Αφηρημένο

Το πρωτεάσωμα αποτελεί βασικό ρυθμιστή της ομοιόστασης κυτταρικής πρωτεΐνης και είναι κλινικά επικυρωθεί αντικαρκινική στόχο. Το immunoproteasome, ένας υπότυπος του πρωτεασώματος εκφράζεται κυρίως σε αιμοποιητικά κύτταρα, αρχικά αναγνωρίστηκε για το ρόλο της στην παρουσίαση του αντιγόνου κατά την διάρκεια της ανοσολογικής απόκρισης. Πρόσφατα, η immunoproteasome έχει εμπλακεί σε αρκετές καταστάσεις ασθένειας συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και αυτοάνοσων διαταραχών, αλλά πολλοί από τους παράγοντες που συμβάλλουν σε αυτές τις παθολογικές διαδικασίες παραμένουν άγνωστα. Ειδικότερα, το κωδικόνιο 60 πολυμορφισμός του

PSMB9

γονίδιο που κωδικοποιεί την β1i immunoproteasome καταλυτική υπομονάδα έχει διερευνηθεί στο πλαίσιο μιας ποικιλίας ασθενειών. Παρά το γεγονός αυτό, προηγούμενες μελέτες έχουν μέχρι στιγμής αναφερθεί αντιφατικά ευρήματα σχετικά με την επίδραση αυτού του πολυμορφισμού στη δραστηριότητα του πρωτεασώματος. Έτσι, έθεσε ως στόχο να διερευνήσει την επίδραση του

PSMB9

κωδικόνιο 60 πολυμορφισμού στην έκφραση και τη δραστηριότητα του β1i υπομονάδας immunoproteasome σε ένα πάνελ ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Η β1i-εκλεκτικός φθορισμογόνου υποστρώματος ακετυλ-Pro-Ala-Leu-7-αμινο-4-μεθυλοκουμαρίνη χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί ειδικά β1i καταλυτική δράση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το κωδικόνιο 60 Arg /πολυμορφισμός His δεν μεταβάλλει σημαντικά την έκφραση και τη δραστηριότητα των β1i μεταξύ των κυτταρικών σειρών που δοκιμάστηκαν. Επιπλέον, εξετάσαμε επίσης την έκφραση β1i σε κλινικά δείγματα από το παχύ έντερο και ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις μας έδειξαν ότι ~ 70% των κλινικά δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου και ~53% των παγκρεατικών δειγμάτων καρκίνο έχουν ανιχνεύσιμη β1i έκφρασης. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η β1i υπομονάδα της immunoproteasome συχνά εκφράζεται σε κόλον και του παγκρέατος, αλλά ότι το κωδικόνιο 60 γενετικές παραλλαγές του β1i εμφανίζουν παρόμοιες καταλυτικές δραστηριότητες και είναι απίθανο να συμβάλλουν στη σημαντική δια-κυτταρική γραμμή και διεθνείς ατομικές μεταβλητότητες στη δραστηριότητα immunoproteasome

Παράθεση:. Πάρκο JE, Ao L, Miller Ζ, Kim K, Wu Υ, Jang ER, et al. (2013)

PSMB9

Κωδικονίου 60 πολυμορφισμοί δεν έχουν καμία επίδραση στην δραστηριότητα του Immunoproteasome καταλυτική υπομονάδα B1i Εκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου στερεού. PLoS ONE 8 (9): e73732. doi: 10.1371 /journal.pone.0073732

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 10, 2013? Αποδεκτές: 20 Ιούλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 9 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Πάρκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, R15CA156601 και R01CA128903 και το Κεντάκυ τον Καρκίνο του πνεύμονα Ερευνητικό Πρόγραμμα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η πρωτεασώματος είναι υπεύθυνη για την αποδόμηση των στοχευμένων πρωτεϊνών και είναι ένας βασικός παράγοντας για τη διατήρηση της ομοιόστασης κυτταρικής πρωτεΐνης και η ρύθμιση των κυτταρικών διαδικασιών που είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη και την εξέλιξη [1] του καρκίνου, [2]. Η immunoproteasome, μια εναλλακτική μορφή του πρωτεασώματος, βρίσκεται σε κύτταρα αιμοποιητικής προέλευσης, αλλά η έκφρασή του μπορεί επίσης να επαχθεί υπό φλεγμονώδεις και το άγχος συνθήκες σε άλλους τύπους κυττάρων [3]. Η immunoproteasome σχηματίζεται όταν οι τρεις τύπους καταλυτικών υπομονάδων που βρέθηκαν στο συστατική πρωτεασώματος, β1 (Y,

