Αφηρημένο

Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να εξετάσει κατά πόσον υπάρχουν ή όχι καρκινικά βλαστικά κύτταρα σε κακοήθεις όγκους περιφερικών νεύρων θήκη (MPNST). Κύτταρα καθιερωμένων γραμμών, πρωτογενείς καλλιέργειες και προσφάτως τεμαχίστηκαν όγκοι καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες ελεύθερες ορού συμπληρωμένο με επιδερμικό και αυξητικών παραγόντων ινοβλαστών. Από τη μία καθιερωμένη ανθρώπινη MPNST κυτταρική γραμμή, S462, τα κύτταρα που πληρούν τα κριτήρια για τα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του ήταν απομονωμένη. Κλωνικές σφαίρες λήφθηκαν, η οποία θα μπορούσε να περάστηκαν πολλές φορές. Εμπλουτισμός βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με κύτταρα σε αυτούς τους τομείς υποστηρίχθηκε επίσης από την αυξημένη έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων όπως CD133, Oct4, νεστίνη και NGFR, και μειωμένη έκφραση των ώριμων δεικτών κυττάρων όπως CD90 και ΝΟΑΜ. Επιπλέον, τα κύτταρα αυτών των κλώνων σφαίρες S462 διαφοροποιηθούν σε κύτταρα Schwann, λείων μυών /ινοβλαστών και νευρώνες-όπως κύτταρα κάτω από συγκεκριμένες διαφοροποίηση που προκαλεί πολιτιστικές συνθήκες. Τέλος, η υποδόρια ένεση των σφαιρών σε ανοσοανεπαρκείς γυμνά ποντίκια οδήγησε στο σχηματισμό όγκου σε υψηλότερη τιμή σε σύγκριση με τα πατρικά προσκολλημένα κύτταρα (66% έναντι 10% στα 2,5 × 10

5). Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν ενδείξεις για την ύπαρξη καρκίνου βλαστικών κυττάρων, όπως κύτταρα σε κακοήθεις όγκους περιφερικών νεύρων θήκη

Παράθεση:. Spyra M, L Kluwe, Hagel C, Nguyen R, Panse J, Kurtz A, et al. (2011) Cancer Βλαστικών Κυττάρων-Όπως και κύτταρα που προέρχονται από κακοήθη Περιφερικών Νεύρων Θήκη όγκοι. PLoS ONE 6 (6): e21099. doi: 10.1371 /journal.pone.0021099

Συντάκτης: Andrew Yeudall, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Δεκεμβρίου 2010? Αποδεκτές: 20 Μαΐου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου 2011

Copyright: © 2011 Spyra et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτές οι μελέτες υποστηρίχθηκαν εν μέρει από μια επιχορήγηση από το πρόγραμμα του Υπουργείου άμυνας νευροϊνωμάτωση (W81XWH-07-0359 για SDR) και «Bundesministerium für Bildung und Forschung» (BMBF) (01GM0480 με AK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι κακοήθεις όγκοι περιφερικών νεύρων θήκη (MPNSTs) είναι τα σαρκώματα μαλακών μορίων που προκύπτουν από τα περιφερικά νεύρα και έχουν υψηλά ποσοστά τοπικής υποτροπής και αιματογενής μετάσταση [1]. Αντιπροσωπεύουν το 10% του συνόλου των σαρκώματα μαλακών ιστών. Το ήμισυ αυτών των κακοηθειών να εμφανιστεί σε ασθενείς με νευροϊνωμάτωση τύπου 1, ενός συνδρόμου ογκοκατασταλτικό γονίδιο με συχνότητα περίπου 1 στις 3000. MPNST, ιδιαίτερα εκείνες που σχετίζονται με νευροϊνωμάτωση τύπου 1, είναι μία από τις πιο επιθετικές κακοήθειες σε ανθρώπους με εξαιρετικά φτωχή πρόγνωση [2].

Τα αποτελέσματα των πρόσφατων μελετών δείχνουν ότι πολλοί κακοήθεις όγκοι περιέχουν κύτταρα με τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωσης, κλωνικότητας, πολυδυναμικότητα, και τα υψηλά ποσοστά σχηματισμού όγκων σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια [3], [4 ]. Όπως εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα τεκμηριωθεί ότι είναι ανθεκτικά στα φάρμακα [5], [6]. Σε πρόσφατη κλινική δοκιμή μας χρησιμοποιώντας το μεσυλικό imatinib, έναν αναστολέα του υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης, αρκετούς ασθενείς με MPNST έδειξε αρχικά πολλά υποσχόμενο απαντήσεις όπως οι όγκοι τους συρρικνώθηκαν σε πολύ μικρές πυρήνες. Ωστόσο, η υποτροπή συνέβη σε όλες τις περιπτώσεις και οι επαναλαμβανόμενες όγκοι δεν ανταποκρίνονται στην αρχική θεραπεία τυχόν περισσότερες (αδημοσίευτες παρατηρήσεις). Ενδεχομένως, ένα μικρό μέρος των κυττάρων βλαστικού κυττάρου που ομοιάζει ξεφύγει από την θεραπεία και οδήγησε σε υποτροπή

Ενώ καρκινικά βλαστικά κύτταρα έχουν αναφερθεί και μελετηθεί εκτεταμένα σε μια σειρά στερεών όγκων [7] – [9]., Αυτοί δεν έχουν ακόμη εντοπιστεί σε MPNSTs. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την υπόθεση ότι MPNSTs περιέχουν επίσης κύτταρα βλαστικού κυττάρου-όπως, η οποία μπορεί να εμπλουτιστεί

in vitro

. Οι κυττάρων που μοιάζουν με βλαστικά κύτταρα από έναν ιδρύθηκε ανθρώπινη MPNST κυτταρική γραμμή, S462, περαιτέρω χαρακτηρίζεται

in vitro

,

in vivo

και μοριακά.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ασθενείς και οι όγκοι

Η διάγνωση του νευροϊνωμάτωση 1 έγινε σύμφωνα με το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας των διαγνωστικών κριτηρίων [10]. MPNST όγκους (n = 12), plexiform (n = 3) και δερματικές νευρινώματα (n = 3), ελήφθησαν ως επί το πλείστον από την χειρουργική και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής Τμήματα του Ιατρικού Κέντρου του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf και μερικά από την Νευρινωμάτωση Κλινική του Μονάχου. Η απόκτηση των όγκων εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας (Αμβούργο Ärztkammer, OB-011/07) και όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση. Αμέσως μετά την χειρουργική αφαίρεση, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε Hanks ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (Gibco, Paisley, UK). Ένα μέρος από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την παθολογική διάγνωση του όγκου (Ινστιτούτο Νευροπαθολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Hamburg-Eppendorf). Ένα άλλο μέρος καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Το υπόλοιπο του ιστού χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργεια κυττάρων.

