Abstract

μετάστασης του καρκίνου είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου που προκαλείται από κόλλα κύτταρο μόρια. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε καθορίσει τη δύναμη προσκόλλησης μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων μονοστοιβάδα και καρκινικών κυττάρων διαφορετικών μεταστατικού δυναμικού χρησιμοποιώντας Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης. Δείχνουμε ότι οι δυνάμεις ρήξης των ομολόγων υποδοχέα-συνδέτη αυξάνονται με την ταχύτητα συστολής και κυμαίνονται μεταξύ 20 και 70 ΡΝ. Έχει αποδειχθεί ότι οι πιο επεμβατικές κυτταρικές σειρές (Τ24, J82) αποτελούν τα ισχυρότερα ομόλογα με τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Χρησιμοποιώντας ICAM-1 επικαλυμμένα υποστρώματα και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για ICAM-1, αποδεικνύουμε ότι το ICAM-1 χρησιμεύει ως πλήκτρο υποδοχέα επί των ενδοθηλιακών κυττάρων και ότι οι αλληλεπιδράσεις του με συνδετήρες που εκφράζονται από κύτταρα όγκου συσχετίζεται με τις δυνάμεις ρήξης που ελήφθη με την πιο επεμβατική τα καρκινικά κύτταρα (Τ24, J82). Για τους λιγότερο επεμβατική καρκινικά κύτταρα (RT112), ενδοθηλιακά ICAM-1 δεν φαίνεται να παίζει κανένα ρόλο στη διαδικασία συγκόλλησης. Επιπλέον, μια λεπτομερής ανάλυση της κατανομής των δυνάμεων ρήξης δείχνουν ότι ICAM-1 αλληλεπιδρά προνομιακά με ένα συνδετήρα επί καρκινικών κυττάρων Τ24 και με δύο συνδετήρες επί καρκινικών κυττάρων J82. Πιθανή αντίθεση υποδοχείς για αυτές τις αλληλεπιδράσεις είναι CD43 και MUC1, δύο γνωστοί συνδέτες για ICAM-1, οι οποίες εκφράζονται από αυτά τα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Laurent VM, Duperray Α, Sundar Rajan V, Verdier C (2014) Ατομικής Δύναμη Μικροσκοπίας αποκαλύπτει ένα ρόλο για ενδοθηλιακό κύτταρο ICAM-1 σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης προσκόλληση των κυττάρων. PLoS ONE 9 (5): e98034. doi: 10.1371 /journal.pone.0098034

Συντάκτης: Andrew Pelling, Πανεπιστήμιο της Οτάβα, Καναδάς

Ελήφθη: 21 Ιαν, 2014? Αποδεκτές: 28, Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: May 23, 2014

Copyright: © 2014 Laurent et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι πηγές της χρηματοδότησης που έχουν στηρίξει το έργο είναι Νανοεπιστήμες Ιδρύματος, ANR Transmig, La Ligue contre le καρκίνο, Labex Tec21. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

συγκολλητικές αλληλεπιδράσεις των καρκινικών κυττάρων με το ενδοθήλιο είναι βασικά γεγονότα στην διαδικασία της μετάστασης (δηλαδή η διασπορά των καρκινικών κυττάρων από ένα όργανο σε άλλα μέρη του σώματος) [1], [2]. Κατά τη διάρκεια του σχηματισμού και της ανάπτυξης των όγκων, τα καρκινικά κύτταρα καταφέρνουν να ξεφύγουν από πρωτογενείς όγκους και να διεισδύσουν τη ροή του αίματος, έτσι μπορούν να ταξιδέψουν σε μεγάλες αποστάσεις. Σε απομακρυσμένες θέσεις εντός του ανθρώπινου σώματος, τα καρκινικά κύτταρα αλληλεπιδρούν με το ενδοθήλιο, να τηρούν και τελικά εξαγγειώνονται, δηλ μεταναστεύουν μέσω του ενδοθηλιακού φραγμού. Λευκοκύτταρα και τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν παρόμοιους μηχανισμούς για την αλληλεπίδραση με τα ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs), αλλά ενώ τα φαινόμενα προσκόλλησης και της μετανάστευσης των λευκοκυττάρων μέσω του ενδοθηλίου έχει ιδιαίτερα μελετηθεί κατά τη διάρκεια της φλεγμονής, λίγα αποτελέσματα είναι διαθέσιμα όσον αφορά τον ρόλο των βασικών μόρια που εμπλέκονται στην προσκόλληση και μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων [1], [3], [4], [5].

Όπως και στην περίπτωση των λευκοκυττάρων προσλήψεις, πρόσδεση και κύλισης των καρκινικών κυττάρων (ΘΚ) στο ενδοθήλιο έχει αποδειχθεί για ορισμένους τα καρκινικά κύτταρα και διαμεσολαβείται από σελεκτίνες. Μετά από αυτήν την αρχική αλληλεπίδραση, σταθερή προσκόλληση λαμβάνει χώρα, που προκαλούνται από διάφορα μόρια κυτταρικής προσκόλλησης που ανήκουν στην οικογένεια ιντεγκρίνης [6], καθώς και ο μόριο διακυτταρικής προσκόλλησης-1 (ICAM-1) και ο αγγειακός μόριο κυτταρικής προσκόλλησης-1 (VCAM-1) από την οικογένεια ανοσοσφαιρίνης, οδηγεί σε εισβολή όγκου [7], [8]. VCAM-1 εκφράζεται από το ενδοθήλιο μετά την διέγερση, και αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α4β1, ενώ ICAM-1 εκφράζεται από ECs, λευκοκύτταρα και κάποια TCs, και μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω από φλεγμονώδεις κυτοκίνες. ICAM-1 εμπλέκεται στην προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο μέσω αλληλεπιδράσεων του με LFA-1 και Mac-1 ιντεγκρινών λευκοκυττάρων (ιντεγκρίνης β2). TCs στερούνται β2 ιντεγκρίνες, αλλά τα ουδετερόφιλα μπορεί να ενεργήσει ως γέφυρα μεταξύ TCs και ECs, με LFA-1 στα λευκοκύτταρα δεσμεύουν το ICAM-1 εκφράζεται επί τόσο ενδοθηλιακά και TCs [5]. Επιπλέον, ICAM-1 είναι ένας υποδοχέας για άλλα μόρια, όπως CD43 [9] και MUC1 [10], τα οποία εκφράζονται από κάποια TCs.

