Αφηρημένο

Η ρεσβερατρόλη, μια φυσική πολυφαινολικών ένωση, έχει αναφερθεί ότι ασκούν αντικαρκινική δράση επηρεάζοντας διαφορετικές μοριακούς στόχους. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τις επιδράσεις και των υποκείμενων μηχανισμών της ρεσβερατρόλης για τον καρκίνο του στομάχου. Βρήκαμε ότι η ρεσβερατρόλη ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Στη συγκέντρωση των 25 και 50 μΜ, η ρεσβερατρόλη ανέστειλε την βιωσιμότητα των κυττάρων και μείωσε τη κλωνογονική δυναμικό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων. θεραπεία ρεσβερατρόλη συλληφθεί γαστρικά καρκινικά κύτταρα στο G1 φάση και οδήγησε σε γήρανση αντί της απόπτωσης. Ρυθμιστές των οδών γήρανση, συμπεριλαμβανομένης της κυκλίνης D1, κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση (CDK4 και 6), ρ21 και ρ16 του κυτταρικού κύκλου και, έγιναν δυσρυθμισμένη με κατεργασία ρεσβερατρόλη. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης στην γαστρικού καρκίνου ήταν επίσης επαληθευτεί

in vivo

χρησιμοποιώντας ένα γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντίκια. Η ρεσβερατρόλη (40 mg /kg /d) που ασκείται ανασταλτική δράση επί του γαστρικού καρκίνου και ανάπτυξη μειώθηκε σημαντικά τα κλάσματα του Κί67-θετικών κυττάρων στα δείγματα όγκου από τα γυμνά ποντίκια. Μετά την επεξεργασία ρεσβερατρόλη, η επαγωγή γήρανση και οι αλλαγές στην έκφραση των ρυθμιστικών εμπλέκονται στις οδούς κυτταρικού κύκλου και γήρανση ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε

in vitro

. Ωστόσο, η εξάντληση των Sirtuin (Sirt) 1 ανέστρεψε τα ανωτέρω περιγραφέντα αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης τόσο

in vitro

και

in vivo

. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ρεσβερατρόλη αναστέλλει γαστρικού καρκίνου σε SIRT1-εξαρτώμενο τρόπο και να παρέχουν λεπτομερή στοιχεία για τη δυνατότητα εφαρμογής της ρεσβερατρόλης στο γαστρικό πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Yang Q, Γουάνγκ Β, Zang W, Wang Χ , Liu Ζ, Λι W, et al. (2013) Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου με την πρόκληση G1 φάση Σύλληψη και Γήρανση σε SIRT1-εξαρτώμενο τρόπο. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10.1371 /journal.pone.0070627

Επιμέλεια: Dominique Heymann, Faculté de Ιατρικής de Nantes, Γαλλία

Ελήφθη: 20 του Μαρτίου του 2013? Αποδεκτές: 19 Ιουνίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 21, Νοεμ, 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81101869, 81100103, 81171536 και 81000868), το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (973 Προγράμματος, Νο 2012CB911202), και Ανεξάρτητη Ίδρυμα Καινοτομίας του Πανεπιστημίου Shandong (2012TS108) .Το χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στον κόσμο. Σύμφωνα με μια παγκόσμια εκτίμηση, συνολικά 989.600 νέες περιπτώσεις GC διαγνώστηκαν και τουλάχιστον 738.000 ασθενείς πέθαναν από την ασθένεια αυτή το 2008, αντιπροσωπεύοντας το 10% του συνόλου των θανάτων από καρκίνο [1]. Παρά το γεγονός ότι η συχνότητα εμφάνισης της GC έχει μειωθεί σε παγκόσμιο επίπεδο, παραμένει υψηλή στις αναπτυσσόμενες χώρες, ιδίως στην Κίνα [1], [2]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει τη στενή σχέση μεταξύ της χρόνιας γαστρίτιδας προκαλούνται από

Helicobacter pylori

μόλυνση και η ανάπτυξη της GC [3]. Επιπλέον, οι ξενιστές γενετικών, περιβαλλοντικών, διαιτητικών και άλλοι παράγοντες έχουν ενοχοποιηθεί στο γαστρικό ογκογόνο διαδικασία [1]. Καθώς εξακολουθεί να είναι δύσκολο να γίνει έγκαιρη διάγνωση για GC, οι περισσότεροι από τους ασθενείς που διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια. Παρά τη βελτίωση των συμβατικών θεραπειών για προηγμένη GC, συμπεριλαμβανομένης της χειρουργικής επέμβασης, χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία, το μήκος ή την ποιότητα ζωής των ασθενών με προχωρημένο GC είναι ακόμη ελλιπής [2], [4]. Ως εκ τούτου, η διερεύνηση νέων προληπτικών φαρμάκων ή θεραπευτικών στόχων του GC χρειάζεται επειγόντως.

