Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) θεωρούνται ότι είναι υπεύθυνη για τη ζοφερή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν την απόκτηση και τη διατήρηση των ιδιοτήτων CSC σε καρκινικά κύτταρα λόγω της σπανιότητάς τους σε κλινικά δείγματα. Εμείς εδώ που προκαλείται από τις ιδιότητες CSC στα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ορίζεται παράγοντες. Εμείς ρετροϊό εισήγαγε μια σειρά από καθορισμένους παράγοντες (

OCT3 /4

,

SOX2

και

KLF4

) σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, που ακολουθείται από τον πολιτισμό με τα συμβατικά μέσο που περιέχει ορό , δεν είναι ανθρώπινα μέσο εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν οι ιδιότητες CSC στα κύτταρα. Τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου σε μεταγωγή με τους τρεις παράγοντες έδειξαν σημαντικά βελτιωμένες ιδιότητες CSC όσον αφορά την έκφραση του γονιδίου δείκτη, σφαίρα σχηματισμός, χημειοαντίσταση και ογκογονικότητα. Έχουμε ορίσει τα κύτταρα με ιδιότητες CSC που προκαλείται από τους παράγοντες, ένα υποσύνολο των μετατραπέντων κυττάρων, όπως επάγεται ΚΕΠ (iCSCs). Επιπλέον, έχουμε δημιουργήσει μια νέα τεχνολογία για να απομονώσει και να συλλέγουν τα iCSCs με βάση τις διαφορές στο βαθμό της βελτίωσης δραστηριότητας βαφής-effluxing. Τα ξενομοσχεύματα που προέρχονται από iCSCs μας δεν ήταν τερατώματα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε αντίθεση με τους όγκους από τα γονικά καρκινικά κύτταρα, οι όγκοι ICSC-based μιμήθηκε πραγματική ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου από την άποψη της ανοσοϊστολογικές ευρήματά τους, η οποία έδειξε κολονικής διαφοροποίηση γράμμωσης. Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι οι φαινότυποι των iCSCs μας ήταν αναπαραγώγιμα σε σειριακή πειράματα μεταμόσχευσης. Με την εισαγωγή ορίζεται παράγοντες, δημιουργήσαμε iCSCs με καταγωγή ειδικότητα απευθείας από τα καρκινικά κύτταρα, δεν

μέσω

μια κατάσταση βλαστικών κυττάρων που προκαλείται από πολυδύναμα. Η νέα μέθοδος μας επιτρέπει να αποκτήσουν άφθονα υλικά του ΚΕΠ που όχι μόνο έχουν αυξημένη ογκογονικότητα, αλλά και την ικανότητα να διαφοροποιούνται ανακεφαλαίωσης ένα συγκεκριμένο τύπο καρκινικών ιστών. Η μέθοδός μας μπορεί να έχει μεγάλη αξία να κατανοήσουν πλήρως ΚΕΠ και να αναπτύξουν νέες θεραπείες που στοχεύουν ΚΕΠ

Παράθεση:. Oshima Ν, Yamada Υ, Nagayama S, Kawada Κ, Hasegawa S, Okabe H, et al. (2014) πρόκλησης καρκίνου ιδιότητες βλαστοκυττάρων στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα από καθορισμένους παράγοντες. PLoS ONE 9 (7): e101735. doi: 10.1371 /journal.pone.0101735

Επιμέλεια: Shree Ram Singh, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Φλεβάρη του 2014? Αποδεκτές: 10 Ιούνη 2014? Δημοσιεύθηκε: 9 του Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Oshima et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη κατέστη δυνατή χάρη στο βραβείο Balzan να Shinya Yamanaka (https://www.balzan.org/en/about-us/balzan-prize-milan), και υποστηρίζονται από ταμεία βοήθειας Έρευνα από Shinryokukai Γενική Ένωση Incorporated (https: //www.shinryokukai.com/) (στο TA), το οποίο είναι ένα μη κερδοσκοπικό σωματείο αποφοίτων του Kobe ιατρική σχολή του πανεπιστημίου, καθώς και επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs? http: //www.jsps.go.jp/english/index.html): 10J06242 (σε NO), και ΟΧΙ ήταν JSPs έρευνα υποτρόφων. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου, και αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Οι ανταγωνιστικές ενδιαφέροντα: NO και TA είναι μέλη χωρίς μισθό Shinryoku-Kai Γενική Incorporated σύνδεσης, η οποία είναι ένας μη κερδοσκοπικός σύλλογος αποφοίτων του Πανεπιστημίου Kobe ιατρική σχολή. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Έχουν

Εισαγωγή

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) έχουν προταθεί για να είναι υπεύθυνος για την κακή πρόγνωση των ασθενών με διάφορες μορφές καρκίνου λόγω των χαρακτηριστικών και της συμπεριφοράς τους, όπως υψηλότερα ποσοστά θεραπευτικής αντίστασης και της επανάληψης [1] – [3]. Ως εκ τούτου, οι ΚΕΠ θεωρείται ως πιθανό θεραπευτικό στόχο. Για τη δημιουργία νέων θεραπειών που στοχεύουν ΚΕΠ, είναι σημαντικό για τη διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την απόκτηση των βλαστική ικανότητα στο ΚΕΠ. Ωστόσο, αυτά είναι ακόμα ασαφής, επειδή ΚΕΠ είναι ένα σπάνιο πληθυσμό των κυττάρων στον ιστό του καρκίνου, και η σπανιότητα του ΚΕΠ καθιστά δύσκολο για τον εντοπισμό και τη συγκέντρωσή τους.

