Αφηρημένο

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η ικανότητα του EVO να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και να προωθήσει τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε κύτταρα μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC). Ο καρκίνος του πνεύμονα έχει τα υψηλότερα ποσοστά επίπτωσης και θνησιμότητας μεταξύ όλων των καρκίνων. Η χημειοθεραπεία είναι η κύρια θεραπεία για SCLC? Ωστόσο, τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα για SCLC είναι λιγότερο αποτελεσματικά από εκείνα που χρησιμοποιούνται για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να αναπτυχθούν νέα φάρμακα για τη θεραπεία SCLC. Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα της evodiamine (ΕΒΟ) επί της κυτταρικής ανάπτυξης, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης διερευνήθηκαν στις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα ΝΟΙ-Η446 και ΝΟΙ-H1688. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν την πρώτη αναφορά ότι EVO μπορεί να αναστέλλει σημαντικά τη βιωσιμότητα τόσο των κυττάρων Η446 και H1688 στη δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τρόπους. EVO επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G2 /M, επήγαγαν απόπτωση με up-ρύθμιση της έκφρασης της κασπάσης-12 και πρωτεΐνη κυτόχρωμα C, και επάγεται η έκφραση του Bax mRNA και από τα κάτω ρυθμίσεως της έκφρασης Bcl-2 mRNA τόσο Η446 και H1688 κυττάρων. Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία επίδραση στην έκφραση πρωτεΐνης της κασπάσης-8. Στο σύνολό τους, τα ανασταλτικά αποτελέσματα του EVO επί της ανάπτυξης των κυττάρων Η446 και H1688 μπορούσε να αποδοθεί στην G2 /M σύλληψη και μετέπειτα απόπτωση, μέσω μιτοχόνδρια-εξαρτώμενες και ενδοπλασματικό δίκτυο στρες που προκαλείται από οδούς (ενδογενές κασπάση-dependent pathways), αλλά όχι μέσω της θάνατος επαγόμενη από υποδοχέα μονοπατιού (εξωγενής κασπάση-εξαρτώμενη οδό). Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η EVO είναι μια πολλά υποσχόμενη νέα και ισχυρή αντικαρκινική υποψήφιο φάρμακο για SCLC. Επιπλέον, το κυτταρικό κύκλο, τα μιτοχόνδρια και τα μονοπάτια ER στρες είναι ορθολογική στόχους για τη μελλοντική ανάπτυξη ενός συστήματος παροχής EVO για τη θεραπεία SCLC

Παράθεση:. Fang C, Zhang J, Qi D, Fan Χ, Luo J, Liu L, et al. (2014) Evodiamine Προκαλεί G2 /M σύλληψης και απόπτωση μέσω μιτοχονδριακού και Ενδοπλασμικό Δίκτυο Πορείες σε Η446 και H1688 Ανθρωπίνων Μικρό-Cell καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (12): e115204. doi: 10.1371 /journal.pone.0115204

Επιμέλεια: Ιρίνα Β Λεμπέντεβα, το Πανεπιστήμιο Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7η του Μάη του 2014? Αποδεκτές: 19 του Νοέμβρη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 15, Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Fang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από την CSTC2012JJB10027 επιχορήγηση από Chongqing Επιστήμης και Τεχνολογίας Επιτροπή, Chongqing, Λαϊκή Δημοκρατία της Κίνας. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου, αντιπροσωπεύοντας το 12,5% του συνόλου των ετήσιων πρόσφατα διαγνωσμένων κρουσμάτων καρκίνου παγκοσμίως. Εκτός από την υψηλή συχνότητα, ο καρκίνος του πνεύμονα έχει το υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας μεταξύ όλων των τύπων του καρκίνου [1]. Ο καρκίνος του πνεύμονα μπορεί να ταξινομηθεί σε μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα (SCLC) και καρκίνο των πνευμόνων μη μικρών κυττάρων (NSCLC) με βάση ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της νόσου. Περίπου 10% έως 15% όλων των καρκίνων του πνεύμονα είναι SCLC [2]. Κλινικά, SCLC διακρίνεται από NSCLC από την ταχεία ανάπτυξη του όγκου και εκτεταμένη μετάσταση. Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Αμερικανικής Εταιρείας Καρκίνου [2], η χημειοθεραπεία είναι η κύρια θεραπεία για SCLC, και σισπλατίνη, ετοποσίδη, καρβοπλατίνη και ιρινοτεκάνη είναι τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα φάρμακα. Ωστόσο, τα φάρμακα αυτά έχουν περιορισμένη μόνο αποτελεσματικότητα και να προκαλέσουν σοβαρές παρενέργειες [3]. Στην πραγματικότητα, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για SCLC είναι μάλλον χαμηλή (3~8%) σε σύγκριση με το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για όλες τις μορφές καρκίνου του πνεύμονα (& lt? 15%) [4]. Μυθιστόρημα και αποτελεσματικών αντικαρκινικών φαρμάκων με λιγότερες και λιγότερο σοβαρές παρενέργειες είναι επιτακτικά αναγκαίες για τη βελτίωση των κλινικών αποτελεσμάτων.