Η κατανάλωση φρέσκων φρούτων και λαχανικών συμβάλλει στη μειωμένη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της GC [2], [5]. Κλινικές εφαρμογές δείχνουν επίσης ότι ορισμένα βιοδραστικά μόρια έχουν διαιτητικές την ικανότητα να αναστέλλουν πολλαπλούς ογκογόνους βήματα [5] – [7]. Η ρεσβερατρόλη (Res, 3,5,4′-τριυδροξυστιλβένιο) είναι ένα φυσικό πολυφαινολικών ένωση παρούσα σε σχεδόν 70 είδη φυτών, μεταξύ των οποίων το δέρμα των κόκκινων σταφυλιών, τα φιστίκια, τα μούρα και άλλοι [6] – [8]. Res αναφέρθηκε αρχικά να ασκήσει δραστηριότητες κατά του όγκου, το 1997 [8]. Αργότερα μελέτες έχουν δείξει ότι Res προσδίδει ανασταλτικά αποτελέσματα σε αρκετές μορφές καρκίνου, όπως ο καρκίνος του παχέος εντέρου, του καρκίνου του μαστού και του λεμφώματος, και επηρεάζει διαφορετικές μοριακών στόχων [9] – [11]. Sirtuin 1 (SIRT1), μια κατηγορία ΙΙΙ νουκλεοτιδίου νικοτιναμιδίου αδενίνης (NAD

+) – εξαρτάται ιστόνης /πρωτεΐνης δεακετυλάσης, έχει αναφερθεί ότι είναι ένα βασικό στόχο των ΑΠΕ σε διάφορα μοντέλα όγκων [9], [10]. Ωστόσο, ορισμένα στοιχεία δείχνουν αντίθετα αποτελέσματα που υποδηλώνει ότι Res εξασκεί χημειοπροστατευτικής επιδράσεις ανεξάρτητες από SIRT1 [11]. Οι ανασταλτικές επιδράσεις των ΑΠΕ με GC και του υποκείμενου μηχανισμού δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι Res ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC

in vitro

. θεραπεία Res επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση και οδήγησε σε κυτταρική γήρανση. Αυτές οι επιδράσεις των ΑΠΕ ήταν επανήλθε με εξάντληση της SIRT1. Οι ανασταλτικές SIRT1 που εξαρτώνται από δραστηριότητες των ΑΠΕ στα κύτταρα GC επίσης επαληθεύεται

in vivo

. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Res ασκεί SIRT1 εξαρτώμενη ανασταλτική δράση με GC και προτείνει ένα θεραπευτικό ρόλο για τις ΑΠΕ στο GC.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας της Shandong University School of Medicine (Νο 001 το 2011 για την έγκριση των ζώων Ηθική) και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

κυτταρικές σειρές, Πολιτισμού Προϋποθέσεις και Res Θεραπεία

κυτταρικές Ανθρωπίνων GC γραμμές AGS (που λαμβάνεται από το κινητό Resource Center, Shanghai Ινστιτούτο Βιοχημείας και κυτταρικής Βιολογίας στο κινεζική Ακαδημία Επιστημών), BGC-823 και SGC-7901 (που αγοράζονται από την Κίνα Κέντρο Type Culture Collection, Wuhan, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε F12 (AGS) ή RPMI 1640 (BGC-823 και SGC-7901) που περιέχει 10% FCS, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Υψηλής καθαρότητας Res αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA), διαλύθηκε σε DMSO και προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν 24 ώρες μετά την συμπλήρωση Res, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Μικρές Παρεμβολή RNA Επιμόλυνση

Χημικά τροποποιημένα μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) που στοχεύουν SIRT1 και ελέγχου siRNA αγοράστηκαν από GenePharma (Shanghai , Κίνα). Η αλληλουχία του SIRT1 siRNA ήταν 5′-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 ‘. Τα κύτταρα επωάστηκαν για όλη τη νύχτα και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ Res για 24 ώρες πριν από την περαιτέρω μελέτη.

Δοκιμασία Βιωσιμότητας Κυττάρων

Ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τον τίτλο Κυττάρων 96 ® υδατική Solution Δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega, Madison, WI, USA). Εν συντομία, 2 χ 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, 20 μΙ MTS (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυ-μεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο) προστέθηκε σε κάθε Λοιπόν. Μετά από επώαση για 3 ώρες στους 37 ° C, η απορρόφηση στα 490 nm καταγράφηκε σε ένα Varioskan Flash Multiplate Reader (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίσθηκε από τον ακόλουθο τύπο: σχετική βιωσιμότητα στοιχείων = (μέσος όρος απορρόφησης ομάδα που υπέστη αγωγή – μέση απορρόφηση του τυφλού) /(μέση απορρόφηση του ελέγχου ομάδα- μέσης απορρόφησης του τυφλού). Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων (300 ή 500 κύτταρα ανά φρεάτιο) και επωάστηκαν για 10 ημέρες έως ότου οι αποικίες ήταν αρκετά μεγάλη για να διακρίνεται σαφώς. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και ο αριθμός των αποικιών με περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκε με το χέρι. Πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, μονιμοποιήθηκαν με προψυχθέν αιθανόλης 70% στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια χρωματίζονται με ιωδιούχο προπίδιο (Beyotime , Jiangsu, Κίνα) που περιέχει RNase Α στους 37 ° C για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό Multicycle (Systems Flow Phoenix, San Diego, CA, USA). Τα πειράματα διεξήχθησαν ανεξάρτητα τρεις φορές.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της απόπτωσης πραγματοποιήθηκαν με την επισήμανση των ρηγμάτων της έλικας DNA χρησιμοποιώντας μια επιτόπια κυττάρων Death Detection Kit, TMR κόκκινο (Roche Applied Science, Basel, Switzerland). Κύτταρα ή τομές παραφίνης ξενομοσχευμάτων σημάνθηκαν με TUNEL σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τα κύτταρα, η θεραπεία με 0,2 mM H

2O

2 για 12 ώρες χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Για τομές παραφίνης, θετικούς μάρτυρες αγοράστηκαν από την Millipore (Billerica, ΜΑ, USA). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (Beyotime) και οι διαφάνειες ή τμήματα απεικονίστηκαν από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Tokyo, Japan) χρησιμοποιώντας το λογισμικό cellSens διάσταση. Τα πειράματα διεξήχθησαν ανεξάρτητα τρεις φορές.