πρόοδο του καρκίνου συνδέεται με μεταβολές στην έκφραση κάποιας κόλλας μόρια. Ορισμένες εργασίες διερεύνησαν την σχέση μεταξύ της έκφρασης Ν-καντερίνης και της προόδου της κακοήθειας του όγκου [11], [12]. Μια αύξηση του καρκινικού κυττάρου διεισδυτικότητα συνδυάζεται με μεταγωγή της Ε-καδερίνης με Ν-καντερίνης και μια αύξηση στην έκφραση κάποιων ιντεγκρίνης υπομονάδες [13]. Από ποσοτική άποψη, η σύγκριση των συγκολλητικών ιδιοτήτων σε μη-κακοήθη και κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα ουροδόχου κύστης έχουν δείξει ότι μια ενισχυμένη επίπεδο Ν-καδερίνης σε κακοήθη κύτταρα Τ24 συνοδεύτηκε από αλλαγές στην λύειν ιδιότητες των επιμέρους μορίων Ν-cadherin [14] . Επιπλέον, η έκφραση ICAM-1 έχει συσχετισθεί με μια πιο επιθετική φαινότυπο όγκου [15], [16]. Παρ ‘όλα αυτά, οι συνδετήρες που εμπλέκονται στην σταθερή προσκόλληση της TC δεν έχουν ακόμη όπως σαφώς ορίζεται για λευκοκύτταρα, και η ποσοτικοποίηση των εν λόγω κόλλα αλληλεπιδράσεων μεταξύ της ECS και τα καρκινικά κύτταρα δεν έχει διερευνηθεί μέχρι στιγμής.

Οι ποσοτικές πληροφορίες σχετικά με την κόλλα κύτταρο δυνάμεις μπορούν να ληφθούν χρησιμοποιώντας διάφορες τεχνικές φασματοσκοπίας δύναμη: τον ανιχνευτή δύναμης βιο-μεμβράνη [17], οπτική λαβίδα [18] και το μικροσκόπιο ατομικής δύναμης (AFM) [19]. Όλες αυτές οι τεχνικές που λειτουργούν κάτω από ένα οπτικό μικροσκόπιο επιτρέπει να απεικονίσει τα κύτταρα και ταυτόχρονα μετρά δυνάμεις προσκόλλησης από λίγες ΡΝ για μερικές εκατοντάδες pN ή περισσότερο. Σε αυτή την εργασία, θα επιλέξετε να χρησιμοποιήσετε το μονοκύτταροι λειτουργία φασματοσκοπία δύναμη του AFM για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ κυττάρων που εμπλέκονται στην πρόσφυση ΣΤΛ σε ECs. Σε αντίθεση με άλλες μεθόδους της δύναμης πρόσφυσης, η τεχνική αυτή επιτρέπει τη διεξαγωγή μετρήσεων σε μία διαμόρφωση πλησίον του

in vivo

κατάσταση. Ένα καρκινικό κύτταρο είναι συνδεδεμένο με ένα μαλακό προβόλου και να θέσει σε επαφή με ένα EC-μονοστοιβάδα και το σήμα δύναμη παρακολουθείται χάρη στην εκτροπή AFM προβόλου [19], [20]. Το σήμα επιτρέπει επίσης την ανίχνευση γεγονότων, όπως το δυνατόν αποσυνθέσεις ομολόγων υποδοχέα-συνδέτη, καθώς και την παγκόσμια δύναμη προσκόλλησης σε κυτταρικό επίπεδο.

Προσδιορισμός των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου διεξήχθη για διαφορετικές συστολής προβόλου ταχύτητες για να μελετήσουν πώς δύναμη ρήξης (εμπλέκονται σε ομόλογα κόλλα κύτταρο-κύτταρο) τροποποιείται. Ερευνήσαμε την σχέση μεταξύ των μετρούμενων ομόλογα υποδοχέα-συνδετήρα και την αντίστοιχη μεταστατικό δυναμικό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων κύστης, προκειμένου να καθοριστεί η κόλλα υπογραφή των εν λόγω καρκινικών κυττάρων. Τέλος, δείχνουμε ότι ο υποδοχέας του ICAM-1 για το ECS δρα ως μεσολαβητής κλειδί για την κόλλα αλληλεπίδραση με τις πιο επεμβατικές καρκινικά κύτταρα. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι οι πιο επεμβατική καρκινικών κυττάρων κύστης αλληλεπιδρούν χάρη σε ένα ή δύο τύπους του ICAM-1 συνδέτες: CD43 και MUC1 είναι καλοί υποψήφιοι, όπως αποδεικνύεται από τα πειράματα κυτταρομετρίας ροής. Αυτή η γνώση για τέτοιες αλληλεπιδράσεις είναι απαραίτητη για την κατανόηση της πρόσφυσης των καρκινικών κυττάρων στο ενδοθήλιο, ένας μηχανισμός που οδηγεί στην εισβολή και τη μετάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κύτταρα και κυτταρική καλλιέργεια

Τρεις κυτταρικές σειρές κύστης που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη: RT112, T24 και J82 (ATCC, Rockville, MD). Αυτές οι κυτταρικές γραμμές αντιπροσωπεύουν την εξέλιξη από και προς κακώς διαφοροποιημένα φαινοτύπους και προκύπτουν από επιφανειακή σε διηθητικό επιθηλιακό καρκίνο ουροδόχου κύστεως του ανθρώπου. RT112 καρκινικά κύτταρα είναι μετρίως διαφοροποιημένες και χαρακτηρίζονται από μία κυτταρολογική βαθμού 2 (ή διαφοροποίησης) [21]. Τ24 και J82 καρκινικά κύτταρα είναι ελάχιστα διαφοροποιημένη και χαρακτηρίζεται από μία κυτταρολογική βαθμού 3. Για να γίνει διάκριση καρκινικών κυττάρων από HUVECs, τα καρκινικά κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο που εκφράζει GFP (Green Fluorescent Protein – pEGFP). Ανθρώπινα κύτταρα ομφάλιου Αγγειακή Endothelial (HUVECs) αγοράστηκαν από Promocell (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Τα καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε

2 ατμόσφαιρα υγροποιημένη 5% CO, σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 UI /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (πλήρες μέσο RPMI). ECs διατηρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας Promocell. Το ECS απλώθηκαν σε πλήρες μέσο καλλιέργειας σε καλυπτρίδες από γυαλί επικαλυμμένο με κολλαγόνο Ι (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Γαλλία) και αφήνονται 3 ημέρες για να εξαπλωθεί προκειμένου να επιτευχθεί συρροή. Για τα πειράματα AFM, το μέσο καλλιέργειας συμπληρώθηκε με HEPES (20 mM, pH 7,4).

Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης

Χρησιμοποιήσαμε ένα Nanowizard ΙΙ AFM (JPK Instruments, Βερολίνο, Γερμανία) τοποθετημένα σε ένα μικροσκόπιο Zeiss (Carl Zeiss, Jena, Germany). Αυτή η διαμόρφωση επιτρέπει να πραγματοποιήσει μετρήσεις AFM και ταυτόχρονα να τηρούν τα κύτταρα χρησιμοποιώντας την αντίθεση ή φθορισμού φάση τρόπους. Αυτό το AFM είναι επίσης εξοπλισμένο με την ενότητα «CellHesion» (JPK Instruments, Βερολίνο, Γερμανία). Η ενότητα αυτή επιτρέπει σε ένα μεγάλου βεληνεκούς κατακόρυφη μετατόπιση του σταδίου μέχρι 100 μm η οποία καθιστά δυνατή μετρήσεις φασματοσκοπίας δύναμη συμπεριλαμβάνονται οι αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου. Παράλληλα, μια κάθετη piezotranslator (PIFOC, Physik Instrumente, Καρλσρούη, Γερμανία) είναι τοποθετημένος στον στόχο μικροσκόπιο για να μετακινήσετε το στόχο ταυτόχρονα με το στάδιο μικροσκόπιο και να επικεντρωθεί σε κύτταρα κατά την εκτέλεση των μετρήσεων AFM. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στους 37 ° C με τη χρήση του Petri πιάτων Θερμάστρα (JPK Instruments, Βερολίνο, Γερμανία).

επίστρωση με κονσόλες

Soft προβόλους ήταν σε σχήμα V αυτοί χωρίς τα άκρα (MLCT- O, Bruker, France). Είχαν βαθμονομηθεί χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ανάλυσης θερμικές διακυμάνσεις [22] και επιδεικνύουν μία σταθερά ελατηρίου κοντά στο 0,01 N /m. Για να καταστεί δυνατή η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στο πρόβολο, ο τελευταίος λειτουργικοποιημένα χρησιμοποιώντας βιοτίνη-conA (Interchim, Montluçon, Γαλλία) [23]. Μετά την έκπλυση με PBS, πρόβολοι επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε βιοτίνη-BSA (Interchim, Montluçon, Γαλλία) (0,5 mg /ml), ξεπλύθηκε και πάλι σε PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν σε στρεπταβιδίνη (Interchim, Montluçon, Γαλλία) (0,5 mg /ml) για 10 λεπτά. Τέλος, πρόβολοι ξεπλύθηκαν με PBS και ρυθμίστε σε μια σταγόνα βιοτίνης-conA κατά την διάρκεια 10 λεπτά και στη συνέχεια ξεπλένονται με PBS. Αυτό το μόριο επιτρέπει την σύνδεση των καρκινικών κυττάρων στους προβόλους με δύναμη μεγαλύτερη από τη δύναμη αποκόλλησης μεταξύ κυττάρων στη μελέτη μας: βιοτίνης-conA εμμένει στο καρκινικό κύτταρο μεμβράνης με απόσπαση δύναμη 2 nN [20], ενώ η δύναμη απόσπασης σχετική στην αλληλεπίδραση μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και ΕΚ είναι της τάξης του 1 nN.

σύλληψης κυττάρων του καρκίνου

τα καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας, τότε αποκολλήθηκαν λίγο πριν τα πειράματα AFM, χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα θρυψίνη /EDTA (0,05% θρυψίνη και 0,53 mM EDTA). RPMI μέσο με ορό προστέθηκε στα κύτταρα για να μπλοκάρουν την επίδραση της θρυψίνης. Τέλος, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό. Τα καρκινικά κύτταρα αποτέθηκαν σε ένα τρυβλίο Petri επί της οποίας είχε αναπτυχθεί μια μονοστρωματική ΕΚ, και εγκαταστάθηκε για μερικά δευτερόλεπτα. σύλληψης κυττάρων συνίστατο στην τοποθέτηση του άκρου προβόλου πάνω από ένα καρκινικό κύτταρο (από καρκινικά κύτταρα ήταν φθορισμού, θα μπορούσαν να διακριθούν από ECs, βλέπε σχήμα 1), να έρθουν σε επαφή με το κύτταρο επί δέκα δευτερόλεπτα με δύναμη 1 nN. Στη συνέχεια, ο πρόβολος με το συλληφθέν κυττάρου ανασυρθεί αργά με σταθερή ταχύτητα και το κύτταρο κρατήθηκε στο μέσο καλλιέργειας για να ξεκουραστεί για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκε 1 ml RPMI 1640 μέσο με ορό. Το κελί ήταν σταθερά συνδεδεμένο με το cantilever και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει την προσκόλληση στην ECS.

Α) Η φωτογραφία του προβόλου με συνημμένο τον καρκίνο του φθορισμού των κυττάρων πάνω από τη μονοστοιβάδα HUVEC. Λευκή γραμμή κλίμακας αντιστοιχεί σε 20 μm. Β) Σκίτσο της μεθόδου προσέγγισης-ανάκλησης και τυπική καμπύλη δύναμης συστολής σε σχέση με την μετατόπιση piezo. Το καρκινικό κύτταρο πλησιάζει την μονοστιβάδα ΕΚ με σταθερή ταχύτητα. Στη συνέχεια, το κύτταρο έρχεται σε επαφή με το ΕΚ κατά τη διάρκεια των 10 δευτερολέπτων (κάτω του 1 nN εφαρμοζόμενη δύναμη) για να δημιουργήσετε διάφορα συγκροτήματα ομολόγων πάνω από την περιοχή πρόσφυσης. Η cantilever ανασύρεται με σταθερή ταχύτητα, προκειμένου να αποσπάσει τα ομόλογα κόλλα. Η καμπύλη ανάσυρσης παρουσιάζει άλματα δύναμης που αντιστοιχεί στη δύναμη ρήξης (στ) των ομολόγων. Η συγκολλητική ενέργεια (σκιασμένη περιοχή) αντιπροσωπεύει την απόσπαση έργο του προβόλου να αποκολληθεί εντελώς το κύτταρο από το υπόστρωμα. Η απόσπαση δύναμη είναι η δύναμη που απαιτείται για να τεντώσει το καρκινικό κύτταρο και το ΕΚ, έως ότου τα ομόλογα αρχίζουν να αποκολληθούν. Σημειώστε ότι ορισμένα άλματα δύναμη μπορεί να ακολουθήσει ένα οροπέδιο που αντιστοιχεί στο σχηματισμό πρόσδεσης