καλλιέργειας κυττάρων

Τα κύτταρα καθιερωμένων κυτταρικών σειρών MPNST S462 και S1507-2 καλλιεργήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες με ορό [11]. Διάστασης και καλλιέργεια κυττάρων από προσφάτως εκτομή MPNSTs ήταν όπως περιγράφεται προηγουμένως [11].

Εμπλουτισμός των κυττάρων βλαστικού κυττάρου που ομοιάζει

Cells καθιερωμένων γραμμών, πρωτογενείς καλλιέργειες και πρόσφατα διαχωρισθεί όγκοι καλλιεργήθηκαν υπό στέλεχος συνθήκες κυττάρου σε μέσο βλαστοκυττάρων (SCM) αποτελείται από Neurobasal Medium (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) με ανθρώπινο ανασυνδυασμένο παράγοντα επιδερμικής ανάπτυξης (EGF, 20 ng /ml, R & amp? συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ), βασικός αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών (bFGF , 20 ng, Prepotech, Rocky Hill, NJ), ηπαρίνη (32 IE /ml, Rathiopharm, Ulm, Γερμανία) και συμπληρώθηκε με 1% Ν2 και 1% Β27 (και τα δύο από την Invitrogen). Πυκνότητες των επιχρυσωμένο κυττάρων κυμαινόταν από απλά έως 500 κύτταρα ανά φρεάτιο. Για σφαίρες πέρασμα, σφαίρες συλλέχθηκαν με ήπια φυγοκέντρηση σε 800

g

για 5 λεπτά, και διαχωρίζονται μηχανικά με σιφωνισμό πάνω και κάτω χρησιμοποιώντας πιπέτα 1 ml. Στη συνέχεια, το κυτταρικό εναιώρημα διηθήθηκε μέσω ενός φίλτρου πλέγματος 30 μm για να απομακρυνθούν οι παραμένοντες συσσωματώματα. Ενιαία κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν σε διάφορες πυκνότητες σε SCM.

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ενσωμάτωσης βρωμοδεοξυουριδίνης (Roche, Mannheim, Germany) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση διαβάστηκε σε φασματοφωτόμετρο σε μήκος κύματος 405 nm.

Κλωνικές σχηματισμός σφαίρα

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα σε τρυβλία 96 φρεατίων. Φρεάτια που περιέχουν μονά κύτταρα σημαδεύτηκαν ενώ εκείνα που περιέχουν περισσότερα από ένα κύτταρο ανά φρεάτιο αποκλείστηκαν από την ανάλυση. Μετά από δύο (ή τρία) εβδομάδες, μετρήθηκαν φρεάτια που περιείχαν σφαίρες. Συχνότητα του σχηματισμού σφαίρας υπολογίζεται ως το ποσοστό των φρεατίων που περιέχουν σφαιρών κατά τα φρεάτια που περιέχουν μόνο κύτταρα.

Real-time PCR

RNA παρασκευάστηκε από σφαίρες και προσκολλημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας στήλες NucleoSpin RNA XS (Macherey Nagel, Düren, Germany). Για τη σύνθεση cDNA χρησιμοποιήσαμε τυχαία εξαμερών εκκινητών (Fermentas, St.Leon-Rot, Γερμανία) και Επαναφορά Ενίσχυση της ανάστροφης μεταγραφάσης (Fermentas). Για την έκφραση του γονιδίου αναλύσεις επικυρωμένες δοκιμασίες έκφρασης TaqMan Gene (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν. Για CD133 διακρίσεις χρησιμοποιήσαμε TaqMan Gene Expression Αναλύσεις δεσμευτικός ως προς εξόνιο 2/3 και 4/5 εξόνιο του CD133. Σχετικές ποσότητες RNA στόχου κανονικοποιήθηκαν προς ριβοσωμική πρωτεΐνη L13a (RPL13a) ως εσωτερικός έλεγχος και η σχετική ποσοτικές τιμές υπολογίστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο ΔΔCt.

Η κυτταρομετρία ροής

Για την ανίχνευση των επιφανειακών δεικτών CD133, CD34, υποδοχέας νευρικού αυξητικού παράγοντα (NGFR, CD271), νευρικά μόριο κυτταρικής προσκόλλησης (NCAM, CD56) και CD90, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 30 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος αραιωτικού αντισώματος (Beckman Coulter, Krefeld, Γερμανία) και 10 μΐ αντι-CD133 /2 ΡΕ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία), 11 μΙ CD271-FITC (R &? D), 5 μΙ CD34-ΡΕ, 5 μΙ CD56-PC5 ή 5 μl CD90-PC7 (Beckmann Coulter) προστέθηκαν (συγκεντρώσεις βέλτιστη αντίσωμα προσδιορίστηκαν με διάφορα πειράματα αραίωση). Ως αρνητικοί μάρτυρες, τα κύτταρα επωάστηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό συμπληρωμένο με 10 μΙ IgG1-PE, 10 μΙ IgG1-FITC, 5 μΙ IgG1-PC5, 10 μΙ IgG1-PC7 (Beckmann Coulter) επί 30 λεπτά στους 4 ° C. Για την ανίχνευση της ενδοκυτταρικής αντιγόνου νεστίνη (R &? D), τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με αντιδραστήριο AB ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (R &? D) και 10 μl νεστίνη-ΡΕ (R &? D) ή 10 μΙ IgG1-PE προστέθηκαν γιά 30 λεπτά στους 4 ° C.