β-Γαλακτοσιδάση Χρώση

Γήρανση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Γήρανση β-Γαλακτοσιδάσης Χρώση Kit (Beyotime). Εν συντομία, κύτταρα ή κατεψυγμένες τομές ξενομοσχευμάτων μονιμοποιήθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με φρεσκοπαρασκευασμένο β-γαλακτοσιδάσης (β-Gal) διάλυμα χρώσης στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Πειράματα εκτελέστηκαν ανεξάρτητα τρεις φορές.

Σταθερή λεντοϊών-μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) GC κύτταρα

Οι φορείς λεντοϊών που περιέχουν τον έλεγχο ή SIRT1 shRNA κατασκευάστηκαν από GenePharma και χρησιμοποιείται για την επιμόλυνση BGC-823 κύτταρα. Αποτελεσματική νοκ ντάουν της SIRT1 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western. Για σταθερή μεταγωγή, ελέγχου-lentivirus μολυσμένα ή SIRT1 shRNA-φακοϊό μολυσμένα BGC-823 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο που παρέχεται με 2 μg /ml πουρομυκίνη για τέσσερις εβδομάδες και θεωρείται ως LV-C και LV-S, αντίστοιχα.

nude ποντίκια μοντέλο ξενομοσχεύματος

Γυναίκα αθυμικοί BALB /c γυμνά ποντίκια (6~8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου (Πεκίνο, Κίνα) και διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου στο Κλειδί εργαστήριο Καρδιαγγειακής αναδιαμόρφωση και Λειτουργία Research, Qilu νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Shandong. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (8 ποντίκια για κάθε ομάδα): ομάδα Ι και II, BGC-823 κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα ανά ένεση σε 0.1 ml PBS) εγχύθηκαν υποδορίως στην περιοχή του πλευρού του γυμνά ποντίκια? ομάδα ΙΙΙ, LV-C (BGC-823 κύτταρα) εγχύθηκε? και η ομάδα IV, LV-S (BGC-823 κύτταρα) εγχύθηκε. Μετά την εμφύτευση, ο γυμνά ποντίκια από τις ομάδες II, III και IV υποβλήθηκαν σε αγωγή με Res (40 mg kg

-1 σε 0,1 ml φυτικού ελαίου, διοικείται από καθετηριασμό, μία φορά ημερησίως). Η υποδόρια μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο, και οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με τον τύπο (μήκος) χ (πλάτος

2) /2. Οι ποντικοί θυσιάσθηκαν τέσσερις εβδομάδες αργότερα. Οι όγκοι συλλέχθηκαν και επεξεργάστηκαν για μελέτες στυπώματος και ανοσοχημικές western.

Real Time-ποσοτική PCR (RT-QPCR)

Το ολικό RNA σε κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) και μετατρέπεται σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript ™ RT (Takara, Tokyo, Japan). RT-QPCR πραγματοποιήθηκε για τα γονίδια, συμπεριλαμβανομένων κυκλίνη D1, κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση 4 (CDK4), ρ21 και β-ακτίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών ενισχύσεως που παρατίθενται στον Πίνακα S1. Η έκφραση του mRNA της κυκλίνης D1, CDK4 και ρ21 κανονικοποιήθηκε σε β-ακτίνη σε σχέση με τον έλεγχο με τη χρήση του 2

-ΔΔCt μέθοδο. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε εις τριπλούν.

Western Blot

Η ολική πρωτεΐνη από τα κύτταρα ή τα δείγματα όγκων εκχυλίζεται με RIPA ρυθμιστικό λύσης (Beyotime) όπως περιγράφεται [12]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Η μεμβράνη ανιχνεύθηκε με αντισώματα έναντι SIRT1 (Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA), bcl-2, bax, κασπάσης-3, κυκλίνη D1, CDK4 και 6 (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ, USA), ρ16 και ρ21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Το δευτερεύον αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν μια υπεροξειδάση (HRP) αντι-κουνελιού ή αντίσωμα ποντικού. Οι πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ECL (Pierce). β-ακτίνης (Cell Signaling) χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης.

Ανοσοϊστοχημεία

Τα δείγματα όγκου από τα γυμνά ποντίκια αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και αντιγόνο ανακτηθεί. Οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι Κί67 (1:500, Abcam) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Συζευγμένο με HRP IgG αντι-κουνελιού και χρώση DAB χρησιμοποιήθηκαν για να απεικονίσει το αντίσωμα Κί67. Τα πλακίδια τελικά με αιματοξυλίνη. Οι πλάκες απεικονίστηκαν με ένα ελαφρύ μικροσκόπιο της Olympus (Τόκιο, Ιαπωνία) με τη χρήση του λογισμικού cellSens διάσταση. Οι Κί67-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν με το χέρι και το ποσοστό του Κί67-θετικών κυττάρων αξιολογήθηκαν ανά πεδία. Πέντε ξεχωριστά πεδία μετρήθηκαν για κάθε ενότητα.