Η

φασματοσκοπία Force:. Ανάλυση των καρκινικών κυττάρων-ΕΚ αλληλεπίδραση

Κατ ‘αρχάς, το καρκινικό κύτταρο ιδρύθηκε πάνω από ένα ΕΚ. Ο πρόβολος χαμήλωσε με σταθερή χαμηλή ταχύτητα (1 μm /s) για να θέσει το καρκινικό κύτταρο σε επαφή με το ΕΚ (πάνω από τον πυρήνα). Μια δύναμη συμπιέσεως από 1 nN εφαρμόστηκε στην ΕΚ κατά 10 δευτερόλεπτα (Σχήμα 1Α) με σκοπό τη δημιουργία δεσμών και να αναπαράγει σταθερή πρόσφυση. Τέλος, το κύτταρο καρκίνος ανασυρθεί με ταχύτητα που κυμαίνεται μεταξύ 0,5 m /s έως 20 m /s. Μέτρηση της εκτροπής προβόλου κατά τη διάρκεια της κάθετης κίνησης καταγράφηκε κατά τα διάφορα στάδια (Εικόνα 1Β). Τυπικά, για ένα ζεύγος κυττάρων καρκίνου-ΕΚ, μια αλληλουχία πέντε καμπύλες δύναμης ελήφθη σε πέντε διαφορετικές ταχύτητες συστολής (με χρόνο ανάπαυσης των περίπου 1 λεπτού ανάμεσα σε κάθε καμπύλη). Στη συνέχεια, το καρκινικό κύτταρο αφέθηκε σε ηρεμία κατά τη διάρκεια δέκα λεπτά και κινήθηκε πάνω από ένα άλλο ΕΚ για τη μέτρηση της μια σειρά από πέντε καμπύλες δύναμης και πάλι. Τέλος, κάθε καρκινικό κύτταρο χρησιμοποιήθηκε τρεις ή τέσσερις φορές, ως εκ τούτου δεκαπέντε ή είκοσι τέτοιες καμπύλες δύναμης (Ν = 15 ή Ν = 20) ελήφθησαν. Οι μετρήσεις στη συνέχεια συλλέχθηκαν για διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου, κατά τη διάρκεια παρόμοια πειράματα. Ένα σκίτσο του τυπικού δύναμη αποσύρσεως από την άποψη της μετατόπισης πιεζοηλεκτρικών παρουσιάζεται στο Σχήμα 1Γ. Το ελάχιστο σημείο της καμπύλης είναι η δύναμη απόσπασης, δηλαδή η δύναμη που απαιτείται για να διαχωριστεί το καρκινικό κύτταρο από την ΕΚ. Η απόσπαση δύναμη υποστηρίζεται από το κύτταρο παραμορφωσιμότητα, αλλά επίσης και από τον αριθμό και τη δύναμη της κόλλας δεσμών που σχηματίζονται μεταξύ των κυττάρων. Τα διαφορετικά άλματα σε ισχύ αντιστοιχούν στις διαδοχικές αποσυνθέσεις των ομολόγων που εμπλέκονται κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης μεταξύ κυττάρων [24], [25] και ως εκ τούτου αντιπροσωπεύει τις δυνάμεις ρήξης (ομόλογα δηλαδή υποδοχέα-συνδετήρα). Σημειώστε ότι ένα άλμα δύναμη μπορεί να ακολουθήσει ένα οροπέδιο σε ισχύ, αντιστοιχεί σε πρόσδεσης του σχηματισμού, του οποίου η επέκταση είναι το μήκος οροπέδιο. Η καμπύλη συστολής παρέχει επίσης πληροφορίες σχετικά με την ενέργεια πρόσφυσης που είναι η εργασία που είναι αναγκαία για να αποσυνδέσετε το καρκινικό κύτταρο (σκιασμένη περιοχή στο σχήμα 1Γ). Αυτό περιλαμβάνει το έργο να τεντώσει τα κύτταρα, καθώς και το έργο να σπάσει τα μοριακούς δεσμούς [25]. Όλες αυτές οι παράμετροι (αποκόλληση δύναμη, δύναμη ρήξης, της ενέργειας πρόσφυση) που λαμβάνονται από την καμπύλη ισχύος με τη χρήση του λογισμικού επεξεργασίας εικόνας (μέσο JPK, Βερολίνο, Γερμανία). Για κάθε σύνολο συνθηκών, πειράματα AFM διεξήχθησαν περίπου 9 φορές σε 3 διαφορετικές ημέρες. Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Όλες οι στατιστικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό R (2.14 απελευθέρωσης). Από τα δεδομένα συσχετίζονται, χρησιμοποιήσαμε ένα μικτό πρότυπο Γενικευμένα Γραμμικά (GLMM). Οι διαφορές μεταξύ των παραμέτρων που υπολογίζονται για τα μη επεξεργασμένα και αντι-ICAM-1-επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχθηκαν με τη μικτή λειτουργία του AFEX πακέτο στο λογισμικό R.

Αναστολή της ICAM-1 προσδέματα για το ECS

Ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα κατά ICAM-1 [27] χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 30 μg /mL. Πριν τα πειράματα AFM, ECs επωάστηκαν για 15 λεπτά παρουσία του αντισώματος στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές σε PBS και επωάζονται σε 2 ml μέσου καλλιέργειας.

Ακινητοποίηση του ICAM-1 και BSA

Ένα κλάσμα 20 μι ανασυνδυασμένου ICAM-1 (RD Systems, Lille, Γαλλία) (25 μg /ml) σε 0,1 Μ NaHCO

3 (ρΗ 8,6) προσροφήθηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C στο κέντρο της καλυπτρίδας. Χωρίς περιορισμούς πρωτεΐνες απομακρύνθηκαν με πλύσιμο με PBS και 2 ml πλήρους RPMI 1640 προστέθηκαν στη συνέχεια στο επικαλυμμένο πιάτο ICAM-1 πριν από τα πειράματα AFM.

