Αφηρημένο

αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησιμοποιείται συχνά ως ένα σταθερό δείκτη καθαριότητας για σταθερή έκφραση του γονιδίου. Ωστόσο, τα μεταγραφικά επίπεδα

GAPDH

μπορεί να είναι ιδιαίτερα επάνω ρυθμισμένη σε ορισμένες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Χρησιμοποιώντας μια δημόσια διαθέσιμη βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών, εντοπίσαμε μια ομάδα γονιδίων των οποίων τα επίπεδα έκφρασης σε ορισμένες μορφές καρκίνου έχουν υψηλή συσχέτιση με το

GAPDH

πάνω ρύθμιση. Η πλειοψηφία των ταυτοποιημένων γονιδίων είναι κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από (

GAPDH

Associated του κυτταρικού κύκλου, ή GACC). Το μοτίβο πάνω ρύθμιση του

GAPDH

σχετίζεται θετικά γονιδίων σε NSCLC είναι παρόμοιο με εκείνο που παρατηρήθηκε σε καλλιεργημένα ινοβλάστες αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες που επάγουν αντι-γήρανσης. Η ανάλυση των δεδομένων έδειξε ότι πάνω ρυθμισμένα

Οι GAPDH

επίπεδα συσχετίζεται με παρεκκλίνουσα έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τις δύο οδούς γλυκόλυσης και γλυκονεογένεση. Κάτω ρύθμιση της φρουκτόζης-1,6-διφωσφορικής (FBP1) στη γλυκονεογένεση, σε συνδυασμό με τα πάνω ρύθμιση των περισσότερων γλυκολυτικά γονίδια είναι στενά συνδεδεμένη με υψηλή έκφραση του

GAPDH

στους όγκους. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται δείχνουν ότι πάνω ρύθμιση του

GAPDH

σχετίζεται θετικά γονίδια είναι ανάλογη με την κακοήθη στάδιο διαφόρων όγκων και συνδέεται με μια δυσμενή πρόγνωση. Έτσι, το έργο αυτό υποδεικνύει ότι τα γονίδια GACC αντιπροσωπεύουν μια πιθανή νέα υπογραφή για τον προσδιορισμό στάδιο του καρκίνου και την πρόγνωση της νόσου

Παράθεση:. Wang D, Moothart DR, Lowy DR, Qian X (2013) Η έκφραση της γλυκεραλδεϋδο-3- φωσφορικής γλυκόζης Associated κυτταρικού κύκλου (GACC) γονίδια συσχετίζεται με τον καρκίνο Στάδιο και κακή επιβίωση σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους. PLoS ONE 8 (4): e61262. doi: 10.1371 /journal.pone.0061262

Επιμέλεια: Jonathan Α Coles, Πανεπιστήμιο της Γλασκόβης, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 31 Δεκ 2012? Αποδεκτές: 8 Μάρτη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Απρ., 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. DW είναι ο ερευνητής του W2MOTIF, LLC, και DRM είναι ο υπάλληλος του αμερικανικού Qualex, Inc. DW και DRM έχουν καταθέσει αίτηση Ηνωμένες Πολιτείες Προσωρινή δίπλωμα ευρεσιτεχνίας που βασίζεται στην παρούσα εργασία (ΗΠΑ 61.732.943). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Αν και η αφυδρογονάση γονίδιο που κωδικοποιεί αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής (GAPDH) χρησιμοποιείται συχνά ως ένας σταθερός δείκτης για συστατική έκφραση του γονιδίου, η έκφραση του δεν είναι πάντα σταθερή, ειδικά στον καρκίνο. Για παράδειγμα, σε μία μελέτη από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC),

GAPDH

ήταν η λιγότερο σταθερή από τα γονίδια του 6 «αναφοράς» που εξετάστηκαν [1]. Αυτό housekeeping γλυκολυτικού ενζύμου έχει ενοχοποιηθεί σε πολλαπλές λειτουργίες και έχει βρεθεί να είναι υπερ-εκφράζεται σε ορισμένους καρκίνους [2].

Περισσότερο από 50 χρόνια πριν, Warburg υπέθεσαν ότι η ανάπτυξη του καρκίνου διευκολύνεται από όγκους παραγωγής ενέργειας τους μέσω αερόβια γλυκόλυση [3]. Πρόσφατες μελέτες με στόχο την αξιολόγηση αυτή την υπόθεση έχουν δείξει ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν προσαρμόσει το μεταβολισμό τους για να διευκολύνουν την πρόσληψη και την ενσωμάτωση των θρεπτικών συστατικών στο βιομάζα που απαιτείται για την παραγωγή νέων κυττάρων [4]. την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου είναι πράγματι συσχετίζεται με αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης και /ή παρεκκλίνουσα του μεταβολισμού της γλυκόζης [5] – [8]. Η υποξική περιβάλλον στο οποίο κατοικούν κύτταρα όγκου οδηγεί σε αύξηση του γλυκολυτικού μεταβολισμού. Ως βασικό ενδιάμεσο στοιχείο της γλυκόλυσης, GAPDH θα μπορούσε να εξυπηρετήσει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξη του όγκου. Ενώ είναι γνωστό ότι οι περισσότερες γλυκολυτικά ένζυμα, συμπεριλαμβανομένων GAPDH, ενεργοποιείται και εκφράζεται έντονα να ανταποκριθεί σε στέρηση οξυγόνου στον όγκο [9], ο ρόλος του GAPDH πάνω ρυθμισμένα σε NSCLC παραμένει ασαφής. Σε ένα σενάριο πιθανώς σχετίζονται με τον καρκίνο, GAPDH βρέθηκε να είναι ένας ρυθμιστής προ-επιβίωσης της κασπάσης-ανεξάρτητου θανάτου κυττάρου (CICD) [10].