Στατιστικές Αναλύσεις

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του στατιστικού πακέτου για τις Κοινωνικές Επιστήμες (SPSS, έκδοση 16.0, Chicago, IL, USA) με μονόδρομη ANOVA με post-hoc δοκιμασία του Tukey. P-τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Res Αναστέλλει τη βιωσιμότητα των κυττάρων GC σε SIRT1-εξαρτώμενο τρόπο

Τρεις κυτταρικές γραμμές GC (AGS, BGC-823 και SGC-7901) εξετάστηκαν στα πειράματά μας. Καλλιέργεια των κυττάρων σε όχημα (0,1% DMSO) δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Res επί 24 ώρες, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο ανέστειλε κατά 25, 50, 100 και 200 ​​μΜ Res (Σχήμα 1Α). Αξίζει να σημειωθεί, πολλαπλασιασμός AGS προφανώς αναστέλλεται όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με 10 μΜ Res, η οποία δεν παρατηρήθηκε στα άλλα δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α). Σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές, η παρουσία 100 μΜ Res ήταν αρκετή για να προκαλέσει περισσότερο από 50% αναστολή ανάπτυξης (56,78% για AGS, 54,87% για BGC-823 και 52,16% για SGC-7901, αντίστοιχα). Ως εκ τούτου, 25 και 50 μΜ Res χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερα πειράματα. Για να προσδιορίσετε το λειτουργικό ρόλο της SIRT1 στη θεραπεία Res, εμείς γκρέμισε έκφραση SIRT1 χρησιμοποιώντας ένα ειδικό siRNA. Η αποτελεσματική αναστολή της έκφρασης SIRT1 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western (Σχήμα 1Β). Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας MTS έδειξαν ότι σε SIRT1 εξαντλημένο κύτταρα, Res δεν ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 1C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Res είναι σε θέση να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC και ότι η ανασταλτική επίδραση μπορεί να διασωθεί από εξάντληση SIRT1.

(Α) κύτταρα GC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς Res στην ενδεικνυόμενη συγκέντρωση για 24 ώρες . Η βιωσιμότητα των κυττάρων στη συνέχεια μετρήθηκε με δοκιμασίες MTS. (Β) Η έκφραση της SIRT1 σε 72 ώρες μετά από τον έλεγχο ή ειδικές επιμόλυνση siRNA προσδιορίστηκε με κηλίδα western. «Ci» αντιπροσωπεύει τον έλεγχο siRNA, και «Si» αντιπροσωπεύει το SIRT1 siRNA. (C) Σαράντα οκτώ ώρες μετά την siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία GC με 50 μΜ Res για 24 ώρες. Στη συνέχεια έγιναν οι δοκιμασίες MTS. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD, * αντιπροσωπεύει P & lt? 0,05, ** αντιπροσωπεύει P & lt? 0,01 και *** αντιπροσωπεύει P & lt?. 0.001

Η

Res Μειώνει την Κλωνογόνος δυναμικό των κυττάρων GC σε Sirt1- εξαρτώμενο τρόπο

για τα κύτταρα του όγκου, σχηματισμό αποικίας έχει βρεθεί να είναι μια πιο ευαίσθητη παράμετρος από βιωσιμότητα να εκτιμηθεί η επίδραση ενός φαρμάκου. Έτσι, οι προσπάθειες στη συνέχεια για να προσδιοριστεί η επίδραση του Res στον κλωνογόνο δυναμικό των κυττάρων GC. Res, σε συγκέντρωση 25 μΜ, οδήγησε σε σημαντική μείωση των εστιών αριθμούς, καθώς και τα μεγέθη στα κύτταρα GC. Μετά τη θεραπεία με 50 μΜ Res, το κλωνογόνο δυναμικό μειωθεί περαιτέρω. Ωστόσο, knockdown του SIRT1 πριν από τη θεραπεία Res αύξησε τον αριθμό των εστιών σε ένα επίπεδο συγκρίσιμο με την ομάδα οχήματος (Σχήμα 2).

Η αποικία πειράματα σχηματισμός διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Οι αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις φαίνονται στο (Α). Η ποσοτική ανάλυση αποδεικνύεται ως ένα ιστόγραμμα στο (Β). «Ci» αντιπροσωπεύει τον έλεγχο siRNA, και «Si» αντιπροσωπεύει το SIRT1 siRNA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD, τα στατιστικά αποτελέσματα σημειώνονται με αστερίσκο και *** αντιπροσωπεύει P & lt?. 0.001

Η

Res Προκαλεί η συσσώρευση του GC κύτταρα στην G1 φάση σε ένα SIRT1-εξαρτώμενο τρόπο