Για το πρωτόκολλο BSA-επικάλυψης, ένα κλάσμα μι BSA σε 100 μg /ml σε PBS απορροφήθηκε 30 λεπτά στους 37 ° C στο κέντρο του τρυβλίου Petri. Χωρίς περιορισμούς πρωτεΐνες απομακρύνθηκαν με πλύσιμο με PBS και 2 ml πλήρους μέσου RPMI προστέθηκαν στη συνέχεια στο BSA επικαλυμμένα πιάτο πριν από τα πειράματα AFM.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ICAM-1, MUC1 και CD43 έκφρασης και ανοσοφθορισμού χρώση

τα επίπεδα έκφρασης του ICAM-1 (επί της επιφάνειας ΕΚ), MUC1 και CD43 (επάνω στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων) αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (ροή Accuri C6 κυτταρόμετρο, BD Bio-Sciences). Η ποσοτικοποίηση έγινε με μέτρηση του γεωμετρικού μέσου φθορισμού. Για τη χρώση ανοσοφθορισμού, γυάλινες καλυπτρίδες επικαλύφθηκαν με 25 μg /ml ανθρώπινη φιμπρονεκτίνη. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για έμμεσο μικροσκοπία ανοσοφθορισμού.

Για τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης του ICAM-1 και MUC1, ECs ή καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα και στη συνέχεια με FITC-συζευγμένο (κατσίκα αντι-ποντικού IgG) δευτερεύον αντίσωμα (Jackson ImmunoResearch, USA). Τα πρωτογενή αντισώματα είναι ένα ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα κατά ICAM-1 [26] ή ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-MUC 1 C595 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Το αντι-MUC 1 αντίσωμα αναγνωρίζει ένα μοτίβο τετραπεπτιδίου εντός του πυρήνα πρωτείνης του μορίου MUC1.

Για επίπεδο έκφρασης CD43, τα καρκινικά κύτταρα επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα CD43-κλώνος L10 σημασμένο με FITC (Invitrogen, USA), η οποία αντιδρά με την εξωκυτταρική περιοχή.

Αποτελέσματα

Πρόσφυση διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών

για να αξιολογηθεί εάν καρκινικών κυττάρων διεισδυτικότητα σχετίζεται με συγκολλητικές ιδιότητες του, θα πραγματοποιηθεί φασματοσκοπία δύναμη μετρήσεις που στοχεύουν στην αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων (διαφορετικών διηθητικότητας) και ECs. Τα καρκινικά κύτταρα να προκύψουν από τις ακόλουθες κυτταρικές σειρές: RT112, Τ24 και J82. κύτταρα RT112 είναι οι λιγότερο επεμβατικές κύτταρα ενώ Τ24 και J82 κύτταρα είναι οι πιο επεμβατικές αυτές [21]. Οι καμπύλες δύναμης διεξήχθησαν μεταξύ ενός καρκινικού κυττάρου συνδέεται με το άκρο προβόλου και μία μονοστοιβάδα ECs επιστρώνονται σε γυάλινη καλυπτρίδα. Το Σχήμα 2 δείχνει τυπικές καμπύλες δύναμης που ελήφθησαν κατά τις αλληλεπιδράσεις των τριών τύπων καρκινικών κυττάρων (Τ24, J82 και RT112) με το ECs. Κάθε καμπύλη συστολής (ταχύτητα σύσπασης V = 5 μm /s) δείχνει αρκετές εκδηλώσεις ρήξη που σχετίζονται με την διαδοχική διάσπαση των δεσμών που εμπλέκονται κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης κυττάρου-κυττάρου. Είναι ενδιαφέρον, οι λιγότερο επεμβατικές κύτταρα (RT112) παρουσιάζουν μικρότερα βήματα δύναμη ρήξης σε σύγκριση με πιο επεμβατικές κύτταρα (Τ24, J82). Επιπλέον, η δύναμη απόσπασης που είναι το ελάχιστο σημείο (Σχήματα 2Α-Β-Γ) της καμπύλης είναι μικρότερο για τα κύτταρα RT112. Τα σχήματα 2Α-Β-Γ δείχνουν επίσης την κατανομή των δυνάμεων ρήξης ανιχνευθεί για καρκινικές κυτταρικές αλληλεπιδράσεις με ECs σε V = 5 μm /s. Αυτά τα μεγέθη [10-70 Pn] είναι στην περιοχή από τυπικές τιμές δύναμης που λαμβάνεται για τα ομόλογα υποδοχέα-συνδετήρα [23], [27], [28], [29]. Είναι αξιοσημείωτο ότι οι τρεις τύποι κυττάρων παρουσιάζουν διαφορετικές τιμές ισχύος: μετρήσεις αποκαλύπτουν μια μέση δύναμη ρήξης 29,6 ± 0,8 ΡΝ για RT112, 34,0 ± 0,9 ΡΝ για Τ24 και 44.2 ± 1.1 ΡΝ για J82 (V = 5 μm /s). Να σημειωθεί ότι ο μέσος όρος των δυνάμεων ρήξης είναι μικρότερες για τα κύτταρα RT112 οποία είναι η λιγότερο επεμβατική είδος.

Τυπικές καμπύλες ισχύ μετά 10s-επαφή μεταξύ ενός TC και μια ΕΚ σχετικά μονοστιβάδα HUVEC. ιστογράμματα Πιθανότητα με συλλεχθεί δυνάμεις ρήξης f για J82 (Α), Τ24 (Β) και RT112 κύτταρα (C) σε V = 5 μm /s. Κάθετη βέλη υποδηλώνουν παραδείγματα της δύναμης άλματα που αντιστοιχεί σε διάλυση των ομολόγων υποδοχέα-συνδετήρα.

