Αφηρημένο

Bortezomib /PS-341 /Velcade, ένας αναστολέας πρωτεασώματος, χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος. Ενώ προτάθηκαν διάφοροι μηχανισμοί της κυτταροτοξικότητας του φαρμάκου, ο πραγματικός μηχανισμός παραμένει αόριστη. Έχουμε ως στόχο να εντοπίσει τα γονίδια που επηρεάζουν την κυτταροτοξικότητα της Bortezomib στη ζύμη σχάσης

S.pombe

όπως το φάρμακο αναστέλλει τον κύκλο κυτταρικής διαίρεσης αυτού του οργανισμού, όπως μεταλλάξεις πρωτεασώματος. Μεταξύ των 2815 γονίδια που εξετάζονται (που καλύπτουν το 56% της συνολικής ΑΠΑ), 19 γονίδια, των οποίων οι διαγραφές να προκαλέσει ισχυρό συνθετικό θνησιμότητα με Μπορτέζομιμπ, εντοπίστηκαν. Τα προϊόντα των 19 γονιδίων που περιλαμβάνονται τέσσερα ουβικιτίνης ένζυμα και έναν παράγοντα πυρηνικής πρωτεασώματος, και 13 από αυτούς είναι συντηρημένα σε ανθρώπους. Τα αποτελέσματά μας θα παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για την κατανόηση των δράσεων του Bortezomib μέσα στα κύτταρα

Παράθεση:. Takeda Κ, Mori Α, Yanagida Μ (2011) ταυτοποίηση των γονιδίων που επηρεάζουν την τοξικότητα της Anti-Cancer Drug Bortezomib από Genome-Wide screening στο

S. pombe

. PLoS ONE 6 (7): e22021. doi: 10.1371 /journal.pone.0022021

Επιμέλεια: Μιχαήλ Polymenis, Texas A & amp? Μ University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 του Μάρτη 2011? Αποδεκτές: 12 Ιουνίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 8 Ιουλίου, 2011

Copyright: © 2011 Takeda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. ΚΤ ήταν υποστηρίζεται οικονομικά από την ερευνητική επιχορήγηση της Astellas Ιδρύματος για την έρευνα στις μεταβολικές διαταραχές (https://www.astellas.com/jp/byoutai/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η οδός ουβικιτίνης /πρωτεασώματος είναι ένα σημαντικό πρωτεολυτικό μηχανήματα στα κύτταρα και έχει κεντρικό ρόλο στον κύκλο κυτταρικής διαίρεσης, απόπτωση, κλπ. [1] Ως εκ τούτου, αυτή η οδός θεωρείται ότι είναι ένα ισχυρό δυναμικό στόχος της κλινικής θεραπείας για ασθένειες όπως ο καρκίνος, και χημικές ουσίες που ρυθμίζουν την δραστηριότητα της οδού ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος έχουν εντατικά διερευνηθεί [2], [3]. Bortezomib /PS-341 /Velcade είναι ένα πεπτίδιο βορονικό οξύ που αναστέλλει την χυμοθρυψίνης ενεργότητα της βήτα υπομονάδας 5 του πρωτεασώματος

in vitro

. Bortezomib έχει ισχυρές πιθανές επιδράσεις κατά του όγκου σε

in vitro

και μελέτες σε ζώα και έχει αναπτυχθεί ως ένα φάρμακο κατά του καρκίνου για τη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος και άλλων μορφών καρκίνου [3], [4]. Αναστέλλοντας την πρωτεασώματος προκαλεί πλειοτροπικές επιδράσεις. Ως εκ τούτου, διάφοροι μηχανισμοί για την κυτταροτοξικότητα του Bortezomib έχουν προταθεί, όπως η αναστολή των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, σταθεροποίηση της ρ53, η διατάραξη της προόδου του κυτταρικού κύκλου, κλπ [5]. Για να αυξηθεί η γνώση των μηχανισμών των αντι-όγκου και αρνητικών επιπτώσεων της Bortezomib, θα είναι επωφελής για τον εντοπισμό γονιδίων που συμμετέχουν στην κυτταροτοξικότητα αυτού του φαρμάκου. Πρωτοπόρος προσπάθεια για τον εντοπισμό τέτοιων γονιδίων αναφέρθηκε από την ομάδα Lightcap το 2010 [6].

Η ζύμη σχάσης

Schizosaccharomyces pombe

είναι ένα απλό μονοκύτταρο ευκαρυωτικό οργανισμό και έχει χρησιμοποιηθεί ως πρότυπος οργανισμός των βασικών βιολογία κυττάρων, λόγω της γενετικής ευπείθεια της και η ομοιότητά του με ανώτερα ευκαρυωτικά. Μια βιβλιοθήκη του 2815 τα στελέχη του γονιδίου-διαγραφεί είναι διαθέσιμο για γονιδιώματος σε επίπεδο μελετών της ευαισθησίας των ναρκωτικών [7], [8], [9].