Έτσι δημιουργία ΚΕΠ

in vitro

από τα καρκινικά κύτταρα και τη διερεύνηση των χαρακτηριστικών τους θεωρείται ότι είναι μία χρήσιμη μέθοδος για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος. Αρκετές μελέτες [4] – [6] ανέφεραν ότι τα κύτταρα με κάποια ιδιότητες CSC όπως αυξημένη ογκογονικότητα ήταν επαγώγιμος. Ωστόσο, δεν αναφέρονται προς το αν τα κύτταρα έχουν την ικανότητα διαφοροποίησης να ανακεφαλαιώσω συγκεκριμένους τύπους καρκινικών ιστών. Ως εκ τούτου, είναι ακόμα ασαφές αν είναι δυνατό να δημιουργήσει ΚΕΠ που αντιστοιχούν ακριβώς στην πρωτογενή καρκινικά βλαστικά κύτταρα.

Όσον αφορά την απόκτηση βλαστική ικανότητα, στην παραγωγή πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (iPSCs), διαπιστώθηκε ότι η έκτοπη έκφραση μόνο τρεις ή τέσσερις παράγοντες μεταγραφής (

OCT3 /4

,

SOX2

και

KLF4

με ή χωρίς

C-MYC

) μπορεί να προκαλέσει ιδιότητες των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων σε σωματικά κύτταρα, όταν χρησιμοποιούνται συνθήκες καλλιέργειας ESC [7], [8]. Αυτά τα γονίδια μπορούν επίσης να προκαλέσουν άμεσα νευρικών βλαστικών κυττάρων (NSC) ιδιότητες σε σωματικά κύτταρα χρησιμοποιώντας συνθήκες νευρο-σφαίρα καλλιέργεια [9]. Έτσι, αυτά τα γονίδια έχουν την ικανότητα να επάγουν διάφορους τύπους βλαστική ικανότητα σε σωματικά κύτταρα, ανάλογα με τις συνθήκες καλλιέργειας. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι αυτά τα γονίδια μπορεί επίσης να προκαλέσει ιδιότητες CSC σε καρκινικά κύτταρα.

Στην παρούσα μελέτη, μετάγονται

OCT3 /4

,

SOX2

και

KLF4

σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, υπό τους όρους της γονικής κυτταρικής καλλιέργειας και αναλύθηκαν τα μεταχθέντα κύτταρα από την άποψη των ιδιοτήτων τους CSC

in vitro

και

in vivo

. Κατά συνέπεια, το σύνολο των τριών γονιδίων θα μπορούσε να προκαλέσει ιδιότητες CSC σε ένα υποσύνολο των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, και ήμασταν σε θέση να εισπράξει τα κύτταρα με προκαλούμενη ιδιότητες CSC με βάση την διαφορά τους στην βαφή-εκροής δραστηριότητα. Τα συλλεχθέντα κύτταρα έδειξαν παχέος εξειδίκευση καταγωγή

in vitro

και

in vivo

. Οι προκαλείται από ΚΕΠ που παράγεται με τη μέθοδο αυτή μπορεί να βοηθήσει στη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την απόκτηση και τη διατήρηση των ιδιοτήτων CSC στα καρκινικά κύτταρα και να αναπτύξουν θεραπεία CSC-στόχευση.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και Cell Culture

Ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές (SW480 και DLD-1) προμηθεύτηκαν από το κινητό Resource Center Ιατροβιολογικών Ερευνών, Πανεπιστήμιο Tohoku. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Life Technologies, Carlsbad CA, USA) και πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) (Life Technologies), και χρησιμοποιήθηκε σε πρώιμο πέρασμα για τα πειράματα.

απομόνωση RNA και ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης αντίδραση αλύσου πολυμεράσης

το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Plus Kit ( QIAGEN, Hilden, Γερμανία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα κλάσμα 1 μα ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με τη χρήση ενός Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche, Βασιλεία, Ελβετία), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Ποσοτική αντίστροφης μεταγραφάσης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε με την καθολική FastStart SYBR Green Master Mix (Roche) και αναλύθηκε με το σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο Βήμα-One (Life Technologies). Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνεται στον Πίνακα S1

Κυτταρομετρίας Ροής

Ένα εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων από καλλιεργημένα κύτταρα ανοσοχρώση με ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ποντικού CD133 (Κλώνος:. AC133, Miltenyi Biotec, Auburn CA , USA), αντι-ανθρώπινο αντίσωμα CD44 ποντικού (κλώνος: G44-26, Becton, Dickinson and Company [BD], Franklin Lakes NJ, USA) ή αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ABCG2 ποντικού (κλώνος: 5D3, BioLegend, San Diego CA, ΗΠΑ). Αφού πλυθεί, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν με PBS που περιέχει 2% FBS, και τα νεκρά κύτταρα σημάνθηκαν με 2 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ, Sigma-Aldrich, St. Louis ΜΟ, USA). Ενιαία αιωρήματα κυττάρων από κύτταρα παραφορμαλδεΰδη στερεωμένα ήταν διαπερατά με 0,2% Triton-X (Sigma), και ανοσοχρωματίστηκαν με ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ποντικού CD26 (Κλώνος: M-A261, BD) και αντι-ανθρώπινο LGR5 κουνέλι (Κλώνος: EPR3065Y , Abcam, Cambridge MA, USA). Σε όλες της κυτταρομετρίας ροής πειράματα (FCM), ισότυπο αντισώματα που αντιστοιχούν σε κάθε αντίσωμα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι. Τα δείγματα αναλύθηκαν με μέσο FACS Aria II (BD).