Στην παρούσα μελέτη, ένα δημοσίως διαθέσιμη βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκε για να εντοπισμό του κύκλου που εξαρτάται από τα γονίδια των κυττάρων που συσχετίζονται με το

GAPDH

up-ρύθμιση και αντι-αποπτωτική δράση. Αυτή η ανάλυση εντόπισε ένα σύνολο γονιδίων υπογραφή του κυτταρικού κύκλου που βασίζεται, ορίζεται

GAPDH

Associated κυτταρικού κύκλου (GACC) γονιδίων, των οποίων τα πάνω ρύθμιση συσχετίζεται με την επιθετικότητα των διαφόρων τύπων όγκων και δυσμενή πρόγνωση τους. Ταυτοποίηση των γονιδίων GACC μπορεί να είναι χρήσιμη σε προσπάθειες που αποσκοπούν στην αποσαφήνιση μονοπάτια που συνδέουν το μεταβολισμό των υδατανθράκων με την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του κυτταρικού κύκλου με βάση, η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε νέες στόχους του καρκίνου βασίζονται σε πρότυπα γονιδιακής έκφρασης GACC σε καρκίνους.

Αποτελέσματα

Up-ρύθμιση του

Κύκλου GAPDH

συνδεδεμένων κυττάρων (GACC) γονιδίων σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC)

Ένα ολοκληρωμένο σύνολο δεδομένων γονιδιακής έκφρασης NSCLC, με βάση το Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array, δημιουργήθηκε από τρεις ανεξάρτητες ομάδες που άμεσα κατεβάσει από την δημόσια διαθέσιμη βάση δεδομένων του Ευρωπαϊκού Ινστιτούτου Βιοπληροφορικής ArrayExpress: E-GEOD-18842, E-GEOD-19188 και Ε-GEOD-19804. Το συνδυασμένο σύνολο δεδομένων, ορίζεται η πλήρης ομάδα, που αποτελείται από 174 NSCLCs και 156 ιστούς ελέγχου. Προκαταρκτική ανάλυση έδειξε τη μεταγραφή ορισμένων γονιδίων του κυτταρικού κύκλου στη δέσμη στοιχείων NSCLC μπορεί να συσχετίζονται με την μεταγραφή του

GAPDH

. Δεδομένου του ρόλου του GAPDH στη γλυκόλυση, η διαπίστωση αυτή ενθάρρυνε την περαιτέρω ανάλυση του γονιδίου προφίλ έκφρασης των όγκων για τη σχέση μεταξύ μεταβολισμό των υδατανθράκων και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου.

γονιδιακή ανάλυση συσχέτισης της έκφρασης εντοπίστηκαν πολλά γονίδια των οποίων η ρύθμιση προς τα πάνω στους όγκους συσχετίζεται στενά με το

GAPDH

έκφρασης. Συγκεκριμένα, στην ομάδα αυτή καρκίνος, 341 up-ρυθμιζόμενα γονίδια ταυτοποιήθηκαν με μια

GAPDH

συντελεστής συσχέτισης έκφραση μεγαλύτερο ή ίσο προς 0,6. Από αυτούς, οι 117 γονίδια (34%) περιγράφονται ως κυτταρικό κύκλο που σχετίζονται με βάση την ορολογία βιολογική διαδικασία Gene Ontology. Στην αρχική GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array με 54.613 ανιχνευτές, μόνο 2.044 σχετιζόμενα γονίδια (3,7%) συνδέονται με Gene Ontology όρος βιολογική διεργασία «του κυτταρικού κύκλου», που σημαίνει περισσότερο από μια 9-φορές εμπλουτισμό για τα γονίδια συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων στους όγκους. Ένα ακόμη μεγαλύτερο ποσοστό των γονιδίων που σχετίζονται με τον κύκλο-κυττάρου (18/26, 69%? Α εμπλουτισμός 17 φορές για τα γονίδια συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων) βρίσκονται, όταν ο συντελεστής συσχέτισης είναι ρυθμισμένη αυστηρότερα, σε μεγαλύτερο από ή ίσο με 0,72 (Πίνακας 1). Τα γονίδια αυτά ορίζονται εδώ ως

GAPDH

Associated κυτταρικού κύκλου (GACC) γονίδια. Τα γονίδια στα λίστα κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με την G1 /S και /ή G2 /μεταβάσεις φάσης Μ (

FOXM1, CDCA3 (Tome-1), CCNB2 (κυκλίνη Β2), BIRC5, CCNB1 (κυκλίνη Β1), CDC45, PRC1

και

CCNA2 (κυκλίνη Α2)

), και πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη μιτωτική διαδικασίες (

NCAPD2, TPX2, AURKB, PSMD2, KIF4A, KIF2C, UBE2S και FAM83D

).