Εδώ, θα προσπαθήσει να εντοπίσει εξελικτικά συντηρημένα γονίδια που επηρεάζουν την κυτταροτοξικότητα της Μπορτέζομιμπ εκμεταλλευόμενοι βιβλιοθήκης γονιδίου-διαγραφή στο

S. pombe

και καθιέρωσε μια μέθοδο για την εκτέλεση του γονιδιώματος-ευρεία συνθετικό θανατηφόρα διαλογής με Μπορτέζομιμπ. Μεταξύ των 2815 γονίδια που εξετάζονται, στελέχη διαγραφή των 19 γονιδίων που είχαν ισχυρό συνθετικό θνησιμότητα με Μπορτέζομιμπ (όπως γονίδια στη συνέχεια χαρακτηρίζεται ως συνθετικό θανατηφόρο με Μπορτέζομιμπ? SLB). Από τα 19 γονίδια SLB, 13 διατηρούνται από ζύμη στον άνθρωπο και περιλαμβάνει παράγοντες που εμπλέκονται στην εξαρτώμενη από ουβικιτίνη /πρωτεασώματος πρωτεόλυση, χρωματίνη σίγηση, πυρηνική /κυτταροπλασματική μεταφορά, αμινοξέων και το μεταβολισμό της βιταμίνης, φυσαλιδώδη διακίνησης, μεταβολισμός RNA, κλπ

Αποτελέσματα

η μιτωτική σύλληψη και την αποτυχία στο χρωμόσωμα διαχωρισμού που προκαλείται από Bortezomib

Βρήκαμε ότι Bortezomib (LC Laboratories) αποτελεσματικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των

S. pombe

, ενώ MG132, ένα αυθεντικό αναστολέας πρωτεασώματος σε κύτταρα θηλαστικών δεν αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό (Σχήμα S1). Στη συνέχεια εξετάστηκε το επίπεδο της πολυ-ουμπικιτινομένων πρωτεϊνών παρουσία ή απουσία Bortezomib (Σχήμα S1). καλλιέργειες λογαριθμικής φάσης συλλέχθηκαν στις 0, 4, και 9 ώρες μετά την προσθήκη 1 mM Bortezomib και ολικές πρωτεΐνες εκχυλίσθηκαν για ανάλυση ανοσοστυπώματος. Με την παρουσία του Bortezomib, πολυ-ουμπικιτινομένων πρωτεΐνες συσσωρευτεί σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι Bortezomib αναστέλλει αποτελεσματικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την πρωτεολυτική δραστηριότητα του πρωτεασώματος σε

S. pombe

.

Τα ευαίσθητα στη θερμοκρασία μεταλλάξεις των συστατικών του πρωτεασώματος (

mts3-1

για Rpn12 του 19S ρυθμιστικών σωματιδίων και

mts2-1

για RPT2 του 19S ρυθμιστικών σωματιδίων ) συλλαμβάνονται σε φάση Μ οφείλεται στην αναστολή της υποβάθμισης της μιτωτικής ρυθμιστικές αρχές, όπως CDC13 (κυκλίνη) [10], [11]. Η διαπίστωση αυτή μας οδήγησε να εξετάσει λεπτομερώς πώς Bortezomib επηρεάζει τον κυτταρικό κύκλο. Μετά την προσθήκη Bortezomib καλλιεργειών σε μέσα λογαριθμικής φάσης, οι συγκεντρώσεις των κυττάρων και η βιωσιμότητα μετρήθηκαν συναρτήσει του χρόνου (Σχήμα 1Α). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων τελικά σταμάτησε και η βιωσιμότητα μειώθηκε σε 21, 10, και 4,7% στις 4, 6, και 9 ώρες μετά την προσθήκη Μπορτέζομιμπ. Χωρίς Bortezomib, τα κύτταρα συνέχισαν τη διαίρεση και διαρκή βιωσιμότητα. Να εξετάσει πώς η κυτταρικού κύκλου επηρεάστηκε από Bortezomib, χρωματίνης DNA, μικροσωληνίσκους, και σωμάτων πόλων ατράκτου (SPB: ομόλογη προς κεντροσωμάτων) έγιναν ορατά με πράσινο ή κόκκινο φθορίζουσα πρωτεΐνη tagging για να ιστόνης Η2Α (για χρωματίνης), α-τουμπουλίνης (μικροσωληνίσκων) και πρωτεΐνες Sid4 (SPB, το ισοδύναμο μαγιά κεντροσωμάτων, εμφανίζεται ως κουκίδα στο σχήμα 1Γ), αντίστοιχα. Η αναλογία των κυττάρων με υπερ-συμπυκνωμένο χρωμοσώματα και άτρακτοι μετάφασης ήταν υψηλότερο (30%) σε 1 ώρα μετά την προσθήκη Bortezomib και στη συνέχεια μειώθηκαν (Σχήμα 1Β και 1C-α). Καθώς ο λόγος των μετάφασης κυττάρων μειώθηκε, η αναλογία των κυττάρων με ένα εκτοπισμένων πυρήνα αύξηση (σχήμα 1C-b), στην οποία δεν διαχωρίστηκαν αδελφές χρωματίδες και ο πυρήνας εκτοπίστηκε από το κέντρο. Καθώς η αναλογία του «εκτοπισμένων πυρήνων» ήταν υψηλότερη στις 4 ώρες και, στη συνέχεια μειώθηκαν, απύρηνο κύτταρα και κύτταρα με μια γιγαντιαία πυρήνα αύξηση (σχήμα 1 Β και C-C). Αυτό ήταν πιθανόν το αποτέλεσμα της ολοκλήρωσης κυτοκίνησης σε κύτταρα με ένα μετατοπισμένο πυρήνα. Έτσι, με την παρουσία του Bortezomib, τα κύτταρα σύντομα συνελήφθησαν στη μετάφαση, δεν μπορεί να διαχωρίσει την αδελφή-χρωματίδες, και η βιωσιμότητα χάθηκε. Αυτοί οι φαινότυποι που προκαλείται από Bortezomib είναι σχεδόν ταυτόσημες με μιτωτικά ελαττώματα που προκαλούνται από