Evodiamine (EVO), ένα σημαντικό αλκαλοειδές quinazolinecarboline στο

Evodia rutaecarpa

, έχει κυτταροτοξικές επιδράσεις στις διαφορετικούς τύπους ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, όπως πολύμορφο κυττάρων [5], γαστρικό καρκίνο κυττάρων [6], κύτταρα καρκίνου του μαστού [7], ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης κύτταρα [8] και καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, EVO παρουσίασαν κυτταροτοξικές επιδράσεις σε διαφορετικές NSCLC κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων αδενοκαρκινώματος Α549 κύτταρα πνεύμονα [9], τα κύτταρα Η1299 [10], τα κύτταρα CL1 [11] και κύτταρα καρκινώματος Η460 μεγάλης πνεύμονα [12], [13]. Σε αντίθεση με τις κυτταροτοξικές επιδράσεις της EVO επί διαφόρων καρκινικών κυττάρων [14], EVO έχει μικρή επίδραση σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα περιφερικού αίματος ή στο σωματικό βάρος των ποντικών που φέρουν όγκο σε αποτελεσματική δόση του [15].

Από την άλλη πλευρά, μερικά φάρμακα που έχουν κυτταροτοξικά αποτελέσματα επί NSCLC έχουν επίσης προφανές επιπτώσεις στην SCLC, όπως wentilactone Α, η οποία είναι κυτταροτοξική σε τόσο Η460 και Η446 [16], και γλυκοζαμίνη, η οποία είναι κυτταροτοξική σε Α549 και Η446 κύτταρα [17 ]. Ως εκ τούτου, αν και δεν υπήρξε καμία αναφορά του αποτελέσματος της EVO για SCLC μέχρι σήμερα, EVO μπορεί να είναι ένα δυναμικό νέο υποψήφιο φάρμακο για τη θεραπεία του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα.

Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα της EVO στη βιωσιμότητα των κυττάρων, το κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση στα ανθρώπινα SCLC κυτταρικές σειρές NCI-Η446 και ΝΟΙ-H1688 ερευνήθηκαν, και οι υποκείμενοι μηχανισμοί διερευνήθηκε περαιτέρω. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα της EVO επί της ανάπτυξης των κυττάρων Η446 και H1688 οφείλονταν στο G2 /M σύλληψη και μετέπειτα απόπτωση μέσω των μιτοχονδρίων-εξαρτώμενη και ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) οδών ενεργοποίηση της κασπάσης που επάγεται από άγχος (ενδογενές κασπάση-dependent pathways ), αλλά όχι μέσω της οδού ενεργοποίησης του θανάτου του υποδοχέα που προκαλείται κασπάσης (εξωγενής κασπάση-εξαρτώμενη οδό). Μέχρι στιγμής, κανένα φάρμακο δεν έχει αναφερθεί ότι επάγουν απόπτωση σε κύτταρα μέσω SCLC οδού ER στρες. Τα αποτελέσματά μας αποτελούν την πρώτη έκθεση, η οποία EVO επάγει την απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές Η446 και H1688 SCLC μέσω της οδού ER στρες. Επιπλέον, δεν έχει υπάρξει προηγούμενη έκθεση ενός φαρμάκου που επάγει ταυτόχρονα διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε κύτταρα μέσω SCLC μιτοχόνδρια μεσολάβηση και ER στρες μονοπάτια. Αναφέρουμε για πρώτη φορά ότι η EVO που προκαλείται G2 /M σύλληψη και την απόπτωση μέσω τόσο των οδών μιτοχόνδρια με τη μεσολάβηση και ER στρες στις κυτταρικές γραμμές Η446 και H1688 SCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1 ένωση

Evodiamine (EVO) αγοράστηκε από Yuancheng Τεχνολογίας Ανάπτυξης Co, Ltd (Wuhan, Κίνα), καθαρότητα 99,13%. EVO διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για την παρασκευή ενός αποθεματικού διαλύματος 40 mM, το οποίο αραιώθηκε με Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Grand Island Biological Company, Grand Island, ΝΥ, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS ) πριν από κάθε πείραμα. Η τελική συγκέντρωση του DMSO δεν ήταν περισσότερο από 0,025% σε αυτή τη μελέτη.

2.2 Cell Culture

Το ανθρώπινο NCI-Η446 και ΝΟΙ-H1688 κυτταρικές σειρές SCLC αγοράστηκαν από την Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα) και η κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), αντίστοιχα. Η446 και H1688 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 IU /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνης (Gibco Co., Grand Island, ΝΥ, USA). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2.

2.3 Κυττάρων Η βιωσιμότητα Δοκιμασίες

Το Η446 ή H1688 κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 96 φρεατίων μικροπλάκες (Corning Incorporated, ΝΥ, USA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 12 ώρες, και το μέσο αντικαταστάθηκε με RPMI 1640 που περιείχε διαφορετικές συγκεντρώσεις του EVO (1,25, 2,5, 5, 10 και 20 μΜ). Μετά το τέλος της καθορισμένης περιόδου επώασης (24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες), το μέσο αλλάχθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 20 μί 5 mg /mL μεθύλιο θειαζολυλ διάλυμα τετραζολίου (ΜΤΤ) (Sigma). Μετά από επώαση για 4 ώρες, το διάλυμα ΜΤΤ αφαιρέθηκε και αντικαταστάθηκε με 150 μL DMSO, και οι μικροπλάκες ανακινήθηκαν για 5 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm με Microplate Multiskan GO Φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, ΜΑ, USA). Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως εξής: Η βιωσιμότητα των κυττάρων (%) = OD

ομάδα δοκιμής /OD

ομάδα ελέγχου χ 100%, όπου OD

ομάδα δοκιμής ήταν η οπτική πυκνότητα (OD) του EVO ή DMSO ομάδα θεραπείας και την ομάδα OD