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν με την M-PER θηλαστικών Πρωτεΐνη αντιδραστήρια εκχύλισης (Thermo Fisher Scientific, Rockford IL, USA ). Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Μετά την ηλεκτροφορητική μεταφορά των πρωτεϊνών, ανοσοαποτύπωση με ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ΑΙ_ϋΗ ποντικού (Κλώνος: 44 /ΑΙ_ϋΗ, BD), που ακολουθείται από ένα δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας, διεξήχθη. Για να προσδιοριστεί η χημική φωταύγεια, το σύστημα LAS 4000 (Fuji Film, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκε.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση

Τα κύτταρα στερεώθηκαν με 70% αιθανόλη σε PBS στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ριβονουκλεάση να αφομοιώσουν το RNA και χρωματίστηκαν με 50 μg /ml ΡΙ. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACS Aria II).

5-FU-χημειοαντίσταση ανάλυση

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 5-φθοριοουρακίλη (5-FU, η Kyowa Kirin, Tokyo, Japan) έκθεση μετρήθηκε με την χρωματομετρική δοκιμασία WST-8 (Cell Μετρώντας Kit-8, Dojindo, Kumamoto, Japan). Ένα σύνολο 5 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων την ημέρα 10, και το μέσο αντικαταστάθηκε με ϋΜΕΜ που περιέχει 1 ή 50 μg /ml 5-FU 24 ώρες μετά την σπορά. Μετά από επώαση για 48 ώρες, η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας μικροτίτλου. Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε ως ο λόγος των τιμών απορρόφησης για το ίδιο δείγμα επωάζονται σε DMEM χωρίς 5-FU για 48 ώρες.

Σφαίρα Δοκιμασία Σχηματισμού

Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε πλάκες Ultra Low Συνημμένο (Corning Incorporated, Corning, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) σε ελεύθερο ορού ϋΜΕΜ που περιείχε 10 ng /ml bFGF (Wako, Osaka, Japan), 10 μg /ml ανθρώπινη ινσουλίνη (CSTI, Miyagi, Ιαπωνία), 100 μg /ml ανθρώπινης τρανσφερίνης (Roche) και 100 μg /ml BSA (Nacalai Tesque), και επωάστηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 επωαστήρα επί 10 ημέρες.

Dye εκροής Ανάλυση δραστηριότητας

Μια ανάλυση δραστηριότητα βαφή εκροή διεξήχθη σύμφωνα με προηγουμένως περιγραφείσες μεθόδους [10] – [12] με κάποιες τροποποιήσεις. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 2% FBS και 1 mM HEPES (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 2% FBS και 1 mM HEPES με Hoechst33342 (ϋίβ Technologies) στα 5 μg /ml, με ή χωρίς την συν-χορήγηση της βεραπαμίλης (Sigma-Aldrich) σε 50 ή 250 μΜ για 90 λεπτά στους 37 ° C, και ήπια ανεστραμμένη κάθε 30 λεπτά. Μετά την επώαση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε 2% FBS και 1 mM HEPES (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με 2 μg /ml ΡΙ για την επισήμανση νεκρά κύτταρα, και διήλθαν μέσω ενός φίλτρου πλέγματος 35 μm, διατηρώντας τα σε πάγο για την κυτταρομετρία ροής και τη διαλογή. Τα κύτταρα αναλύονται και ταξινομούνται με FACS Aria II. Η βαφή Hoechst διεγέρθηκε με ένα λέιζερ υπεριώδους (355 nm), και ο φθορισμός μετρήθηκε τόσο με ένα 670/50 φίλτρο (Hoechst Κόκκινο) και 450/50 φίλτρο (Hoechst μπλε).

In Vivo Ογκογονικότητα Μελέτη

Ένα σύνολο 1 × 10

6, 3 × 10

5 ή 1 × 10

5 κύτταρα σε 100 μΙ ορού PBS χωρίς ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές της ραχιαίας μια ανοσοανεπάρκεια γυμνό ποντίκι (KSN /Slc ποντίκι, SLC, Shizuoka, Ιαπωνία). Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο 0.5 × L × W

2 (L: μήκος, W: πλάτος). Τα πειράματα ελεγχθεί και εγκριθεί από την Ηθική και την Επιτροπή Ερευνών των Ζώων, Πανεπιστήμιο του Κιότο (Αριθμός Άδειας: 11537, 12237, 13217), και διεξάγεται σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος. Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Serial Μεταμόσχευση

Για τις σειριακές πειράματα μεταμόσχευσης, ταξινομημένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για εννέα-16 ημέρες (πρώτος πολιτισμός) μετά τη διαλογή, τότε συνολικά 3 × 10

6 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε ανοσοανεπαρκείς γυμνούς ποντικούς. Οι όγκοι (πρώτη όγκους) αποκόπηκαν όταν έφτασαν μία διάμετρο μεγαλύτερη των 10 mm και ήταν παθολογικά αναλύθηκαν. Οι όγκοι αποκόπηκαν επίσης ενζυματικώς διαχωρίστηκαν σε μονοκύτταρους αιωρημάτων από ένα gentleMACS διαστάσεως και ανθρώπινα καρκινικά διαστάσεως Kit (Miltenyi Biotec), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Τα διαχωρισμένα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς μετά από καλλιεργήθηκαν για έξι έως δέκα ημέρες (δεύτερη καλλιέργεια), και αναλύθηκαν με FCM με βάση τη δραστηριότητα εκροής βαφή τους στις ημέρες έξι έως δώδεκα μετά την διάσπαση. Η διαδικασία επαναλήφθηκε τρεις φορές μέχρις ότου ελήφθησαν τα τέταρτος καλλιεργημένα κύτταρα από τη διάσταση του τρίτου σετ των όγκων.