για να εξεταστεί η ανασταλτική δράση των ΑΠΕ στα κύτταρα GC, πραγματοποιήσαμε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Παρατηρήσαμε ότι το 25 και 50 μΜ Res αύξησε το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 τόσο BGC-823 και SGC-7901 κύτταρα (Σχήματα 3Α και 3Β). Η επαγωγή της σύλληψης φάση G1 από Res ήταν επίσης δοσοεξαρτώμενη. Res σε μια συγκέντρωση 50 μΜ έδειξαν ισχυρότερη επίδραση από ό, τι στους 25 μΜ. Η αύξηση του αριθμού των κυττάρων στην G1 φάση συνοδεύεται από μια μείωση των κυτταρικών πληθυσμών κυρίως στις φάσεις S. Η εξάντληση των SIRT1 πριν από τη θεραπεία Res ελάττωσε την επαγωγή G1 φάση του Res (Σχήματα 3Α και 3Β). Για να επιβεβαιωθούν τα παραπάνω αποτελέσματα, εξετάσαμε την έκφραση των ρυθμιστικών του κυτταρικού κύκλου από τη φάση G1, συμπεριλαμβανομένης της κυκλίνης D1, CDK4, CDK6, p21 και p16 σε BGC-823 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, σε Res επεξεργασμένο BGC-823 κύτταρα, τα επίπεδα πρωτεΐνης των ενεργοποιητών του G1 /μετάβαση S (κυκλίνη D1, CDK4 και CDK6) μειώθηκε, ενώ τα επίπεδα της πρωτεΐνης των αναστολέων των CDK (CDKIs) (ρ21 και p16) αυξήθηκε. Αντίθετα, οι αλλαγές αυτές δεν βρέθηκαν σε SIRT1-εξαντλημένα κύτταρα BGC-823, όταν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 50 μΜ Res. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από την RT-QPCR της κυκλίνης D1, CDK4 και ρ21 (Σχήμα 3D).

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου των κυττάρων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις φαίνονται στο (Α). Η ποσοτική ανάλυση αποδεικνύεται ως ιστογράμματα στο (Β). (C) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου ανιχνεύθηκαν με western blot. Τα επίπεδα mRNA των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου (D) ανιχνεύθηκαν με RT-QPCR. «Con ‘αντιπροσωπεύει θεραπεία όχημα,’ R ‘αντιπροσωπεύει ρεσβερατρόλη,« Ci’ αντιπροσωπεύει τον έλεγχο siRNA, και «Si» αντιπροσωπεύει την SIRT1 siRNA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD, το * αντιπροσωπεύει Ρ & lt? 0,05 και *** αντιπροσωπεύει Ρ & lt?. 0.001

Η

Η έλλειψη κυττάρων υπο-G1 έδειξε ότι η θεραπεία Res δεν ενεργοποιούν την απόπτωση στα κύτταρα GC (Σχήμα 3Α), η οποία ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα των πειραμάτων σήμανσης TUNEL από BGC-823 κύτταρα (Σχήμα S1A). Τα επίπεδα πρωτεΐνης των μορίων που σχετίζονται με την απόπτωση, όπως Bcl-2, Βαχ και κασπάσης-3, από κάθε ομάδα ήταν συγκρίσιμες (Σχήμα S1B). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Res επάγει σύλληψη G1 φάση σε κύτταρα GC σε ένα SIRT1-εξαρτώμενο τρόπο και δεν επάγει την απόπτωση.

Res επάγει γήρανση των GC κυττάρων σε ένα SIRT1 τρόπο εξαρτώμενο

στα χέρια μας, Res οδηγεί σε διακοπή της ανάπτυξης και όχι αυξημένη απόπτωση. Ως εκ τούτου, έχουμε καταβληθούν περαιτέρω προσπάθειες για να διερευνήσει κατά πόσον Res θα μπορούσε να προκαλέσει γήρανση σε κύτταρα GC. β-Gal χρώση, ένας ειδικός δείκτης για γηρασμένα κύτταρα θηλαστικών, χρησιμοποιήθηκε. Μετά τη θεραπεία Res βρήκαμε αυξημένη κλάσματα κύτταρα χρωματίστηκαν με β-Gal. Ωστόσο, η προκατεργασία με SIRT1 siRNA μπλοκάρει Res προκαλούμενη κυτταρικής γήρανσης (Σχήμα 4). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από δύο BGC-823 και SGC-7901 κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι Res εξαρτώμενα επί SIRT1 να επάγει την κυτταρική γήρανση σε κύτταρα GC. Χρώσης

β-Gal διεξήχθη για την ανίχνευση γηρασμένα κύτταρα. Οι αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις φαίνονται στο (Α). Μεγέθυνση: × 200, bar για 100 μm. Η ποσοτική ανάλυση αποδεικνύεται ως ένα ιστόγραμμα στο (Β). «Ci» αντιπροσωπεύει τον έλεγχο siRNA και «Si» αντιπροσωπεύει το SIRT1 siRNA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD, τα στατιστικά αποτελέσματα υποδεικνύονται με αστερίσκους και *** αντιπροσωπεύει Ρ & lt?. 0.001