mts2-1

, η θερμοκρασία-ευαίσθητο μετάλλαξη σε RPT2 υπομονάδα των σωματιδίων 19S [10]. Στην περίπτωση του

mts3-1

μετάλλαξη (Rpn12 του 19S), φαινότυπος μετάφαση σύλληψης είναι σοβαρώτερους? 75% των κυττάρων που έχουν συλληφθεί σύντομα σε μετάφαση [11]. Και στις δύο περιπτώσεις, μετάφαση σύλληψης είναι διαχρονικά και ο πυρήνας μετατοπίζεται στη συνέχεια, όπως φαίνεται στην περίπτωση της θεραπείας Μπορτέζομιμπ. Δεδομένου ότι το ελάττωμα κατά τη μετάβαση /ανάφαση μετάφαση οφείλεται στην αναστολή της πρωτεολύσεως, ουβικιτινιωμένες υποστρώματα του πρωτεασώματος όπως CDC13 (κυκλίνη) θα πρέπει να συσσωρεύονται [12]. Για να εξεταστεί αυτό, κύτταρα που εκτοπικά εκφραζόμενη εξα-ιστιδίνης (His6) ταμπέλα σήμα ουβικιτίνης παρασκευάστηκαν και καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία Bortezomib για 4 ώρες στους 26 ° C. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια εκχυλίζεται από τις δύο καλλιέργειες υπό μετουσιωτικές συνθήκες με 6Μ γουανιδίνη-ΗΟΙ και τα προκύπτοντα εκχυλίσματα εφαρμόζονται σε σφαιρίδια TALON (Clontech), τα οποία απορροφούν την ετικέτα His6, για τον καθαρισμό των ουβικουιτινωμένης-πρωτεΐνες. TALON-καθαρισμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα έναντι CDC13 (Εικόνα 1D). Με την παρουσία του Bortezomib, multi-ουβικιτινιωμένες CDC13 παρατηρήθηκε, όπως αναφέρεται στο ευαίσθητα στη θερμοκρασία μεταλλάγματα του πρωτεασώματος [12]. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι ένα χημικό αναστολέα για την πρωτεασώματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αντικαταστήσει το ts πρωτεασώματος μεταλλάκτες. Αυτό το φάρμακο μπορεί να είναι χρήσιμο για την ανάλυση των φαινοτύπων του πρωτεασώματος-ελάττωμα σε χαμηλή θερμοκρασία, για παράδειγμα, σε μειωτικής ή στα πειράματα στα οποία θα πρέπει να αποφεύγονται αντιδράσεις θερμικού σοκ. Ως εκ τούτου, υιοθετήσαμε Bortezomib για περαιτέρω γενετικού ελέγχου για τον εντοπισμό των γονιδίων που επηρεάζουν το φαινότυπο δυσλειτουργία του πρωτεασώματος.

(Α) Bortezomib (1 mM) ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Οι συγκεντρώσεις των κυττάρων και βιωσιμότητες παρουσιάζονται. ΒΖ: Bortezomib (Β) Bortezomib (1 mM) ανέστειλε την κανονική εξέλιξη της φάσης Μ. Το γράφημα δείχνει την αναλογία των κυττάρων με ατράκτους μετάφασης και υπερ-συμπυκνωμένη χρωμοσωμάτων (μπλε, τα κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 1α-

α

), κύτταρα με ένα εκτοπισμένων πυρήνα (κόκκινο, Σχήμα 1α-

b

), κύτταρα χωρίς πυρήνα και με ένα γιγαντιαίο πυρήνα (πορτοκαλί, Σχήμα 1α-

γ

), και τα κύτταρα με χρωμόσωμα σχίζεται από το διάφραγμα (πράσινο, Σχήμα 1α-

d

, και

e

). (Γ) Χρωμοσώματα, μικροσωληνίσκους, και SPB παρατηρήθηκαν με την παρουσία Μπορτέζομιμπ. Τα κύτταρα δείχνουν ανωμαλίες μιτωτική ανταποκριτής να Σχήμα 2Β δείχνεται στο Α-Ε (άνω πάνελ: + ΒΖ). Οι εικόνες της κανονικής εξέλιξης της κυτταρικής διαίρεσης φαίνεται στο κάτω πάνελ (-BZ). Bar = 10 μm (D) Πολυ-ουβικουιτινωμένης κυκλίνης /CDC13 συσσωρευτεί υπό την παρουσία Μπορτέζομιμπ. Δείτε κείμενο για λεπτομέρειες.