έλεγχος ήταν η οπτική πυκνότητα του αρνητικού ομάδα ελέγχου. Τα ανεπεξέργαστα Η446 ή κύτταρα H1688 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα αρνητικού ελέγχου. Το

50 τιμή IC αναφέρεται στη συγκέντρωση του φαρμάκου που απαιτείται για να σκοτώσει το 50% των κυττάρων [18]. Οι κυτταρικές βιωσιμότητες διαφορετικών συγκεντρώσεων EVO αναλύθηκαν από OriginPro 7 λογισμικό (OriginLab Corporation, Northampton, ΜΑ, USA), και στη συνέχεια ελήφθησαν οι IC

50 τιμές. Οι μορφολογίες των κυττάρων Η446 που επωάστηκαν με EVO για 24 ώρες έγιναν ορατά κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (ECLIPSE Ti-S, Nikon Instruments Inc., Tokyo, Japan).

Κύκλος

2.4 Κυττάρων και Αναλύσεις απόπτωση

Τα Η446 ή H1688 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 25 cm

2 φιάλες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ EVO για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και trypsinzation, και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη στους 4 ° C για 12 ώρες. Μετά την έκπλυση δύο φορές με διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ένα διάλυμα χρώσης DNA που περιέχει 40 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) και 0.1 mg /mL RNase στους 25 ° C στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με ροή FACSVantage κυτταρόμετρο (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) εφοδιασμένο με λογισμικό CellQuest το [18]. Στη συνέχεια, η κατανομή του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε και αναλύθηκε.

Ποσοτικοποίηση κυττάρων

Τα αποπτωτικά προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα V-FITC Annexin kit /ΡΙ ανίχνευσης απόπτωσης (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Σαγκάη, Κίνα). Η επαγωγή της απόπτωσης ανιχνεύθηκε σε Η446 ή H1688 κυττάρων μετά από 24 ώρες επεξεργασίας με 10 μΜ EVO σύμφωνα με την V FITC-Annexin μέθοδος /ΡΙ χρώση. Τα κύτταρα Η446 παρατηρήθηκαν κάτω από ένα Nikon Eclipse Ti ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού.

2.5 δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS), ενδοκυτταρικού ελεύθερου ασβεστίου (Ca

2+), και δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ψ

m )

ROS, Ca

2+ και ψ

επίπεδα m προσδιορίστηκαν με ροή FACSVantage κυτταρομετρίας χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα τρία φθοριόχρωμες: 2 ‘, 7’-dichlorofluorescin διοξική (DCF-DA) (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Haimen, Jiangshu, Κίνα), Fluo-3 /AM (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Σαγκάη, Κίνα), και JC-1 (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Jiangshu, Κίνα), αντίστοιχα [19]. Εν συντομία, Η446 ή H1688 κύτταρα σπείρονται σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων (Corning ενσωμάτωση, ΝΥ, USA) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ EVO για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ένα διάλυμα χρώσης που περιείχε 10 μΜ DCF-DA (5 μΜ Fluo-3 /ΑΜ ή 5 μg /mL JC-1) στους 37 ° C για 30 λεπτά (45 λεπτά ή 20 λεπτά) και Στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACSVantage κυτταρομετρητή ροής.

2.6 κασπάσης-3, -8 και -9 δραστηριότητα δοκιμασία

Η κασπάσης-3, -8 και -9 επίπεδα δραστηριότητας μετρήθηκαν δοκιμασία δραστηριότητας με τη χρήση κιτ (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Haimen, Jiangsu, Κίνα). Εν συντομία, Η446 ή H1688 κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από επεξεργασία με 10 μΜ EVO για 24 ώρες (48 ώρες ή 72 ώρες). Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS, επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό λύσης (100 μι ανά 2 χ 10

6 κύτταρα), αφέθηκαν επί πάγου για 15 λεπτά και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στα 18.000 χ

g

στο 4 ° C για 10 λεπτά. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων με επώαση ενός μίγματος που αποτελείται από 10 μι του κυτταρικού λύματος, 80 μί ρυθμιστικού αντίδρασης και 10 μL της κασπάσης-3 (-8 ή -9) υπόστρωμα (Ac-DEVD-ρΝΑ) στους 37 ° C για 4 ώρες. Η κασπάση-3 (-8 ή -9) δραστηριότητα στα δείγματα προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα Multiskan GO Microplate Φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ, USA) σε απορρόφηση 405 nm.

2.7 Ανάλυση Western Blot

κυτοχρώματος C (Cyt C), κασπάσης-12, -8, -9 και -3, παράγοντας που σχετίζεται αυτοκτονία (FAS) και παράγοντα νέκρωσης όγκων που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγει συνδέτη (Trail) μετρήθηκαν σε το επίπεδο πρωτεΐνης με κηλίδωση Western. κύτταρα Η446 σε επεξεργασία με 10 μΜ EVO για 48 ώρες συλλέχθηκαν και επωάστηκαν σε δοκιμασία ράδιο ανοσοκαταβύθιση (RIPA) ρυθμιστικού λύσης (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Haimen, Jiangshu, Κίνα) για 60 λεπτά σε πάγο. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 13,000 g για 15 λεπτά, και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στα προϊόντα λύσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad Dye (Bradford) Αντιδραστήριο (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και αποτυπώθηκε επάνω σε μεμβράνες μεταφοράς Immobilon-Ρ (Millipore Corporation, Bedford, ΜΑ, USA).

Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε ρυθμιστικό TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl και 0.05% Tween 20). Cyt C, κασπάσης-12, -8, -9 και -3, Fas και Trail ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα (αντι-cyt C, κασπάσης-12, -8, -9 και -3, Fas και Trail) και δευτεροβάθμια (IgG αίγας αντι-κουνελιού (Η + L), συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας) αντισώματα. Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από το Πεκίνο Βιοσύνθεση Βιοτεχνολογία Co, LTD., Πεκίνο, Κίνα και αραιώνονται 1:200 με 5% αποβουτυρωμένο γάλα TBST (Sigma) πριν από τη χρήση. Η τελική συγκέντρωση των αντισωμάτων ήταν 20 μg /mL. Ομοίως, Cyt C και κασπάσης-12 και -8 μετρήθηκαν σε H1688 κύτταρα κατεργασμένα με EVO για 48 ώρες με κηλίδωση Western.

2.8 Αντίστροφη Μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Σύνολο κυτταρικό RNA από προσφάτως απομονωθέντα κύτταρα Η446 απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ανάστροφη μεταγραφάση (Genecopoeia Inc., Rockville, MD, USA). Το συγκεκριμένο προϊόν γονίδιο ενισχύθηκε με PCR με Taq DNA πολυμεράση (Fermentas, Waltham, ΜΑ, USA). Τα σετ εκκινητών για την PCR ήταν οι εξής:

Bax αίσθηση σκέλος: 5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3 ‘?

Bax αντινοηματικός κλώνος: 5′-CCAGCCTTGAGCACCAGTTT-3′.

Bcl-2 αίσθηση σκέλος: 5′-ACTTCGCCGAGATGTCCAGC-3 ‘?

Bcl-2 αντιπληροφοριακό σκέλος: 5′-GCACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3′?

2.9 Στατιστική Ανάλυση

Κάθε πείραμα σε αυτή τη μελέτη επαναλήφθηκε 3 φορές. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD) εκτός αν δηλώνεται διαφορετικά. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του στατιστικού πακέτου για τις Κοινωνικές Επιστήμες (έκδοση 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των πειραματικών ομάδων. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

3.1 ανασταλτική δράση της Evodiamine για την ανάπτυξη των κυττάρων

Οι ανασταλτικές επιδράσεις της EVO για ανθρώπινο αυξήσεις των κυττάρων SCLC Η446 και H1688 αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ κυτταροτοξικότητας. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, EVO ανέστειλε ανθρώπινη αυξητική SCLC Η446 σε μία δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Το ποσοστό βιωσιμότητας του Η446 κύτταρα επεξεργασμένα με 10 μΜ EVO για 24 h (~66%) μειώθηκαν κατά -16% σε σχέση με εκείνη για κύτταρα κατεργασμένα με 1,25 μΜ EVO (-82%). Το ποσοστό βιωσιμότητας του Η446 κύτταρα επεξεργασμένα με 10 μΜ EVO για 72 ώρες (-35%) μειώθηκαν κατά ~ 22% σε σύγκριση με εκείνη για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 1.25 μΜ EVO (-57%). Το IC

50 τιμές για EVO επεξεργασμένα Η446 κυττάρων για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες ήταν & gt? 20 μΜ, 18.07 μΜ και 1,80 μΜ, αντίστοιχα

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. . Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (η = 3). *

P

& lt? 0,05 έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων. Τα ανεπεξέργαστα Η446 ή κύτταρα H1688 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα αρνητικού ελέγχου. Η ομάδα 0 μΜ EVO περιείχε 0,025% DMSO. Το DMSO 0,025% χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή 20 μΜ EVO (η μέγιστη συγκέντρωση του διαλύματος EVO στη μελέτη). *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη EVO ομάδα αγωγής στις 24 ώρες.

#

P

& lt?.. 0.05, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες EVO ομάδα αγωγής στις 48 ώρες

Η

EVO ανέστειλε την ανθρώπινη ανάπτυξη των κυττάρων SCLC H1688 σε έναν ελαφρώς διαφορετικό τρόπο (Εικόνα 1Β ): (1) EVO ανέστειλε ανθρώπινο κυτταρική ανάπτυξη SCLC H1688 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μέσα σε 72 ώρες. Τα ποσοστά βιωσιμότητας H1688 κύτταρα επεξεργασμένα με 10 μΜ EVO (~49% στις 24 ώρες, ~ 33% στις 48 ώρες και -30% σε 72 ώρες, αντίστοιχα) μειώθηκε κατά ~ 19%, 19% και 21% σε σύγκριση με εκείνη που έλαβαν με 1,25 μΜ EVO (~68% για 24 ώρες, ~52% για 48 ώρες και ~51% για 72 ώρες, αντίστοιχα). (2) EVO ανέστειλε H1688 ανάπτυξης σε μια χρονο-εξαρτώμενο τρόπο σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 1,25 μΜ έως 10 μΜ εντός 48 h και σε μια συγκέντρωση 20 μΜ μέσα σε 72 ώρες. (3) Τα ποσοστά αναστολής μετά την κατεργασία για 48 ώρες ήταν σχεδόν τα ίδια με αυτά μετά από 72 ώρες της θεραπείας με EVO σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 1,25 μΜ έως 10 μΜ. (4) Το IC

50 τιμές του EVO σε H1688 κύτταρα μειώθηκαν από 8,14 μΜ (στις 24 ώρες) για να 2.08 μΜ (στις 48 ώρες) ή 1,37 μΜ (σε 72 ώρες).