PSMB6

), β2 (Ζ,

PSMB7

) και β5 (X,

PSMB5

), αντικαθίστανται από τρεις ομόλογες ανοσο-υπομονάδες: β1i (LMP2,

PSMB9

), β2i (MeCl-1,

PSMB10

) και β5i (LMP7,

PSMB8

). Σε σύγκριση με την συστατική πρωτεασώματος, ο immunoproteasome βρίσκεται να έχει ελαφρώς τροποποιηθεί πρωτεολυτική ιδιαιτερότητες οι οποίες είναι ικανές να παράγουν πεπτίδια πιο κατάλληλο για σύνδεση με το κύριο σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας Ι μόρια διευκολύνοντας έτσι την παρουσίαση αντιγόνου [4]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η immunoproteasome μπορεί να έχει σημαντικές λειτουργίες πέρα ​​από την προσαρμοστική ανοσοαπόκριση. Για παράδειγμα, η immunoproteasome βρέθηκε να εκφράζεται σε μη-φλεγμονή, ανοσο-previleged ιστούς (π.χ. αμφιβληστροειδή και στον εγκέφαλο [5], [6]) και στο πλαίσιο διαφόρων καταστάσεων ασθένειας (π.χ. καρκίνος, νευροεκφυλιστικές ασθένειες, αυτοάνοσες ασθένειες, [3], [7] και παραπομπές εκεί). Παρά τις παρατηρήσεις αυτές, η βιολογική σημασία του immunoproteasome σε τέτοιες νοσηρές καταστάσεις δεν είναι πλήρως κατανοητός.

Η β1i υπομονάδα του immunoproteasome κωδικοποιείται από το

PSMB9

γονίδιο που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6. Αυτό το γονίδιο φιλοξενεί μια συχνά εμφανιζόμενων γενετικό R /H πολυμορφισμός στο κωδικόνιο 60 (p.60R & gt? Η? c.179G & gt? Α? rs17587) σε συχνότητες H αλληλόμορφο 1,1% έως 34%, που ποικίλλουν σε όλη εθνοτικών ομάδων ([8] και αναφορές σ ‘αυτό) . Πολλές έρευνες έχουν αναφέρει πιθανές συσχετίσεις μεταξύ του κωδικονίου 60

PSMB9

κατάσταση πολυμορφισμό και αυξημένη ευπάθεια σε διάφορες ασθένειες όπως ο εξαρτώμενος από ινσουλίνη σακχαρώδης διαβήτης, η ρευματοειδής αρθρίτιδα και η σκλήρυνση κατά πλάκας [8] – [16]. Ωστόσο, είναι δύσκολο να αποκρυπτογραφηθούν από τις προηγούμενες μελέτες αν οι παρατηρούμενες ενώσεις έχουν άμεση σχέση με την αλλαγμένη δραστικότητα της υπομονάδας β1i ως αποτέλεσμα της τροποποίησης R /H αμινοξέων. Αυτό οφείλεται εν μέρει στην αλληλεξαρτώμενων των υπομονάδων του πρωτεασώματος και την έλλειψη κατάλληλων μοριακών ανιχνευτών. Μια προηγούμενη έρευνα από Mishto et al. [17] εξετάζονται πιο προσεκτικά τις επιπτώσεις αυτού του πολυμορφισμού σχετικά με τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος στην ηλικία του εγκεφάλου χρησιμοποιώντας το φθορογόνο πεπτίδιο υπόστρωμα Ν-ηλεκτρινυλο-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Suc-LLVY-AMC). Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη προτείνει ότι τα αποτελέσματα H αλληλόμορφο σε μία μειωμένη δραστηριότητα πρωτεασώματος σε ηλικιωμένους εγκέφαλο [17]. Ωστόσο, δεδομένου ότι Suc-LLVY-AMC συμβατικά χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της συνολικής τύπου χυμοτρυψίνης (CT-L) πρωτεολυτική δραστηριότητα του πρωτεασώματος και έτσι μπορεί να υδρολυθεί με πολλαπλές υπομονάδες τόσο του immunoproteasome και τη συστατική πρωτεασώματος, αυτή η μείωση στην υδρόλυση του Suc-LLVY-AMC δεν μπορούν να αναφέρουν κατ ‘ανάγκη τις αλλαγές στο β1i λειτουργία. Επιπλέον, μια μεταγενέστερη μελέτη από την ίδια ομάδα, χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένα πεπτίδια που μιμούνται ενδογενών υποστρωμάτων έδειξε ότι δεν υπάρχει διαφορά στα προφίλ υδρόλυση υποστρώματος μεταξύ των κωδικονίων 60 γονότυπους [18].

