Αφηρημένο

RB1 ​​

-inducible συσπειρωμένης σπείρας 1 (RB1CC1, επίσης γνωστή ως FIP200) παίζει ρόλο στην ενίσχυση της οδού RB1 μέσω της άμεσης σύνδεσης στην πλούσια σε GC περιοχή 201bp ανοδικά (από την έναρξη ATG) του

RB1 ​​

υποκινητή. Εδώ, ταυτοποιήσαμε hSNF5 και ρ53 ως συνεταίροι δέσμευσης του RB1CC1 με προσδιορισμούς ανοσοκαθίζησης και ανοσοφθορισμό. Η αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των μορίων και της οδού RB1 αναλύθηκε με τις δοκιμασίες της χρωματίνης ανοσοκαταβύθισης, λουσιφεράση-ρεπόρτερ, η αντίστροφη μεταγραφή-αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης και ανοσοστύπωμα. Η καταστολή της ανάπτυξης του όγκου με RB1CC1 αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής ή με δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης. Το συγκρότημα πυρηνικών RB1CC1 αφορούν hSNF5 ή /και να ενεργοποιηθεί p53 μεταγραφή του

RB1 ​​

,

p16

και

p21

, και κατέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, η έκφραση της πυρηνικής RB1CC1 συσχετίζεται σημαντικά με εκείνα των RB1 και ρ16 σε καρκινικό ιστό του μαστού

in vivo

, και ο δείκτης πολλαπλασιασμού Ki-67 εξαρτιόταν από ρ53 καθώς RB1CC1. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι RB1CC1 μαζί με hSNF5 ή /και p53 ενισχύει την οδό RB1 μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης του

RB1 ​​

,

p16

και

p21

. Αξιολόγηση της έκφρασης RB1CC1 σε συνδυασμό με RB1 και η κατάσταση ρ53 αναμένεται να παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες στην κλινική πρακτική και μελλοντικές θεραπευτικές στρατηγικές στον καρκίνο του μαστού

Παράθεση:. Chano Τ, Ikebuchi Κ, Όχη Υ, Tameno Η, Tomita Υ, Jin Y, et al. (2010) RB1CC1 Ενεργοποιεί RB1 Pathway και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και Cologenic επιβίωσης σε ανθρώπινα καρκινικά. PLoS ONE 5 (6): e11404. doi: 10.1371 /journal.pone.0011404

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 του Νοέμβρη 2009? Αποδεκτές: 9 Ιουνίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 30, Ιουνίου, 2010

Copyright: © 2010 Chano et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από KAKENHI (Grant-in-ενισχύσεις για την επιστημονική έρευνα σε τομείς προτεραιότητας? Νο 20012025) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας, την Ιαπωνία? και η Ιαπωνική Εταιρεία του Εργαστηρίου Ταμείου Ιατρικής για την προώθηση της επιστημονικής έρευνας. Αυτές οι πηγές χρηματοδότησης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση για τη δημοσίευση, την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το ρετινοβλάστωμα ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη (RB1) ρυθμίζει G1 /S-φάση εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και είναι ένα κρίσιμο μεσολαβητή των αντι-πολλαπλασιαστική σηματοδότηση. Παρά το γεγονός ότι η φωσφορυλίωση παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της λειτουργικής RB1, η μεταγραφική ρύθμιση του RB1 είναι πολύ λιγότερο γνωστή [1]. RB1 επαγόμενο συσπειρωμένης σπείρας 1 (RB1CC1: το σύμβολο που χρησιμοποιείται εδώ, το οποίο έχει εγκριθεί από το γονιδίωμα Οργανισμού [HUGO] Επιτροπή Ανθρωπίνων Gene ονοματολογίας? Είναι επίσης γνωστό ως FIP200, κινάση εστιακής προσκόλλησης οικογένεια αλληλεπιδρούν πρωτεΐνη 200 kDa) αναγνωρίστηκε ως ρυθμιστής της οδού RB1 ότι ιδιαίτερα ενισχύει

RB1 ​​

μεταγραφή [2], [3]. Πρόσφατα, έχουμε καταδείξει ότι η πυρηνική RB1CC1 προσδένεται σε ένα πλούσιο σε GC 201bp περιοχή ανοδικά (από την έναρξη ATG) του προαγωγού RB1 και ενεργοποιεί την έκφραση του RB1 [4]. Μια γενετική αναδιάταξη του

RB1CC1

έχει επίσης προταθεί ότι εμπλέκεται στην ογκογένεση του καρκίνου του μαστού [3], [5]. Είναι ενδιαφέρον, έχει αναφερθεί ότι RB1CC1 δεσμεύει και σταθεροποιεί την ρ53 [6], γεγονός που υποδηλώνει ότι RB1CC1 θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής που συνδέει τις οδούς RB1 και ρ53. παρούσα μελέτη μας ερευνά το μηχανισμό της RB1CC1 ενίσχυση της οδού RB1. RB1CC1 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με ρ53 ή /και hSNF5, έναν παράγοντα χρωματίνης-αναδιαμόρφωση, σε πυρήνες κυττάρων, και ενεργοποιεί την μεταγραφή του

RB1 ​​

,

p16

και

ρ21

. Επιπλέον, η πυρηνική RB1CC1 συσχετίζεται σημαντικά την έκφραση RB1 και ρ16 σε ιστό καρκίνου του μαστού

in vivo

.