Μετά την κατεργασία με 10 μΜ EVO, τα ποσοστά βιωσιμότητας Η446 ή H1688 κύτταρα ήταν ~66% ή ~49% (24 ώρες), ~56% ή ~ 33% (48 ώρες), και 35% ή περίπου 30% (72 ώρες), αντίστοιχα . Λόγω της προφανούς ανασταλτική επίδραση του 10 μΜ EVO επί Η446 ή H1688 κύτταρα, το ενδιάμεσο δόση EVO (δηλαδή, 10 μΜ) επιλέχθηκε για να χρησιμοποιηθεί σε όλες τις ακόλουθες δοκιμές, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Το Σχ. 1C έδειξαν ότι τα μορφολογίες των κυττάρων Η446 σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις EVO επί 24 ώρες μεταβλήθηκε σημαντικά. Όταν αυξάνεται η συγκέντρωση EVO, περισσότερα κύτταρα Η446 έγινε γύρο και αποσπάται από την πλάκα καλλιέργειας ως ψευδοπόδια τους σταδιακά αποσύρεται. EVO ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Η446 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, εκτός του ότι τα κύτταρα Η446 σε επεξεργασία με EVO στα 5 μΜ, 10 μΜ ή 20 μΜ για 24 ώρες είχε παρόμοια αποτελέσματα κυτταροτοξικότητας.

Στο σύνολό τους, το φυσικό φυτικό συστατικό EVO ανέστειλε σημαντικά τις βιωσιμότητες των κυττάρων Η446 και H1688 SCLC στη δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τρόπους.

3.2 Επιπτώσεις της Evodiamine στις κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

για να εξετάσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου ήταν υπεύθυνη για το EVO μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, μελετήσαμε την κατανομή του κυτταρικού κύκλου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και 2Β, EVO συνελήφθη επιλεκτικά το κυτταρικό κύκλο στο G2 φάση /Μ (δηλαδή, η προ-μιτωτική /μιτωτική φάση). Μετά την επεξεργασία με 10 μΜ EVO για 24 ώρες, ο αριθμός των EVO επεξεργασμένου Η446 ή H1688 κυττάρων σε G2 /M (~ 63% ή -50%) ήταν περίπου 5 φορές ή 2,5 φορές εκείνη των μη κατεργασμένων κυττάρων (μάρτυρα αναφοράς , ~ 13% ή 20%). Εν τω μεταξύ, οι αριθμοί (-31% ή -29%) των EVO επεξεργασμένου Η446 ή H1688 κυττάρων σε φάση S (φάση σύνθεσης κατά την οποία αναπαράγονται τα χρωμοσώματα) ήταν σχεδόν τα ίδια με εκείνα των μη επεξεργασμένων κυττάρων (-30% ή -29%).

κυτταρικού κύκλου ανιχνεύεται με δοκιμασία PI. Η απόπτωση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία διπλή χρώση αννεξίνης V /PI. Τα κύτταρα Η446 βάφονται με Annexin V /PI παρατηρήθηκαν κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (η = 3). *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου. Τα ανεπεξέργαστα Η446 ή H1688 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα αρνητικού ελέγχου.

Η

Η απόπτωση είναι επίσης αναφέρεται ως κυτταρική αυτοκτονία ή προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Για να προσδιορίσετε αν EVO απόπτωση που επάγεται από το SCLC Η446 και H1688 κυττάρων, τα ποσοστά απόπτωσης ανιχνεύθηκαν με διπλή χρώση αννεξίνης V-FITC /PI. Μετά τη θεραπεία με EVO για 24 ώρες, όπως υποδεικνύεται στο Σχ. 2C και 2D, το ποσοστό απόπτωσης του EVO επεξεργασμένου Η446 (-15%) ή H1688 (~ 11%) των κυττάρων ήταν πολύ υψηλότερη από εκείνη των μη κατεργασμένων κυττάρων (τυφλός μάρτυρας, περίπου 5% ή ~ 4%)? όπως φαίνεται στο Σχ. 2Ε, τυπικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης, όπως η συμπύκνωση της χρωματίνης και της περιθωριοποίησης, της πυρηνικής κατακερματισμού και σχηματισμό αποπτωτικών σώμα, παρατηρήθηκαν σε EVO-θεραπεία Η446 κύτταρα. Εν ολίγοις, EVO επάγεται σημαντικά την απόπτωση τόσο H446 και H1688 κυττάρων. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι σε προκαταρκτικά πειράματα μας, αξιολόγησε τα αποπτωτικά αποτελέσματα χαμηλότερων δόσεων EVO (όπως 1,25 μΜ και 2,5 μΜ). Τα ποσοστά απόπτωση κυττάρων SCLC Η446 σε επεξεργασία με 1,25 μΜ EVO ή 2,5 μΜ EVO ήταν σχεδόν τα ίδια με εκείνα των αντίστοιχων κενό ελέγχους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