Ένα μεγάλο μέρος της διαφοράς όσον αφορά τη λειτουργική επίπτωση των κωδικονίων PSMB9 60 πολυμορφισμού προκύπτει από την έλλειψη ενός εργαλείου να παρατηρήσουμε ειδικά τη λειτουργία του β1i υπομονάδας. Από αυτή την άποψη, Lin et al. [19] και Blackburn et al. [20] ανέφεραν πρόσφατα σχετικά με την ανάπτυξη και την εφαρμογή του φθορογόνου υποστρώματος Ακετυλο-Pro-Ala-Leu-7-αμινο-4-μεθυλοκουμαρίνη (Ac-PAL-AMC), η οποία υδρολύεται επιλεκτικά με β1i. Αυτό το μυθιστόρημα εργαλείο κατέστησε δυνατό να εκτιμηθεί η άμεση λειτουργική επίδραση του

PSMB9

κωδικόνιο 60 πολυμορφισμού στο β1i υπομονάδα. Στην τρέχουσα μελέτη μας, μελετήσαμε την έκφραση του β1i στην κλινική του παχέος εντέρου και του παγκρέατος καρκινικούς ιστούς, καθώς και σε καθιερωμένες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Χρησιμοποιώντας το β1i επιλεκτικό φθορισμογόνου υποστρώματος Ac-PAL-AMC, αξιολογήσαμε επίσης την καταλυτική δράση της β1i σε πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές που φέρουν διαφορετικούς γονότυπους στο κωδικόνιο 60. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι β1i συχνά εκφράζεται σε κόλον και του παγκρέατος, αλλά το κωδικόνιο 60

PSMB9

πολυμορφισμός δεν έχει σημαντικό αντίκτυπο στην καταλυτική δράση της β1i εκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

Καθιερωμένες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων (κόλου, HCT-8, DLD-1, HCT-116, SW480? πνεύμονα, Η23, Η358, Η460, H727, Η1299? προστάτη, PC-3, DU145? παγκρέατος, BxPC-3, PANC-1, AsPC1? μαστού, MCF-7, Hs578T, MDA-MB-231) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρείται υπό τις συνιστώμενες συνθήκες. Τα φθορισμογόνα υποστρώματα Suc-LLVY-AMC και Ac-PAL-AMC συντέθηκαν ειδικά μετά την καθιερωμένη στρατηγική σύνθεσης πεπτιδίων. Αναστολείς πρωτεασώματος UK-101 και epoxomicin συντέθηκαν και καθαρίστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [21], [22]. Καθαρισμένο 20 S συστατική πρωτεασώματος και immunoproteasome αγοράστηκαν από τη Βοστώνη Biochem.

Ανοσοϊστοχημική Ανάλυση

μικροσυστοιχίες ιστών που περιέχουν αποχαρακτηρίζονται, αρχειακό περιπτώσεις ανθρώπινου παχέος εντέρου και δείγματα καρκίνου του παγκρέατος ιστού ελήφθησαν από τις ΗΠΑ Biomax. Η χρήση των δειγμάτων αποχαρακτηριστούν συστοιχία ιστού από μια εμπορική πηγή για την τρέχουσα μελέτη θεωρείται ότι εξαιρούνται από την Ανθρώπινη κανονισμό Θέμα από το Διοικητικό κριτική Θεσμική. Μία δοκιμασία στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-ανοσοϋπεροξειδάσης πραγματοποιήθηκε μετά τη διαδικασία ανάκτησης αντιγόνου (κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, ρΗ 6) χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι β1i (1:100 αραίωση, Enzo Life Sciences), σύμφωνα με την προηγουμένως αναφερθείσα πρωτόκολλο [23]. Ανοσολογική αντίδραση έγινε ορατή χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB), και πυρήνες με αιματοξυλίνη. Η ειδικότητα του ανοσοαντιδραστικού σημάτων επαληθεύτηκε παραλείποντας είτε το πρωτεύον ή το δευτερεύον αντίσωμα. Οι τομές ανοσοχρωματίστηκε μικροσυστοιχιών ιστών αναλύθηκαν από έμπειρο παθολόγο (Dr. Eun Υ Lee). Η ένταση της ανοσοχρώση ανατέθηκε σε μια κλίμακα από το 0 έως 2 ή 3.