Αποτελέσματα

RB1CC1 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με hSNF5 ή /και ρ53

αρχικά προσπάθησαν να προσδιορίσουν RB1CC1 δέσμευσης πρωτεϊνών σε MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού με μία δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης που ακολουθείται από υγρή χρωματογραφία-διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS /MS). Ένας παράγοντας αναδιαμόρφωσης χρωματίνης, hSNF5 (επίσης γνωστό ως BAF47 ή INI1) συν-ανοσοκαταβυθίζεται με RB1CC1 (Εικ. 1Α). Η δοκιμασία pull-down χρησιμοποιώντας RB1CC1 διαγραφή-μεταλλάξεων αποκάλυψαν ότι η C-τελική περιοχή του RB1CC1 (αα 1364-1594) ήταν απαραίτητη για την αλληλεπίδραση με hSNF5 (Εικ. 1 Β και C). Το Ν-άκρο της RB1CC1 αλληλεπιδρά επίσης με p53 [6], και έτσι θεωρήθηκε ότι θα μπορούσαν να RB1CC1 σχηματίζουν ένα σύμπλοκο με hSNF5 ή /και ρ53 για την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Το συγκρότημα σχηματισμός μεταξύ RB1CC1, hSNF5 και ρ53 εκτιμήθηκε με προσδιορισμούς ανοσοκαθίζησης και ανοσοφθορισμό. RB1CC1, hSNF5 και p53 ήταν συν-ανοσοκαταβυθίζονται με δύο είδη αντισωμάτων που αναγνωρίζουν διαφορετικές περιοχές της RB1CC1 (αα 25-271 και 549-817.)? η σύνθεση καθενός από τα ιζήματα είναι διαφορετική, πιθανώς λόγω των προτιμότερη κλάσματα για κάθε αντίσωμα (Σχ. 1D). RB1CC1-1 και -2 αντισώματα έχουν την τάση να προσδένονται κατά μεγαλύτερη προτίμηση στα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα, αντίστοιχα. hSNF5 και άφθονα πυρηνικών ρ53 (που θα μπορούσε να είναι περισσότερο φωσφορυλιωμένη και σιγά-σιγά κινητοποιήθηκαν PAGE) θα μπορούσε να είναι κατά προτίμηση συν-καθιζάνει με το σύμπλοκο μεταξύ των πυρηνικών RB1CC1 και RB1CC1-1 αντισώματος. Αντίστοιχα, RB1CC1-2 αντίσωμα μπορεί να δεσπόζει συνδέονται με άφθονη κυτταροπλασματική RB1CC1 καθώς hSNF5 και μερικά από p53 στο κυτταρόπλασμα. RB1CC1, hSNF5 και ρ53 συν-εντοπίζεται στους πυρήνες των κυττάρων με την εξαίρεση των πυρηνίσκων (Σχ 1 Ε και F?. Εικ. S1). Τα δεδομένα έδειξαν ότι RB1CC1 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με hSNF5 ή /και ρ53 κυρίως σε πυρήνες κυττάρων.

(Α) MCF-7 προϊόντα κυτταρικής λύσης ανοσοκαταβυθίζονται (ΙΡ) με αντι-RB1CC1 αντίσωμα και αναλύθηκαν με SDS-PAGE ακολουθούμενη με χρώση αργύρου. Το μόριο που συν-ανοσοκατακρημνίστηκε με RB1CC1 ταυτοποιήθηκε ως hSNF5 με υγρή χρωματογραφία-διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS /MS). (Β) Flag-RB1CC1 και ΗΑ-hSNF5 συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ293. Κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντι-Flag ή αντι-ΗΑ αντίσωμα και αναλύθηκαν με ανοσοστυπώματα όπως υποδεικνύεται. Βέλη δείχνουν τις συν-ανοσοκαταβυθίστηκε σήματα. (Γ) ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν με αμφότερα ΗΑ-hSNF5 άγριου τύπου (πλήρης) και Flag-RB1CC1 παραλλαγές? άγριου τύπου (wt), DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC και FCC. Σχηματικά διαγράμματα των RB1CC1wt και μεταλλάξεις υποδεικνύονται επίσης από την αριστερή πλευρά. Το ορθογώνιο δείχνει την θέση σύνδεσης για hSNF5, και η σπασμένη ορθογώνιο υποδηλώνει ότι για ρ53. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΗΑ και ανοσοστυπώθηκαν όπως υποδεικνύεται. (D) MCF-7 κυτταρολύματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με δύο είδη αντισώματος αντι-RB1CC1 και αναλύθηκαν με ανοσοστυπώματα. (Ε) RB1CC1 (πράσινο), hSNF5 (κόκκινο), p53 (μπλε) και η νέα εικόνα σε κύτταρα HeLa. Κάθε πρωτεΐνη ανοσοφθορισμό επισημαίνονται με Alexa 488, 594 ή 350 αντίστοιχα. μπαρ κλίμακα, 50 μm. (F) RB1CC1 (πράσινο), DAPI και η συγχωνευμένη εικόνα σε κύτταρα HeLa. RB1CC1 είναι ανοσο-επισημαίνονται με Alexa 488, και DAPI εμφανίζεται με μπλε φθορισμό σε πυρήνες κυττάρων. μπαρ κλίμακα, 50 μm.

Η

RB1CC1 δεσμεύει και ενεργοποιεί τους υποστηρικτές της RB1, p16 και p21, σε συνεργασία με την p53 ή /και hSNF5

RB1CC1 [2], [4] [6], και hSNF5 [7], [8], [9], [10] ενισχύουν τη μεταγραφή των μορίων που εμπλέκονται στην οδό RB1, έτσι ώστε να εξεταστεί κατά πόσον RB1CC1, hSNF5 και ρ53 δεσμεύονται με τις περιοχές υποκινητή του

RB1

,

p16

και

p21

. Χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασίες χρησιμοποιώντας αντισώματα εναντίον RB1CC1, hSNF5 και p53 έδειξε ότι τα θραύσματα υποστηρικτής του

RB1 ​​

,

p16

και

p21

, οι οποίες ενισχύθηκαν από χρωματίνη κυττάρων HeLa , καταβυθίστηκαν με κάθε αντίσωμα (Σχ. 2Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα μόρια προσλαμβάνονται στις περιοχές υποκινητή της οδού RB1. Η συμμετοχή αυτών των τριών μορίων στην έκφραση του