Ανοσοϊστοχημεία

φορμαλίνη σταθερό, εγκλεισμένα σε παραφίνη τομές που προέρχονται από τα ξενομοσχεύματα βάφτηκαν με αντι-ανθρώπινο κυτοκερατίνης 20 μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (ΟΚ20) (κλώνος: Ks20.8, 1:25 αραίωση, Dako, Glostrup, Denmark), αντι-ανθρώπινο cytokeratin 7 (CK7) μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (κλώνος: SP52, συγκέντρωση? 0.536 μg /ml, Roche) ή αντι-ανθρώπου τύπου ουραία ομοιοακολουθίας 2 (CDX2) μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (κλώνος: AMT28, αραίωση 1:500, Leica Biosystems, Wetzlar, Γερμανία) με τη μέθοδο ανοσοϋπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτίνης. ανάκτηση αντιγόνου μικροκυμάτων έγινε. Για ανοσοκυτταροχημεία, τα καλλιεργημένα κύτταρα, τα οποία σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με αντι-ΟΚ20 αντίσωμα (Κλώνος: Ks20.8, αραίωση 1:100) ή αντίσωμα αντι-CDX2 (Κλώνος: CDX2-88, προαραιωμένο, Abcam) , και αντίθετα με Hoechst33342 (Τεχνολογίες ζωής) για τον εντοπισμό όλων των πυρήνων.

Αποτελέσματα

Η μεταγωγή του

OCT3 /4

,

SOX2

και

KLF4

σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή

μετάγονται

OCT3 /4, SOX2, KLF4

, ή ένα μίγμα των τριών (εφεξής, ΟΣΚ) στο κύτταρο καρκίνου του κόλου SW480 ανθρώπινα line χρησιμοποιώντας ρετροϊού [7] (βλέπε Methods S1), καθώς επίσης και ένα Mock διάνυσμα (κενός φορέας) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια ονομάζονται O-SW480, S-SW480, Κ-SW480, SW480 OSK-και Μ-SW480, αντίστοιχα. Τα γονικά κύτταρα επίσης ονομάζονται WT-SW480. Σε αυτή τη μελέτη, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS και αξιολογήθηκαν την ημέρα 10 μετά την μεταγωγή (Εικ. S1 Α). Επιβεβαιώσαμε ρετροϊική μεταγωγή και έκφραση του mRNA του σε μεταγωγή γονιδίων (Σχ. S1B και S1c). Στα κύτταρα Μ-SW480,

KLF4

ήταν ενδογενώς εκφράζονται, ενώ

OCT3 /4

και

SOX2

δεν ανιχνεύθηκαν. Διακρίνονται μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν σε κάθε μία από τις γραμμές που αποδόθηκαν σε μεταγωγή γονιδίου (ων) τους (Σχ. S1D).

Έκφραση προηγουμένως αναφερθεί δείκτες που σχετίζονται με την ΚΕΠ κόλον και εντερικό βλαστικά κύτταρα σε μεταχθέντα-SW480 κύτταρα

Για να εκτιμηθεί η κατάσταση των βλαστικών κυττάρων των μετατραπέντων κυττάρων, αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του προηγουμένως αναφερθεί υποψήφια γονίδια-δείκτες, αν και διαμάχη [13], [14], του ΚΕΠ παχέος εντέρου και εντερική βλαστικών κυττάρων, όπως όπως

CD133

[15], [16],

CD44

[17], [18],

CD26

[19],

ΑΙ_ϋΗ1

[ ,,,0],20],

ABCG2

[21] και

LGR5

[22] από qRT-PCR (Σχ. 1Α). Μεταξύ των κυτταρικών γραμμών, μόνο τα κύτταρα OSK-SW480 είχαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του mRNA όλων των γονιδίων σε σύγκριση με κύτταρα Μ-SW480 (n = 3).

(Α) qRT-PCR έχουν αναφερθεί στο παρελθόν δεικτών σχετικών να ΚΕΠ κόλον και εντερικό βλαστικά κύτταρα στα μεταγόμενα SW480 κυττάρων. Όλοι οι δείκτες ήταν υπερεκφράζεται στα κύτταρα OSK-SW480. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA κανονικοποιήθηκαν με εκείνα του

GAPDH

. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με εκείνες του M-SW480 απεικονίζεται. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης δεικτών CSC στα μεταγόμενα κύτταρα SW480 όπως προσδιορίζεται με μια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FCM). Τα δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα έδειξαν ότι οι αριθμοί των CD133-, CD44-υψηλής, CD26- και ABCG2-θετικών κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένα στα κύτταρα OSK-SW480. Οι αντιπροσωπευτικές διαγράμματα στιγμών κάθε δείκτη που φαίνεται στο Σχήμα S2. (Γ) Η πρωτεΐνη έκφραση των ΑΙ_ϋΗ1 στα μεταγόμενα κύτταρα SW480 προσδιορίζεται με ανάλυση κηλίδος Western. Ο πίνακας δείχνει αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Δ) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

in vitro

. Ένα σύνολο 3 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων την ημέρα επτά και μετρήθηκαν την ημέρα 11. Ο αριθμός των κυττάρων ΟΣΚ-SW480 ήταν χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων Μ-SW480 (n = 3). (Ε) Τα κύτταρα στο /0 φάση G1 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση FCM την ημέρα 11. Το ποσοστό των κυττάρων στην /0 φάση G1 σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα Ο-, Κ- και ΟΣΚ-SW480 (n = 3) . (F) ανάλυση 5-FU-chemoresitance. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ΟΣΚ-SW480 παρουσία της 5-FU ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων Μ-SW480 σε αμφότερες τις συγκεντρώσεις 50 μg 1 και /ml 5-FU (n = 3). Η βιωσιμότητα των κυττάρων Μ-SW480 σε κάθε συγκέντρωση ρυθμίστηκε στο 100%. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση: SD. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01, δοκιμασία του Dunnett