Η

ενέργεια πρόσφυση και δύναμη απόσπασης (κυτταρικό επίπεδο)

Μια σημαντική πτυχή που χαρακτηρίζουν την αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων στην ECS είναι η ενέργεια προσκόλλησης που περιλαμβάνει ολόκληρη την περιοχή επαφής των κυττάρων. Η ενέργεια πρόσφυση προέρχεται μέσω της ενσωμάτωσης της περιοχής κάτω από την καμπύλη F (z), όπου F είναι η δύναμη και z είναι η μετατόπιση piezo. Η γραμμή βάση επιλέγεται ως η τελική οριακή τιμή, αφού όλες οι ομολογίες αποσπώνται. Το λογισμικό JPK επιτρέπει να επιλέξετε αυτήν την τιμή και στη συνέχεια εκτελεί την ένταξη. Συνεπώς ερευνήσαμε την ενέργεια πρόσφυση καθώς και τη δύναμη απόσπασης (απόλυτη τιμή της ελάχιστης δύναμης επί επανατυλίξεως καμπύλη ισχύος, βλέπε Σχήμα 1Β) συναρτήσει της ταχύτητας συστολής (V). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, αυτές οι δύο παράμετροι αυξάνονται με την ταχύτητα συστολής. Όσον αφορά την ενέργεια προσκόλλησης, τα πιο επεμβατική J82 κυττάρων που υπάρχουν μεγαλύτερες τιμές σε σύγκριση με τα κύτταρα Τ24 ή RT112. Επιπλέον, η διαφορά αυτή επιβεβαιώνεται από την απόσπαση των τιμών ισχύος που είναι υψηλότερο για τα κύτταρα J82 σε σύγκριση με τα κύτταρα Τ24 και RT112. Σε κάθε περίπτωση, αποκόλληση δυνάμεις ή ενέργειες πρόσφυση είναι πάντα μικρότερη με το λιγότερο επεμβατική κυττάρων RT112.

Οικόπεδο της ενέργειας πρόσφυσης (Α) και την απόσπαση δύναμη (Β) έναντι της ταχύτητας συστολής μετά από 10s-επαφή μεταξύ ενός TC και ΕΚ σχετικά με μονοστιβάδα HUVEC. Τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου: T24 (ανοιχτός κύκλος), J82 (πλήρες τετράγωνο) και RT112 (πλήρες τρίγωνο). Τα δεδομένα απεικονίζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Η γραμμή είναι μόνο ένας οδηγός για το μάτι.

Η

Επίδραση της ταχύτητας συστολής σε ισχύ ρήξης

Η δύναμη ρήξης έχει αποδειχθεί θεωρητικά να εξαρτάται από το λογάριθμο του ποσοστού φόρτωσης του προβόλου [30]. Για να μελετηθεί η υπογραφή του κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου, κάποιος πρέπει να αναλύσει τα φάσματα ισχύος των τριών τύπων καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασής τους με ECs (Σχήμα 4). Αυτά τα φάσματα παρούσες αξίες δύναμη ανάλογα με την ταχύτητα ανάσυρσης ή ισοδύναμα το ποσοστό φόρτωσης r

f (N /s), ισούται με το γινόμενο της ταχύτητας συστολής V (m /s) φορές το ελατήριο σταθεράς k (N /m) του προβόλου, δηλαδή r

f = kV. τιμές δύναμη αυξάνεται σταδιακά με την ταχύτητα συστολής και κυμαίνονται μεταξύ 20,8 ± 0,7 Pn και 47,4 ± 1,9 ΡΝ για τα κύτταρα RT112, μεταξύ 27,1 ± 1,1 Pn και 52,4 ± 2,0 ΡΝ για τα κύτταρα Τ24, καθώς και μεταξύ 31,6 ± 1,0 Pn και 65,8 ± 1,6 ΡΝ για J82 κύτταρα. Για τις τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές, η μέση δύναμη ρήξης σε σχέση με το λογάριθμο των αυξήσεων της ταχύτητας συστολής, αλλά δεν είναι γραμμική.

Σχέση μεταξύ δύναμης ρήξης και της ταχύτητας συστολής μετά από 10s-επαφή μεταξύ ενός TC και μια ΕΚ σχετικά με ένα HUVEC μονοστιβάδας. Τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου: T24 (πλήρης κύκλος), J82 (πλήρες τετράγωνο) και RT112 (πλήρες τρίγωνο) αλληλεπιδρούν με το ενδοθήλιο. Τα δεδομένα απεικονίζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Η γραμμή είναι μόνο ένας οδηγός για το μάτι.

Η

Μέτρηση των ειδικών και μη ειδικών δυνάμεων πρόσφυσης για τα καρκινικά κύτταρα

Σε μια προηγούμενη μελέτη, δείξαμε ότι το ICAM-1 ενεπλάκη σε TC εξαγγείωση [4]. Για να δοκιμαστεί η ειδική προσκόλληση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και ICAM-1 μορίων, πραγματοποιήσαμε πειράματα φασματοσκοπίας δύναμη μεταξύ ενός καρκινικού κυττάρου συνδέεται με το άκρο ενός προβόλου AFM και ακινητοποιημένα μόρια ICAM-1 σε ένα γυάλινο πιάτο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, αυτές οι μετρήσεις δείχνουν ότι οι δυνάμεις ρήξης είναι πολύ κοντά στις ήδη ελήφθησαν για τον καρκίνο του κυττάρου-ΕΚ αλληλεπίδραση [28]. Οι τιμές βρίσκονται στο εύρος του [20-70pN] για ταχύτητα συστολής μεταξύ 0,5 μm /s και 20 m /s. Για να συγκρίνετε τις τιμές αυτές με τις μη ειδικές δυνάμεις πρόσφυσης, μετρήσαμε επίσης τις δυνάμεις ρήξης μεταξύ TCs και BSA-βαμμένη επιφάνεια. Το επίπεδο ισχύος που εμπλέκονται στη μη ειδική προσκόλληση είναι της τάξεως των [10-45pN], η οποία είναι πολύ λιγότερο σημαντικό, περίπου το 40% έως 70% του εργατικού ειδικής σύνδεσης.

ισχύος Ρήξη εναντίον της ταχύτητας συστολής για κύτταρα Τ24 αλληλεπιδρά είτε με ένα επικαλυμμένο υπόστρωμα ή με ΑΕΚ (κύκλος). Το υπόστρωμα είναι επικαλυμμένο με BSA 100 μg /ml (τετράγωνο) ή ανασυνδυασμένο ICAM-1 25 μg /ml (διαμάντι). Τα δεδομένα απεικονίζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Η γραμμή είναι μόνο ένας οδηγός για το μάτι.