RB1 ​​

,

p16

και

p21

επικυρώθηκαν με την εισαγωγή SH-RNA για

RB1CC1

(sh –

RB1CC1

),

hSNF5

(SH-

hSNF5

) και

p53

(SH-

p53

) σε κύτταρα HeLa . Οι νοκ ντάουν επιπτώσεις στο

RB1CC1

,

hSNF5

,

p53

,

p21

,

p16

και

RB1 ​​

έκφραση mRNA αναλύθηκαν με ημι-ποσοτική RT-PCR. SH-

RB1CC1

και SH-

hSNF5

μειωμένα επίπεδα mRNA της

RB1 ​​

,

p16

και

p21

, ενώ SH-

p53

μειώθηκε μόνο

p21

mRNA (Εικ. 2Β). Με άλλα λόγια, RB1CC1 και hSNF5 υποχρεούνται να διατηρήσουν τις μεταγραφές του

RB1 ​​

,

p16

και

p21

, ενώ p53 απαιτείται ειδικά για τη μεταγραφή του

p21

. RB1CC1 ενεργοποιείται σημαντικά τους υποψηφίους για

RB1 ​​

,

p16

και

p21

(Σχ. 2C), και το νοκ ντάουν της RB1CC1 τους καταστέλλεται (Σχ. 2D). Αυτές οι βελτιώσεις προαγωγός από RB1CC1 συγκρίθηκαν μεταξύ HeLa, TTC642 (hSNF5-null) και Η1299 (p53-null) κύτταρα, προκειμένου να επικυρωθεί η απαίτηση για hSNF5 ή p53 όταν RB1CC1 ενεργοποιεί

RB1 ​​

,

p16

και

p21

. RB1CC1 ήταν σε θέση να παράσχει σημαντική ενίσχυση της

RB1 ​​

και

p16

υποστηρικτές στην TTC642 κύτταρα, και έπαιξε μόνο έναν μικρό ρόλο στο

p16

και

p21

μεταγραφής σε Η1299 κύτταρα (Σχ. 2Ε). Λαμβάνοντας υπόψη το μονοπάτι RB1 ξεκίνησε από RB1CC1, RB1CC1 απαιτεί hSNF5 για την ενίσχυση της

RB1 ​​

και p53 για την ενίσχυση της

p21

μεταγραφές, αλλά και οι δύο hSNF5 και p53 απαιτούνται για RB1CC1 ενίσχυση της

p16

μεταγραφή. Εν ολίγοις, RB1CC1 απαιτεί αλληλεπίδραση με τόσο hSNF5 και p53 να παρέχει μια ισχυρή ενεργοποίηση του

RB1 ​​

,

p16

και

p21

υποστηρικτές.

(Α ) χρωματίνης ανοσοκαταβύθισης (ChIP δοκιμασία) πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HeLa. Η χρωματίνη ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-RB1CC1, αντι-ρ53, ή αντι-hSNF5 αντίσωμα. Κάθε καθιζάνει DNA αναλύθηκε με ποσοτική και ημι-ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές υποκινητή ειδικό για

RB1 ​​

,

p16

και

ρ21

. Οι εντάσεις σήματος ορίστηκαν με βάση εκείνα που προέρχονται από το DNA εισόδου (2 ng /μl) των κυττάρων HeLa, τα οποία ορίστηκαν ως 1.000. (Β) Ημι-ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε αριθμό μεμονωμένων κύκλο για κάθε μεταγραφή σε κύτταρα HeLa έλαβαν θεραπεία με shRNA για

RB1CC1

,

hSNF5

ή

p53

. SH-

GL3

, SH-

p21

και SH-

p16

χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Οι παρενθέσεις δείχνουν τους αριθμούς κύκλο PCR. (C-D) σε κύτταρα HeLa, δραστικότητα λουσιφεράσης του υποκινητή για

RB1 ​​

,

p16

και

p21

αυξήθηκαν σημαντικά κατά τη μορφομετατροπή του πλασμιδίου που εκφράζει RB1CC1 (RB1CC1wt) (

C

) και μειώθηκε σημαντικά κατά την εξουδετέρωση των RB1CC1 χρησιμοποιώντας SH-

RB1CC1

-1 και -2 (

D

), σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ροϋΝΑ ή SH-RNA αγωνίζομαι, αντίστοιχα, ως μάρτυρες. Οι τιμές δείχνουν τα μέσα ± τυπικά σφάλματα από πειράματα τετραπλούν. (Έλεγχος τ? Αστερίσκοι (*) δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ pcDNA και RB1CC1wt ή μεταξύ αγωνίζομαι και SH-

RB1CC1

*, p & lt?. 0,05? Και **, p & lt? 0,01). Η αποτελεσματικότητα του υπερ-έκφραση ή knockdown του RB1CC1 ελέγχθηκε με Western κηλίδες όπως υποδεικνύεται στα ανώτερα φύλλα. (Ε) Μετά την εισαγωγή του RB1CC1wt, λουσιφεράσης δραστηριότητες των δικαιούχων για

RB1 ​​

,

p16

και

p21

συγκρίθηκαν μεταξύ HeLa, TTC642 (hSNF5-null) και Η1299 κύτταρα (p53-null). Οι αστερίσκοι (**) υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντικές διαφορές (έλεγχος τ? Ρ & lt? 0,01). Μεταξύ HeLa και TTC642 ή μεταξύ HeLa και Η1299

Η

RB1CC1 ενεργοποιεί το μονοπάτι RB1 και καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου

για να αξιολογηθεί κατά πόσον RB1CC1 ενισχύει μονοπάτια RB1 για να καταστείλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, HeLa κύτταρα lentivirally μετάγονται με

RB1CC1

cDNA ή shRNA. Η έκτοπη έκφραση του RB1CC1 αύξησε τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53, ρ21, ρ16 και RB1, και ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη (Σχ. 3Α και Β, αριστερό πάνελ). Σε αντίθεση, η εξουδετέρωση του ενδογενούς RB1CC1 με SH-