3.3 Επιδράσεις Evodiamine επί ROS, Ca

2+ και ψ

m επίπεδα

το ROS, Ca

2+ και ψ

επίπεδα m ήταν κρίσιμοι παράγοντες υποδηλώνουν την πιθανή ενεργοποίηση των μονοπατιών της απόπτωσης. Οι περισσότεροι ROS είναι ελεύθερες ρίζες που προκαλούν DNA, πρωτεϊνών και βλάβη βιομεμβράνης [18]. Ενδοκυττάριο ασβέστιο είναι ένας κύριες ενδοκυτταρικές παράγοντας σηματοδότησης. Ψ

m είναι ένας βασικός δείκτης για την υγεία των κυττάρων, επειδή είναι σχετικές με την ικανότητα ATP γενιά των κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, ο ROS, Ca

2+ και ψ

m μετρήθηκαν με φθορίζοντες ανιχνευτές χρησιμοποιώντας ένα ροής FACSVantage κυτταρόμετρο [18]. Μετά τη θεραπεία με EVO για 24 ώρες, σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου, (1) τα επίπεδα ROS σε EVO επεξεργασμένα SCLC Η446 κυττάρων αυξήθηκε κατά περισσότερο από το ένα τέταρτο (~ 28%), και σε H1688 κύτταρα, τα επίπεδα πάνω από ROS διπλασιάστηκαν (-104%) (Σχ 3Α και 3Β.)? (2) η ενδοκυτταρική Ca

2+ επίπεδα τόσο στα κύτταρα Η446 και H1688 αυξήθηκε κατά το ήμισυ (~51% ή -48%) (Σχ 3C και 3D.)? (3), ο ψ

επίπεδα m μειώθηκε σχεδόν κατά το ένα τρίτο (~32%) και από το ένα έβδομο (~ 14%) στην Η446 και H1688 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχ. 3Ε και 3F). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η EVO αύξησε τα επίπεδα ROS σε SCLC κύτταρα. Περίσσεια ROS όχι μόνο καταστραφεί το DNA, αλλά κατεστραμμένο και την μιτοχονδριακή μεμβράνη και αυξημένη διαπερατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Πιο ασβέστιο απελευθερώθηκε από τα μιτοχόνδρια και μπήκε στο κυτταρόπλασμα. Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου αυξήθηκε, και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης μερικώς αποπολωμένο. EVO απόπτωση που επάγεται στα δύο κύτταρα SCLC Η446 και H1688 μέσω του ROS μεσολάβηση μιτοχονδριακό μονοπάτι.

ROS, Ca

2+ και ψ

m χωριστά ανιχνεύεται από DCF-DA, Fluo-3 /AM και JC-1 προσδιορισμούς. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (η = 3). Τα ανεπεξέργαστα Η446 ή κύτταρα H1688 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα αρνητικού ελέγχου. *

P

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου

Η

3.4 Επιπτώσεις της Evodiamine για κασπάσης-8, -9 και -3 Δραστηριότητα Δοκιμασία

Οι κασπάσες είναι πρωτεολυτικά ένζυμα που είναι κρίσιμες μεσολαβητές απόπτωσης. Οι δραστηριότητες της κασπάσης-8, -9 και -3 προσδιορίστηκαν με φασματοφωτομετρία. Σε σύγκριση με τις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου, σημαντικές αυξήσεις στις δραστηριότητες της κασπάσης-8, -9 και -3 βρέθηκαν στα κύτταρα Η446 σε επεξεργασία με 10 μΜ EVO για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες, με την εξαίρεση της αύξησης της κασπάσης -8 δραστηριότητα σε EVO-επεξεργασμένα κύτταρα μετά από 24 ώρες, η οποία δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Τα υψηλότερα επίπεδα της κασπάσης-8 (~213%, Σχ. 4Α) και δραστικότητα κασπάσης-9 (~ 240%, Εικ. 4Β) παρατηρήθηκαν μετά από θεραπεία με EVO για 48 ώρες, ενώ το υψηλότερο επίπεδο δραστικότητας κασπάσης-3 ( ~564%) παρατηρήθηκε στις 24 ώρες (Σχ. 4C). Ωστόσο, τα υψηλότερα κασπάσης-8 και -9 δραστηριότητες ήταν ακόμη χαμηλότερος από τη δράση της κασπάσης-3 (~278%) σε EVO-κατεργασμένων κυττάρων στις 48 ώρες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η EVO απόπτωση που επάγεται μέσω της κασπάσης-dependent pathways.

Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν από μία χρωματομετρική ανίχνευση του Ac-DEVD-ρΝΑ. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (η = 3). δραστηριότητες της κασπάσης δόθηκαν ως αυθαίρετες μονάδες (AU) ανά mg πρωτεΐνης. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα Η446 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα αρνητικού ελέγχου. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου.

#

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με αντίστοιχες EVO ομάδα αγωγής στις 24 ώρες.

P

& lt?. 0,05, σε σύγκριση με αντίστοιχες EVO ομάδα αγωγής στις 48 ώρες

Η

3.5 Επιδράσεις Evodiamine στο Protein Expression του Cyt C, κασπάση-12, – 8, -9 και -3, Fas και Trail

Cyt C είναι μία μιτοχονδριακή πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην έναρξη των μιτοχονδρίων-απόπτωση. Οι κασπάσες είναι πρωτεάσες κυστεΐνης-ασπαρτικού οξέος που είναι απαραίτητα για την απόπτωση. Η κασπάση-12 εντοπίζεται στο ER και εμπλέκονται στην ER-απόπτωση. Η κασπάση-8 διαμεσολαβεί τη μεταγωγή σήματος καθοδικά υποδοχέων θανάτου (DR) που βρίσκεται στην πλασματική μεμβράνη και συνεπώς εμπλέκεται σε DR-απόπτωση. Η αλληλεπίδραση των DR με φυσικούς συνδετήρες του (όπως FasL και Trail) επάγει την ενεργοποίηση της κασπάσης-8. Κασπάση-9 είναι μία πρωτεάση ασπαρτικού οξέος-ειδική. Caspase-3 είναι ένα κασπάσης δήμιος υπεύθυνη για συμπύκνωση χρωματίνης και κατάτμηση του DNA σε απόπτωση. Cyt C και κασπάσης-12 και -8 πυροδοτούν την ενεργοποίηση της κασπάσης 9 (εκκινητή κασπάσης) και κασπάσης-3 (caspase τελεστή), πριν τελικά επάγεται απόπτωση.