Προσδιορισμός

PSMB9

Πολυμορφικό Κατάσταση στο κωδικόνιο 60

Το

PSMB9

γονότυποι στο κωδικόνιο 60 αρχικά προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους PCR και DNA ενζυματική πέψεις όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [24]. Το amplicon που καλύπτουν όλο το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης κλωνοποιήθηκε στη συνέχεια και αναλύθηκε με άμεση αλληλούχιση για να βεβαιωθείτε ότι οι κυτταρικές σειρές δεν περιέχουν πρόσθετες γενετικές παραλλαγές στο γονίδιο PSMB9.

Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης

Μία ισοδύναμη ποσότητα ιστού ή κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα και ανιχνεύτηκαν με αντι-β1i (1:1000, Abcam) και αντι-β-ακτίνης (1:1000, Novus) αντισώματα. Μετά την πλύση, οι κηλίδες επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση ραδικιού. Τα δεσμευμένα αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Pierce Biotechnology). Για τη σύγκριση των σχετικών επιπέδων έκφρασης των β1i μεταξύ πολλαπλών κυτταρικών σειρών, σειριακά αραιωμένο κυτταρικά εκχυλίσματα H23 χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα βαθμονόμησης και εντάσεις μπάντα πυκνομετρικά ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού One Ποσότητα (Bio-Rad).

Proteasome δραστηριότητα Δοκιμασίες

Η καταλυτική δραστικότητα της β1i προσδιορίστηκε με παρακολούθηση του ρυθμού υδρόλυσης φθορίζοντος 7-αμινο-4-μεθυλοκουμαρίνη (AMC) από Ac-PAL-AMC [20]. Εν συντομία, καθαρισμένα παρασκευάσματα του πρωτεασώματος ή τα κυτταρικά εκχυλίσματα που περιέχουν ισοδύναμες συνολική ποσότητα πρωτεΐνης (10 μg) προστέθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και ρυθμίζεται σε τελικό όγκο 50 μΐ χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό δοκιμασίας (20 mM Tris /Cl, 0.5 mM EDTA, ρΗ 8,0). Η αντίδραση άρχισε με την προσθήκη Ac-PAL-ΑΜΟ (100 μΜ) και ο φθορισμός του απελευθερωμένου AMC παρακολουθήθηκε για 90 λεπτά χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας SpectraMax M5 (Molecular Devices, διέγερση 360 nm και εκπομπή 460 nm). Προκειμένου να εξακριβωθεί ότι η υδρόλυση του υποστρώματος διαμεσολαβείται από β1i, πρόσθετα σύνολα των κυτταρικών εκχυλισμάτων ή καθαρισμένα παρασκευάσματα του πρωτεασώματος προ-αγωγή με αναστολείς του πρωτεασώματος UK101 ή epoxomicin για 1 ώρα, μετά την οποία παρακολουθήθηκαν σήματα φθορισμού. Σε ξεχωριστά πειράματα, η υδρόλυση του Suc-LLVY-AMC (100 μΜ) παρακολουθήθηκε για να αξιολογήσει τη συνολική CT-L πρωτεολυτική δραστηριότητα.

Στατιστική Ανάλυση

Οι τιμές από τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσο με τυπικές αποκλίσεις. Μια σύγκριση μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του μαθητή

t-test

και p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Η συχνή έκφραση της β1i στην Κολόν και καρκίνο του παγκρέατος ιστούς.

κατά την αξιολόγηση της έκφρασης των β1i στον καρκίνο του παχέος εντέρου, χρησιμοποιήσαμε τέσσερα πρώτα ζευγάρια του καρκίνου του παχέος εντέρου και μη κακοήθεις δίπλα παχέος ιστούς από ταιριάζουν δότες. Οι αναλύσεις ανοσοκηλίδωσης μας έδειξαν ότι τα επίπεδα β1i ήταν ιδιαίτερα αυξημένα σε όλες τις τέσσερις κλινικές κόλον καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τα ζεύγη μη κακοήθεις ιστούς του παχέως (Σχήμα 1Α). Για την περαιτέρω αξιολόγηση της συχνότητας των β1i έκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις σε μία συστοιχία όγκου που περιέχει 153 αξιολογήσιμων καρκίνο του παχέος εντέρου υποδείγματα όλων των κλινικά στάδια. Η ένταση της χρώσης β1i αξιολογήθηκε σε μια κλίμακα από το 0 έως 3 και τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η πλειοψηφία (περίπου 70%, n = 107 από 153 σύνολο δειγμάτων) του κόλου καρκινικούς ιστούς ήταν θετικά (το ένταση χρώσης ≥1) για β1i χρώση (Σχήμα 1Β). Παρόμοιες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μίας συστοιχίας όγκου που περιέχει 43 αξιολογήσιμους παγκρεατικό καρκίνο δείγματα όλων των κλινικά στάδια. Λόγω του περιορισμένου μεγέθους του δείγματος, η ένταση της β1i χρώσης αξιολογήθηκε σε μια κλίμακα από το 0 έως 2 και τα αποτελέσματά μας έδειξε ότι περίπου το 53% (n = 23 από 43 στο σύνολο δειγμάτων) των παγκρεατικών καρκινικών ιστών είχαν θετικές (ο ≥ ένταση χρώσης 1) χρώση β1i (Σχήμα 1 C). Και για τις δύο συστοιχίες των ιστών, που αξιολόγησε κατά πόσο υπάρχει οποιαδήποτε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης β1i και διατίθενται κλινικοπαθολογική παράγοντες (π.χ. φύλο και την τάξη του όγκου). Ωστόσο, τα αποτελέσματα δεν αποκάλυψε εμφανή ενώσεις.