RB1CC1

μείωσε τα επίπεδα του ρ53, hSNF5, ρ21 και ρ16, και ενίσχυσαν την ανάπτυξη των κυττάρων (Σχ. 3Α και Β, δεξί πάνελ). Τα ίδια πειράματα σε δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού (MCF-7 και SK-BR3) απέδωσε παρόμοια αποτελέσματα (Σχ. S2A-D). Στις

RB1CC1

-transduced κύτταρα, ο αριθμός των G0 /G1-φάση-κυττάρων αυξήθηκε ταυτόχρονα με τη μείωση του αριθμού των κυττάρων σε S και G2 /M φάσεις. Εισαγωγή SH-

RB1CC1

μειώθηκε το G0 /G1 του πληθυσμού και την αύξηση των πληθυσμών των κυττάρων σε S και G2 /M. (Σχήμα 3C?. Σχ. S2E)

(Α) κύτταρα HeLa ήταν lentivirally μεταγωγή με

RB1CC1

ή SH-

RB1CC1

. Τα λύματα ανοσοστυπώθηκαν όπως υποδεικνύεται. δοκιμασίες (Β) Η ανάπτυξη σε κύτταρα HeLa μετάγονται όπως στο

ένα

. Τα δεδομένα ποσοτικοποιήθηκαν από πειράματα εις τριπλούν (κατώτερο στήλη). Εκπρόσωπος ανοσοστυπώματα, πιάτα και σημαίνουν οι αριθμοί των αποικιών ± τα πρότυπα σφάλματα. (Γ) Μετά την τροποποίηση της έκφρασης λεντοϊού RB1CC1, τα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

RB1CC1

και SH-

RB1CC1

υποδεικνύονται με κόκκινο (αριστερά) και το μπλε (δεξιά), αντίστοιχα. Τα δεδομένα (μέση τιμή ± ποσοστά τυπικές αποκλίσεις) επιβεβαιώθηκαν σε πειράματα εις τριπλούν, και μια αντιπροσωπευτική γραφική παράσταση με κυτταρομετρία ροής έχει καταδειχθεί. pLenti6 και SH-GL3 χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Τα βέλη δείχνουν ότι οι αυξήσεις (μέχρι βέλος) και μειώσεις (κάτω βέλος) ήταν στατιστικά σημαντικές, σύμφωνα με t-test του Student? p & lt?. 0.05 (D) RB1CC1, hSNF5 και μορφή ρ53 η μεταγραφική συγκρότημα στους πυρήνες των κυττάρων, και να ενεργοποιήσετε

RB1 ​​

,

p16

και

p21

Η

Στο σύνολό τους, τα προαναφερθέντα στοιχεία έδειξαν ότι RB1CC1 σχηματίζεται ένα συγκρότημα με hSNF5 ή /και p53, και σε παγκόσμιο επίπεδο ενεργοποιημένη τη μεταγραφή του

RB1 ​​

,

p16

και

p21

(Εικ. 3D).

εκφραστική ανάλυση των μορίων που εμπλέκονται στην οδό RB1CC1-RB1 σε καρκίνους του μαστού

in vivo

η

Για να αξιολογηθεί η συσχέτιση μεταξύ η πολλαπλασιαστική δραστηριότητα και η προαναφερθείσα RB1CC1 οδό ενεργοποίησης RB1 περιλαμβάνουν ρ53 και hSNF5 στον ιστό του όγκου

in vivo

, αξιολογήσαμε την εκφραστική ιδιότητα του RB1CC1, RB1, ρ16, ρ21, Ki-67, ρ53 και hSNF5 σε 59 περιπτώσεις καρκίνου του μαστού. Τέσσερις περιπτώσεις nullizygotes RB1 έδειξε υψηλό δείκτη Ki-67 πολλαπλασιασμό (μέσα ± τυπική απόκλιση σφάλματα = 69,7 ± 6,6%). Η ανοσοαντιδραστικότητα ρ53-ρ21 αναφέρονται στην έκφραση-χωρίστηκε σε δύο κατηγορίες, «κανονική» (p53nor) για ασθενή χρώση και «μη φυσιολογικό» (p53ab) για ισχυρή χρώση, η οποία έδειξε ότι εξαιρετικά μεταλλαγμένη πρωτεΐνη ρ53 συσσωρεύθηκε. Υπήρχαν 41 και 14 περιπτώσεις p53nor και p53ab, αντίστοιχα, σε αυτή τη σειρά. hSNF5 ήταν ιδιαίτερα διατηρήθηκε σε καρκίνους του μαστού, ανεξάρτητα από RB1CC1 ή την κατάσταση της ρ53 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι ανοσοϊστοχημικές αποτελέσματα για RB1CC1 ποσοτικά βαθμολογήθηκαν ως Ι-ΙΙΙ. Grade III, εκφράζοντας RB1CC1 άφθονα στους πυρήνες των κυττάρων, καταγράφηκε ως RB1CC1 (+), ενώ οι βαθμοί Ι-ΙΙ χωρίς πυρηνικά RB1CC1 καταγράφηκαν ως (-) (Εικ. 4Α). Όπως έχει ήδη αναφερθεί [4], η έκφραση της RB1 ήταν αρκετά καλά συσχετίζεται με την έκφραση RB1CC1 στις περιπτώσεις καταγράφονται ως RB1CC1 (+) και ήταν υψηλότερη από ό, τι στην RB1CC1 (-) περιπτώσεις (Εικ. 4Β, αριστερά). έκφραση p16 επίσης συσχετίζεται θετικά με την έκφραση της πυρηνικής RB1CC1 (Εικ. 4Β, 2