Μετά από πλύση με φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, τα κύτταρα αναλύθηκαν μέσα σε 1 ώρα με κυτταρομετρία ροής είτε σε FC 500 κυτταρόμετρο ροής χρησιμοποιώντας λογισμικό CXP (Beckman Coulter) ή σε PAS Particle σύστημα ανάλυσης (Partec, Münster, Γερμανία).

μαγνητική διαλογή κυττάρων

κύτταρα εναιωρούνται σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.5% αλβουμίνη βόειου ορού και 2 mM EDTA σημάνθηκαν μαγνητικά με αντι-CD133 /2, CD34 και CD271 μικροσφαιρίδια χρησιμοποιώντας την Miltenyi Biotec CD133 /2, CD34, CD271 κιτ μικροσφαιρίδιο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο μαγνητικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε με στήλες MACS διαχωρισμού (Miltenyi Biotec). Θετικά και αρνητικά κλάσματα εκλούστηκαν τρεις φορές για να αυξηθεί η καθαρότητα των δειγμάτων. Κλάσματα των θετικών και αρνητικών ταξινομημένα κύτταρα αξιολογήθηκαν για καθαρότητα με κυτταρομετρία ροής με ένα FC 500 κυτταρόμετρο ροής χρησιμοποιώντας λογισμικό CXP (Beckman Coulter).

προσδιορισμούς διαφοροποίησης των κυττάρων

διαχωρισμένα σφαίρες ή γονικών κυττάρων προσκολλημένα ήταν επιστρώθηκαν σε φρεάτια επικαλυμμένα με πολυ-λυσίνη και λαμινίνη, και αναπτύχθηκαν σε DMEM:F-12 (3:01) που περιείχε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Για τη διαφοροποίηση νευρογλοία, 5 ng /ml ανασυνδυασμένη ανθρώπινη νεουρεγκιουλίνη-SS1 (ευγενώς από τον Dr. S. Carroll, Τομέας Νευροπαθολογίας, Τμήμα Παθολογίας, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Μπέρμιγχαμ, Αλαμπάμα) και 2 mM φορσκολίνη (Sigma, Μόναχο, Γερμανία) προστέθηκαν για τουλάχιστον 2 εβδομάδες [12]. Για λείου μυός ινοβλαστών (SM /Fb) διαφοροποίηση, 40 ng /ml bFGF (Prepotech) προστέθηκε για 5 ημέρες, και στη συνέχεια προστέθηκε 1 ng /ml μετασχηματισμού SS1 αυξητικό παράγοντα (Sigma) επί 7 ημέρες [12]. Για νευρώνες, Neurobasal μέσο συμπληρώθηκε με 1 mM ρετινοϊκό οξύ (Sigma), 10 mg /ml κυκλικής ΑΜΡ (Sigma), 1% Β27, και 2 mM γλουταμίνη [7] για 1 εβδομάδα ή περισσότερο. Για όλες τις συνθήκες, το μέσο αλλάχθηκε κάθε τρεις ημέρες

ανοσοφθορισμού χρώση

κύτταρα αναπτύσσονται σε πλακίδια θαλάμου μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα:. Κουνελιού αντι-ανθρώπινης S100 (1 :500, ϋΑΚΟ, Hamburg, Germany), κουνελιού αντι-λείου μυός ακτίνη (1:100, Santa Cruz, Heidelberg, Γερμανία), αντι-ανθρώπου σε συνδυασμό με μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη ποντικού (ΜΑΡ) -2 (Millipore, Schwalbach, Γερμανία), ποντίκι αντι-ανθρώπινο NGFR (1:100, Millipore), αντι-ανθρώπινου νευρονηματίου ποντικού (1:400, Millipore) και ποντικού αντι-ανθρώπου νεστίνη (1:200, Millipore). Για διπλή σήμανση S100 είτε με νευρονηματίου ή NGFR, η ίδια διαδικασία χρησιμοποιήθηκε για το δεύτερο πρωτεύοντα αντισώματα και ένα δεύτερο αντίσωμα που δημιουργείται σε ένα άλλο είδος και επισημαίνονται με χρησιμοποιήθηκε μια άλλη βαφή. Κατάλληλους ελέγχους ισοτόπου και η παράλειψη της πρωτοβάθμιας και δευτεροβάθμιας αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για να αποκλειστούν πιθανές μη ειδική ανοσοσήμανση. Οι πυρήνες σημάνθηκαν με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (Invitrogen).

Ογκογονικότητα δοκιμασία σε γυμνούς ποντικούς

αθυμικά γυμνά ποντίκια (Charles River) αναισθητοποιήθηκαν εν συντομία με ένα μίγμα CO

2/0

2 και διίσταται σφαίρες ή προσκολλημένα κύτταρα αιωρούνται σε 50% Matrigel (R &? D) εγχύθηκαν υποδορίως σε ποντικούς [13]. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε δύο φορές την εβδομάδα. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την τοπική αρχή (Behörde für Wissenschaft und Gesundheit, Αμβούργο, 68/06).

αφαιρέθηκαν όγκοι αναπτύσσονται σε ποντίκια, που καθορίζεται στο 7% φορμόλη και ενσωματωμένο σε παραφίνη. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Για ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιήσαμε κουνελιού αντι-ανθρώπου S100 (1:500) και κουνελιού αντι-ανθρώπινης Κί67 (1:50, NeoMarkers, Asbach, Γερμανία) αντισώματα. Για την ανίχνευση αντισωμάτων, χρησιμοποιήθηκε το διττό σύστημα Envision Kit υπεροξειδάσης (Dako). Αντιδράσεις χρώματος αναπτύχθηκαν με VectorRed (Vector Laboratories, Burlingame, CA) και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη.