(α) ανάλυση ανοσοαποτύπωσης για β1i χρήση πρωτεΐνης λύματα που παρασκευάζονται από μη κακοήθη (Ν) και καρκινικών (Τ) παχέος ιστούς από τους ίδιους δότες (n = 4 ζεύγη) . β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι εντάσεις ζώνης για β1i και β-ακτίνης πυκνομετρικώς αναλύονται και χρησιμοποιούνται για να ληφθεί η σχετική β1i έκφραση ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη επίπεδα. (Β) Η ανοσοϊστοχημική χρώση για β1i χρησιμοποιώντας μια συστοιχία όγκου που περιέχει 153 δείγματα ιστών αξιολογήσιμους κόλον όγκου. Οι εντάσεις του β1i θετική χρώση αξιολογήθηκαν σε μια κλίμακα από 0 έως 3. Κατά προσέγγιση το 70% (46 δείγματα είχαν ένταση του βαθμού 1, 38 με βαθμό 2, και 8, με βαθμό 3, από 153 σύνολο δειγμάτων όγκου) του παχέος ιστούς έχουν θετικό (η ένταση χρώσης ≥1) β1i χρώση. (Γ) Η ανοσοϊστοχημική χρώση για β1i χρησιμοποιώντας μια συστοιχία όγκου που περιέχει 43 όγκων δειγμάτων παγκρεατικού ιστού αξιολογήσιμο. Οι εντάσεις του β1i θετική χρώση αξιολογήθηκαν σε μια κλίμακα από το 0 έως 2. Περίπου το 53% (9 δείγματα με ένταση βαθμό 1, και 14, με βαθμό 2, από 43 σύνολο δειγμάτων όγκου) των παγκρεατικών καρκινικών ιστών είχε ≥1 β1i ένταση χρώσης .

Η

καταλυτική δράση του β1i σε μια ομάδα ανθρώπινων Καρκίνου Lines κύτταρο που φέρει διαφορετικό κωδικόνιο 60 πολυμορφικές παραλλαγές

Προηγουμένως, Blackburn et al. [20] ανέφεραν ότι το Ac-PAL-AMC (Σχήμα 2Α) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα επιλεκτικό ανιχνευτή για τη μέτρηση της καταλυτικής δραστικότητας του β1i. Πριν από τη χρήση του Ac-PAL-AMC στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε επίσης ότι η υδρόλυση του Ac-PAL-AMC επιλεκτικά μεσολάβηση β1i χρησιμοποιώντας καθαρισμένα παρασκευάσματα immunoproteasome και συστατική πρωτεασώματος. Πράγματι, Ac-PAL-AMC υδρολύεται εύκολα από τον immunoproteasome, αλλά όχι από το συστατική πρωτεασώματος (Σχήμα 2Β). Η προεπεξεργασία με UK101, έναν αναστολέα β1i-εκλεκτικός πρωτεασώματος [21], παρεμπόδισε πλήρως υδρόλυση Ac-PAL-AMC, περαιτέρω επικύρωση Ac-PAL-AMC ως ανιχνευτή β1i-selecitve (Σχήμα 2Β). Ομοίως, περίπου το 90% της υδρόλυσης του Ac-PAL-AMC ανεστάλη σε Panc-1 κυτταρικά εκχυλίσματα από UK-101 προ-επεξεργασίας (Σχήμα 2C). Σε αντίθεση, η υδρόλυση του Suc-LLVY-AMC μόνο μερικώς μπλοκαριστεί από UK101 προεπεξεργασία Panc-1 εκχυλίσματα, υποδηλώνοντας ότι Suc-LLVY-AMC υδρολύεται από υπομονάδες πρωτεασώματος πλην β1i (δηλαδή β5 ή β5i) (Σχήμα 2C).