Η

Res αναστέλλει την ανάπτυξη όγκου ίη νίνο σε ένα SIRT1 τρόπο εξαρτώμενο

στη συνέχεια, πρόσθετες μελέτες διεξήχθησαν για να προσδιοριστούν οι επιδράσεις του Res επί BGC-823 ξενομοσχεύματα ανάπτυξης σε γυμνά ποντίκια. Για το

in vivo

μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν σταθερή μεταγωγή κύτταρα λεντοϊού-shRNA BGC-823. Από τις τέσσερις SIRT1 shRNA-φακοϊούς, LV-1 και LV-4 που ασκείται προφανείς επιπτώσεις σίγηση στο SIRT1 έκφρασης (Εικόνα S2). Μετά από τέσσερις εβδομάδες διαλογής, η έκφραση του SIRT1 διατηρήθηκε στα μειωμένα επίπεδα στα κύτταρα σταθερά λεντοϊού-shRNA BGC-823 (Εικόνα S2). Σταθερό LV-1 βραδέος-shRNA κύτταρα BGC-823 χρησιμοποιήθηκαν σε μετέπειτα μελέτες ξενομοσχεύματα λόγω των ισχυρότερες ανασταλτικές επιδράσεις επί της έκφρασης SIRT1 σε σύγκριση με το LV-4. Όλα τα ζώα επιβίωσαν έως το τέλος των πειραμάτων μας, και καμία εμφανής διαφορά βρέθηκε στο σωματικό βάρος τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τέσσερις εβδομάδες μετά την εμφύτευση, οι μετρήσεις των όγκων του όγκου έδειξε ότι η θεραπεία με Res μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του BGC-823 ξενομοσχεύματα (Res vs έλεγχος: 0,5728 ± 0,2276 cm

3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm

3, Ρ & lt? 0.001) . Σταθερό μεταγωγή του ελέγχου shRNA-lentivirus δεν επηρέασε σημαντικά τον όγκο του όγκου (Res vs Res + Ci: 0,5728 ± 0,2276 εκατοστά

3 vs 0,68 ± 0,0672 εκατοστά

3, P = 0,603). Ωστόσο, στις SIRT1 εξαντλημένο ξενομοσχευμάτων, οι ανασταλτικές επιδράσεις των ΑΠΕ στην ανάπτυξη του όγκου διασώθηκαν (Res + Si vs Res + Ci: 1,2313 ± 0,1777 εκατοστά

3 vs 0,68 ± 0,0672 εκατοστά

3, P & lt? 0.001, Res + Si vs ελέγχου: 1,2313 ± 0,1777 εκατοστά

3 vs 1,4288 ± 0,1741 εκατοστά

3, P = 0,123) (Εικόνα 5Α). Στα Res επεξεργασμένα ξενομοσχεύματα, ο δείκτης πολλαπλασιασμού, Ki67, μειώθηκε σημαντικά (Σχήμα 5Β) (% του Κί67-θετικών κυττάρων, Res vs έλεγχος: 3 ± 1,8 έναντι 44,67 ± 3,79, Ρ & lt? 0.001). Γήρανση παρατηρήθηκε σε ξενομοσχεύματα από Res ποντίκια με αγωγή που υποδεικνύεται από β-Gal χρώση (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, κανένας προφανής απόπτωση που προκαλείται από ΑΠΕ στα ξενομοσχεύματα (Σχήμα S1D) και δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στις ρυθμιστικές αρχές της απόπτωσης, όπως bcl-2, bax και κασπάσης-3 (Σχήμα S1c). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τις

in vitro

πειράματα. Επιπλέον, οι αλλαγές στην έκφραση των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, περιλαμβανομένων κυκλίνη D1, CDK4, CDK6, ρ21 και ρ16 ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε

in vitro

(Σχήμα 5C). Όλες οι αλλαγές που παρατηρήθηκαν σε Ki67, β-Gal και των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου αντιστράφηκαν από SIRT1 εξάντληση (Σχήματα 5Β και C) (% του Κί67-θετικών κυττάρων, Res + Si vs Res + Ci: 46,32 ± 6,03 vs 2,65 ± 1,53, Ρ & lt? 0.001, Res + Si vs έλεγχος: 46,32 ± 6,03 έναντι 44,67 ± 3,79, Ρ = 0,946)

(Α) Γυμνοί ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες και υπήρξαν 8 ποντίκια για κάθε ομάδα.. BGC-823 κύτταρα (1 χ 10

6) με διαφορετικές θεραπείες ενέθηκαν υποδορίως σε κάθε ομάδα. Μετά την εμφύτευση, το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με τον τύπο (μήκος) χ (πλάτος

2) /2. (Β) Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα στα δείγματα όγκου από τις διάφορες ομάδες ανιχνεύθηκαν με Κί67 ανοσοχημείας. Γήρανση υποδείχθηκε με χρώση β-Gal. Οι αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις. Μεγέθυνση: χ 400, bar για 20 μm. (Γ) Η συνολική πρωτεΐνη από τα δείγματα όγκων εκχυλίζεται, και η έκφραση των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου ανιχνεύθηκαν με western blot. «C» αντιπροσωπεύει ελέγχου, «R» αντιπροσωπεύει ρεσβερατρόλη, «Ci» αντιπροσωπεύει το σταθερό έλεγχο λεντοϊού-shRNA BGC-823 κύτταρα, και «Si» αντιπροσωπεύει τις σταθερές SIRT1 λεντοϊού-shRNA BGC-823 κύτταρα.