Ανάλυση δεδομένων

Η σύγκριση των συχνοτήτων του σχηματισμού σφαίρας μεταξύ των διαφόρων διόδων και την αύξηση της ο αριθμός των κυττάρων ικανά να σχηματίζουν σφαίρες όγκου με πέρασμα ελέγχθηκε από ένα μη-παραμετρική ANOVA? εάν είναι σημαντικές, οι συγκρίσεις post-hoc χρησιμοποιώντας τεστ Dunn του έγιναν. Η αύξηση του αριθμού των πολλαπλασιαστικών κυττάρων συναρτήσει του χρόνου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα μη-παραμετρική επαναλαμβανόμενες μετρήσεις ANOVA? εάν είναι σημαντικές, συγκρίσεις post-hoc χρησιμοποιώντας τεστ Tukeys του έγινε. Η ίδια δοκιμή εκτελέσθηκε για σύγκριση μια αύξηση του πολλαπλασιασμού του CD133 θετικών και αρνητικών σφαίρες την πάροδο του χρόνου. Οι διαφορές στην σχετική ποσότητα του cDNA αναλύθηκαν με RT-PCR, και οι αλλαγές στο ποσοστό των θετικών κυττάρων σε γονικά προσκολλητικά κύτταρα και σφαίρες αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, ελέγχθηκαν με τη χρήση της μη παραμετρικής Mann-Whitney U-test. Οι διαφορές στη συχνότητα σχηματισμού όγκου μεταξύ ποντικών που ενέθηκαν με προσκολλημένα κύτταρα και σφαίρες αντίστοιχα, υπολογίστηκαν από το Chi-square τεστ. Όλες οι μέσες τιμές παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Οι τιμές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

σχηματισμό σφαίρα από κύτταρα MPNST

Για να εξεταστεί κατά πόσον ή όχι MPNSTs περιέχει βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν, κύτταρα από 2 συσταθεί γραμμές και 12 αποσυντίθενται όγκοι καλλιεργήθηκαν σε μέσο άνευ ορού που περιέχει EGF και FGF. Σφαίρες ή σφαίρα που μοιάζει συσσωματώματα ελήφθησαν από τις δύο κυτταρικές σειρές και 10 από τα 12 ανατομή φρέσκο ​​όγκους. Σφαίρες που σχηματίζεται σε χαμηλή πυκνότητα, τόσο χαμηλά όσο ένα κύτταρο ανά φρεάτιο και πολλαπλασιάστηκαν επί τουλάχιστον 20 περάσματα από την καθιερωμένη κυτταρική γραμμή MPNST S462. Σφαίρες ή σφαίρα-όπως αδρανών υλικών ελήφθησαν επίσης από άλλο ιδρύθηκε γραμμή MPNST (S1507-2) και από πρωτογενή κύτταρα MPNST και φρεσκοτριμμένο τεμαχίζεται MPNSTs? Ωστόσο, επέζησαν μόνο για 2 έως 12 διόδους, και δεν θα μπορούσε να ληφθεί σε κυτταρικές πυκνότητες χαμηλότερες από 100 κύτταρα ανά φρεάτιο. Ομοίως, σφαίρες ή σφαίρα που μοιάζει συσσωματώματα ελήφθησαν επίσης από πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από νευρινώματα plexiform και δερματική νευρινώματα, αλλά δεν θα μπορούσε να είναι ανακαλλιεργήθηκε περισσότερο από δύο φορές. έτσι περαιτέρω πειράματα επικεντρώθηκαν σε σφαίρες S462.

In vitro χαρακτηρισμός των MPNST S462 σφαίρες

Γονική κύτταρα MPNST S462 της διόδου 35, η οποία υπό κανονικές συνθήκες μέσο με ορό μεγαλώνουν προσκολλημένα, σχηματίζεται κυμαινόμενο σφαίρες μετά 2 ημέρες υπό συνθήκες αρχέγονων κυττάρων (Σχήμα 1Α, Β?. προσκολλημένα κύτταρα S462 αναφέρονται στη γονική κυτταρική γραμμή S462). Πολλαπλασιασμό των κυττάρων στους τομείς απέδειξαν ότι αυτά δεν ήταν αδρανή μόνο (Εικ. 2Α). Όταν διαχωρίστηκαν αυτά τα πρωτογενή σφαίρες και τα κύτταρα απλώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλή πυκνότητα σε φρεάτια μιας πλάκας 96-φρεατίων, δευτερογενείς σφαίρες λήφθηκαν σε 16.7% ± 2.4 του εκβαθύνσεις που περιέχουν μεμονωμένες κύτταρα. Η συχνότητα του σχηματισμού σφαίρας από μεμονωμένα κύτταρα αυξήθηκε όταν οι σφαίρες πέρασαν περαιτέρω (σχ. 2Β). Κλωνικές σφαίρες ελήφθησαν επίσης από προσκολλημένα κύτταρα S462 του πολύ νωρίς πέρασμα 2, με μια υψηλότερη συχνότητα σχηματισμού πρωτογενών σφαίρας 31,86% ± 2,50, σχεδόν διπλάσια με προσκολλημένα κύτταρα S462 του περάσματος 35. Μέχρι σήμερα, MPNST S462 σφαίρες έχουν περάστηκαν κάτω από κλωνική συνθήκες πάνω από 20 φορές.

(Α) Γονικός κύτταρα S462 υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας με ορό αυξάνονται προσκολλημένα (απόσπασμα 35). (Β) Κυμαινόμενο δευτερεύουσα σφαίρα μετά από δύο εβδομάδες υπό συνθήκες βλαστικών κυττάρων χωρίς ορό. Η σφαίρα προήλθε από ένα μοναδικό κύτταρο και έτσι ήταν κλωνική. Μπαρ = 20 μm.