(α) χημική δομή του Ac-PAL-AMC. (Β) υδρόλυση Ac-PAL-AMC συναρτήσει του χρόνου με καθαρισμένο συστατική πρωτεασώματος (cross), καθαρισμένο immunoproteasome (κλειστός κύκλος), ή καθαρισμένη immunoproteasome προ-θεραπεία με UK101 (ανοιχτό τετράγωνο). Μια γραμμική αύξηση παρατηρήθηκε μόνο σε φρεάτια immunoproteasome περιέχουν. (Γ) Ο ρυθμός υδρόλυσης του Ac-PAL-AMC ή Suc-LLVY-AMC με την παρουσία του εκχυλίσματος Panc-1 κυττάρων (10 μg). Η υδρόλυση του Ac-PAL-AMC ήταν σχεδόν πλήρως ανασταλεί από UK101 προεπεξεργασίας (10 μΜ). Υδρόλυση του Suc-LLVY-AMC ανεστάλη εν μέρει από το Ηνωμένο Βασίλειο-101 προ-επεξεργασίας. Epoxomicin (EPX, 10 μΜ), ένα ευρέως δράσης αναστολέας πρωτεασώματος, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας.

Η

Μετά την επικύρωση του Ac-PAL-AMC ως β1i επιλεκτικό ανιχνευτή, μπορούμε στη συνέχεια αξιολογούνται η δραστηριότητα β1i σε ένα πάνελ ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Αυτές οι κυτταρικές σειρές σαρώθηκαν για τους

PSMB9

γονότυπους στο κωδικόνιο 60 (n = 6 για εκείνους που HH ή HR γονότυπο? N = 11 για εκείνους που RR γονότυπος) και δεν έχουν επαληθευθεί να έχει οποιεσδήποτε πρόσθετες παραλλαγές στο

PSMB9

γονίδιο με άμεση αλληλούχιση (Πίνακας S1). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα καταλυτικές δραστηριότητες των β1i αξιολογείται από την ταχύτητα υδρόλυσης του Ac-PAL-AMC διαφέρουν σημαντικά μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών, ωστόσο οι διαφορές αυτές δεν φαίνεται να συνδέονται με την πολυμορφική κατάσταση κωδικόνιο 60 (Σχήμα 3).

(α) η καταλυτική δραστηριότητα του β1i μετράται με ταχύτητα υδρόλυσης του Ac-PAL-AMC σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές με Η /Υ ή R /H γονότυπο (κενό ράβδοι) και R /R γονότυπο (μαύρα ιστία). Μεταβλητή δραστηριότητα παρατηρήθηκε μεταξύ των κυτταρικών σειρών. (Β) Ποσοστό υδρόλυσης Ac-PAL-AMC σε κυτταρικές σειρές με Η /Υ ή R /H γονότυπο (ανοιχτοί κύκλοι) ή R /R γονότυπο (κλειστά τετράγωνα). Ρυθμός της υδρόλυσης δεν παρουσίασαν καμία στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των κυτταρικών σειρών Η- H + και.

Η

β1i Έκφραση σε ανθρώπινα καρκινικά Γραμμές κύτταρο που φέρει διαφορετικό κωδικόνιο 60 πολυμορφικές παραλλαγές

Ως επόμενο βήμα , εξετάσαμε αν οι β1i επίπεδα έκφρασης επηρεάζονται από το κωδικόνιο 60 πολυμορφική κατάσταση στα δοκιμάστηκαν καρκινικές κυτταρικές σειρές. Προκειμένου να ποσοτικοποιηθεί β1i επίπεδα πρωτεΐνης, η οποία εμφανίζει σημαντική μεταβλητότητα μεταξύ διαφορετικών κυτταρικών γραμμών, χρησιμοποιήσαμε εκχυλίσματα αραιώνονται σειριακά Η23 κυττάρου ως πρότυπα βαθμονόμησης (Σχήμα 4). Μια σύγκριση των κυτταρικών σειρών με τον H-αλληλόμορφο προς αυτούς που δεν έχουν την H-αλληλόμορφο δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην έκφραση β1i (Σχήμα 5Α). Αντ ‘αυτού, βρήκαμε μια πολύ σημαντική συσχέτιση μεταξύ της καταλυτικής β1i δραστηριότητα και το επίπεδο έκφρασης του (Εικόνα 5Β, r

2 = 0,86, p & lt? 0,0001, οι μεμονωμένες τιμές περιλαμβάνονται στον πίνακα S1). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης β1i πιθανό λογαριασμού για την πλειονότητα των μεταβλητότητα που παρατηρείται στην β1i δραστηριότητα σε διάφορες κυτταρικές σειρές.