KPNA2 (importin άλφα 1

) και

CDKN3

(

αναστολέας κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη 3

) είναι επίσης κυτταρικό κύκλο που σχετίζονται. Κορυφαία

GAPDH

θετικά συνδεδεμένων γονιδίων σε αυτή την κατηγορία περιλαμβάνουν

τριοζοφωσφορική ισομεράση

1 (

ΤΡΙ1

) και

γλυκόζης-6-φωσφορικής γλυκόζης

(

GPI

), καθένα από τα οποία κωδικοποιεί ένα κλειδί γλυκολυτικού ενζύμου. Έτσι, μόνο 6 από τα 26 γονίδια στη λίστα (

CENPA

,

RAD51AP1

,

SLC2A1

,

KIF4A, RFC4 και RRM2

) δύναται δεν πρέπει να οριστεί ως σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο ή γλυκόλυση. Τουλάχιστον ένα υποσύνολο αυτών των έξι γονίδια δεν μπορεί στην πραγματικότητα να είναι εξαιρέσεις, όπως CENPA αποτελεί βασικό κεντρομερική πρωτεΐνη που υπόκεινται σε κυτταρικό κύκλο μεταβολές που εξαρτώνται από [11]. Υπάρχουν επίσης ορισμένα στοιχεία που δείχνουν RAD51AP1 μπορεί να συμβάλει στην νεοπλασματική ανάπτυξη [12], ενώ SLC2A1 συμμετέχει σε σχετικές γλυκόλυση μεταφοράς γλυκόζης. Τέλος, KIF4A εμπλέκεται στην συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων και ο διαχωρισμός κατά τη διάρκεια της μίτωσης [13], RFC4 είναι απαραίτητη για πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) σύνθεση εξαρτώμενη DNA [14], και RRM2 κωδικοποιεί ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης Μ2, η οποία καταλύει τον σχηματισμό δεοξυριβονουκλεοτίδια από ριβονουκλεοτίδια σε εξαρτώμενο κυτταρικού κύκλου μόδα [15]. Εν ολίγοις, οι δύο κατηγορίες γονιδίων έχουν ταυτοποιηθεί στη λίστα. Κατηγορίας Ι αποτελείται από γλυκόζη μεταβολικών γονίδια που σχετίζονται οδού, ενώ Class II καλύπτει τα γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο.

Η

Η υψηλότερη κατάταξη γονίδια GACC είναι ιδιαίτερα συνδεδεμένες με την πορεία που ρυθμίζονται από το μεταγραφικό παράγοντα Forkhead ασφαλείας Μ1 (

FOXM1

,

r

= 0,77) σε NSCLC. Ο Πίνακας 2 παραθέτει τα γονίδια στο μονοπάτι FOXM1 στα οποία η έκφραση τους συσχετίζεται με G2 /M εξέλιξη, χρωμοσωμικό διαχωρισμό και κυτοκίνηση. Η

r

τιμές μεταξύ της έκφρασης της πλειοψηφίας αυτών των γονιδίων (19/29, 68%) και την έκφραση του

GAPDH

στη λίστα είναι πάνω από 0,6.

Η

εκατόν είκοσι τρία κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια, που έχει έναν συντελεστή συσχέτισης μικρότερη ή ίση με -0,6, εντοπίστηκαν στην NSCLC, κατά τη διάρκεια την ανάλυση των δεδομένων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Κανένα από τα γονίδια αυτής της ομάδας περιγράφονται από την βιολογική διεργασία Gene Ontology ως κυτταρικό κύκλο που σχετίζονται.

Σε αντίθεση με τους καρκινικούς ιστούς, ανάλυση των καρκινικών ιστών χωρίς έλεγχο στην κοόρτη προσδιορίζονται μόνο 5/70 ( 7%) των γονιδίων που συσχετίζονται θετικά με

GAPDH

έκφραση (

r

μεγαλύτερη ή ίση με 0,6). Η βιολογική διαδικασία Γονιδιακή Οντολογία περιγράφει αυτά τα γονίδια, όπως του κυτταρικού κύκλου. Οι συσχετίζονται γονίδια του κυτταρικού κύκλου περιλαμβάνουν

CDK4

(

r

= 0,62) και

CHK1

(

r

= 0,62). Αυτά τα δύο γονίδια παρατηρήθηκαν επίσης να εκφράζεται έντονα μέσα στους ιστούς του καρκίνου.

Όπως συνάγεται από τις ανωτέρω διαπιστώσεις, για τα περισσότερα από τα γονίδια υψηλής έκφρασης GACC στους όγκους, υπήρχε μόνο ένα αδύναμο συσχετισμό για

GAPDH

και γονιδιακή έκφραση GACC παρατηρήθηκε στα δείγματα ιστών ελέγχου (συντελεστές συσχέτισης ήταν ως επί το πλείστον σε 0.2-0.5 σειρές). Αντιθέτως, οι συντελεστές συσχέτισης για τα 15 γονίδια υψηλότερη κατάταξη GACC από τους ιστούς του καρκίνου ήταν μεγαλύτερα από 0,7 (Σχήμα 1). Έκφραση των γονιδίων εντός της γλυκολυτικής οδού (

GAPDH

,

ΤΡΙ1

και

GPI

) παρέμεινε υψηλή συσχέτιση τόσο στην NSCLCs και δείγματα ιστών ελέγχου μη-καρκίνου.

οι συντελεστές συσχέτισης των

GAPDH

επίπεδα έκφρασης και

τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου που σχετίζεται GAPDH

υπολογίστηκαν σε NSCLCs (μαύρο, επιλεγμένα γονίδια με

r

& gt? 0,7) και τους ελέγχους (λευκό) σχεδιάζονται.

ΤΡΙ1

και

GPI

είναι γονίδια που κωδικοποιούν δύο ένζυμα σε γλυκόλυση. Το υπόλοιπο των γονιδίων κωδικοποιεί πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο.