Η

δοκιμασία ενσωμάτωσης βρωμοδεοξυουριδίνης αποκάλυψε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων S462 στην κλωνική σφαίρες (δευτεροβάθμια σφαίρες). Η αύξηση της απορρόφησης των κυττάρων ήταν σημαντική για 8, 10, και 15 ημέρες σε SCM έναντι 3 ημέρες (ρ & lt? 0,01 **). Αλλαγές στην συχνότητα του σχηματισμού σφαίρας σε εκβαθύνσεις που περιείχαν μονά κύτταρα αρχικά από προσκολλημένα S462, στη συνέχεια, από διίσταται σφαίρες απλώθηκαν ως απλά κύτταρα και ανακαλλιεργήθηκαν διαδοχικά. Η αύξηση στη συχνότητα του σχηματισμού σφαίρας με την αύξηση του πέρασμα ήταν σημαντική (απόσπασμα 1 (πρωτογενή τομέα) έναντι περάσματα 10 (10

ου σφαίρες) και 12 (12

ου σφαίρες), P & lt? 0,01 **, πέρασμα 2 ( δευτεροβάθμιας σφαίρες) έναντι περάσματα 10 (10

ου σφαίρες) και 12

ου σφαίρες), P & lt? 0,05 *)

Η

Up-ρύθμιση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων και προς τα κάτω ρύθμιση των ώριμων. δείκτες κυττάρων σε S462 σφαίρες

Real-Time PCR αποκάλυψε τη ρύθμιση των δεικτών βλαστοκυττάρων νεστίνη, NGFR, Oct4, Notch4, SOX2, CD133 και SOX9 στο S462 σφαίρες των αποσπασμάτων μεταξύ 13 και 16, σε σύγκριση με το S462 προσκολλημένα κύτταρα διατηρούνται κάτω από τις συνθήκες καλλιέργειας SCM για 14-16 ώρες (Σχ. 3Α, αριστερά). Σε αντίθεση, ο EGF υποδοχέα (EGFR) και NCAM, ένας δείκτης των ανώριμων κυττάρων Schwann, εκφράστηκαν σε χαμηλότερα επίπεδα σε S462 σφαίρες ό, τι σε γονικά κύτταρα προσκολλημένα τους (Σχ. 3Α, δεξιά).

(Α) Ακίνητη -Ώρα PCR. Η έκφραση του κάθε δείκτη στους τομείς ομαλοποιήθηκε έναντι έκφραση του ίδιου δείκτη στα προσκολλημένα κύτταρα S462. Σφαίρες σε περάσματα μεταξύ 13 και 16. * p & lt? 0,05? προσκολλημένη σε σχέση με την έκφραση σφαίρα μεταγραφή (νεστίνη, NGFR, Oct4, Sox2, CD133, SOX9, EGFR και NCAM). (Β) κυτταρομετρία ροής. Αλλαγές στο ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν ώριμη και βλαστικών δείκτες αρχέγονων κυττάρων σε προσκολλημένα κύτταρα και σε σφαίρες (διόδους 8 και 13), CD133 και NCAM προσκολλητικά έναντι σφαίρες ρ & lt? 0,05 *, CD34 και CD90 προσκολλημένα έναντι σφαίρες ρ & lt? 0,01 **, NGFR και νεστίνη προσκολλημένη σε σχέση με σφαίρες p & lt? 0,01 ***. EGFR, υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα? NGFR, υποδοχέα παράγοντα ανάπτυξης νεύρου? ΝΟΑΜ, κυτταρικής προσκόλλησης μόριο.

Η

Η κυτταρομετρία ροής έδειξε αυξημένη έκφραση των νευρικών δεικτών κορυφής ΝΟΡΚ, CD133 και νεστίνη στους τομείς σε σχέση με τη γονική προσκολλημένα κύτταρα S462 (Σχ. 3Β). Η αναλογία των κυττάρων που εκφράζουν CD34 ήταν επίσης αυξημένη σε τομείς έως περίπου 50%. Επιπλέον, περίπου το 60% του πληθυσμού NGFR θετικής συνεκφράζεται-CD133 εις τα συγκολλημένα S462 και στους τομείς (66,84 ± 10,82% προσκολλημένα έναντι 60,81 ± 12,21% σφαίρες, όχι σημαντική), (Σχ. 4). Αντίθετα, CD90 και ΝΟΑΜ εκφράστηκαν λιγότερο συχνά στη S462 σφαίρες σε σχέση με τα προσκολλημένα κύτταρα (Εικ. 3Β).

Side και προς τα εμπρός ανάλυση διασποράς των προσκολλημένων κυττάρων (αριστερή στήλη) και σφαίρες (στο πέρασμα 8, δεξιά στήλη) έδειξαν διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Ζωντανά κύτταρα οριοθετημένα στο R1 (άνω πάνελ), και οι gatings για NGFR (R2) θετικά κύτταρα (μεσαίο πάνελ) εμφανίζεται με πορτοκαλί χρώμα. NGFR-θετικά κύτταρα (που παριστάνεται με πορτοκαλί χρώμα) εντός των CD133-θετικά κύτταρα δείχνουν συν-έκφραση του CD133 /NGFR (κάτω πάνελ). κύτταρα ΝΟΡΚ συν-έκφραση CD133 είναι σπάνιες στον πληθυσμό προσκολλημένων κυττάρων και αυξημένη σε σφαίρες. Ισότυπος ελέγχου για όλα τα αντιγόνα που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των τεταρτημόρια για τα αρνητικά τους πληθυσμούς. NGFR, υποδοχέα νευρικού αυξητικού παράγοντα.

Η

Ανώτατη συχνότητα του σχηματισμού σφαίρας S462 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CD133 +

Χρησιμοποιώντας μαγνητική διαλογή με βάση σφαιρίδια, εμπλουτίσαμε CD133 θετικά και αρνητικά κύτταρα από τον ορό -cultured προσκολλημένα κύτταρα S462 (πέρασμα 35) έως 90 και 80%, αντίστοιχα, και να τους καλλιεργούνται ξεχωριστά σε SCM σε χαμηλή πυκνότητα κυττάρων. Περισσότερες σφαίρες που σχηματίζονται στον πληθυσμό CD133 + σε σύγκριση με τον πληθυσμό CD133- (35,21% έναντι 18,35%). Επιπλέον, τα κύτταρα στο CD133 + σφαίρες πολλαπλασιαστεί πιο γρήγορα από ό, τι εκείνα των CD133- σφαίρες (απορρόφηση στα 405 nm των 0,7 ± 0,047 έναντι 0,39 ± 0,0312, p & lt? 0.001).