Η

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης των δεικτών (Εικόνα 1Β, 1C και S2.). Η ανάλυση FCM έδειξαν ότι τα κύτταρα OSK-SW480 είχαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του CD133, CD26 και ABCG2. Τα περισσότερα από τα μεταχθέντα κύτταρα εξέφρασαν CD44, αλλά ο αριθμός των κυττάρων που εκφράζουν ένα υψηλότερο επίπεδο CD44 αυξήθηκε περίπου δύο φορές σε κύτταρα OSK-SW480 σύγκριση με τα κύτταρα Μ-SW480 (n = 3) (Σχ. 1 Β και S2). Τα κύτταρα OSK-SW480 έδειξε μια τάση να έχουν ένα αυξημένο επίπεδο έκφρασης LGR5, αλλά αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχ. 1 Β και S2) (n = 3). Μια ανάλυση κηλίδος Western έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης της ΑΙ_ϋΗ1 αυξήθηκε μόνο στα κύτταρα OSK-SW480 (Εικ. 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι ΟΣΚ έχουν την ικανότητα να προκαλούν CSC υπογραφές σε ένα υποσύνολο των κυττάρων SW480.

Ο πολλαπλασιασμός και του κυτταρικού κύκλου σε μεταγωγή κύτταρα SW480

επόμενο αξιολογείται η ανάπτυξη των κυττάρων

σε vitro

. Ο αριθμός των κυττάρων ΟΣΚ-SW480 στις 96 ώρες μετά τη σπορά 3 × 10

5 κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων Μ-SW480 (ρ & lt? 0,01, η = 3) (Εικ 1D.). Όσο περισσότερο παρατήρηση έδειξε επίσης συνεπή αποτελέσματα (Εικ. S3). Για να εξεταστεί εάν τα μεταδιηγερμένα γονίδια επηρεάζονται τον κυτταρικό κύκλο, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση κυτταρικού κύκλου με FCM με χρώση DNA χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο (Σχ. 1Ε). Το ποσοστό των κυττάρων στην /0 φάση G1 ήταν περίπου 10% υψηλότερη σε Ο-, Κ- και καλλιέργειες OSK-SW480 από εκείνη των κυττάρων Μ-SW480 (n = 3).

Ευαισθησία σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες

για να εξεταστεί η ευαισθησία αντικαρκινικό φάρμακο των κυττάρων, συγκρίναμε τα ποσοστά επιβίωσης των κυττάρων μετά από επεξεργασία με 1 ή 50 μg /ml 5-FU για 48 ώρες από την WST-8 χρωματομετρική δοκιμασία (Σχ. 1F). Στα κύτταρα OSK-SW480, το ποσοστό επιβίωσης ήταν περίπου 20% υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων Μ-SW480 σε αμφότερες τις συγκεντρώσεις της 5-FU (n = 3). Το αποτέλεσμα αυτό πρότεινε ότι τα κύτταρα ΟΣΚ-SW480 περιείχαν τα κύτταρα που αποκτήθηκαν χημειοαντίσταση με 5-FU.

Σφαίρα σχηματισμό

δοκιμασία

Έχει ήδη αναφερθεί ότι η ΚΕΠ είχαν μεγαλύτερη ικανότητα να σχηματίζουν σφαιροειδή κάτω πολιτισμού στην χαμηλή πιάτα προσκόλληση και ελεύθερο από ορό μέσο [2], [16]. Για να εξεταστεί η ικανότητα σχηματισμού σφαίρας των μεταγόμενων κυττάρων μας, εκτελέσαμε μία δοκιμασία σφαίρα σχηματισμό (Εικ. 2Α). Στα κύτταρα Μ-SW480, μπορούμε μετά βίας παρατηρήθηκε κάποια σφαιροειδή. Σε αντίθεση, στο Ο-, Κ- και καλλιέργειες OSK-SW480, παρατηρήσαμε μια προφανώς αυξημένο αριθμό των σφαιροειδών (μέσος όρος: 47, 23 και 50, αντίστοιχα, η = 3), υποδεικνύοντας ότι

OCT3 /4, KLF4

και ΟΣΚ συνέβαλαν στην σφαιροειδές σχηματισμό σε ένα υποσύνολο των κυττάρων SW480.

(α) ο προσδιορισμός σχηματισμού σφαιροειδές. Ένα σύνολο 1 × 10

4 κύτταρα απλώθηκαν σε χαμηλά πιάτα προσάρτησης την ημέρα 10 και καλλιεργήθηκαν με μέσο ελεύθερο ορού για 10 ημέρες. Στην Ο-, Κ- και ΟΣΚ-SW480 καλλιέργειες, ο αριθμός των σφαιριδίων ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων Μ-SW480. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την SD (η = 3). Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. (Β) Η ογκογονικότητα των κυττάρων μετά την εμφύτευση στον υποδόριο περιοχές ανοσοανεπάρκεια γυμνών ποντικών. Ένα σύνολο 1 × 10

6 κύτταρα (αριστερός πίνακας) ή 3 × 10

5 κυττάρων (δεξί πάνελ) εγχύθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές με ανοσοανεπάρκεια γυμνών ποντικών την ημέρα 10. Ο όγκος των όγκων που προέρχονται από το Κ- και OSK-SW480 κύτταρα ήταν προφανώς υψηλότερες από εκείνες των κυττάρων κ.β., Μ-, Ο- και S-SW480 και για τις δύο αριθμούς εγχέονται κύτταρα. Οι κόκκινες γραμμές δείχνουν την διάμεση τιμή όγκου του όγκου. ** P & lt? 0,01, NS:. Δεν είναι σημαντική, δοκιμασία του Dunnett (εκτός των †: U-test)