ου αριστερά). Επισήμανση δεικτών p21 και Ki-67 σε περιπτώσεις p53nor – αλλά όχι στις περιπτώσεις p53ab – ήταν καλά συσχετίζονται με την κατάσταση έκφρασης του RB1CC1 (Εικ. 4Β, 3

ου αριστερά και δεξιά). Μαζί, η κατάσταση έκφρασης του RB1CC1 και ρ53 σχετίζεται με αυξημένη έκφραση της RB1, ρ16 και ρ21, το οποίο με τη σειρά του επηρέασε το δείκτη της δραστικότητας πολλαπλασιασμού Ki-67 σε κλινικές καρκίνων του μαστού. Ως εκ τούτου, η ανοσοϊστοχημική κατάσταση των RB1 και ρ53, καθώς και εκείνη του RB1CC1 θα πρέπει να είναι καλοί προάγγελοι της πολλαπλασιαστικής δραστηριότητας? Έτσι, η οδός RB1CC1-RB1 αποδείχθηκε σε πειράματα μας θα μπορούσε να παίξει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του μαστού κλινικής

(Α) Οι ανοσοϊστοχημικές ποιότητες RB1CC1 ταξινομήθηκαν ως Ι-ΙΙΙ:. Ι, αρνητική χρώση σε τόσο κυτταρόπλασμα και πυρήνες? II, θετική χρώση μόνο στο κυτταρόπλασμα και αρνητική σε πυρήνες? III, θετική χρώση σε πυρήνες ή /και το κυτταρόπλασμα. Κατηγορίες ΙΙΙ, εκφράζοντας RB1CC1 άφθονα στους πυρήνες των κυττάρων, καταγράφηκαν ως RB1CC1 (+), ενώ οι βαθμοί Ι-ΙΙ χωρίς πυρηνικά RB1CC1 καταγράφηκαν ως RB1CC1 (-). μπαρ κλίμακα δείχνει 50μm. (Β) Συσχέτιση μεταξύ RB1CC1 και RB1, p16, p21 ή Ki-67 σε p53normal (άνω διαγράμματα) και ανώμαλη (κάτω γραφικές παραστάσεις) περιπτώσεις. RB1CC1 (-) ή (+) κατάσταση υποδεικνύεται στην οριζόντια γραμμή, και κάθε δείκτης επισήμανσης επισημαίνεται σε κατακόρυφη γραμμή στα γραφήματα. Μια ανώμαλη κατάσταση ρ53 ορίστηκε ως περίπτωση καρκίνου του μαστού όταν περισσότερο από το 50% των καρκινικών κυττάρων ήταν έντονα θετικά για ρ53, ενώ λιγότερο από το 10% των κυττάρων ήταν θετικά για ρ21. Τέτοια περίπτωση εξαιρετικά έδειξε ότι μεταλλαγμένη πρωτεΐνη p53 είχε συσσωρευτεί, και ότι οι ανέπαφες τις λειτουργίες της p53 (όπως μεταγραφικής ενεργοποίησης για

p21

) ήταν απώλεια. Μαθητή

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις συσχετίσεις (*, p & lt? 0,05? Και **, p & lt? 0,01)

Η

Συζήτηση

RB1CC1 είναι. μία νέα ρυθμιστής της RB1 που αποφωσφορυλιώνει RB1 [2], [6] και αυξάνει την έκφραση της [2], [4]? Επιπλέον, μια γενετική αναδιάταξη του

RB1CC1

μπορεί να εμπλέκεται στην ογκογένεση του καρκίνου του μαστού [3], [5]. Πιο πρόσφατα, αναφέραμε ότι η πυρηνική RB1CC1 ενεργοποιεί άμεσα την

RB1 ​​

υποκινητή μέσω μιας 201bp ανάντη περιοχή πλούσια σε GC (-201 /U-GCbox) [4]. Να διευκρινίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια τον μοριακό μηχανισμό της δράσης RB1CC1, μία δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης που ακολουθείται από LC-MS /MS επιχειρήθηκε, και ένας παράγοντας αναδιαμόρφωσης χρωματίνης, hSNF5 εντοπίστηκε. RB1CC1 αλληλεπιδρά επίσης με ρ53, έτσι RB1CC1 πιστεύεται ότι σχηματίζει ένα σύμπλοκο με hSNF5 ή /και ρ53. Πιστεύεται ότι διεγείρει RB1CC1

RB1 ​​

[2], [4], και ότι hSNF5 ενισχύει

p16

(επίσης γνωστή ως ΙΝΚ4 & ή CDKN2A) και /ή

p21

(επίσης γνωστή ως Cip1, WAF1 ή CDKN1A) [7], [8], [9], [10]. Στην πραγματικότητα, οι δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης και ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι ένα σύμπλοκο μεταξύ RB1CC1, hSNF5 και μορφές p53 στους πυρήνες των κυττάρων, και το chip, ποσοτική RT-PCR και τις δοκιμασίες λουσιφεράσης για

RB1 ​​

,

p16

και

p21

έχουν προτείνει ότι οι συντονισμένες μεταγραφική βελτιώσεις αυτών των μορίων που επηρεάζονται από το συγκρότημα, συμπεριλαμβανομένων RB1CC1, hSNF5 και p53. Ωστόσο, RB1CC1, hSNF5 και p53 δεν είναι εξίσου σημαντικές για την διέγερση του καθενός από τους υποστηρικτές του

RB1 ​​

,

p16

ή

p21

, ενώ τρία μόρια προσλαμβάνονται με κάθε δικαιούχος. Για παράδειγμα, φίμωση

p53

σε κύτταρα HeLa είχε καμία επίδραση στην μεταγραφή του

RB1 ​​

, και RB1CC1 υπερ-έκφραση μπορεί να ενεργοποιήσει το

RB1 ​​

προαγωγό σε Η1299 (ρ53- null) κύτταρα. Αυτά σημαίνουν ότι p53 δεν υποχρεούται ουσιαστικά να