Η

μεταλλάξεις πρωτεασώματος που σχετίζονται με υπερευαισθησία στα Bortezomib

Πριν από τη διεξοδική εξέταση, εξετάσαμε πώς η Bortezomib κυτταροτοξικότητα επηρεάζεται από μεταλλάξεις που σχετίζονται με την ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος σύστημα. Σε σύγκριση με τον άγριο τύπο ήταν πέντε μεταλλάξεις που σχετίζονται με πρωτεασώματος ως εξής:

mts2-1

,

mts3-1

,

pts1-727

(μεταλλαχθεί σε beta 5 υπομονάδα οι 20S συγκρότημα [13]),

ump1-620

(μεταλλαγμένο στον παράγοντα 20S ωρίμανσης Ump1 [13]), και

Δcut8

(γονίδιο-διαγραφή μεταλλαγμένο του

cut8

+

απαιτείται για τη σωστή πυρηνικό εντοπισμό του πρωτεασώματος [14], [15]). Κάθε στέλεχος επωάστηκε σε ένα πλούσιο πιάτο άγαρ YES για να σχηματίσουν μια αποικία και στη συνέχεια εντοπίστηκε σε τρυβλία με άγαρ που περιέχει 0, 100, 250, ή 500 μΜ Bortezomib, επικουρούμενη από ένα σύστημα ρομπότ (ρότορα, Singer, UK). Μετά από 3 ημέρες επώασης στους 26 ° C, η ικανότητα σχηματισμού αποικιών από κάθε κηλίδα εκτιμήθηκε (Σχήμα 2Α και Β). Η άγριου τύπου σχηματίζονται αποικίες σε όλα τα πιάτα, ενώ μεταλλάξεις πρωτεασώματος που σχετίζονται ήταν ελαττωματικά στην αποικία-σχηματισμό σε πλάκες Bortezomib (

Δcut8

στα 100 μΜ και άλλους σε 500 μΜ). Η σαφής υπερευαισθησία του

Δcut8

να Bortezomib μας οδήγησαν να υιοθετήσει την παραπάνω περιγραφείσα μέθοδο για περαιτέρω γονιδίωμα-ευρεία προβολή των συνθετικών θανατηφόρων μεταλλάξεων με Μπορτέζομιμπ.

(Α) Στρατηγική για συνθετικά θανατηφόρο διαλογής ( Β) Μεταλλάξεις των συστατικών του μονοπατιού ουβικουϊτίνης /πρωτεασώματος είναι υπερευαίσθητοι σε Μπορτέζομιμπ. Οκτώ αποικίες από κάθε στέλεχος αντίγραφο-επιστρώθηκαν επί πλακών άγαρ με διάφορες συγκεντρώσεις Bortezomib και επωάστηκαν για 3 ημέρες στους 26 ° C. (C) Περίληψη των συνθετικών θανατηφόρων διαλογής με Μπορτέζομιμπ. Δείτε κείμενο για λεπτομέρειες. (D) Επικύρωση των απομονωμένων μεταλλάξεις που είχαν ελαττώματα της ανάπτυξης σε 100 μΜ Bortezomib από τον εντοπισμό 5-φορές διαδοχικές αραιώσεις του αγενούς αναπτυσσόμενα κύτταρα.

Η

Γονιδίωμα-ευρύ συνθετικό θανατηφόρο διαλογής με Μπορτέζομιμπ

Για την αναγνώριση των γονιδίων που επηρεάζουν την κυτταροτοξικότητα της Bortezomib στο

S. pombe

, θα προβληθεί 2815 μεταλλάξεις του γονιδίου-διαγραφής για τα συνθετικά αναστολής της ανάπτυξης σε πλάκες άγαρ ΝΑΙ με Μπορτέζομιμπ χρησιμοποιώντας τη βοήθεια ρομπότ ρεπλίκα επιμετάλλωση. Από την πρωτογενή εξέταση, 59, 62, και 135 στελέχη απομονώθηκαν που είχαν ελαττώματα ανάπτυξη σε μέσα με 100, 250, και 500 μΜ Bortezomib, αντίστοιχα. Δεν υπήρχε σαφής Bortezomib ανθεκτικά μεταλλαγμένα που αναπτύχθηκε ταχύτερα από ό, τι το στέλεχος άγριου τύπου σε 500 μέσο μΜ Μπορτέζομιμπ. Μια περίληψη της διαλογής δείχνεται στο Σχήμα 2C (παραδείγματα των πρώτων αποτελεσμάτων του πρωτογενούς διαλογής και τον κατάλογο των γονιδίων φαίνεται στο Σχήμα S2 και Πίνακας S1). Τα 59 στελέχη που είχαν ελαττώματα ανάπτυξης με 100 μΜ Μπορτέζομιμπ επανεξετάστηκαν με κηλίδωση 5-φορές σειριακές αραιώσεις των καλλιεργειών λογαριθμικής φάσης του κάθε στελέχους (από 10 κύτταρα για να 6250 κύτταρα) σε πλάκες ΝΑΙ με και χωρίς Μπορτέζομιμπ (Σχήμα 2D). Πραγματοποιήσαμε αυτές τις retests εις διπλούν. Ως αποτέλεσμα, 19 μεταλλάξεις του γονιδίου-διαγραφή αναπαραγώγιμα έδειξε ελαττώματα ανάπτυξη σε πλάκες ΝΑΙ με 100 μΜ Μπορτέζομιμπ. Δεκαεπτά και 12 στελέχη έδειξαν ελαττώματα ανάπτυξη με 250 και 500 μΜ Bortezomib, αντίστοιχα. Το υπόλοιπο των μεταλλάξεων δεν έδειξαν σαφή ελαττώματα ανάπτυξης με Μπορτέζομιμπ στη δοκιμασία κηλίδωσης. Καμία από τις μεταλλάξεις που δοκιμάζονται σε χαμηλότερες δόσεις (1 nM-10 μΜ) του Bortezomib έδειξε σημαντικά ελαττώματα ανάπτυξης (Σχήμα S3). Ως εκ τούτου, υιοθετήσαμε μια συγκέντρωση 100 μΜ Bortezomib για τον έλεγχο υπερευαισθησία του