Για EVO-αγωγή Η446 ή H1688 κυττάρων, σε σύγκριση με αντίστοιχες ομάδες ελέγχου τους (το επίπεδο ορίστηκε ως 100% σε κάθε ένα από τους ελέγχους), (1), η πρωτεΐνη επίπεδα έκφρασης του Cyt C αυξήθηκαν σημαντικά κατά -220% και ~367% (βλέπε Σχ. 5Α και 5Β), αντίστοιχα , (2) η έκφραση της πρωτεΐνης επίπεδα της κασπάσης-12 αυξήθηκαν σημαντικά κατά ~248% και ~190% (βλέπε Σχ. 5C και 5D), αντίστοιχα, και (3), η έκφραση της πρωτεΐνης επίπεδα της κασπάσης-8 ήταν σχεδόν αμετάβλητα ( περίπου 94% και ~112%, αντίστοιχα) (βλ. Σχήμα 5Ε και 5F). Περαιτέρω έρευνα των κυττάρων Η446 που έλαβαν θεραπεία με EVO αποκάλυψε ότι η σημαντική αύξηση του επιπέδου της Cyt C οδήγησε σε αυξημένη κασπάσης-9 και -3 έκφραση με ~275% και 204%, αντιστοίχως (βλέπε Εικ. 5G και 5Η). Επιπλέον, FasL και Trail, τα οποία είναι κασπάσης-8 ενεργοποιητές, δεν ήταν αμετάβλητος (~102% και ~105%, αντίστοιχα) (βλέπε Σχ. 5Θ και 5J). Τα αποτελέσματα κηλίδος Western πρότεινε ότι EVO αύξησε το Cyt C και κασπάσης-12 επίπεδα και στις δύο κύτταρα Η446 και H1688 SCLC, έτσι EVO επαγόμενη απόπτωση τόσο μέσω του mitochondria- και ER-μεσολάβηση μονοπάτια. Περαιτέρω, η αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης της κασπάσης-9 και -3 έδειξαν ότι EVO απόπτωση που επάγεται μέσω ενός κασπάσης-3-εξαρτώμενη οδό. Σε αντίθετη περίπτωση, η EVO δεν είχε καμία επίδραση επί της πρωτεΐνης έκφραση της κασπάσης-8 σε κύτταρα είτε Η446 ή H1688 SCLC, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν διεγείρουν απόπτωση μέσω ενός DR-παθολογική οδό.

Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με στύπωμα Western . Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (η = 3). Τα ανεπεξέργαστα Η446 ή κύτταρα H1688 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα αρνητικού ελέγχου. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου. Fas: παράγοντας που σχετίζεται αυτοκτονία? Trail: παράγοντας νέκρωσης όγκων που σχετίζονται με την απόπτωση που επάγει συνδέτη? Cyt ο: κυτοχρώματος C.

Η

3.6 Επιδράσεις Evodiamine επί της έκφρασης mRNA του Βαχ και Bcl-2

ΒΑΧ είναι επίσης γνωστή ως Bcl-2 πρωτεΐνη που μοιάζει 4 ή Bcl- 2-συνδέονται Χ? Bcl-2 αντιπροσωπεύει λεμφώματος Β-κυττάρου 2. Βαχ προάγει την απόπτωση με ανταγωνισμό Bcl-2, το οποίο είναι ειδικά θεωρείται ένα σημαντικό αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη. Ταυτόχρονα, ΒΑΧ και Bcl-2 είναι ξεχωριστά κωδικοποιούνται από τα γονίδια ΒΑΧ και Bcl-2. Εδώ, τα επίπεδα έκφρασης του Βαχ και Bcl-2 γονιδίων προσδιορίστηκαν με RT-PCR. Σε σχέση με τους αντίστοιχους ελέγχους τους (1), το mRNA επίπεδα έκφρασης του Βαχ σε Η446 ή H1688 κύτταρα κατεργασμένα με EVO αυξήθηκαν σημαντικά κατά ~215% ή ~135% (στις 24 ώρες), ~397% ή ~172% (στα 48 h) και ~514% ή ~185% (σε 72 ώρες), αντίστοιχα (Σχ. 6Α και 6Β). (2) Αντιθέτως, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του Bcl-2 σε EVO επεξεργασμένου Η446 ή H1688 κύτταρα ήταν σημαντικά μειώθηκε κατά περίπου 10% ή ~ 11% (στις 24 ώρες), ~ 60% ή ~ 28% (στα 48 h), και ~66% ή ~53% (σε 72 ώρες), αντιστοίχως (Εικ. 6C και 6D). Στο σύνολό τους, EVO αύξησε την αναλογία του Βαχ /Bcl-2 στο μεταγραφικό επίπεδο, η οποία αναμένεται να αυξηθεί ακόμη περισσότερο το ποσοστό του Βαχ /Bcl-2 στο επίπεδο της πρωτεΐνης και τελικά την προώθηση της απόπτωσης.