Η

Up-ρύθμιση του

GAPDH

στον NSCLC και μονοπάτια γλυκόλυση /γλυκονεογένεση

Τα αποτελέσματα παραίτηση σημαίνει ότι

GAPDH

έκφραση μπορεί να σχετίζεται με δραστηριότητες που σχετίζονται κυτταρικού κύκλου. Να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ των up-ρυθμιζόμενων γονιδίων GACC στον καρκίνο του πνεύμονα και το ενδεχομένως ανώμαλη έκφραση της γλυκόζης μεταβολικά μονοπάτια, αναλύσαμε τις αξίες της έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στη γλυκόλυση και γλυκονεογένεση. Η έκφραση του κάθε γονιδίου σε αυτά τα μονοπάτια ρυθμίζεται προς τα πάνω ή αμετάβλητη, στα κύτταρα του όγκου, με την εξαίρεση της φρουκτόζης-1,6-διφωσφορικής (

FBP1

) (Πίνακας 3, Σχήμα 2). Up-ρύθμιση του

GAPDH

είναι πλέον στατιστικά σημαντική μεταξύ όλων των 10 γλυκόλυση (G1-10 στον Πίνακα 3) τα βήματα και 4 παράκαμψης (BP1-3 στον Πίνακα 3) τα βήματα γλυκονεογένεση (1,07 φορές αύξηση και μονόπλευρο t -test

σ

= 1.44E-57). Περίπου το 75% ή το 35% των NSCLC εμφανίζει τόσο αυξάνεται

GAPDH

έκφρασης και μειωμένη

FBP1

έκφρασης στο σύνολο δεδομένων χρησιμοποιώντας είτε το μεσαίο ή το 25% της τιμής τεταρτημόριο ως σημείο cut-off. Επιπλέον, η έκφραση του

GAPDH

και

FBP1

είναι συν-ρυθμίζονται με το up-ρύθμιση του γονιδίου GACC

FOXM1

(

r

= 0,77 ) σε όγκους (Σχήμα 3).

Το σχήμα δείχνει τις οδούς της κυτταρικής γλυκόλυσης και γλυκονεογένεση. Οβάλ σχήμα κείμενο αντιπροσωπεύει τις μεταβολίτες των οδών. GLC = Γλυκόζη, G6P = Γλυκόζη-6-φωσφορικό άλας, F6P = 6-φωσφορικής φρουκτόζης, F1,6P = 1,6-διφωσφορική φρουκτόζη, GAPD = 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης, DHAP = φωσφορικό διυδροξυακετόνη, 1,3-BPG = 1, 3-Bisphosphoglyceric οξύ, 3PG = Γλυκερική 3-φωσφορικής, 2PG = Γλυκερική 2-φωσφορικό άλας, PEP = φωσφοενολοπυροσταφυλικό οξύ, ΠΥΡ = πυροσταφυλικό οξύ, OXA = οξαλοξικού. σύμβολα γονίδιο, κρατική ρύθμιση (↑ ή ↓ εάν ανιχνευθεί) και μονοπατιού (στις παρενθέσεις, G1-10: βήμα γλυκόλυση 1-10, BP1-3: γλυκονεογένεση βήμα παράκαμψης 1-3) υποδεικνύονται

Η

μέσες τιμές (Α) ή 25% οι τιμές τεταρτημόριο (Β) της γονιδιακής έκφρασης θεωρούνται ως σημεία αποκοπής. Οι αριθμοί της αξίας υψηλότερη από cut-off σημείο (

GAPDH ή FOXM1

) ή χαμηλότερες από cut-off σημείο (

FBP1

) ή οι διάφοροι συνδυασμοί χαράσσονται για τις δύο όγκους (μαύρο) και έλεγχοι (λευκό).

η

Συνάφεια μέχρι ρυθμιζόμενων

GAPDH

θετική συσχέτιση γονιδίων με NSCLC στη ρύθμιση της κυτταρικής γήρανσης

για να διερευνήσουν περαιτέρω τη συσχέτιση του πάνω ρύθμιση των γονιδίων GACC και εκείνη του άλλου

GAPDH

συσχετίζονται θετικά γονιδίων σε NSCLC, εμείς εικάζουν ότι ο καρκίνος μπορεί να προκύψουν εν μέρει από τη μείωση στην κανονική ρύθμιση του γηρασμού από γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο . Κατά συνέπεια, εξετάσαμε τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε καλλιεργημένα κύτταρα στα οποία είχε προκληθεί ρύθμιση αντι-γήρανση, και να τους σε σύγκριση με τα γονίδια των οποίων τα επάνω ρυθμισμένη έκφραση βρέθηκαν να συσχετίζονται θετικά με

GAPDH

έκφραση στην κοόρτη NSCLC. Η σύγκριση αυτή χρησιμοποιείται microarray σύνολο δεδομένων E-GEOD-19018, στην οποία χαμηλής διαβιβάσεως IMR-90 ανθρώπινοι διπλοειδείς ινοβλάστες είχαν καλλιεργηθεί σε 20% οξυγόνο (κανονικές αναπαραγωγικό δυναμικό) ή 3% οξυγόνο (αύξηση αναπαραγωγικό δυναμικό), μετά το οποίο είχε εξαχθεί το RNA και σε υβριδισμό σε μικροσυστοιχίες. Όταν τα κορυφαία 341

GAPDH

συσχετίζεται θετικά γονίδια (

r

μεγαλύτερη ή ίση με 0,6) που προσδιορίζονται στο σύνολο δεδομένων NSCLC συγκρίθηκαν με εκείνα από τις καλλιεργημένες ινοβλάστες, το επάνω ρυθμισμένη

GAPDH

συσχετίζεται θετικά γονίδια (συμπεριλαμβανομένου τουλάχιστον 34% των γονιδίων GACC) τόσο στο NSCLC και των ινοβλαστών καλλιεργημένα σε 3% οξυγόνο (ένταση χαμηλό οξυγόνο και αντι-γήρανση) βρέθηκαν να είναι παρόμοια (Σχήμα 4). Ένας καλός συσχετισμός (

r = 0,71

) βρέθηκε μεταξύ ενός λόγου σήματος έκφραση του καρκίνου /ελέγχου και την αναλογία των καλλιεργημένων κυττάρων 3% οξυγόνο /20% οξυγόνο στην έκφραση αυτών των γονιδίων.