Η

Ογκογονικότητα

in vivo

Η

Για να εξεταστεί η ογκογονικότητα των μεταγόμενων κυττάρων, μπορούμε υποδορίως μεταμοσχευθεί 1 × 10

6 ή 3 × 10

5 κυττάρων σε ανοσοανεπαρκή γυμνά ποντίκια στην ραχιαία επιφάνεια και στις δύο πλευρές, και στη συνέχεια, μετρήθηκε η συχνότητα και ο όγκος των όγκων μετά από τέσσερις εβδομάδες για το 1 × 10

6 κύτταρα και οκτώ εβδομάδων για τον 3 × 10

5 κυττάρων μετά από μεταμόσχευση, αντιστοίχως (Εικ. 2Β). Μια περίληψη της επίπτωσης όγκων παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Τα κύτταρα Κ- και OSK-SW480 δημιουργούνται όγκοι στο 100% των τοποθεσιών, ενώ οι άλλες γραμμές που δημιουργούνται όγκοι σε 75% και 25% των περιπτώσεων για τον αριθμό των κυττάρων του 1 × 10

6 και 3 × 10

5 κύτταρα, αντίστοιχα. Παρατηρήσαμε ένα σημαντικά μεγαλύτερο όγκο των όγκων στα κυτταρικά ένεση ποντικούς K- και OSK-SW480 σε σύγκριση με εκείνους που ενέθηκαν με άλλες γραμμές, και στις δύο κυτταρικές ποσότητες, δηλαδή 1 × 10

6 και 3 × 10

5 κυττάρων (Εικ. 2Β).

η

στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η ΟΣΚ επαρκώς προκαλείται από όλα τα προηγούμενα αναφερθεί CSC ιδιότητες εξετάσαμε

in vitro

και

in vivo

, ενώ κανένα μεμονωμένο γονίδιο ήταν επαρκής για να επάγει όλες αυτές τις ιδιότητες. Έχουμε ορίσει τα κύτταρα με τις ιδιότητες CSC στις καλλιέργειες ΟΣΚ-SW480 ως προκαλούμενη ΚΕΠ (iCSCs).

δραστηριότητας εκροής για Hoechst33342

Σε προηγούμενες εκθέσεις [2], [10], [12 ], [23], [24], FCM χρησιμοποιώντας επισήμανση Hoechst33342 με βεραπαμίλη (VM), η οποία είναι μια ΑΤΡ-Binding Cassette (ABC) αναστολέας μεταφορέα, ήταν ένας αποτελεσματικός τρόπος για να εμπλουτίσουν διάφορους τύπους βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν, συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων . Σε αυτή τη δοκιμασία, θεωρήθηκε ότι τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν (τα λεγόμενα κύτταρα Side πληθυσμού) δεν είχαν επισημανθεί από Hoechst33342 χωρίς VM, αλλά σημάνθηκαν με Hoechst33342 με τη διοίκηση του VM.

Εμείς επιβεβαίωσε την ύπαρξη 5 μg /ml του Hoechst33342-effluxing κύτταρα, τα οποία εξαφανίστηκε με την συν-χορήγηση 50 μΜ VM στην καλλιέργεια Μ-SW480 (Εικ. 3Α). Θέτουμε μια πύλη στο οποίο περιλαμβάνεται ο πληθυσμός, και ονομάζονται τα κύτταρα στην πύλη απουσία VM ως «V0-κύτταρα» (Εικ. 3Α, αριστερός πίνακας), που ακολουθείται από ανάλυση των άλλων γραμμών. Ο αριθμός των V0-κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά στο Ο- και πολιτισμών ΟΣΚ-SW480 (3,9% και 5,0%, αντίστοιχα) σε σύγκριση με την καλλιέργεια Μ-SW480 (2,6%) (Εικ. 3Α, δεξί πάνελ). Αξίζει να σημειωθεί ότι, μοναδικό κύτταρα, τα οποία δεν είχαν ετικέτα με Hoechst33342 ακόμη και με την παρουσία 50 μΜ VM, ήταν εμφανείς στις καλλιέργειες OSK-SW480. Εμείς ονομάζονται αυτά τα κύτταρα ως «V50-κύτταρα» (Εικ. 3Α, αριστερός πίνακας). Η θεραπεία με 250 μΜ VM ως αποτέλεσμα την εξαφάνιση των κυττάρων μέσα στην πύλη, υποδεικνύοντας ότι τα V50-κύτταρα ήταν ευαίσθητα σε 250 μΜ VM (Σχ. 3Β, αριστερό πάνελ). Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι πήραμε ένα νέο πληθυσμό συλλεκτικό κυττάρων:. V50-κύτταρα με μια ιδιαίτερα ισχυρή χρωστική-εκροής δραστηριότητα που προκαλείται στις καλλιέργειες ΟΣΚ-SW480

(Α) Τα κύτταρα ΟΣΚ-SW480 συμπεριληφθεί πληθυσμό κυττάρων μη επισημασμένου με 5 μg /ml του Hoechst33342 με τη συγχορήγηση του 50 μΜ του verapamil (VM). Έχουμε ορίσει τα κύτταρα μη επισημασμένου με Hoechst33342 χωρίς VM και με 50 μΜ VM ως V0-κύτταρα και V50-κύτταρα, αντίστοιχα. Το αριστερό πάνελ δείχνει αντιπροσωπευτικά διαγράμματα στιγμών επισημασμένο και μη επισημασμένο κύτταρα την ημέρα 10 μετά την μεταγωγή. Το δεξί πλαίσιο δείχνει τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η υποπληθυσμός V0 αυξήθηκε στο Ο- και τα κύτταρα OSK-SW480. Οι V50-κύτταρα προφανώς δει στις καλλιέργειες OSK-SW480. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την SD (η = 3). * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, δοκιμασία του Dunnett. (Β) Dye δραστηριότητα εκροή κατά την ημέρα 10 (αριστερό πάνελ) και την ημέρα 28 (δεξιά πλευρά) μετά την μεταγωγή. Τα V50-κύτταρα εξαφανίστηκαν κάτω από τη θεραπεία με τη συγχορήγηση 250 μΜ VM ακόμη και στα κύτταρα OSK-SW480. Η αναλογία των κυττάρων ΟΣΚ-V50 μειώθηκε με το χρόνο.