S462 σφαίρες είναι ικανά διαφοροποίησης καταγωγή

για να εκτιμηθεί η πιθανότητα σε πολλαπλές-διαφοροποίηση, κλωνικά προέρχεται σφαίρες και προσκολλημένα κύτταρα S462 από το πέρασμα 35 ήταν και οι δύο καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει ορό, η οποία προκαλεί διαφοροποίηση. Μετά από δύο έως τρεις εβδομάδες, η έκφραση της S100 παρατηρήθηκε σε ένα μικρό αριθμό κυττάρων από S462 κλωνική σφαίρες, δείχνοντας γενεαλογία διαφοροποίηση σε κύτταρο-όπως κύτταρα Schwann. Αντίθετα, η έκφραση αυτού του δείκτη δεν παρατηρήθηκε στα προσκολλημένα κύτταρα S462 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Περισσότερο από το 50% των κυττάρων από τις σφαίρες κλωνική εκφράζονται νεστίνη όταν καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει ορό, σε σύγκριση με κανένα από τα προσκολλημένα κύτταρα S462 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η προσθήκη νεουρεγκιουλίνης και επάγεται από φορσκολίνη ειδική διαφοροποίηση προς S100 + Schwann κύτταρα σε σχεδόν όλα τα κύτταρα του κλωνικού σφαίρες S462, αλλά μόνο ένα μικρό μέρος των προσκολλημένων κυττάρων S462 ήταν πραγματικά θετικά για S100 και έδειξε ελαφρά διαφορετική μορφολογία (σχ. 5Α). Η διπολική μορφολογία των κυττάρων S100 + Schwann διαφοροποιείται από κλωνική σφαίρες (Εικ. 5Α, D) ήταν παρόμοια με εκείνη των κυττάρων Schwann που προέρχεται από ένα plexiform νευρίνωμα (Εικ. Ένθετο 5Α). Αυτά τα διαφοροποιημένα κύτταρα από κλωνικές σφαίρες εξέφρασε επίσης την Schwann δείκτες κυττάρου νευρονηματίου και NGFR (Εικ. 5Α), προσκολλημένα κύτταρα εξέφρασαν νευρονηματίου αλλά πολύ σπάνια NGFR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

προσκολλημένα κύτταρα (αριστερή στήλη) και σε διάσταση σφαίρα κύτταρα (δεξιά στήλες) καλλιεργήθηκαν με αυξητικούς παράγοντες που επάγουν διαφοροποίηση σε κύτταρα που μοιάζουν με (Α) κύτταρα Schwann, (Β) /Fb και (C) νευρώνες SM, τα οποία είναι θετικά χρωματίστηκαν για S100 /NGFR /νευρονηματίου (κύτταρα Schwann), SMA ( SM /Fb), και ΜΑΡ-2 (νευρώνες), αντίστοιχα. Τοποθετήστε το Α απεικονίζει κύτταρα S100 + Schwann που προέρχεται από έναν πολιτισμό plexiform νευρίνωμα. μικρογραφίες αντίθεσης (Δ) φάση από διαφοροποιημένα κύτταρα κάτω από 3 συνθήκες καλλιέργειας για τη δημιουργία των κυττάρων Schwann, SM /Fb και νευρώνες-όπως κύτταρα. Τα διαφοροποιημένα κύτταρα που υποδεικνύεται από τα βέλη και τα μη διαφοροποιημένα κύτταρα με αιχμές βελών. Γραμμές = 20 μm. NGFR, των νεύρων του αυξητικού παράγοντα? SMA, ακτίνη των λείων μυών? ΜΑΡ-2, μικροσωληνίσκων πρωτεΐνη που συνδέεται-2? PNF, plexiform νευρίνωμα? LC, όπως-κύτταρα.

Η

Ομοίως, η έκθεση σε bFGF και ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-SS1 επήγαγε ειδικές διαφοροποίηση /Fb κύτταρα που μοιάζουν με SM σε ένα μεγάλο μέρος των κυττάρων από κλωνικών σφαίρες S462 ενώ μόνο μερικά S462 προσκολλημένα κύτταρα έδειξαν έκφραση λείου μυός ακτίνης και ινοβλαστοειδή μορφολογία (σχ. 5Β, D).

Τέλος, κυκλικού ΑΜΡ και ρητινοϊκού οξέος που επάγεται νευρογενή διαφοροποίηση γράμμωσης σε κύτταρα κλωνική σφαίρες, όπως εκφράζεται ΜΑΡ-2 και παρουσίασαν νευρώνα-ειδική μορφολογία όπως μεγάλα κυτταρικά σώματα και νευρίτες (Εικ. 5C, D). Σε αντίθεση, ενώ τα προσκολλημένα κύτταρα εξέφρασαν ΜΑΡ-2 κάτω από τις ίδιες συνθήκες πολιτιστικές (Σχ. 5C), αυτά τα κύτταρα δεν εμφανίζουν νευρώνα-όπως μορφολογία.

In vivo χαρακτηρισμός της σφαίρας κυττάρων S462

Η υποδόρια ένεση του 2,5 × 10

5 κυττάρων κλωνικής σφαιρών S462 (n = 9) οδήγησε σε εμφανή στερεά σχηματισμό όγκου 1 έως 3 μήνες μετά την ένεση σε 66% των γυμνών ποντικών. Σε αντίθεση, ανιχνεύσιμη συμπαγείς όγκους που σχηματίζονται μόνο στο 10% των γυμνών ποντικών (n = 10), όταν εγχύθηκε ο ίδιος αριθμός των προσφυόμενων κυττάρων S462, αυτός ο όγκος που απαιτείται πάνω από τρεις μήνες για να σχηματίσουν (Εικ. 6Α). Ιστολογικά, οι όγκοι τόσο από προσκολλημένα κύτταρα και σφαίρες παρουσίασαν τυπικά χαρακτηριστικά του MPNST:. Σχήμα ατράκτου, ιδιαίτερα πολλαπλασιαστικών όπως φαίνεται με υψηλούς αριθμούς Κί67 θετικών κυττάρων, και τα κύτταρα του όγκου αρνητικά S100 (Σχήμα 6Β)