Μια ισοδύναμη ποσότητα (10 μα) από κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με ένα αντίσωμα να β1i μαζί με σειριακά αραιωμένο H23 εκχυλίσματα κυττάρων (πρότυπα βαθμονόμησης). Η πυκνομετρική ανάλυση των εντάσεων ζώνης διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί ποσοτικά σχετικά επίπεδα έκφρασης β1i. Οι κυτταρικές γραμμές έκφρασης υψηλών επιπέδων β1i φαίνεται στο (Α) και κυτταρικές γραμμές με χαμηλή έκφραση του β1i φαίνονται στο (Β).

Η

(α) β1i έκφραση σε κυτταρικές σειρές με Η /Υ ή R /H (ανοιχτός κύκλος) και R /R γονότυπους (κλειστό τετράγωνο). β1i έκφραση δεν έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των κυτταρικών σειρών Η- H + και. (Β) Συσχέτιση του Ac-PAL-AMC υδρόλυση με β1i έκφραση σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Μια πολύ σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των β1i και την καταλυτική δράση του (Ρ

2 = 0,86, p & lt? 0.0001).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη μας , διερευνήθηκε η επίδραση του

PSMB9

κωδικόνιο 60 πολυμορφισμοί στο β1i υπομονάδα του immunoproteasome εκφράζεται σε πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας ένα πρόσφατα ανέφερε β1i καθετήρα δραστηριότητα, Ac-PAL-AMC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το κωδικόνιο 60 πολυμορφισμός δεν έχει σημαντικό αντίκτυπο στα επίπεδα έκφρασης ή καταλυτικές δραστηριότητες του β1i στον πίνακα των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών που δοκιμάστηκαν. Αυτά τα αποτελέσματα είναι διαφορετικό από τα προηγούμενα ευρήματα τα οποία έδειξαν ότι εγκεφαλικού ιστού από ηλικιωμένα άτομα που φέρουν το κωδικόνιο 60 H αλληλόμορφο είχαν μειωμένη δραστικότητα πρωτεασώματος σε σύγκριση με ιστό από εκείνους που δεν φέρουν το κωδικόνιο 60 H αλληλόμορφο [17]. Μια πιθανή αιτία για αυτές τις εμφανείς διαφορές μπορεί να σχετίζονται με τα διαφορετικά υποστρώματα χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση πρωτεολυτική δραστηριότητα. Το φθορισμογόνο υπόστρωμα Suc-LLVY-AMC που χρησιμοποιείται από Mishto et al. [17] συνήθως χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της συνολικής χυμοθρυψίνης ενεργότητα του πρωτεασώματος. Ωστόσο, δεδομένου ότι αυτό το υπόστρωμα μπορεί να υδρολυθεί τόσο από την immunoproteasome (β1i και β5i) και η συστατική πρωτεασώματος (β5) [25], τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη χρήση Suc-LLVY-AMC δεν μπορεί να πειράζουν την άμεση συμβολή του β1i γενετικού πολυμορφισμού. τρέχοντα αποτελέσματα μας ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την πρόσφατα αναφερθεί υπόστρωμα Ac-PAL-AMC που διασπάται επιλεκτικά από το β1i υπομονάδα (Εικόνα 2) [20]. Τα ευρήματά μας συνάδουν με την προηγούμενη έκθεση ότι η

PSMB9

κωδικόνιο 60 πολυμορφισμός δεν είχε καμία επίδραση στα προφίλ υποβάθμιση ενός πεπτιδίου 28-mer (Kloe 258) και μία ανασυνδυασμένη μορφή της IkBα, ένα βασικό ρυθμιστή της κλασικής NF -κB μονοπάτι και γνωστό υπόστρωμα του πρωτεασώματος [18]. Αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε εντελώς το ενδεχόμενο ότι ο αντίκτυπος του κωδικονίου 60 πολυμορφισμός μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με τους τύπους υποστρώματος και την ασθένεια, τα αποτελέσματα από την παρούσα μελέτη και άλλοι προτείνουν ότι το κωδικόνιο 60 πολυμορφισμός δεν θα μπορεί να συμβάλει στην μεταβλητότητα μεταξύ των ατόμων στην β1i καταλυτική επίπεδα δραστηριότητας.