RB1 ​​

μεταγραφής, και ότι RB1CC1 και hSNF5 μπορούν να συνεργαστούν για να ενεργοποιήσετε

RB1 ​​

μεταγραφή. Έτσι, τα τρία μόρια δεν είναι πάντοτε απαραίτητη για την ενεργοποίηση του καθενός από τους αναδόχους, ενώ και οι τρεις χρειάζονται για τη συντονισμένη μεταγραφές του

RB1 ​​

,

p16

και

p21

. Έχουμε επίσης δημιουργήσει νωρίτερα ότι η πυρηνική RB1CC1 δεσμεύει και ενεργοποιεί το

RB1 ​​

υποκινητή [4]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ένα σημείο-μετάλλαξη στο -201 /U-GCbox του

RB1 ​​

υποκινητή εντοπίσθηκε σε ένα κληρονομικό οικογένεια ρετινοβλάστωμα [11]. Θα πρέπει να επισημανθεί ότι η -201 /U-GCbox του

RB1 ​​

και η δέσμευση της μεταγραφής συγκρότημα που περιλαμβάνει RB1CC1, hSNF5 και το παιχνίδι p53 σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη καρκινογένεση.

Στην παρούσα μελέτη , RB1CC1, σε συνεργασία με hSNF5 και ρ53, ενεργοποιεί το μονοπάτι RB1 και καταστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου. Προκειμένου να ενεργοποιηθεί αποτελεσματικά το μονοπάτι RB1, RB1CC1 πρέπει να εκφράζονται σε πυρήνες κυττάρων και θα πρέπει να σχηματίζει ένα σύμπλοκο με hSNF5 ή /και ρ53, όπως προτείνεται στις ανοσοκυτταροχημικές και ανοσοϊστοχημικές δεδομένα αυτής της μελέτης. PIASy (μια πρωτεΐνη-αναστολέας της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης y STAT) αλληλεπιδρά με το C-άκρο (αα 1350-1594) του RB1CC1 και στρατολογεί έναν αλληλεπιδρά σύμπλοκο μεταξύ PIASy και RB1CC1 από κυτόπλασμα σε πυρήνες [12]. Επιπλέον, PIASy ρυθμίζει αρνητικά στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) δραστηριότητα διεγείρεται από κυτταροπλασματική RB1CC1, και θετικά ενεργοποιεί το μονοπάτι σηματοδότησης ρ53-ρ21 μαζί με πυρηνικά RB1CC1 [12]. Αυτά τα δεδομένα φαίνεται να είναι συμβατή με τα δεδομένα που παρουσιάζονται μας σχετικά με την υπο-εντοπισμός του συγκροτήματος που αποτελείται από RB1CC1, hSNF5 και ρ53. Η πυρηνική μοριακό σύμπλοκο, συμπεριλαμβανομένων RB1CC1, hSNF5, p53 και επιπλέον PIASy, μπορούν να σχηματίσουν ένα μεγάλο τμήμα της μεταγραφής για να ενεργοποιήσετε την οδό RB1 συντονισμένα και να καταστέλλουν την ογκογένεση στον ανθρώπινο ιστό του μαστού.

Πυρηνική έκφραση RB1CC1 θα μπορούσε να είναι σημαντική για την καταστολή του όγκου. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, RB1CC1 βρίσκεται όχι μόνο στον πυρήνα αλλά και στο κυτταρόπλασμα [4], [6], [13], [14]. Κυτταροπλασματικά RB1CC1 έχει προταθεί να είναι το ισοδύναμο της μαγιάς Atg17, και αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι λειτουργεί RB1CC1 ως ουσιαστικό μόριο στη ρύθμιση autophagy [13], [14], [15]. Autophagy έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση, αλλά ο ακριβής ρόλος του είναι ασαφής. Είναι κατανοητό ότι η αυτοφαγία έχει διαφορετικούς ρόλους σε διάφορα στάδια, ή πλαίσια, της ογκογένεσης. Young, et al. [16] ανέφεραν ότι η αυτοφαγία μεσολαβεί η μιτωτική γήρανση, ένα παράθυρο στην ανάπτυξη όγκων σε πρώιμο στάδιο. Προτείνουμε κυτταροπλασματική-πυρηνική μετάβαση της RB1CC1 παίζει καθοριστικό ρόλο σε συνεργασία αυτοφαγία-γήρανση. Τα δεδομένα μας

in vitro

και

in vivo

δείχνουν ότι RB1CC1 παίζει διαφορετικούς ρόλους ανάλογα με υποκυτταρική θέση του. Πυρηνική RB1CC1 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με hSNF5, ρ53 και οποιοδήποτε άλλο συστατικό που συμβάλλει στην μεταγραφή του μονοπατιού RB1, υποδεικνύοντας μια πιθανή σύνδεση με μιτωτική γήρανση. Ωστόσο, κυτταροπλασματική RB1CC1 φαίνεται να παίζει κανένα ρόλο ως καταστολέας των όγκων ενεργοποίηση της οδού RB1.

έκφραση Πυρηνική RB1CC1 συσχετίστηκε σημαντικά με εκείνα των RB1 και p16 στον ιστό του καρκίνου του μαστού

in vivo

, ανεξάρτητα από το κατάσταση ρ53. Ki-67 δείκτης πολλαπλασιασμού και της έκφρασης p21 επηρεάστηκαν τόσο από RB1CC1 και p53, και τον δείκτη Ki-67 εξαρτάται επίσης από την κατάσταση RB1. Οι εκφράσεις του RB1, p16 και p21 επηρεάζουν τον δείκτη Ki-67 πολλαπλασιαστική δραστηριότητα, έτσι ώστε η ανοσοϊστοχημική κατάσταση των RB1 και p53, καθώς και εκείνη του RB1CC1 μπορεί να προβλέψει την πολλαπλασιαστική δραστηριότητα του όγκου. Έτσι, η παρούσα δεδομένα υποδηλώνουν ότι προόδου των καρκίνων του μαστού ήταν υπό την ισχυρή επιρροή του RB1CC1, καθώς και RB1 και ρ53 κατάσταση. Αναμένουμε ότι η συνδυασμένη ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση της RB1, RB1CC1 και p53 θα παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τις κλινικές εφαρμογές τους, όπως πιθανή χρήση ως προγνωστικούς βιοδείκτες.