τα θετικά συντελεστές συσχέτισης ανάμεσα λόγος σήματος όγκου /ελέγχου στον NSCLC σύνολο δεδομένων και την αναλογία σήματος του 3% οξυγόνο /20% οξυγόνο καλλιεργημένα ανθρώπινα διπλοειδή σύνολο δεδομένων ινοβλαστών απεικονίζονται.

Η

γονίδια GACC είναι νέες υπογραφές γονίδιο για NSCLC και άλλων στερεών όγκων

Χρησιμοποιώντας διάφορα σύνολα δεδομένων στη διάθεσή μας, έχουμε αξιολογηθεί κατά πόσον τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης GACC μπορεί να είναι σχετικές με το στάδιο του καρκίνου και την πρόγνωση. Όπως φαίνεται στο διάγραμμα χάρτη θερμότητας στο Σχήμα 5, η κορυφαία γονίδια GACC, καθώς και τα γονίδια που σχετίζονται γλυκόλυση, είναι συγκεντρωμένα στους όγκους. Επιπλέον, αυτά τα γονίδια μπορεί να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση διαφορετικά στάδια του καρκίνου.

Οι σειρές ενός χάρτη μικροσυστοιχιών θερμότητα αντιπροσωπεύουν γονίδια με κάθε στήλη της αυτής γραμμής αντιπροσωπεύει ένα διαφορετικό δείγμα (όνομα πηγής που ακολουθείται από την κατάσταση της νόσου). Οι τιμές έκφρασης γονιδίων από τέσσερις ομάδες των NSCLCs με διαφορετικά στάδια του όγκου (I, II, III) (Α), των καρκινωμάτων του φλοιού (ACC) με βαθμούς όγκου (υψηλή ή χαμηλή) (Β), καρκίνους του μαστού (BC) με διαφορετικές ποιότητες του όγκου (Ι, ΙΙ, ΙΙΙ) (C), και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) με διάφορα στάδια όγκου (πολύ νωρίς, νωρίς, προηγμένες, σε πολύ προχωρημένο στάδιο) και φυσιολογικό ήπαρ (D) είναι συγκεντρωμένα και παρουσιάστηκε από τη θερμότητα χάρτη.

Συγκεκριμένα, οι ομάδες από E-GEOD-19804, τα οποία περιλαμβάνουν 24 NSCLCs με διαφορετικά στάδια του όγκου (I, II, III) που είχαν επιλεγεί τυχαία από το αρχικό σύνολο δεδομένων (6 σταδίου Ι, 6 στάδιο II, και 12 στάδιο ΙΙΙ), είναι κατά προτίμηση συγκεντρωμένα ανάλογα με το στάδιο. Cluster 1 κατά προτίμηση συνδέεται με πιο προχωρημένους όγκους στάδιο, καθώς έχει 8 σταδίου ΙΙΙ (89%) των όγκων και 1 σταδίου II όγκου. Αντίθετα, cluster 2, το οποίο έχει 11 σταδίου Ι /ΙΙ (73%) και 4 σταδίου όγκους III, εμπλουτίζεται για όγκους πρώιμο στάδιο (Σχήμα 5Α).

Οι ομάδες από την E-GEOD-10927, το οποίο περιλαμβάνει 33 φλοιού των καρκίνων με τους βαθμούς του όγκου (υψηλή ή χαμηλή), μπορούν επίσης να ομαδοποιηθούν. Cluster 1 εμπλουτίζεται για όγκους υψηλής ποιότητας, καθώς διαθέτει 13 υψηλής ποιότητας (87%) και 2 όγκους χαμηλής ποιότητας. Από την άλλη πλευρά, σύμπλεγμα 2 είναι σχετικά εμπλουτισμένο για τους όγκους χαμηλής ποιότητας, όπως έχει 11 χαμηλού βαθμού (61%) και 7 όγκους υψηλού βαθμού (Σχήμα 5Β).

Οι ομάδες από E-GEOD- 29431, το οποίο περιέχει 28 καρκίνους του μαστού με τους βαθμούς του όγκου (I, II, III), είναι συγκεντρωμένα. Δεκατέσσερις στάδιο I /II και 14 δείγματα σταδίου ΙΙΙ επιλέχθηκαν τυχαία από το αρχικό σύνολο δεδομένων. Cluster 1 έχει 8 σταδίου ΙΙΙ (73%) και οι όγκοι II 3 στάδιο, ενώ cluster 2 έχει 11 σταδίου Ι /ΙΙ (65%) και 6 όγκους σταδίου ΙΙΙ (Σχήμα 5C).

Οι ομάδες από την Ε- GEOD-6764, τα οποία περιέχουν ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) και φυσιολογικό ήπαρ, είναι συγκεντρωμένα. Ομάδα 1 αποτελείται σχεδόν εξ ολοκλήρου από πολύ προχωρημένο /προχωρημένο III HCC (91%), ενώ το σύμπλεγμα 3 έχει κατά κύριο λόγο από πολύ νωρίς /νωρίς όγκους (67%). Όλα τα 8 φυσιολογικά δείγματα είναι συστάδα 2 (73%), η οποία περιλαμβάνει επίσης 2 πολύ νωρίς και 1 πρώιμους όγκους (Σχήμα 5D).

