαιτέρω μελέτες, με μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων θα μας βοηθήσει να κατανοήσουμε τις διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ των δύο μεθοδολογιών και να προσθέσετε την τρέχουσα κατανόησή μας των μεταλλάξεων που οδηγούν την εξέλιξη και την επανάληψη στην GBM.

Ευχαριστίες

Η συγγραφείς θα ήθελαν να αναγνωρίσουν τους ασθενείς που συμμετείχαν στο έργο Cancer Genome Atlas (TCGA) και ο Andrew E. Sloan, MD, για την υποστήριξή του για την βιοτράπεζας όγκου του εγκεφάλου Πανεπιστημιακά Νοσοκομεία. Τα αποτελέσματα δημοσιεύονται εδώ είναι εν όλω ή εν μέρει βασίζεται στο έργο του καρκίνου Γονιδιώματος Atlas συστάθηκε με το NCI και NHGRI. Περισσότερες πληροφορίες για TCGA μπορείτε να βρείτε εδώ: https://cancergenome.nih.gov/

.