Η

Επιβεβαίωση με άλλο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή

Για να επιβεβαιώσετε τα τρέχοντα αποτελέσματα, εξετάσαμε μια άλλη κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου, DLD- 1, σε ορισμένα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων των αξιολογήσεων του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων

in vitro

, ογκογενετικότητας

in vivo

και οι Hoechst33342 effluxing ιδιότητες (Εικ. S4). Στα κύτταρα DLD-1, ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων ΟΣΚ-DLD-1 ήταν χαμηλότερη από εκείνη του wt- (γονική) και Mock-DLD-1 κύτταρα (ρ & lt? 0,01, η = 3) (Εικ S4A.) . Η ογκογονικότητα των 1 × 10

5 κυττάρων ήταν υψηλότερη σε OSK-DLD-1 κύτταρα σε σύγκριση με το wt- και Mock-DLD-1 κύτταρα (Σχ. S4B, Πίνακας S2). V50-κύτταρα παρατηρήθηκαν επίσης στον ΟΣΚ-DLD-1, αλλά όχι στην Mock-DLD-1, καλλιέργειες (Εικ. S4C).

Η συλλογή των iCSCs από ΟΣΚ-SW480

να εξετάσει κατά πόσον οι ιδιότητες CSC προκαλείται σε ΟΣΚ-SW480 καλλιέργειες μπορούν να αποδοθούν στο V50-κύτταρα, που ταξινομούνται και αναλύονται τα V50-κυττάρων και μη-V50-κύτταρα παρουσία 50 μΜ VM στα κύτταρα ΟΣΚ-SW480, και V0- κύτταρα και μη-V0-κυττάρων απουσία του VM και μη-V50-κύτταρα σε παρουσία 50 μΜ VM στις καλλιέργειες M-SW480. Αυτά τα κύτταρα ονομάζονται OSK-V50, ΟΣΚ-nonV50, Μ-V0, Μ-nonV0 και Μ-nonV50, αντίστοιχα.

Μετά την διαλογή με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογέα (FACS) την ημέρα 10, όλη η γραμμές ήταν στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS. Τα κύτταρα OSK-V50 εμφάνισαν μορφολογία παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε διακριτά στα κύτταρα OSK-SW480 την ημέρα 10 (Σχ. 4Α, Σχ. S1D). Σε αντίθεση, τα κύτταρα OSK-nonV50 εμφάνισαν μορφολογία παρόμοια με εκείνη του Μ-V0, Μ-nonV0 και κυττάρων Μ-nonV50 (Σχ. 4Α). Ο ρυθμός ανάπτυξης κυττάρου των κυττάρων ΟΣΚ-V50 ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη των άλλων γραμμών (ρ & lt? 0,01, η = 3) (Εικόνα 4Β)., Με αποτέλεσμα την μειωμένη αναλογία (-0.1%) από τα 50-V κυττάρων σε 28 ημέρες μετά τη μεταγωγή υπό τις τρέχουσες συνθήκες καλλιέργειας (Σχ. 3Β, δεξί πάνελ).

Οι V50-κύτταρα στα κύτταρα ΟΣΚ-SW480 (ΟΣΚ-V50) ταξινομήθηκαν με FACS. Μη V0-, V0- και μη V50-κύτταρα στα κύτταρα Μ-SW480 (Μ-nonV0, Μ-V0 και Μ-nonV50, αντίστοιχα) και μη-V50-κύτταρα στα κύτταρα OSK-SW480 (ΟΣΚ-nonV50 ) έχουν επίσης ταξινομηθεί και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όλη μεταγενέστερα. (Α) Οι μορφολογίες των κυττάρων καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες μετά τη διαλογή. Η μορφολογία των κυττάρων ΟΣΚ-V50 ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε διακριτά κύτταρα OSK-SW480 (Εικ. S1D, με επένδυση κύκλος). Σε αντίθεση, η μορφολογία των κυττάρων ΟΣΚ-nonV50 ήταν παρόμοια με εκείνη του Μ-V0, Μ-nonV0 και Μ-nonV50 κύτταρα. Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. (Β) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

in vitro

. Συνολικά 3 × 10

5 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 14 έως 18 ημέρες μετά τη διαλογή ήταν seeded και μετρήθηκαν 96 ώρες αργότερα. Ο αριθμός των κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα OSK-V50 από ότι σε όλες τις άλλες γραμμές. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την SD (η = 3). ** P & lt? 0,01, δοκιμή Scheff του. (Γ) Ογκογονικότητα των κυττάρων σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια. Συνολικά 3 × 10

5 ή 1 × 10

5 κύτταρα υποδόρια ένεση σε ανοσοανεπάρκεια γυμνά ποντίκια την ημέρα 18 μετά τη διαλογή. Το μέγεθος του όγκου και η συχνότητα μετρήθηκαν οκτώ εβδομάδες μετά την ένεση. Μόνο τα κύτταρα OSK-V50 δημιουργείται προφανείς όγκους, τόσο για τις εγχυθεί αριθμούς κυττάρων, ενώ δεν παρατηρήθηκαν όγκοι ελήφθησαν από το Μ-nonV0, Μ-V0, Μ-nonV50 και τα κύτταρα OSK-nonV50. Η συχνότητα εμφάνισης του σχηματισμού όγκων από τα κύτταρα ΟΣΚ-V50 ήταν 4/4 και για τις δύο ένεση αριθμούς κυττάρων. Οι κόκκινες γραμμές δείχνουν την διάμεση τιμή όγκου του όγκου.