S.pombe

μεταλλάξεις στην παρούσα μελέτη μας, αν και στην προηγούμενη και παρόμοια μελέτη σε ανθρώπινα κύτταρα, μια συγκέντρωση 4-7-nM της βορτεζομίμπης ήταν χρησιμοποιείται για τον έλεγχο [6]

Τα 19 γονίδια που παρουσίασαν σαφή ελαττώματα της ανάπτυξης σε 100 μΜ πλάκες Bortezomib στη δοκιμή κηλίδες κατηγοριοποιήθηκαν ανάλογα με τη λειτουργία:. πέντε ανήκαν σε ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος, τέσσερις στις πυρηνικές πρωτεΐνες /χρωματίνης και την πυρηνική μεταφορά, τρεις έως φυσαλιδώδους κυκλοφορία, τρία έως το αμινοξύ και το μεταβολισμό των βιταμινών, τρεις με τον μεταβολισμό του RNA, και την πρωτεϊνική κινάση Α (Πίνακας 1). Ο Πίνακας 1 παραθέτει τα συστηματικά ονόματα, πρωτοβάθμια ονόματα (εάν υπάρχει), εκκολαπτόμενους μαγιά

Saccharomyces cerevisiae

και τα ανθρώπινα ορθόλογα, και μια σύντομη περιγραφή του κάθε γονιδίου SLB. Μεταξύ των 19 γονιδίων SLB, τα 13 γονίδια που φέρεται να έχει δυναμικό ορθόλογα στον άνθρωπο.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι Bortezomib, ένας αναστολέας του πρωτεασώματος χρησιμοποιούνται ευρέως ως ένα αντικαρκινικό φάρμακο, αναστέλλει αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των

S.pombe

και επάγει μιτωτική σύλληψη, καθώς και ευαίσθητα στη θερμοκρασία μεταλλάξεις των υπομονάδων του πρωτεασώματος. Δεκαεννέα γονίδιο μεταλλάξεις διαγραφής εντοπίστηκαν από τον έλεγχο του γονιδιώματος-ευρεία ώστε να είναι συνθετικό θανατηφόρα με Μπορτέζομιμπ.

Παρά την ισχυρή επίδραση του Bortezomib να συλλάβει τον κυτταρικό κύκλο, με άλλο αναστολέα πρωτεασώματος, MG132, είχαν ασθενέστερη ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό στην η παρούσα μελέτη. MG132 είναι, ωστόσο, αναφερθεί ότι αναστέλλει protesome εξαρτώμενη πρωτεόλυση στο κυτταρικό λύμα

S.pombe

, υποδεικνύοντας ότι η πρωτεασώματος του

S.pombe

είναι ευαίσθητο σε αυτού του αναστολέα [16]. Στις

S.cerevisiae

, MG132 χρησιμοποιείται για να αναστείλει πρωτεόλυση

in vivo

υπό το γονίδιο διαγραφή του PDR5, η κύρια αντλία εκροής φαρμάκου, που θα μπορούσαν να εκκρίνουν αποτελεσματικά MG132 από το κύτταρο [17].

S.pombe

διαθέτει δύο ορθόλογα PDR5, Pdr1 και Bfr1. Η διαφορά στα αποτελέσματα των Bortezomib και MG132 μπορεί να οφείλεται σε διαφορές τους στο κελί διαπερατότητας ή την αποτελεσματικότητα απέκκρισης από αντλίες εκροής φαρμάκου. Βορτεζομίμπη μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη της οδού ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος σε

S.pombe

.

Πραγματοποιήσαμε το συνθετικό θανατηφόρο οθόνης για τον εντοπισμό γονιδίων που επηρεάζουν την ευαισθησία για Bortezomib, χρησιμοποιώντας το 2815 γονίδιο-μεταλλάγματα εξάλειψης του