Το μοτίβο της γονιδιακής ομαδοποίησης προτείνει ότι σχετίζονται GACC γονιδιακή έκφραση μπορεί να είναι σχετικές ως βιοδείκτες να προβλέψουμε την πρόγνωση του καρκίνου. Για να αξιολογηθεί αυτή η πιθανότητα, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης GACC αναλύθηκαν από ένα σύνολο δεδομένων από 442 αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα [16] και συσχετίζεται με τα αποτελέσματα επιβίωση 60 μηνών. Υψηλή έκφραση των γονιδίων κορυφαία GACC σχετίζεται με κακή έκβαση της νόσου (Εικόνα 6Α). Συνδυάζοντας το επίπεδο γονιδιακής έκφρασης GACC με

GAPDH

επίπεδο μπορεί να βελτιώσει την προγνωστική δύναμη της μόνο στο επίπεδο των γονιδίων GACC στις περισσότερες περιπτώσεις (Εικόνα 6Β).

(Α) Πρόκληση ομάδα διευθυντή με 442 πνεύμονα αδενοκαρκινώματα από caArray για την ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier. Η προς τα πάνω ρύθμιση όλων των επιλεγμένων κορυφαία γονίδιο GACC σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Συνδυασμός up-ρύθμιση του

GAPDH

με ατομικές γονίδιο GACC βελτιώνει τη δύναμη πρόβλεψης (υψηλή έκφραση του γονιδίου GACC και υψηλή

GAPDH

έκφρασης (πράσινη γραμμή)

vs

υψηλής γονίδιο GACC έκφραση μόνη της (μπλε γραμμή)). H = υψηλή. L = χαμηλή. (Β) Η στατιστική σημαντικότητα της ανάλυσης επιβίωσης Kaplan-Meier χρήση μεμονωμένων γονιδίων GACC ως δείκτη (

GAPDH-

) ή συνδυασμός των γονιδίων GACC και

GAPDH

(

GAPDH

+) ως δείκτες. Οι κατάλογοι πίνακα

σ

αξίες της ανάλυσης chi-square.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, μια δημόσια διαθέσιμη βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών [17] χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της μεταγραφής επίπεδα

GAPDH

και συνδέονται γονιδιακή έκφραση σε στερεούς όγκους. Τα δεδομένα της μελέτης αναλύθηκαν με τη χρήση των Plus2 U133 Affymetrix GeneChip Human Genome ή μορφές Array U133A, τα οποία συνήθως χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση γονιδιακής έκφρασης. Η ανάλυση των δεδομένων βασίστηκε σε μια μεγαλύτερη ομάδα NSCLC (συνολικά 330 δείγματα) που συνδυάζονται ανεξάρτητα στοιχεία από διάφορες πηγές. ταυτοποίηση μας στατιστικά σημαντικές αλλαγές στο

GAPDH

έκφραση σε όγκους επέτρεψε την αξιολόγηση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης που συσχετίζεται με εκείνη του

GAPDH

.

Τα αυξημένα επίπεδα του GAPDH έχουν παρατηρήθηκαν σε ογκογονίδιο επαγόμενη μεταμόρφωση [18], η αγγειογένεση [19] και αντι-αποπτωτική λειτουργία [20] – [22]. Σε άλλες μελέτες, ωστόσο, GAPDH έχει εμπλακεί στην προαγωγή της απόπτωσης [23] – [25]. Ο λόγος για αυτό το παράδοξο είναι ελάχιστα κατανοητή [26]. έργο Barbini του [27] έχει προτείνει ότι η διαφορική υποκυτταρικός εντοπισμός της GAPDH μπορεί να συμβάλει στην αντίθετες βιολογικές δραστηριότητες της στην αποπτωτικών και πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων. Οι διαφορετικές λειτουργίες της GAPDH μπορεί επίσης να ρυθμίζεται με διάφορα επίπεδα του μετα-μεταφραστική τροποποίηση της πρωτεΐνης [28].

ανάλυση μας δείχνει ότι τα προφίλ του γονιδίου GACC πάνω ρύθμιση είναι ανάλογες προς τις αντι-γήρανση σε ο προφίλ στους όγκους, παρά συσχέτιση με την προώθηση της γηράνσεως ή απόπτωση. Έχουμε εντοπίσει μια ομάδα γονιδίων, για τα οποία η έκφραση του mRNA συσχετίζεται έντονα με

GAPDH

έκφραση σε κύτταρα όγκου. Σε γενικές γραμμές, οι δύο τέτοιες κατηγορίες γονιδίου έχουν ταυτοποιηθεί στους όγκους. Κατηγορίας Ι αποτελείται από μεταβολικής γονίδια που σχετίζονται οδό. Κορυφαία

GAPDH

θετικά συνδεδεμένων γονιδίων σε αυτή την κατηγορία περιλαμβάνουν

τριοζοφωσφορική ισομεράση

1 (

ΤΡΙ1

) και

γλυκόζης-6-φωσφορικής γλυκόζης

(

GPI

), καθένα από τα οποία κωδικοποιεί ένα κλειδί γλυκολυτικού ενζύμου. Κατηγορία ΙΙ καλύπτει τα γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο που συνήθως κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην G2 /M μετάβαση και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου φάσης Μ. Από αυτές, η πιο κατατοπιστική πρωτεΐνη φάνηκε να είναι μεταγραφικός παράγοντας Forkhead ασφαλείας Μ1 (FOXM1), ένα κρίσιμο στοιχείο για την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [29] και ένα σημαντικό ρυθμιστή της μετάστασης του όγκου [30].

FOXM1

συνδέονται γονίδια

CCNB2

(

r

= 0,75),

CENPA

(

r

= 0,75),

AURKB

(

r

= 0,73),

BIRC5

(

survivin r

= 0,73),

ΝΕΚ2

(

r

= 0.69) είναι μεταξύ των κορυφαίων γονίδια GACC. Η πυρηνική πρωτεΐνη CENPF, η οποία είναι ένας μεταγραφικός στόχος του FOXM1 (

CENPF

,

r = 0,67

), ρυθμίζει το σημείο ελέγχου συγκροτήματος άξονα για να διασφαλιστεί η σωστή σταθερότητα των χρωμοσωμάτων και ο διαχωρισμός κατά τη διάρκεια της μίτωσης [31]. ρύθμιση up-των γονιδίων αυτών συνδέεται σταθερά με υψηλής εκφράσεις του

GAPDH

.