Η

Συζήτηση

Res, μια φυσική πολυφαινόλη, αυτή τη στιγμή αξιολογείται ως μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινικός παράγοντας. Αν και έχει αποδειχθεί να προσδίδει αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα έναντι διαφόρων τύπων καρκίνου τόσο σε κυτταρική καλλιέργεια και μοντέλα ξενομοσχεύματος [9] – [11], τα αποτελέσματά της στην χημειοπροφύλαξη GC και του υποκείμενου μηχανισμού δεν έχουν καλά μελετηθεί. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι Res ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC γραμμές (AGS, BGC-823 και SGC-7901). Παρατηρήθηκε η δραστικότητα αντι-αυξητικού αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μΜ Res για 24 ώρες, και η ανασταλτική δράση ήταν δοσοεξαρτώμενη. Σε συγκέντρωση 50 μΜ Res, οι αναλογίες αναστολής για αυτές τις τρεις κυτταρικές γραμμές ήταν 41%, 34% και 32%, αντίστοιχα. Όταν η συγκέντρωση του Res αυξήθηκε περαιτέρω, ενισχύθηκαν τα ανασταλτικά αποτελέσματα. Αμφότερες οι 100 και 200 ​​μΜ Res ανέστειλε την ανάπτυξη περισσότερο από 50% σε σύγκριση με την ομάδα οχήματος. Επιπλέον, η υψηλότερη δόση των ΑΠΕ είναι πολύ μεγάλη για να επιτευχθεί

in vivo

και, επομένως, δεν έχει κανένα νόημα σε ένα κλινικό περιβάλλον [13], [14]. Ως εκ τούτου, οι δύο χαμηλότερες αποτελεσματικές συγκεντρώσεις των 25 και 50 μΜ Res χρησιμοποιήθηκαν στις μεταγενέστερες μελέτες. Η δραστικότητα αναστολής ανάπτυξης του Res φαίνεται να είναι κυττάρου-ειδική, καθώς διαφέρει η IC50 ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και κυμαίνεται από 27 μΜ έως 180 μΜ [9], [10], [15], [16]. Ορισμένες από αυτές τις μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι Res εξασκεί τις ανασταλτικές επιδράσεις σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο [15], [16]. Η συγκέντρωση και η διάρκεια της θεραπείας Res που χρησιμοποιείται στη μελέτη μας ήταν σύμφωνα με την πλειονότητα των αναφορών από άλλες ομάδες [8], [9], [16]. Για το

in vivo

μελέτη, η μέθοδος χορήγησης που χρησιμοποιείται είναι καθετηριασμό επειδή αυτή είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται συνήθως σε ποντικούς ως εναλλακτική λύση στην ενδοπεριτοναϊκή ένεση [15], [17]. Επιπλέον, μελέτες σε ποντίκια έχουν αποκαλύψει ότι Res απορροφάται αποτελεσματικά μετά από του στόματος χορήγηση και μπορούν να βρεθούν σε όλο το σώμα [17], [18]. Όταν χρησιμοποιείται

in vivo

, Res μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όπως χαρακτηρίζεται από την έκφραση Ki67, το οποίο είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα από

in vitro

πειράματά μας.

ΑΠΕ μπορούν να επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω ποικίλων μηχανισμών, μεταξύ των οποίων, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου είναι σημαντική [9], [15], [19]. Μας

in vitro

δεδομένα έδειξαν ότι η θεραπεία των κυττάρων GC με Res προκαλεί G1 σύλληψη φάση. Η G1 φάση είναι η πρώτη από τις τέσσερις φάσεις του κυτταρικού κύκλου που λαμβάνει χώρα σε ευκαρυωτικά κυτταρική διαίρεση. G1 είναι ένα ιδιαίτερα σημαντικό φάση του κυτταρικού κύκλου, επειδή είναι το σημείο στο οποίο ένα κύτταρο δεσμεύεται σε ένα στρογγυλό διαίρεσης. Πρόοδος μέσω φάση G1 απαιτεί το σχηματισμό και τη δράση της κυκλίνης D-CDK4 ή -CDK6 συγκροτήματα. Αυτά τα σύμπλοκα στη συνέχεια φωσφορυλιώνει το ρετινοβλάστωμα, η οποία οδηγεί στην απελευθέρωση των E2F μεταγραφικών παραγόντων και κατάντη της μεταγραφής γονιδίου που εμπλέκεται στην εξέλιξη της φάσης S. Οι δραστηριότητες των συμπλεγμάτων D-CDK κυκλίνη ρυθμίζονται από αναστολείς ανάντη, συμπεριλαμβανομένων των μελών της INK (p15, p16 και p18) και των οικογενειών CIP (p21, p27 και p57) [20], [21]. Κατά μήκος της ίδιας γραμμής, η οποία συνοδεύεται με τη σύλληψη φάση G1, παρατηρήσαμε την προς τα κάτω ρύθμιση της κυκλίνης D1, CDK4 και CDK6 και την προς τα πάνω ρύθμιση του p21 και p16 σε Res επεξεργασμένα GC κύτταρα. Μας

in vivo

αποτελέσματα των επιπέδων έκφρασης αυτών των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου στα δείγματα των όγκων είναι σύμφωνη με τις