S. pombe

. Δεκαεννέα μεταλλάξεις διαγραφής αναγνωρίστηκαν με σοβαρές γενετικές ανάπτυξη που προκαλείται από 100 μΜ Bortezomib (που παρατίθενται στον Πίνακα 1 και Σχήμα 3). Πέντε από τις αρμόδιες γονίδια (που ορίζεται SLB) ήταν ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος που σχετίζονται με: pof3, cul3, mug30, ubp16 και cut8. συνθετικό θνησιμότητα τους με Μπορτέζομιμπ μπορεί να εξηγηθεί μέσω της ανασταλτικής δράσης του φαρμάκου κατά του πρωτεασώματος. Για παράδειγμα, ubiquitin λιγάσες παρέχουν τα υποστρώματα για πρωτεασώματος, έτσι ώστε και οι δύο μείωση θα μπορούσε να προκαλέσει σοβαρές συνθετικό επιδράσεις. Άλλοι δεν έχουν αναφερθεί ότι σχετίζεται με πρωτεασώματος λειτουργία. Ωστόσο, ορισμένα από τα γονίδια SLB μπορούσε ακόμα να εξηγηθεί μέσω των λειτουργιών του πρωτεασώματος. Για τρία γονίδια SLB φυσαλιδώδη διακίνησης (sec28, ftp105, και ryh1), ελαττώματα στο εκκριτικό μονοπάτι επικαλούνται ER (ενδοπλασματικό δίκτυο) το άγχος που μπορεί να ενισχύσει την απαίτηση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος [18]. Ένα από φυσαλιδώδη εμπορίας γονιδίων SLB, ftp105, κωδικοποιεί εντόπιση της πρωτεΐνης Golgi που αναφέρθηκε να αλληλεπιδρούν με deubiquitinase Usp5 και να απαιτείται για τον εντοπισμό Golgi της Usp5 [19]. Το ανθρώπινο ορθόλογο του Ftp105 είναι C17orf28 /DMC1 (κάτω-ρυθμίζονται σε πολλαπλές καρκίνους), ένας δυνητικός καταστολέας όγκων [20]. Ως εκ τούτου, η συνθετική θνησιμότητα των ftp105 διαγραφή με Μπορτέζομιμπ θα μελετηθεί περαιτέρω στο μέλλον. Ryh1 αναφέρθηκε πρόσφατα για τη ρύθμιση TORC 2 (στόχος της ραπαμυκίνης συγκρότημα 2) σε

S.pombe

[21]. Όσον αφορά πυρηνικές πρωτεΐνες SLB, μπορεί να απαιτείται περισσότερο πρωτεασώματος όταν η δυναμική της χρωματίνης είναι σε κίνδυνο σε μεταλλάξεις διαγραφής της χρωματίνης ρυθμιστών, όπως η πυρηνική πρωτεασώματος είναι γνωστό ότι συμβάλλουν στη κανονισμούς χρωματίνη σαν επιδιόρθωση της βλάβης του DNA, η αντιγραφή του DNA, και η μεταγραφή [15], [22 ], [23], [24]. Ένα από τα προϊόντα του γονιδίου της πυρηνικής SLB είναι το ΡΙΚ1, ένα συστατικό του CLRK συγκρότημα ουβικιτίνης λιγάση που απαιτούνται για χρωματίνης αποσιώπηση [25], [26]. Αν και υποστρώματα CLRK ουβικιτίνης λιγάσης δεν είναι γνωστή, μπορεί να είναι ένα περίεργο πείραμα για να εξετάσει κατά πόσον Bortezomib επηρεάζει χρωματίνης DNA αποσιώπηση. ΡΚΑ έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται σε κανονισμούς μετάφαση /ανάφαση στην ζύμη σχάσης και σε συστήματα Xenopus-αυγό

in vitro

[12], [27], [28]. Ενώ ορισμένα από τα άλλα γονίδια SLB, όπως οι παράγοντες βιταμίνη μεταβολικές, είναι δύσκολο να εξηγηθεί, θα μπορούσαν να εμπλέκονται σε έναν από τους πολύ διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες του πρωτεασώματος. Bortezomib μπορεί ενδεχομένως να έχουν άλλους στόχους από την πρωτεασώματος εντός των κυττάρων του

S. pombe

. Έτσι αξιολόγηση των γονιδίων SLB φαινομενικά άσχετη με ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος μπορεί να αξίζει για την εξέταση των άλλων στόχων. Συνδυασμός γονιδιακής διαγραφής SLB και του πρωτεασώματος ευαίσθητα στη θερμοκρασία μεταλλάξεις θα είναι χρήσιμο να κρίνει εάν το συνθετικό θνησιμότητα οφείλεται στην αναστολή του πρωτεασώματος ή σε άλλες διαταραχές που προκαλούνται από Bortezomib. Εάν το συνθετικό θνησιμότητα οφείλεται στην αναστολή του πρωτεασώματος, το διπλό μετάλλαγμα του γονιδίου SLB και το πρωτεάσωμα αναμένεται να παρουσιάσει μια πολύ αυστηρότερη φαινότυπο από ό, τι ένα και μόνο του πρωτεασώματος μετάλλαγμα. Στην πραγματικότητα, μία μετάλλαξη του

cut8

, ένα γονίδιο SLB, παρουσιάζει συνθετικά θνησιμότητα σε μεταλλάξεις του πρωτεασώματος

mts2-1

και

mts3-1

[14]. Αν και θα πρέπει να έχουμε κατά νου ότι η βορτεζομίμπη έχει άλλο στόχο, τα παρόντα αποτελέσματα έχουν δυνητικά σημαντικές επιπτώσεις για τη βασική βιολογία πρωτεασώματος, ανοίγοντας δρόμους για την ανακάλυψη νέων και απροσδόκητων σχέσεων μεταξύ του πρωτεασώματος και άλλα κυτταρικά μονοπάτια. Μια παρόμοια γονιδίωμα-ευρεία οθόνη σε ανθρώπινα κύτταρα πρότεινε ότι οι μεταφράσεις πρωτεΐνη, ER /Golgi μονοπάτι, μονοπάτι DNA αποκατάστασης των ζημιών, και τη ρύθμιση της Myc και πολυαμίνες εμπλέκονται σε Bortezomib που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο [6]. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης πρόσφατα δείχνουν ότι τα γονίδια που εμπλέκονται σε μονοπάτια βιταμινών και αμινοξέων του μεταβολισμού, χρωματίνης αποσιώπηση, πυρηνική /κυτταρόπλασμα μετακινούνται, και το μονοπάτι cAMP που σχετίζονται με την πρωτεασώματος στη ζύμη σχάσης