με τα αξιόλογα κλινικά επιτυχίες της βορτεζομίμπης και carfilzomib στη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος και άλλες αιματολογικές κακοήθειες, η πρωτεασώματος αναγνωρίζεται πλέον ως ένα σημαντικό χημειοθεραπευτικά στόχο. Ωστόσο, ανεπιθύμητες τοξικότητες περιορίζουν την ευρεία χρήση των επί του παρόντος διαθέσιμων φαρμάκων πρωτεασώματος στόχευση. Για να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί, το immunoproteasome, μια εναλλακτική μορφή της συστατικής πρωτεασώματος, έχει διερευνηθεί ως εναλλακτική θεραπευτικό στόχο. Τέτοιες προσπάθειες έχουν αποδώσει υποσχόμενα immunoproteasome στόχευση ενώσεις με αντικαρκινική αποτελεσματικότητα και βελτιωμένα προφίλ τοξικότητας [7], [23], [26], [27]. Στην εξερεύνηση immunoproteasome-στόχευσης για τη θεραπεία του καρκίνου, είναι σημαντικό να εξεταστεί η έκφραση immunoproteasome σε διάφορα είδη καρκίνου. Ενώ η immunoproteasome είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω σε αιματολογικές κακοήθειες, η έκφραση του immunoproteasome σε στερεά του καρκίνου δεν έχει εξετασθεί διεξοδικά. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι η β1i υπομονάδα εκφράζεται συχνά σε κλινικά δείγματα ιστών από κόλον και του παγκρέατος, καθώς και μια ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών που προέρχονται από κόλον, πνεύμονα, του προστάτη και του μαστού ιστούς. Αν και έχουν παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί από την ομάδα μας και άλλοι [21], [23], [28], [29], η τρέχουσα μελέτη μας παρέχει πιο ισχυρή πληροφορίες σχετικά με την έκφραση του β1i στην πλειονότητα των κλινικών του παχέος εντέρου και του παγκρέατος καρκινικούς ιστούς δοκιμάζεται . Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των υπομονάδων immunoproteasome έχει επίσης αναφερθεί σε ορισμένους τύπους καρκίνου [30] – [34] και είναι πιθανό ότι η κατάσταση έκφρασης του immunoproteasome μπορεί να εξαρτάται από τους τύπους της νόσου και των παθογόνων μηχανισμών τους. Από την άλλη πλευρά, θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα αποτελέσματα μας στις συχνότητες του β1i πολυμορφισμών των καρκινικών κυτταρικών γραμμών που προέρχονται από διαφορετικά όργανα δεν είναι απαραίτητα ανακλαστικά εκείνων μεταξύ αυτών των τύπων καρκίνου. Αυτό οφείλεται εν μέρει λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος και του πειραματικού σχεδιασμού της τρέχουσας μελέτης μας. Ειδικότερα, πειραματικό σχεδιασμό μας που εμπλέκονται με τον αποκλεισμό των αρκετές κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν επιπλέον πολυμορφισμών στα γονίδια που κωδικοποιούν β1i ή /και άλλες υπομονάδες immunoproteasome όπως β5i με σκοπό την ελαχιστοποίηση πιθανών παραγόντων σύνθεσης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι πολυμορφισμοί κωδικόνιο 60 δεν είναι πιθανό να είναι υπεύθυνη για την παρατηρούμενη μεταβλητότητα στην β1i έκφραση /δραστικότητα μεταξύ των δοκιμαζόμενων κυτταρικών σειρών. Σε περαιτέρω επικύρωση ευρήματά μας, μπορεί να είναι σημαντικό να χρησιμοποιείται ένα μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος καρκινικές κυτταρικές γραμμές ή κλινικά δείγματα που προέρχονται από τα ίδια όργανα, ίσως η σύγκριση των δειγμάτων με συγκρίσιμα β1i επίπεδα έκφρασης. Επιπλέον, γενετικές μελέτες σύνδεσης εξετάζει την β1i πολυμορφισμού στο κωδικόνιο 60, στο πλαίσιο της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου είναι επίσης δικαιολογημένη.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η β1i υπομονάδα του immunoproteasome συχνά εκφράζεται στο παχύ έντερο και στο πάγκρεας καρκίνους και πιθανώς σε άλλους τύπους στερεών καρκίνων. Επιπλέον, ο γενετικός πολυμορφισμός στο κωδικόνιο 60 φαίνεται να έχουν καμία σημαντική επίδραση επί της έκφρασης και την καταλυτική δραστηριότητα των β1i σε καρκινικά κύτταρα. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά μπορούν να παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για την ανάπτυξη της immunoproteasome-στόχευση αντικαρκινικών παραγόντων. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα αποκλείουν κωδικόνιο 60 πολυμορφική κατάσταση ως μια πιθανή παράγοντας που συμβάλλει στην μεταβλητή ευαισθησία σε αναστολείς immunoproteasome στόχευση β1i.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0073732.s001

(DOCX)