Εν ολίγοις, έχουμε αναφερθεί εδώ ότι RB1CC1, που συνδέει το RB1 και p53 οδούς ως πιθανή μεσολαβητής, σχηματίζει ένα σύμπλοκο με hSNF5 ή /και ρ53 που ενισχύει την οδό RB1 σε παγκόσμιο επίπεδο. Ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση των RB1 και ρ53 σε συνδυασμό με RB1CC1 μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη σε βολικό, συνήθη κλινική προσδιορισμούς και παρέχει μια πρόβλεψη της βιολογικής συμπεριφοράς των νεοπλασμάτων του μαστού και /ή των όγκων των άλλων οργάνων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

TTC642 ευγενώς από τους Drs. Shigeru Ohta, Hiroyuki Shimada και Timothy J. Triche (Νοσοκομείο Παίδων του Λος Άντζελες, Los Angeles, CA). HeLa, ΗΕΚ293, MCF-7, SK-BR3 και Η1299 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (MD), και καλλιεργούνται σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (DMEM) ή RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Όλα τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας συμπληρωμένο με πενικιλλίνη (50 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (50 mg /ml).

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Αντιορός κουνελιού έναντι RB1CC1 (αα. 25-271, 549 -817 ως κάθε επιτόπιο) δημιουργήθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [4], [17], και το καθαρισμένο IgG χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Anti-p53 (FL-393) και αντι-p21 (F-5) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (CA). Αντι-HA (3F10) ήταν από τη Roche (Γερμανία). Anti-Flag (Μ2) και αντι-τουμπουλίνης α (DM 1Α) αγοράστηκαν από την Sigma (MO). Τα άλλα αντισώματα ήταν από την BD Biosciences (CA).

Η ανοσοκαταβύθιση συμπλόκου πρωτεΐνης που ακολουθείται από υγρό χρω- ματογραφία διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (LC-MS /MS)

Ο MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού ήταν λύθηκαν σε EBC ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8.0), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet Ρ-40 (ΝΡ-40), 0,25% δεοξυχολικό νάτριο, 0,2 mM Να

3νο

4, 100mM NaF και 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Wako Chemicals, Ιαπωνία), και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 20 λεπτά στα 20.000 χ g στους 4 ° C. Το υπερκείμενο 5 ml (~10mg /ml) επωάστηκε με 100 μα αντι-RB1CC1 καθαρίστηκε IgG πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα ανοσοσύμπλοκα δεσμεύεται στις πρωτεΐνες G-αγαρόζης (Pierce, IL) για επιπλέον 2 ώρες στους 4 ° C και πλύθηκαν πέντε φορές με ΝΕΤΝ (20mM Tris-HCl (ρΗ 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% ΝΡ 40). Οι πρωτεΐνες που δεσμεύτηκαν με την πρωτεΐνη G-Sepharose εκλούστηκαν με προσθήκη ρυθμιστικού δείγματος Laemmli SDS που περιείχε 62,5 mM Tris-HCl (ρΗ 6.8), 10% γλυκερόλη, 5% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 2% SDS, και 0.01% μπλε βρωμοφαινόλη στο πήκτωμα και βράζει για 3 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση στα 10.000 χ g για 2 λεπτά, το υπερκείμενο υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), και οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν με χρώση αργύρου. Το έντονα χρωματισμένο ειδική ζώνη σε πήκτωμα σε πέψη με θρυψίνη, και τα ανακτηθέντα πεπτίδια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο μάζας ηλεκτροψεκασμού ιόντος παγίδα (LCQ, Finnigan ΜΑΤ, CA) συζευγμένο σε απευθείας σύνδεση με τριχοειδή HPLC (Magic 2002, Michrom BioResorces, CA) για να να αποκτήσουν φάσματα φασματομετρία μάζας /φασματομετρία μάζας (MS /MS). Τα δεδομένα προέρχονται από την MS /MS φάσματα που χρησιμοποιούνται για την αναζήτηση μιας καταρτίζονται βάση δεδομένων πρωτεΐνη, η οποία αποτελείται από NR βάση δεδομένων και ένα έξι-ανάγνωση-πλαισίου μεταφραστεί βάση δεδομένων EST, για να εντοπίσει την πρωτεΐνη με τη χρήση της διαθέσιμης στο κοινό κυνήγι του προγράμματος (http: //prowl.rockefeller.edu).

το πλασμιδιακό DNA και γονιδιακή μεταφορά

οι εξωτερικές και εσωτερικές μεταλλάξεις διαγραφής για

RB1CC1

(GenBank αρ. NM_014781) δημιουργήθηκαν στο pcDNA3.1 φορέα πλασμιδίου (Invitrogen), με ένα συνδυασμό που βασίζεται στην PCR χειρισμούς με κατάλληλα εξωτερικά αρχικά τεμάχια στις θέσεις που περιγράφονται παρακάτω και την πέψη ενζύμου περιορισμού. Τα νουκλεοτίδια όλων των κατασκευασμάτων επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA. Οι

RB1CC1

μεταλλάξεις DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC και FCC διαγράφονται τα αμινοξέα 863 – 1083, 1078-1363, 1364-1594, 1 με 1356, 824 – 1594 και 1-863, αντίστοιχα ( Σχ. 1C, αριστερό πλαίσιο). Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας FuGENE HD (Roche) σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή. Οι πλασμιδικοί φορείς του RNAi για

RB1CC1

παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, δύο είδη λεντοϊού sh-RNA φορείς (SH-