S.pombe

. Ως εκ τούτου, πρέπει να καταβληθούν περαιτέρω προσπάθειες για την κατανόηση των μηχανισμών της συνθετικής θνησιμότητα αυτών των απροσδόκητη γονιδίου διαγραφές SLB με Μπορτέζομιμπ.

Οι Δεκατρείς συντηρημένα γονίδια SLB εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα.

Η

Εντοπίσαμε 13 συντηρημένα γονίδια SLB δυνητικά ενδιαφέρον για περαιτέρω μελέτες. Όπως αναφέρεται στα αποτελέσματα, 4-7 ηΜ Bortezomib χρησιμοποιήθηκε για τα γονίδια της οθόνης επηρεάζει την κυτταροτοξικότητα των Bortezomib σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, και 100 μΜ Bortezomib χρησιμοποιήθηκε για

S.pombe

μεταλλαγμένο διαλογής στην παρούσα μελέτη . Η διαφορά στην ευαισθησία Bortezomib μπορεί να αντανακλά τη διαφορά στη βιολογία αυτών των οργανισμών, όπως είναι η διαπερατότητα του φαρμάκου και την απέκκριση του φαρμάκου. Σε γενικές γραμμές, τα κύτταρα ζύμης είναι πιο ανθεκτικές σε διαταραχές με χημικούς αναστολείς. Ως εκ τούτου, τα ανθρώπινα ορθόλογα των συντηρημένων γονιδίων SLB θα πρέπει να εξεταστεί από τις μικρές παρεμβολές RNA για να δούμε αν νοκ ντάουν τους επηρεάζει την ικανότητα επιβίωσης των ανθρώπινων κυττάρων σε χαμηλότερες δόσεις της βορτεζομίμπης. Εάν παρουσιαστούν οι ίδιες συνθετικές επιπτώσεις στα ανθρώπινα κύτταρα, όπως τα γονίδια SLB έχουν δυναμικό για την καινοτομία των νέων θεραπειών ή διαγνώσεις. Για παράδειγμα, εάν αναπτύσσονται χημικοί αναστολείς για αυτά τα συντηρημένα προϊόντα SLB, τέτοιες χημικές ουσίες θα είναι υποψήφιοι χρησιμοποιείται για θεραπεία κοκτέιλ με Μπορτέζομιμπ. Από την άλλη πλευρά, οι ασθενείς με γενετικά ασθενές φόντο οφείλεται σε αυτά τα ορθόλογα SLB θα μπορούσε να έχει σοβαρές αρνητικές συνέπειες κατά τη χορήγηση Μπορτέζομιμπ. Συνεπώς, χρειάζονται περαιτέρω έρευνες σχετικά με τα ορθόλογα SLB στο ανθρώπινο αναμένεται στο μέλλον.

Υλικά και Μέθοδοι

θεραπείες Στέλεχος, μέσο, ​​τον πολιτισμό, και τα ναρκωτικά

S. pombe

heterothallic απλοειδή 972

h

–

και 975

h

+

και χρησιμοποιήθηκαν τα παράγωγά τους. Συμπληρώστε την πλούσια YE, ΝΑΙ και ελάχιστα μέσα EMM2 χρησιμοποιήθηκαν [29]. διαλύματα παρακαταθήκης Bortezomib (LC Laboratories, Woburn, ΜΑ) παρασκευάστηκαν σε DMSO και φάρμακα προστέθηκαν στο υγρό καλλιέργειας ή μέσο άγαρ στην αναγραφόμενη συγκέντρωση.

Συνθετικά θανατηφόρο

διαλογής

Για γονιδιώματος-ευρεία διαλογής, υιοθετήσαμε τη βιβλιοθήκη διαγραφή του

S. pombe

απλοειδή αγοράζονται από Bioneer Corp. (Κορέα). Οι ελέγχου στελέχη άγριου τύπου είναι ED666 (