Η

Ο ρόλος της

υποδοχέα ICAM-1

Όπως φαίνεται από συνεστιακής απεικόνισης μικροσκόπιο (Εικόνα 6Α), η έκφραση του ICAM-1 σε μη διεγερμένα ECs είναι μέτρια. ανάλυση FACS (Σχήμα 6Β) επιβεβαιώνει το επίπεδο έκφρασης ICAM-1, κατά τη σύγκριση των επιπέδων φθορισμού των κυττάρων σε επεξεργασία με ένα άσχετο αντίσωμα και με το αντίσωμα αντι-ICAM-1. Για να προσδιοριστεί η σχετική συνεισφορά του υποδοχέα ICAM-1 στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, εξετάσαμε την αλλοίωση των δυνάμεων πρόσφυσης όταν το κλείδωμα αυτόν τον υποδοχέα με ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα. Το Σχήμα 7 δείχνει την επίδραση του αντισώματος εναντίον ΙΟΑΜ-1 κατά τη διάρκεια της συγκόλλησης των τριών τύπων καρκινικών κυττάρων με την ECs. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή της ΕΚ ICAM-1 είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση των δυνάμεων ρήξης για μόνο τα πιο επεμβατική κύτταρα. Για τα κύτταρα Τ24, μέσοι δύναμη κυμαινόταν μεταξύ 27,1 και 52,4 pN ΡΝ (σε διαφορετικές ταχύτητες) χωρίς αποκλεισμό του υποδοχέα ICAM-1, αλλά μεταξύ 14,4 και 35,7 pN PN, όταν το κλείδωμα ICAM-1 (Σχήμα 7Α). Αυτή η επίδραση είναι επίσης σαφώς ορατή στο κουτί-ινίδια οικόπεδο που λαμβάνονται με ταχύτητα ανάσυρσης των 5 μm /s (Σχήμα 7 Β). Το αντι-ΙΟΑΜ-1 αντίσωμα επάγει σημαντική μείωση της δύναμης ρήξης για Τ24 (από 34pN σε 21,8 PN, βλέπε Εικόνα 7Β) και η τιμή του 21,8 ΡΝ (+/- 0,7) που ελήφθη μετά τη χρήση του αντισώματος είναι συγκρίσιμη με εκείνη της ρήξη αξία ισχύος της 23.3pN (+/- 1,6) που λαμβάνονται για την προσκόλληση T24-BSA (βλέπε σχήμα 7G). Ως εκ τούτου, μετά την αναστολή του ICAM-1, το επίπεδο δύναμης ρήξη είναι χαρακτηριστικό ενός μη ειδική προσκόλληση. Αυτή η αναστολή φαίνεται να είναι σχεδόν πλήρης για τα κύτταρα Τ24. Για J82 κύτταρα, μέσοι δύναμη να κυμαίνεται μεταξύ 31,6 και 65,8 pN pN χωρίς κλείδωμα ICAM-1 και μεταξύ 17,7 και 58,1 pN pN όταν το κλείδωμα ICAM-1. Αυτή η επίδραση του αντι-ΙΟΑΜ-1 είναι σαφώς ορατή στο Θηκόγραμμα-whisker του σχήματος 7D: η μέση τιμή μειώνεται από 44,2 έως 30,4 pN pN με ταχύτητα συστολής των 5 μm /s. Τέλος, η πρόσφυση των κυττάρων RT112 να ECs δεν μειώνεται με την παρουσία του αντισώματος αντι-ΙΟΑΜ-1: οι μέσες τιμές κυμαίνονται μεταξύ 20,8 και 47,4 pN pN ενώ είναι μεταξύ 21,1 και 58,6 pN pN όταν το κλείδωμα ICAM-1. Αυτή η μη σημαντική επίδραση του αντισώματος αντι-ΙΟΑΜ-1 έχει επιβεβαιωθεί από τις γραφικές παραστάσεις κυτίου whisker (Σχήμα 7F): το αντίσωμα δεν προκαλεί καμία μείωση στην δύναμη ρήξης. Ως εκ τούτου, μια σημαντική μείωση στη δέσμευση δυνάμεων για επεμβατικές κύτταρα (π.χ. 35% για το J82 και Τ24 κύτταρα) έχει αποτιμηθεί εδώ ανεξάρτητα από την ταχύτητα, ενώ δεν υπάρχει καμία αλλαγή στην περίπτωση των λιγότερο επεμβατική κυττάρων RT112. Αυτό αποδεικνύει σαφώς ότι το ICAM-1 εκφράζεται από την ECS διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο για την σταθερή προσκόλληση των πιο επεμβατικές κύτταρα (J82 και Τ24).

Α) Ομοεστιακή μικροσκόπιο εικόνα μίας μονοστοιβάδας ΕΚ χρώση για το ICAM-1 ( πράσινος). HUVECs μονιμοποιήθηκαν με PFA. Οι πυρήνες χρωματίζονται με μπλε χρησιμοποιώντας DAPI. Β) Ποσοτικοποίηση των ICAM-1 επίπεδα με ανάλυση FACS (διακεκομμένη γραμμή) σε σύγκριση με ένα άσχετο αντίσωμα (συνεχής γραμμή).

Η

ισχύος Ρήξη εναντίον της ταχύτητας συστολής μετά την αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και την ΕΚ, υποβάλλεται σε επεξεργασία με ένα αντι ICAM-1 αντίσωμα ή όχι. Αντίστοιχη οικόπεδα box-μουστακιού δείχνουν δυνάμεις ρήξης με ταχύτητα ανάσυρσης των 5 m /s. (Α, Β) Τ24-ΕΚ, (C, D) J82-ΕΚ και (Ε, F) RT112-ΕΚ. Ως σύγκριση, η Θηκόγραμμα δύναμη ρήξης φαίνεται επίσης για την αλληλεπίδραση Τ24-BSA (πίνακας G). Για πίνακες Α, C και Ε, η γραμμή είναι μόνο ένας οδηγός για το μάτι. Τα δεδομένα απεικονίζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Αστέρια αντιπροσωπεύουν το p-value από GLMM στατιστικών ελέγχων μεταξύ των παραμέτρων που υπολογίζονται για τα μη επεξεργασμένα και αντι-ICAM-1-επεξεργασμένα κύτταρα (* p ≤ 0,05).