RB1CC1

-1 και -2) που αντιστοιχούν σε διαφορετικές θέσεις στόχους (nt. 2070-2090 και nt. 4611 – 4631, αντίστοιχα) στο

RB1CC1

mRNA (GenBank αρ. NM_014781) συντέθηκαν in vitro με εισαγωγή τεχνητών ολιγονουκλεοτιδίων μέσα στο pSIH1-H1-Puro φορέα sh-RNA (Σύστημα Biosciences, CA). Φορείς για sh-RNA

hSNF5

και

p53

παρασκευάσθηκαν με OpenBiosystems (AL). Για μη φίμωση των ελέγχων, SH-

GL3

και φορείς αγωνίζομαι αγοράστηκαν από το Σύστημα Βιοεπιστημών και OpenBiosystems, αντίστοιχα. Επιπλέον, τα ανθρώπινα

RB1CC1

cDNA υποκλωνοποιήθηκε σε φορέα pLenti6 (Invitrogen). Lenti-ιού μεταφορά sh-RNA ή cDNA παρασκευάστηκε με κάθε μείγμα συσκευασία, σύμφωνα με τις οδηγίες του κάθε κατασκευαστή. Κλωνοποιηθούν και να επεκταθούν τα κύτταρα επιλέχθηκαν με την παρουσία πουρομυκίνης ή βλαστισιδίνη, αντίστοιχα, και χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα.

Τραβήξτε προς τα κάτω

δοκιμασία

Flag-tagged-άγριου τύπου (wt)

RB1CC1

ή μεταλλάξεις του (DCCA, dccB, DLZ, LZC, DCC και FCC) μετήχθησαν σε ΗΕΚ293 κύτταρα σε συνδυασμό με ΗΑ-tagged hSNF5 (πλήρης). Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΝΕ (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% ΝΡ-40 και 1 mM Να

3νο

4 που περιέχει ένα μίγμα από αναστολείς πρωτεάσης). Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν και τα υπερκείμενα επωάστηκαν με αντι-Flag ή αντι-ΗΑ ακινητοποιημένο σφαιρίδια για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν πέντε φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ΤΝΕ και βράζεται με την παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος Laemmli SDS. Τα σύμπλοκα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε φίλτρα μεμβράνης PVDF και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοαποτυπώματος με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

Η ανοσοκαταβύθιση για την ανίχνευση του συμπλόκου πρωτεΐνης

MCF-7 κύτταρα μονοστιβάδας ξεπλύθηκαν με παγωμένο ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και αποξέστηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ΝΡ-40 (20 mmol /L Tris (ρΗ 8.0), 137 mmol /L NaCl, 1% ΝΡ-40, 10% γλυκερόλη) συμπληρωμένο με 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Wako Chemicals) και 3 mmol /L Na

3νο

4. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν σε πάγο για 20 λεπτά, καθαρίζεται με φυγοκέντρηση, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία δικινχονινικού οξέος (Pierce). Διαλύματα που περιέχουν 400 έως 1000 μα πρωτεΐνης συντομία προκαταρκτική διαύγαση με σφαιρίδια πρωτεΐνης-G-αγαρόζης (Pierce) και στη συνέχεια χρησιμοποιείται για την αντίδραση ανοσοκαταβύθισης με 2 είδη των αντι-RB1CC1 κουνελιού πολυκλωνικό IgGs ή κανονικά IgGs κουνελιού ελέγχου στους 4 ° C όλη τη νύκτα, ακολουθούμενο με επώαση με σφαιρίδια πρωτεΐνης G-για 2 ώρες για να συλλέξει ανοσοσυμπλεγμάτων. Τέλος, τα σφαιρίδια πλύθηκαν με ΝΡ-40 ρυθμιστικό πέντε φορές, επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS, βραστά, διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE και αναλύθηκαν με ανοσοστυπώματα όπως περιγράφεται παρακάτω.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

τα κύτταρα γενικά λύθηκαν για κηλίδωση Western όπως περιγράφεται από Sarbassov, et al. [18] Μετά την εκκαθάριση λύθηκαν υλικών με φυγοκέντρηση στα 15.000 χ g για 1 λεπτό, τα υπερκείμενα υπέστησαν ζέση σε ρυθμιστικό δείγματος SDS. Πρωτεΐνες επιλυθεί με SDS-PAGE μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) φίλτρα. Μετά το μπλοκάρισμα των φίλτρων με ΤΒδ-Τ (10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.6), 150 mM χλωριούχο νάτριο, 0,1% Tween 20) που περιέχει 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA), τα φίλτρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα σε ΤΒδ-Τ που περιέχει 2% BSA στους 4 ° C. Τα φίλτρα μετά πλύθηκαν σε TBS-T και επωάσθηκαν για 1 h σε ραφανιδική υπεροξειδάση-συζευγμένο αντι-ποντικού, αντι-κουνελιού, ή IgG αντι-αρουραίου (GE Healthcare, UK) αραιωμένο 1:20,000 σε ΤΒδ-Τ που περιέχει 2% BSA . Μετά από αρκετές πλύσεις με ΤΒδ-Τ, η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ECL (GE Healthcare) σύμφωνα με τις διαδικασίες που συνιστώνται από τον κατασκευαστή.

ανοσοφθορισμού δοκιμασία

MCF-7 και HeLa κύτταρα ήταν καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια LabTek ™ θάλαμο (BD Biosciences) σε 70% συρροή, σταθεροποιήθηκαν με 1% ρυθμισμένη φορμαλδεΰδη και 70% αιθανόλη, και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100. Η πρωταρχική κουνελιού αντι-RB1CC1 IgG, αντι-hSNF5 IgG2a ποντικού (BAF48) και κουνελιού IgG αντι-ρ53 (FL393) συζεύχθηκαν με Alexa 488, 594 και 350 με το κιτ επισήμανσης ZenonTM (Molecular Probes).