κυτταρολύματα ήταν αναλύθηκαν με RT-PCR. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (η = 3). Τα ανεπεξέργαστα Η446 ή κύτταρα H1688 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα αρνητικού ελέγχου. *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου.

#

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με αντίστοιχες EVO ομάδα αγωγής στις 24 ώρες.

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη EVO ομάδα αγωγής στις 48 ώρες

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε για πρώτη φορά. ότι η EVO αναστέλλει σημαντικά τη βιωσιμότητα των SCLC κυττάρων. Το IC

50 αξίες της EVO στα κύτταρα Η446 μειώθηκε από & gt? 20 μΜ (24 ώρες) με 18.07 μΜ (48 ώρες) ή 1,80 μΜ (72 ώρες)? και σε H1688 κύτταρα, το IC

50 μειώθηκε από 8,14 μΜ (24 h) έως 2,08 μΜ (48 ώρες) ή 1,37 μΜ (72 h). EVO ασκείται ανασταλτικές επιδράσεις σε κύτταρα Η446 και H1688 σε συγκέντρωση και το χρόνο που εξαρτάται από τρόπους. Είχε προηγουμένως τεκμηριωθεί ότι το IC

50 αξίες της EVO σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC ήταν 12 μΜ (48 h, Η460 κύτταρα) [13], 13,2 μΜ (72 ώρες, (R) -EVO, Η460 κύτταρα) [12] , 2,6 μΜ (72 h, (S) -EVO, Η460 κύτταρα) [12], και 100 μΜ (72 ώρες, τα κύτταρα Α549) [9]. Εν ολίγοις, EVO παρουσίασαν αντικαρκινική δράση σε SCLC, εκτός από τα κύτταρα NSCLC. Επιπλέον, στις περισσότερες περιπτώσεις, EVO ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων Η446 SCLC πιο αποτελεσματικά από ότι κύτταρα Η460 και Α549 NSCLC.

Η έρευνα της κατανομής του κυτταρικού κύκλου απέδειξε ότι η διάσπαση του κυτταρικού κύκλου ήταν υπεύθυνη για Πό- ντου μεσολαβεί αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης. Ο αριθμός των κυττάρων Η446 και H1688 στη φάση S ήταν σχεδόν αμετάβλητο μετά τη θεραπεία EVO σύγκριση με τον έλεγχο. Ωστόσο, EVO πυροδότησε μια σύλληψη σε φάση G2 /M, δηλαδή, EVO-αντιμετωπίζονται Η446 και H1688 κύτταρα συσσωρεύονται στο G2 /M φάση. Μια σύλληψη των κυττάρων σε G2 /M φάση σε απόκριση σε γενοτοξικό στρες (όπως το οξειδωτικό στρες και DNA παρεμβαλλόμενοι παράγοντες) μπορεί να προκαλεί βλάβη στο DNA τόσο σε ρ53-εξαρτώμενη (μέσω ROS) [20] και p53-ανεξάρτητο τρόπο [21].

τεκμηριωθεί προηγουμένως ότι EVO επαγόμενη απόπτωση σε διαφορετικά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μέσω διαφορετικών οδών. Για παράδειγμα, σε NSCLC Η1299 κύτταρα απόπτωση που επάγεται μέσω της καταστολής του πυρηνικού παράγοντα (NF) -κB μονοπάτι ενεργοποίησης [10]? και σε παγκρεατικά κύτταρα SW1990, απόπτωση επήχθη μέσω ρύθμιση του μονοπατιού ΡΙ3 K /Akt [22], σε 253J και Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα, η απόπτωση που επάγεται μέσω mTOR /S6K1 μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση του Mcl-1 [8]. επαγωγή απόπτωσης από EVO στα κύτταρα Η446 ή H1688 SCLC χαρακτηρίζεται από διπλή χρώση αννεξίνης V-FITC /PI, και μορφολογικές αλλαγές ήταν εμφανείς σε Η446 κύτταρα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η σύλληψη του G2 /M κυττάρων φάση κύκλου σταμάτησε την ανάπτυξη των κυττάρων Η446 και H1688 και τελικά οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο με απόπτωση μέσω δύο εγγενείς κασπάσης-dependent pathways, αλλά όχι μέσω της εξωγενούς κασπάσης-εξαρτώμενο μονοπάτι (Σχ . 7):

η

η απόπτωση που προκαλείται μέσω της οδού ενεργοποίησης της κασπάσης μιτοχόνδρια με τη μεσολάβηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η EVO ενεργοποιείται μιτοχονδριακή απόπτωση συνοδεύεται από τη συσσώρευση των ROS. Σε αυτή τη μελέτη, η αλλαγή της μιτοχονδριακής διαπερατότητας της μεμβράνης που προκαλείται από την παραγωγή ROS οδήγησε στην ενεργοποίηση της ενδοκυτταρικής απελευθέρωσης ασβεστίου, η απώλεια του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης, και την επακόλουθη απελευθέρωση του Cyt C. Όντας ένας παράγοντας της απόπτωσης, Cyt C προκάλεσε περαιτέρω την ενεργοποίηση του κασπάσης 9 (κασπάση εκκινητή) που ακολουθείται από την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 (caspase τελεστή), η επαγωγή της διάσπασης της ΡΑΚΡ και η τελική διέγερση απόπτωσης [23]. Xu et al.