Ο μηχανισμός με τον οποίο GAPDH και FOXM1 μπορεί να συν-ρύθμιση είναι ασαφής. Προκειμένου να πυροδοτήσει τα γεγονότα που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο, είναι πιθανό ότι και οι δύο GAPDH και FOXM1 μετατοπίζονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα σε καρκινικά κύτταρα. Πυρηνική μετατόπιση του GAPDH μπορεί να ρυθμίζεται από ακετυλίωση [32]. FOXM1 εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα στα τέλη G1 και τις φάσεις S. Πυρηνική μετατόπιση του FOXM1 συμβαίνει λίγο πριν την πρόοδο σε G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου και απαιτεί δραστηριότητα εντός της οδού Raf /MEK /σηματοδότηση ΜΑΡΚ [33]. Τόσο GAPDH και FOXM1 συν-μετατοπίζονται στον πυρήνα κατά τη διάρκεια της μεταβατικής φάσης G2 /M μέσω της αλληλεπίδρασής τους με άλλες πρωτεΐνες. Σε αυτή τη διαδικασία, KPNA2 (importin άλφα 1) μπορεί να αλληλεπιδρούν με GAPDH, δεδομένου ότι ο συντελεστής συσχέτισης του

KPNA2

έκφρασης με

GAPDH

σε NSCLC είναι 0,75.

γονίδια GACC είναι επάνω ρυθμισμένη στα κύτταρα με επώαση 3% οξυγόνο, τα οποία έχουν μεγαλύτερη ικανότητα αντιγραφής (αντι-γήρανση) από εκείνες καλλιεργήθηκαν σε 20% οξυγόνο. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σε συμφωνία με τις πρόσφατες μελέτες που αποδεικνύουν ότι η εξάντληση GAPDH διακόπτες ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα σε ένα φαινότυπο γήρανσης [34]. πειράματα διάσωσης που απασχολούνται μεταβολικές και γενετικές μοντέλα επιβεβαίωσε ότι GAPDH έχει σημαντικές ρυθμιστικές λειτουργίες που συνδέονται με το μεταβολισμό της ενέργειας και των δικτύων του κυτταρικού κύκλου. Συνοψίζοντας, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι GAPDH εξυπηρετεί ένα ρόλο κλειδί στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της κυτταρικής γήρανσης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων.

Εκτός από NSCLC, το πάνω ρύθμιση

GAPDH

και συνδέονται γονίδια , συμπεριλαμβανομένων γονιδίων GACC, παρατηρήθηκε σε άλλους τύπους όγκων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μεταγραφή του GAPDH σε όγκους είναι ένα σημαντικό βήμα στην ανάπτυξη καρκίνου, όπου μπορεί να συμβάλλουν στην αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που σχετίζονται με τον κύκλο του κυττάρου. Αυτή η διαδικασία μπορεί επίσης να περιλαμβάνει παρεκκλίνουσα γλυκόλυση και γλυκονεογένεση, όπως τα περισσότερα γονίδια και στις δύο οδούς είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω. Ωστόσο, το γονίδιο γλυκονεογένεση

FBP1

ρυθμίζεται προς τα κάτω στους όγκους. Κατά την κανονική μεταβολισμό της γλυκόζης, η περίσσεια GAPDH συνεχώς μεταβολίζεται από γλυκόλυση σε πυροσταφυλικό οξύ, το οποίο στη συνέχεια μετατρέπεται από FBP1 σε φρουκτόζη-1,6-διφωσφορικής διάρκεια γλυκονεογένεση. Στον καρκίνο, ρύθμιση προς τα κάτω του FBP1 μπορεί να οδηγήσει σε συσσώρευση GAPDH εντός του κυτταροπλάσματος και μπορεί επίσης να προκαλέσει μετατόπιση της περίσσειας GAPDH προς τον πυρήνα. Κάτω ρύθμιση των FBP1 σε καρκινικά κύτταρα έχει αναφερθεί πρόσφατα [35], [36]. FBP1 θεωρείται ένας όγκος γονίδιο καταστολής του γαστρικού καρκινικά κύτταρα και προς τα κάτω ρύθμιση FBP1 που διαμεσολαβείται από υπερμεθυλίωση προαγωγού βρίσκεται στο ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και ο καρκίνος του παχέος εντέρου. Υπερ-έκφραση του GAPDH στους όγκους μπορεί να συνδεθεί παρεκκλίνουσα του μεταβολισμού της γλυκόζης με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ωστόσο, η ανάλυσή μας δεν μπορεί να αποκλείσει την πιθανότητα ότι η παρατηρούμενη πάνω ρύθμιση και των δύο

GAPDH

και τα γονίδια GACC μπορεί να είναι μια δευτερεύουσα επίπτωση του καρκίνου που οφείλεται στις υψηλής ενέργειας απαιτήσεις που απαιτούνται για την ταχεία ανάπτυξη. Ενώ η απόπτωση αναστέλλεται, τον κυτταρικό μεταβολισμό είναι αυξημένη και οι βασικές μεταβολικές οδούς ενεργοποιηθεί. Επιπλέον, αυτή η μελέτη έχει περιοριστεί σε μέτρηση μεταγραφική επίπεδα με βάση τα δεδομένα μικροσυστοιχίας, και δεν μπορεί να δημιουργήσει μια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης γονιδίου και κυτταρικά επίπεδα της πρωτεΐνης μέσα στα υψηλής μεταβολικής περιβάλλοντα. Περαιτέρω πειραματισμός που απαιτείται για να αντιμετωπιστούν αυτά τα ζητήματα.