(Α) Συχνότητα και ο χρόνος του σχηματισμού όγκου με 2.5 × 10

5 προσκολλημένα (n = 10, δίοδο 35) ή κλωνική σφαίρα S462 (n = 9), CD133

+ (n = 9) και CD133

– (Ν = 5) κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως. Όλα τα κύτταρα σφαίρα ελήφθησαν μεταξύ των διόδων 8 και 13. Τα προσκολλημένα σε σχέση με τις σφαίρες και προσκολλημένη σε σχέση με CD133 + σφαίρες p & lt? 0,05 *. (Β) Ιστολογία των όγκων που προέρχονται από προσκολλημένα κύτταρα (αριστερό πάνελ) και κύτταρα σφαίρα έδειξαν ότι αυτοί οι όγκοι μοιάζουν MPNSTs. Η &? Ε δείχνει τυπικό ατράκτου σχήμα κύτταρα του MPNST (βέλη, άνω πλαίσιο), τα οποία είναι ιδιαίτερα πολλαπλασιαστικές με Ki-67 immunstaining (βέλη, μεσαίο πλαίσιο) και αρνητικοί για S100 (κάτω πίνακας). Bar = 200 μm, ισχύει για όλες τις μικρογραφίες. (C) Τα κύτταρα διαχωριστεί από ποντίκια όγκους σχηματίζονται δευτερογενείς σφαίρες

in vitro

(εκπρόσωπος δευτερεύουσα σφαίρα 3 εβδομάδες μετά την επίστρωση ενιαίου κύτταρα). Bar = 20 μm.

Η

Όταν 2,5 × 10

5 κύτταρα από CD133 + σφαίρες (n = 9) και CD133- σφαίρες (n = 5) εγχύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς υποδορίως, μόνο CD133 + κύτταρα οδήγησε στο σχηματισμό ορατό όγκο σε 55% των ποντικών, ανάμεσα σε δύο εβδομάδες και 1 μήνα μετά την ένεση (Σχ. 6Α). Όταν (η = 3) εγχύθηκαν 5,6 × 10

4 κύτταρα από CD133 + σφαίρες, οι όγκοι που σχηματίζονται σε 66% των ποντικών και πήρε περίπου ένα μήνα για να αναπτυχθεί. Σε αντίθεση, 2.5 × 10

5 κύτταρα από CD133- σφαίρες δεν οδηγούν σε οποιοδήποτε σχηματισμό ορατό όγκο? και υψηλότερους αριθμούς κυττάρων (5 × 10

6, η = 7) οδήγησε σε ορατούς όγκους σε μόνο το 14% των ποντικών και περίπου 2 μήνες μετά την ένεση.

Όταν οι όγκοι από ποντικούς είχαν πρόσφατα διαχωρισθεί και επιχρυσωμένο ως μεμονωμένα κύτταρα σε συνθήκες καλλιέργειας βλαστοκυττάρων, στρογγυλό σφαίρες εμφανίστηκαν μέσα σε δύο ημέρες (Εικ. 6C). Αυτές οι σφαίρες θα μπορούσαν να καλλιεργηθούν με κλωνοποίηση για τα επόμενα περάσματα. Η συχνότητα του σχηματισμού σφαίρας των κυττάρων από όγκους που αναπτύσσονται σε ποντικούς ήταν περίπου 32%, μεγαλύτερη από εκείνη των προσκολλημένων κυττάρων S462 στο πέρασμα 35 (το οποίο ήταν περίπου 17%), ενώ συγκρίσιμη με εκείνη των προσκολλημένων κυττάρων S462 στο πέρασμα 2, η οποία ήταν γύρω 31%.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, εφαρμόσαμε συνθήκες καλλιέργειας βελτιστοποιημένα για νευρικά βλαστικά κύτταρα, για τον εμπλουτισμό του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν από MPNSTs. Καταφέραμε στην απόκτηση και τον εμπλουτισμό αυτών των κυττάρων από έναν ιδρύθηκε MPNST κυτταρική σειρά, S462, και έτσι αποδεικνύεται ότι υπάρχουν καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με MPNST. Σφαίρες θα μπορούσαν να ληφθούν από μεμονωμένα κύτταρα MPNST S462, υποδεικνύοντας ότι είναι αλήθεια σφαίρες πολλαπλασιαζόμενα και όχι συσσωματώματα κυττάρων. Σφαίρες ελήφθησαν επίσης από πρωτογενή S462 στο πέρασμα 2, με ακόμα μεγαλύτερη συχνότητα. Επομένως, είναι απίθανο ότι τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με πετύχαμε, εμπλουτισμένο και σπούδασε είναι ένα τεχνούργημα της μακροχρόνιας καλλιέργειας.

Εμείς δεν θα μπορούσε να αποκτήσει κλωνική σφαίρες που θα μπορούσαν να περνιούνται από ένα δεύτερο MPNST κυτταρική γραμμή, πολλά πρωτοβάθμια MPNST πολιτισμών, φρέσκα τεμαχίζεται όγκους ή plexiform και δερματικά νευρινώματα [12]. MPNST όγκοι είναι κλινικά, γενετικά και ιστοπαθολογικά πολύ ετερογενή [1]. Είναι πιθανό ότι μόνο η γραμμή S462, το οποίο προέρχεται από ένα πολύ επιθετικό και επαναλαμβανόμενο όγκου, περιέχει ένα κατάλληλο ποσοστό του κυττάρου-όπως βλαστικά κύτταρα που είναι αρκετά ανώριμη να επιτρέπουν το σχηματισμό κλωνικών σφαίρες κάτω από τις επιλεγμένες συνθήκες. Σφαίρες από κάποιες άλλες MPNSTs μπορούσε να περνιούνται σε υψηλότερες πυκνότητες μέχρι και 12 φορές, υποδεικνύοντας κάποια κύτταρο-σαν δυναμικό στέλεχος. Οι συνθήκες καλλιέργειας εφαρμόσαμε σε αυτή τη μελέτη είναι απίθανο να είναι η βέλτιστη για καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν σε MPNST. Αυτό μπορεί επίσης να αντικατοπτρίζεται στις δυσκολίες στην ίδρυση μόνιμων καλλιεργειών από φρέσκα όγκων, ακόμη και σε κανονικές συνθήκες καλλιέργειας με ορό ([14].