h

+ ade6-M210 ura4-D18 leu1-32

) και ED668 (

h

+ ade6-m216 ura4-D18 leu1-32

), οι οποίες επίσης αγοράστηκαν από Bioneer Corp. Το απλοειδές βιβλιοθήκη γονιδίων-διαγραφή παρασχέθηκε ως αποθέματα γλυκερόλης σε πλακίδια των 96 φρεατίων. Πρώτον, 5 μΙ από κάθε απόθεμα του στελέχους διαγραφής κηλιδώθηκε επί πλακών ΝΑΙ από μια πλάκα 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας το σύστημα αυτοματισμού εργαστήριο BioMek FX (Beckman Coulter, Brea, CA). Μετά από 3 ημέρες επώασης στους 26 ° C, μια αποικία από κάθε στέλεχος πάρθηκε-up και στίγματα σε ένα άλλο πιάτο ΝΑΙ (θεωρούνται τα μητρικά πλάκες) με τη χρήση του ρομπότ ρότορα (Τραγουδιστής Instruments, UK). Μια αποικία τετραπλασιάζεται για να ελέγξετε την επαναληψιμότητα. Από τα μητρικά πλάκες, εντόπισε αποικίες και πάλι πήρε-up και στίγματα πάνω σε πλάκες ΝΑΙ περιέχουν 0, 100, 250, και 500 μΜ Bortezomib, αντίστοιχα. Spotted πλάκες με διάφορες συγκεντρώσεις του φαρμάκου επωάστηκαν για 3 ημέρες στους 26 ° C και ο σχηματισμός αποικιών από κάθε στέλεχος εκτιμήθηκε. Για την επικύρωση του πρωτογενούς διαλογής, Bortezomib ευαισθησίες των επιλεγμένων στελεχών από την πρωτογενή διαλογή επανεξετάστηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδες δοκιμών.

Ανοσοστύπωμα και πρωτεΐνη καθαρισμό

Για ανάλυση ανοσοστυπώματος, οι ολικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το τριχλωροοξικό οξύ (TCA) μέθοδο. Ταυτόσημα ποσότητες πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE γέλης και στυπώθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Αντι-πολυ-ουβικιτίνη (FK-2? Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, MBL, Ιαπωνία), αντι-αλφα-τουμπουλίνης (TAT1? Μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, ένα δώρο από τον Dr. Gull) και αντι-CDC13 (κουνελιού πολυκλωνικό) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτεύοντα αντισώματα. Χρένου συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα και σύστημα χημειοφωταύγειας ECL (GE Healthcare) χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν έκφραση του σήματος. Για να καθαριστεί ουβικιτινιωμένες πρωτεΐνες, η προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδος εφαρμόστηκε με μικρή τροποποίηση [15].

φθορισμού μικροσκοπία

Όλες οι εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού ρύθμιση Axioplan 2 (Zeiss, Germany). Μέθοδοι κατασκευής του GFP ή RFP συγχωνευμένο γονίδιο που περιγράφηκε προηγουμένως [30].

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Bortezomib αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των

S.pombe

. (Α) Bortezomib και MG-132 προστέθηκαν σε καλλιέργεια λογαριθμικής φάσης του

S. pombe

στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό εξετάστηκε για 8 ώρες. Τα πτυσσόμενα αυξήσεις στις 8 ώρες μετά την προσθήκη του φαρμάκου παρουσιάζονται στον Υ-άξονα. (Β) Τα επίπεδα της πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες εξετάστηκαν με την παρουσία (+) ή απουσία (-) 1 mM Μπορτέζομιμπ. Πολυ-ουμπικιτινομένων πρωτεΐνες συσσωρεύονται σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο μετά την προσθήκη του Bortezomib

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022021.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Ένα παράδειγμα της πρωτογενούς διαλογής απεικονίζεται. Όπως περιγράφεται στο κείμενο, κάθε αποικία από κάθε στέλεχος γονιδίου-διαγραφή είχε εντοπιστεί σε κάθε θέση (Α1, Α2 …) πλακών άγαρ ΝΑΙ με 0, 100, 250, και 500 μΜ Μπορτέζομιμπ. Για τη διαλογή 2815 στελέχη, παρασκευάστηκαν 31 σύνολα από αυτές τις πλάκες. Μετά από επώαση στους 26 ° C για 3 ημέρες, σχηματισμός αποικιών εκτιμήθηκε. στελέχη άγριου-τύπου κηλιδώθηκαν σε θέσεις Η2 και Η3 (λευκή διακεκομμένη γραμμή). Στελέχη στίγματα πάνω σε Α3, Β8, Β10, και C10 επελέγησαν ως υποψήφιοι παρουσιάζουν σοβαρά ελαττώματα ανάπτυξης με 100 μΜ Μπορτέζομιμπ και επανεξετάστηκαν από σειριακή κηλίδες αραίωση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022021.s002

(ΔΕΘ )

Εικόνα S3.

Ευαισθησία σε χαμηλότερες δόσεις Μπορτέζομιμπ. ικανότητα Colony-σχηματισμό πέντε μεταλλάγματα SLB εξετάστηκε σε μέσο άγαρ YES που περιέχει 0, 1 ηΜ, 10 ηΜ, 100 ηΜ, 1 μΜ, 10 μΜ και 100 μΜ Bortezomib όπως περιγράφεται στο Σχήμα 2 (D). Κάτω από 10 μΜ Bortezomib, δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση ελάττωμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0022021.s003

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Κατάλογος των γονιδίων που εντοπίστηκαν για να δείξει ελάττωμα ανάπτυξη παρουσία των 100, 250 και 500 μΜ Bortezomib από τον έλεγχο.

doi: 10.1371 /journal.pone.0022021.s004

(XLS)

Ευχαριστίες

Είμαστε πολύ ευγνώμων προς τον Δρ Κόλιν Γκόρντον για τον εφοδιασμό του

S. pombe

στελέχη και ο Δρ Keith Γλάρος για την παροχή αντισώματα.