Η

Η ογκογονικότητα των κυττάρων ΟΣΚ-V50 στην ανοσοανεπάρκεια ποντικούς ήταν προφανώς υψηλότερο σε σχέση με το μέγεθος και τη συχνότητα των όγκων από εκείνη των άλλων κυτταρικών σειρών, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων ΟΣΚ-nonV50 (Εικ. 4C).

στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα ΟΣΚ-V50 παρουσίασαν ιδιότητες CSC, αλλά ότι τα κύτταρα ΟΣΚ-nonV50 λένε το αντίθετο, υποδεικνύοντας ότι οι ιδιότητες CSC προκαλείται στο κύτταρα ΟΣΚ-SW480 ήταν αναλογεί στον πληθυσμό V50-κυττάρων.

Παχέος διαφοροποίηση γενεαλογία των κυττάρων ΟΣΚ-V50

in vitro

η

κύτταρα ΟΣΚ-V50, καθώς και Μ- κύτταρα V0 ήταν θετικά για CDX2, ένας κύριος ρυθμιστής των εντερικών επιθηλιακών διαφοροποίηση [25], και ΟΚ20, ένα παχέος εντέρου δείκτης διαφοροποίησης [26], με ανοσοχρώση (Εικ. 5Α). Έτσι, τα κύτταρα ΟΣΚ-V50 διατηρείται παχέος φαινότυπο καταγωγή και την ικανότητα διαφοροποίησης

in vitro

(Εικ. 5Α).

(Α) ανοσοκυτταροχημεία για CDX2 και πρωτεΐνες ΟΚ20. κύτταρα OSK-V50 ήταν θετικά για CDX2 και ΟΚ20, καθώς και κύτταρα Μ-V0. Τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με Hoechst33342. Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. (Β) Η φαινοτυπική ποικιλομορφία στη μορφολογία και την κινητικότητα των παραγώγων των κυττάρων ΟΣΚ-V50. Οι φωτογραφίες είναι time-lapse φωτογραφίες του M-V0 και τα κύτταρα OSK-V50. Τα ταξινομημένα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για πέντε ημέρες και κατόπιν παρατηρείται κάθε έξι ώρες για 42 ώρες. απεικόνισης time-lapse αποκάλυψε ότι υπήρξε μια υψηλότερη ποικιλομορφία τόσο στην μορφολογία και την κινητικότητα σε κύτταρα ΟΣΚ-V50 (κάτω πίνακα) σε σύγκριση με τα κύτταρα Μ-V0 (άνω πάνελ). Αρχική μεγέθυνση, × 20. Οι ταινίες του Μ-V0 και τα κύτταρα ΟΣΚ-V50 φαίνεται στο βίντεο S1 και S2 βίντεο, αντίστοιχα.

Η

φαινοτύπου ποικιλομορφία σε παράγωγα του ΟΣΚ-V50

Δημιουργία ετερογένεια σε καρκινικούς ιστούς είναι μία από τις αξιοσημείωτες ιδιότητες CSC [1] – [3]. Για να εξετάσουμε αυτό το ακίνητο σε απομονωμένα κύτταρα μας, αναλύσαμε στη συνέχεια 23 ημέρες μετά τη διαλογή (Εικ. S5). Τα κύτταρα OSK-V50, σε αντίθεση με όλα τα άλλα κύτταρα, θα μπορούσε να παράγει V50-κύτταρα και καθώς και διάφορες διαφορετικά υποσύνολα των κυττάρων από την άποψη του βαθμού λειτουργίας Hoechst-effluxing (Εικ. S5).

Είμαστε δίπλα εκτελούνται

in vitro

time-lapse απεικόνιση του Μ-V0 και ΟΣΚ-V50 κυττάρων για 42 ώρες (Σχ. 5Β, Μέθοδοι S1). Τα κύτταρα Μ-V0 αποτελούνταν από μικρό στρογγυλούς και κύτταρα σχήματος ατράκτου, και σχημάτισε αποικίες που αποτελούνται από κύτταρα με διαυγές άκρες. Τα κύτταρα OSK-V50 αποτελούνταν από κύτταρα με διάφορες μορφολογίες, όπως πολυγωνικό, στρογγυλούς, cuboidal-, ατρακτοειδή και επίπεδη σε σχήμα κύτταρα, τα οποία μεταβάλλονται μορφολογίες τους με το χρόνο, και σχηματίζεται με επίπεδη τοποθετημένη αποικίες που αποτελούνται από κύτταρα με ασαφή άκρα . Επιπλέον, τα κύτταρα OSK-V50 εμφάνισαν υψηλότερη κινητικότητα των κυττάρων από τα κύτταρα Μ-V0 (Εικ. 5Β, Βίντεο S1 και S2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα ΟΣΚ-V50 μπορεί να παράγει μεγαλύτερη ποικιλομορφία όσον αφορά την μορφολογία και την κινητικότητα σε σχέση με τα κύτταρα Μ-V0.

Παχέος διαφοροποίηση γενεαλογία των κυττάρων ΟΣΚ-V50

in vivo

επόμενο ιστολογικά αξιολόγησε τους όγκους που προέρχονται από την M-SW480 και κύτταρα ΟΣΚ-V50 σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια (Εικ. 6).