Κυττάρων

S462 εξέφρασαν μια σειρά από δείκτες βλαστικών ή προγονικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων νεστίνη, NFGR CD133 και CD34 σε διαφορετικούς βαθμούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα κύτταρα είναι λιγότερο διαφοροποιημένα και πιο ανώριμα. έκφραση αυτών των δεικτών αυξήθηκε σημαντικά σε κλωνική σφαίρες υποστηρίζοντας την υπόθεση μας ότι βλαστικά σαν κύτταρα εμπλουτισμένα σε σφαίρες. CD133 + S462 σφαίρες είχαν υψηλότερη συχνότητα σχηματισμό σφαίρας

in vitro

και σχηματισμό όγκων σε ποντίκια σε σύγκριση με CD133- σφαίρες. Αυτός ο δείκτης έτσι σηματοδοτεί καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με MPNST σε κάποιο βαθμό, αλλά όχι αποκλειστικά.

Νευρωνικά λοφίο βλαστικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και διαφοροποιούνται σε ένα αριθμό σειρών συμπεριλαμβανομένων των νευρώνων, γλοίας, και μυοϊνοβλάστες [15], [16]. με την παρουσία των αντίστοιχων αυξητικών παραγόντων, τα κύτταρα των κλώνων σφαιρών MPNST S462 διαφοροποιήθηκαν σε κύτταρα που μοιάζουν με Schwann κύτταρα, SM /Fb και νευρώνες. Τέτοια διαφοροποίηση καταγωγή ήταν πολύ λιγότερο βαθιά και λιγότερο συχνή στα προσκολλημένα κύτταρα MPNST. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι μη διαφοροποιημένα ή αποδιαφοροποιημένα κύτταρα, τα οποία διαθέτουν ένα υψηλότερο δυναμικό για διαφοροποίηση από διαφοροποιημένα κύτταρα, τα εμπλουτισμένα σε κλωνική σφαίρες S462. Στην πραγματικότητα, CD34, ένα glycophosphoprotein, κανονικά εκφράζεται από ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα, μεσεγχυματικά και αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα, και το πιο σημαντικό στα νευρικά βλαστικά κύτταρα είναι επίσης εντοπίζεται σε MPNSTs όγκους, πιθανόν στην ενδονευρικών ινοβλάστες [17], [18]. Η αύξηση στην έκφραση αυτού του δείκτη στους τομείς υποδεικνύει ότι ένας αυξανόμενος αριθμός κυττάρων σχετίζεται με μια πιο αδιαφοροποίητη φαινότυπο υπό τις συνθήκες βλαστικών κυττάρων που χρησιμοποιούνται. Είναι επίσης δυνατόν ότι οι συνθήκες καλλιέργειας νευρικών βλαστικών κυττάρων επάγουν ή προάγουν αποδιαφοροποίηση των κυττάρων S462 ή πολλαπλασιασμό κυττάρων stem-σαν παρούσα στο γονικό πληθυσμό.

αυτο-ανανέωση είναι μία από τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Η αύξηση του σχηματισμού σφαίρας με πέρασμα σε βλαστοκυττάρων μέσα ενημέρωσης δείχνει ότι η συχνότητα των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν εντός των σφαιρών αυξάνει με την αύξηση, όπως θα αναμενόταν εάν αυτές οι συνθήκες καλλιέργειας επιλέγει για, ή υποστήριξη αυξημένο πολλαπλασιασμό, ή επιβίωσης, των βλαστικών-όπως κύτταρα. Ως εκ τούτου, ένας εμπλουτισμός των καρκινικών βλαστικών κυττάρων σε σφαιρίδια μαζί με μειωμένη αναλογίες των διαφοροποιημένων κυττάρων είναι η πιθανή αιτία για την αυξημένη ογκογόνο δραστικότητα των σφαιρών. Είναι ενδιαφέρον ότι, όπως φαίνεται στη μητρική MPNST, όγκους ποντικών προερχόμενα έδειξε πράγματι καμία έκφραση του Schwann δείκτης διαφοροποίησης των κυττάρων S100.

Τα αποτελέσματά μας παρέχουν ενδείξεις για την ύπαρξη των βλαστικών καρκίνου ή βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με κύτταρα σε MPNST. Αυτά τα κύτταρα αναπτύσσονται ως κλωνική σφαίρες για πολλαπλά περάσματα κάτω νευρικά πολιτιστικές συνθήκες βλαστικών κυττάρων, ρητή βλαστικών /δείκτες προγονικών κυττάρων και επάγει τον σχηματισμό όγκων σε ανοσοανεπάρκεια γυμνούς ποντικούς σε σημαντικά υψηλότερη συχνότητα από ό, τι προσκολλημένα κύτταρα. Μελετώντας αυτά τα κύτταρα μπορεί να συμβάλει στην καλύτερη κατανόηση της βιολογίας και της παθογένεσης των MPNST και μπορεί να επιτρέπει την αναγνώριση των συγκεκριμένων στόχων για την ανάπτυξη των θεραπειών.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Τμήματα νευροχειρουργική, Ογκολογίας και νευροπαθολογία (University Medical Center Hamburg Eppendorf, Αμβούργο, Γερμανία) που μας επιτρέπει να χρησιμοποιούν τις εγκαταστάσεις τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες πηγαίνει στο Δρ H. Guenther (Τμήμα Νευροχειρουργικής), Κ Kluge, Α Schaefer και C. Horn, (κυτταρομετρίας ροής εγκατάσταση του Τμήματος Ογκολογίας και Αιματολογίας) και Μ Haberkorn (Τμήμα Νευροπαθολογίας) για να μας δώσει επιστημονικές και τεχνικές συμβουλές. Είμαστε επίσης πολύ ευγνώμων προς τον καθηγητή R. Friedrich, Δρ Μ Blessmann (Τμήμα Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής), ο καθηγητής Ε Yekebas και ο Δρ Μ Bockhorn (Τμήμα Χειρουργικής) από το Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου Eppendorf και ο Δρ U. Wahlländer -Danek (Νευρινωμάτωση Κλινική, Μόναχο, Γερμανία), για την παροχή του υλικού όγκου.