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι πάνω ρύθμιση των γονιδίων GACC στο εσωτερικό των κυττάρων του όγκου είναι ανάλογη με κακοήθη τους κατάσταση, και έτσι μπορεί να είναι ένας πιθανός προγνωστικός παράγοντας της πρόγνωσης της νόσου. Με βάση το

GAPDH

σχετίζεται θετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης, η υποκατηγορία των NSCLC, του φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα, τον καρκίνο του μαστού και HCC μπορούν επίσης να ταξινομηθούν σε διάφορα στάδια. Το up-ρύθμιση του

GAPDH

σχετίζεται θετικά γονίδια συσχετίζεται με πιο σοβαρές ή /και μεταγενέστερα στάδια του καρκίνου. Το πιο σημαντικό, χρησιμοποιώντας τόσο

επίπεδα GAPDH

μεταγραφής και έκφρασης του γονιδίου GACC στην ανάλυση επιβίωσης βελτιώσει σημαντικά την προγνωστική δύναμη του χρησιμοποιώντας γονιδιακό επίπεδο GACC μόνη της, στις περισσότερες περιπτώσεις.

Μέθοδοι

Η μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης αναλύσεις που αναφέρονται σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιούνται δεδομένα από ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress) του Ευρωπαϊκού Ινστιτούτου Βιοπληροφορικής (EBI) και caArray (https://array.nci.nih.gov /caarray/home.action) του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου (NCI), δύο από τα οποία είναι διαθέσιμα στο κοινό. Οι αναλύσεις που περιλαμβάνονται ανεξάρτητες ομάδες από ArrayEaxpress περιέχει NSCLC (E-GEOD-18842, E-GEOD-19188 και Ε-GEOD-19804), ο καρκίνος του φλοιού των επινεφριδίων (E-GEOD-10927), ο καρκίνος του μαστού (E-GEOD-29431), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) (E-GEOD-6764), κυτταρικές σειρές σε διάφορες συνθήκες (Ε-GEOD-19018) και ένα κοόρτη από caArray περιέχουν αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (Jacob-00182) για Affymetrix GeneChip Human Genome U133 συν 2 ή Arrays U133A. Τα αρχεία CEL που περιέχει τα πρωτογενή δεδομένα από κάθε πείραμα ήταν άμεσα κατεβάσει από την ιστοσελίδα του EBI ή NCI με συγκεκριμένο αριθμό προσχώρησης. Τα δεδομένα στη συνέχεια κανονικοποιούνται με την αξιολόγηση του ποιοτικού ελέγχου αρχείων CEL χρησιμοποιώντας 3 ‘Πίνακες Έκφραση Στιβαρή Multi-array Ανάλυση (RMA) από την έκφραση λογισμικού Affymetrix Console (https://www.affymetrix.com). Οι κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης αντιπροσωπεύουν το σύνολο ανιχνευτών ένταση σε λογαριθμική κλίμακα-2. Το ολοκληρωμένο σύνολο δεδομένων NSCLC από ArrayExpress περιλαμβάνει τρία ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων NSCLC για ανάλυση, στην οποία όλα τα αρχεία CEL από τις πηγές αυτές συνδυάστηκαν για ανάλυση RMA.

t-test του φοιτητή (one-tailed) και τον υπολογισμό του συντελεστή συσχέτισης Pearson ήταν διεξάγεται με τη χρήση του Microsoft Excel.

P

τιμές του t-test μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά διαφορετικά. Πλατεία Chi δοκιμής (chisq.test), χάρτη θερμότητας σχέδιο (heatmap) και ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του ανοικτού κώδικα στατιστικό εργαλείο R (έκδοση 2.14.1) (Υποστήριξη Πληροφοριών). Στο γονίδιο αναλύσεις έκφρασης, η αξία ενός επιλεγμένου επιπέδου έκφρασης γονιδίου συγκρίθηκε με τη μέση τιμή ή το 25% της τιμής τεταρτημόριο της έκφρασης γονιδίου σε κάθε κοόρτη. Οι αριθμοί υψηλότερη ή χαμηλότερη από τη διάμεση τιμή ή 25% αξία τεταρτημόριο απεικονίζονται στα αποτελέσματα. Για την ανάλυση επιβίωσης, τιμές υψηλότερες ή χαμηλότερες από διάμεση σε κάθε ομάδα γονίδιο τοποθετήθηκαν σε «υψηλό», «χαμηλό», ή διαφορετικούς συνδυασμούς για την ανάλυση. Όλες οι χρόνοι επιβίωσης προσαρμόστηκαν σε μήνες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1. αρχείο

δεδομένων για το χάρτη θερμότητας (HCCdata.csv)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061262.s001

(CSV)

αρχείου S2. αρχείο

δεδομένων για ανάλυση επιβίωσης (TPX2survival.csv)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061262.s002

(CSV)

αρχείου S3.

R πηγαίο κώδικα για την ανάλυση βιοπληροφορικής

doi:. 10.1371 /journal.pone.0061262.s003

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ. Jeffrey D. Kittendorf και Thomas C. Johnson της AQLS Inc., Δρ. Nicholas Chi-Kwan Ling, Degang Zhong και ο Roger Anderson για τις χρήσιμες συζητήσεις του χειρογράφου. Θέλουμε να ευχαριστήσουμε την ομάδα τεχνικής υποστήριξης Affymetrix για διαβουλεύσεις σχετικά με την ανάλυση των δεδομένων.