Η

Λεπτομερής ανάλυση των δυνάμεων ρήξης

από τη στιγμή που χρησιμοποιούνται οι μέσες τιμές των δυνάμεων ρήξης που μπορεί να κρύψει την πολυπλοκότητα των συγκολλητικών δεσμών, μια πιο λεπτομερή επιθεώρηση των άλματα δύναμης (όπως φαίνεται χρησιμοποιώντας ιστογράμματα) πραγματοποιήθηκε προκειμένου να αποκτήσει περισσότερες πληροφορίες. Αυτή η ανάλυση δίνεται στο Σχήμα 8 όπου το TC-ECs ή το TC-υπόστρωμα (ICAM-1 ή BSA) είναι άλματα δύναμη καταγράφονται και να παρουσιάζονται με τη χρήση ιστογράμματα, σε μια δεδομένη ταχύτητα 5 m /s. Επιθεώρηση του ιστογράμματος του T24-ECs δυνάμεις ρήξης στο Σχήμα 8Α (χωρίς την επίδραση της αντι-ΙΟΑΜ-1) αποκαλύπτει μια κατανομή Gauss με κέντρο το 32,9 ΡΝ (+/- 5.8). Είναι ενδιαφέρον, αυτή η κατανομή των δυνάμεων που βρέθηκαν για αλληλεπίδραση T24-ΕΚ είναι αρκετά παρόμοια με εκείνη που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης μεταξύ T24 και του ICAM-1 επικαλυμμένο-υπόστρωμα (δηλαδή μέση τιμή = 28,8 pN +/- 5,1) (βλέπε ιστόγραμμα στο Σχήμα 8D ). Από την άλλη πλευρά, όταν ο ECs υποβληθεί σε αγωγή με το αντίσωμα αντι-ICAM-1, η κορυφή στο Σχήμα 8Α σχεδόν εξαφανίζεται (η περιοχή κάτω από την καμπύλη χωρίζεται από έναν παράγοντα δέκα). Μια νέα κορυφή με κέντρο 19 pN εμφανίζεται, παρόμοια με την τιμή των 21,5 pN αποτελέσματα για T24 αλληλεπιδρά με το BSA-επικαλυμμένη επιφάνεια (Σχήμα 8Ε), η οποία μπορεί να αποδοθεί σε μη-ειδικές αλληλεπιδράσεις.

Επίδραση του αντι -ICAM-1 αντισώματος στις αλληλεπιδράσεις του καρκίνου-ΕΚ. διανομές δύναμη ρήξη είναι Gaussian με μία ή δύο κορυφές αποκαλύπτοντας την παρουσία του προσδέματος ομολόγων υποδοχέα /ή μη ειδικές αλληλεπιδράσεις. ιστογράμματα πιθανότητα δύναμη ρήξης (V = 5 m /s) για το (Α) Τ24-HUVEC, (Β) J82-HUVEC, (C) RT112-HUVEC. Μαύρα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν την αλληλεπίδραση του καρκίνου-κυττάρων και της ΕΚ χωρίς αντίσωμα, ενώ τα κόκκινα δείχνουν την κατανομή της δύναμης μετά τη χρήση του αντισώματος. Πάνελ D (T24-ICAM-1) και Ε (T24-BSA) δείχνουν τις πιθανότητες δύναμη ρήξης για κύτταρα Τ24 σε επαφή με επικαλυμμένα υποστρώματα. Ο αριθμός Ν των γεγονότων που αναφέρονται στα ιστογράμματα

Η

Το ιστόγραμμα των δυνάμεων ρήξης J82-ΕΚ αποκαλύπτει μια διανομή ενός διπλού Gaussian κατανομή:. Υπάρχουν δύο κορυφές αρχικά (42 Pn και 70 PN) ως μπορεί να δει κανείς από το μεγάλο φάσμα των τιμών της δύναμης. Μετά την επώαση με το αντίσωμα, η τελευταία κορυφή (70 PN) εξαφανίζεται εντελώς, ενώ το πρώτο (42 PN) μειώνεται κατά ένα συντελεστή 3 (Σχήμα 8Β). Μπορούμε να συμπεράνουμε ότι το ICAM-1 αναμένεται να αλληλεπιδρά με δύο προσδεμάτων στην επιφάνεια J82 κυττάρων, και ότι το αντίσωμα αναστέλλει και τις δύο αλληλεπιδράσεις, αλλά κατά προτίμηση ένα. Αυτοί οι δεσμοί μπορεί να είναι ειδικές αλληλεπιδράσεις με δύο διαφορετικούς συνδετήρες για παράδειγμα. Επιπλέον (Σχήμα 8Β), μια νέα χαμηλότερη κορυφή εμφανίζεται όταν χρησιμοποιείτε το αντίσωμα (≈28pN), των οποίων η αξία είναι πολύ κοντά σε εκείνο που βρέθηκε για μη-ειδικά ομόλογα.

Η περίπτωση του RT112 κυττάρων είναι διαφορετική, όπως μπορεί να φανεί στο Σχήμα 8C. Υπάρχει μόνο μία κορυφή με και χωρίς το αντίσωμα που βρίσκεται σε παρόμοια επίπεδα (28 ΡΝ και 33 PN, καμία σημαντική διαφορά). Η προσθήκη του αντι-ΙΟΑΜ-1 αντισώματος δεν αλλάζει τη γενική καμπύλη, ως εκ τούτου δεν υπάρχει σαφής επίδραση ανιχνεύεται για τα κύτταρα RT112, υποδεικνύοντας ότι το ICAM-1 είναι πιθανόν να μην εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία συγκόλλησης.

Ανάλυση του ICAM- 1 συνδέτες (CD43 και MUC1) έκφραση με επεμβατικές κύτταρα Τ24 και J82

καρκινικά κύτταρα κύστης δεν εκφράζουν τους κοινούς συνδετήρες ICAM-1, όπως LFA-1 ή Mac-1 [5]. Από την άλλη πλευρά, η έκφραση του MUC 1 (βλεννίνη 1) και CD43 (λευκοσιαλίνη) έχουν πρόσφατα περιγραφεί ως ICAM-1 προσδέματα [31], [10], [9], [32]. Ως εκ τούτου, εμείς ποσοτικοποιηθεί η έκφρασή τους με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα στην Εικόνα 9 δείχνουν ότι τα κύτταρα Τ24 εκφράζουν μόνο το συνδέτη CD43 ενώ κύτταρα J82 εκφράζουν τόσο CD 43 και συνδετήρες MUC1. Όσον αφορά τα κύτταρα RT112, εκφράζουν μόνο το συνδέτη CD43.