in vitro

αποτελέσματα. Τα αποτελέσματά μας είναι επίσης σύμφωνη με εκείνα των προηγούμενων μελετών [15], αν και ορισμένοι άλλοι έχουν αναφέρει ότι η σύλληψη φάσης S διεγείρεται από Res [9], [19]. Ανθεκτικότητα διακοπής αύξησης μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση ή γήρανση σε κύτταρα. Επειδή και οι δύο μονοπάτια σηματοδότησης ρ21 και ρ16 συμμετέχουν στην εξέλιξη γήρανση που προκαλείται από διάφορα είδη στρες [22], [23], εκτελέσαμε χρώση β-Gal. θεραπεία Res αύξησε σημαντικά τη συχνότητα των γηρασμένων κυττάρων GC με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Το πρόγραμμα κυτταρική γήρανση αποτελεί ένα σημαντικό εμπόδιο κατά την έναρξη του καρκίνου και την ανάπτυξη [24], [25]. Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι, μέσα από την εξασθένηση του οξειδωτικού στρες και τη βελτίωση του μεταβολισμού, Res ασκεί αντιγηραντική δράση τόσο

in vitro

και

in vivo

[26] – [28], έχουν το αντίθετο αποτέλεσμα έχει αποδειχθεί στον καρκίνο. Res έχει βρεθεί ότι επάγει γηρασμό σαν αναστολή της ανάπτυξης σε διάφορους τύπους καρκίνων [29], [30]. Ο διπλός ρόλος των ΑΠΕ στην κυτταρική γήρανση, επιβραδύνοντας τη γήρανση σε φυσιολογικούς ιστούς και επιτάχυνση της γήρανσης σε όγκους, κάνει ένα ιδανικό υποψήφιο για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου.

Η απόπτωση είναι μια άλλη κοινή δράση που παρατηρείται συνήθως σε ΑΠΕ-θεραπεία καρκινικά κύτταρα [9], [11], [15], [16]. Πειραματικά στοιχεία δείχνουν ότι η απόπτωση μπορεί να προκληθεί από πολλές διαφορετικές οδούς και πολυάριθμων ρυθμιστικών μορίων. Μεταξύ αυτών των ρυθμιστικών αρχών, οι πρωτεΐνες που περιλαμβάνουν την οικογένεια Bcl-2 είναι σημαντικά. Υπάρχουν δύο αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bcl-2, Bcl-XL) και προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Βαχ, κακό, Bak και bcl-xs) σε αυτή την οικογένεια. Μια αύξηση του bcl-2 αναλογία προ-αποπτωτικών bax /αντι-αποπτωτικό ενισχύει την διαπερατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης, προκαλεί την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο και, με τη σειρά του, έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κασπάσης-9 και κατάντη στοχεύουν κασπάσης-3 [31]. Παρά την εγγενή αποπτωτικό μονοπάτι, τα προ-αποπτωτικά συνδέτες, όπως FasL, με σύνδεση προς τους υποδοχείς τους, προκαλούν την ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και καθοδικούς τελεστές, όπως κασπάση-3. Η ενεργοποίηση των κασπασών τελεστών επάγει την διάσπαση πολλών κυτταρικών υποστρωμάτων και προκαλεί άμεσα απόπτωση [31] – [33]. Παρά το γεγονός ότι πολλές προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι η απόπτωση ήταν υπεύθυνη για τις ΑΠΕ που προκαλείται από την αναστολή της ανάπτυξης, εμείς δεν παρατηρούμε προφανές απόπτωση σε ΑΠΕ-θεραπεία GC κύτταρα. Αυτή η απουσία της απόπτωσης μπορεί να οφείλεται στη συγκέντρωση και τη διάρκεια της θεραπείας Res προσαρμόζονται στο πείραμά μας επειδή οι μελέτες από διαφορετικές ομάδες δείχνουν ότι Res εξασκεί δοσολογίας και της διάρκειας αποτελέσματα που εξαρτώνται από [34], [35]. Επιπλέον, καθώς τα αποτελέσματα των ΑΠΕ είναι επίσης κυττάρου-ειδικά [36] – [38], τα κύτταρα GC χρησιμοποιείται στη μελέτη μας μπορεί να είναι ανθεκτικά στην Res-επαγόμενη απόπτωση

Res έχει πολλαπλούς στόχους.? μεταξύ των οποίων, της τάξης ΙΙΙ NAD

+ – εξαρτώμενη δεακετυλάσης SIRT1 είναι το πιο συχνά μελετηθεί. Αν και μια βιοχημική μελέτη έδειξε ότι Res δεν ήταν μια άμεση ενεργοποιητής της SIRT1 [39], Res έχει ακόμα θεωρηθεί ως ένα κλασικό αγωνιστής της SIRT1. Πολυάριθμες μελέτες δείχνουν ότι Res ασκεί διαφορετικές επιδράσεις σε διάφορα μοντέλα σε SIRT1-εξαρτώμενο τρόπο [40], [41]. Στο πείραμά μας, SIRT1-εξάντληση αντέστρεψε την αναστολή της ανάπτυξης των ΑΠΕ, τόσο

in vitro

και

in vivo

. Η σύλληψη φάση G1 και γήρανση που προκαλείται από τη θεραπεία Res διασώθηκαν από SIRT1-εξάντληση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι επιδράσεις αναστολή Res με GC εξαρτώνται από SIRT1. Σύμφωνα με τις προηγούμενες μελέτες, SIRT1 μπορεί να ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών. Πρώτον, άμεσα, SIRT1 μεσολαβεί άμεσα την απακετυλίωση μιας πρωτεΐνης και, στη συνέχεια, ενισχύει την ουβικιτινίωση της και μετέπειτα ουμπικιτίνης αποικοδόμηση πρωτεασώματος [42].