Αφηρημένο

κυττάρων-διεισδυτική πεπτίδια (ΠΠΚ) έχουν αποδειχθεί πολύ αποτελεσματικά ως ενδοκυτταρική οχήματα παράδοσης για διάφορες θεραπευτική. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένες ανησυχίες σχετικά με τη μη-ειδική διείσδυση και κυτταροτοξικότητα της CPP για αποτελεσματικές θεραπείες του καρκίνου. Εδώ, με βάση το κύτταρο-διεισδυτική μοτίβο ενός αντικαρκινικού πεπτιδίου, buforin IIb, σχεδιάσαμε αρκετά παράγωγα CPP με εξειδίκευση καρκινικών κυττάρων. Μεταξύ των παραγώγων, ένα πεπτίδιο 17-αμινοξέων (BR2) βρέθηκε να έχουν καρκίνο εξειδίκευση χωρίς τοξικότητα σε φυσιολογικά κύτταρα. Μετά που στοχεύουν ειδικά τα καρκινικά κύτταρα μέσω της αλληλεπίδρασης με γαγγλιοσίδες, BR2 τέθηκε κύτταρα μέσω των λιπιδίων με μεσολάβηση μακροπινοκυττάρωσης. Επιπλέον, BR2 έδειξε υψηλότερη απόδοση μετατόπιση της μεμβράνης από το γνωστό CPP Tat (49-57). Η ικανότητα του BR2 ως φορέας φαρμάκου ειδική για τον καρκίνο καταδείχθηκε με σύντηξη BR2 σε ένα μεταβλητό θραύσμα μονής αλυσίδας (scFv) που κατευθύνεται προς ένα μεταλλαγμένο K-ras (G12V). BR2-συντηγμένο scFv επαγόμενη υψηλότερο βαθμό απόπτωσης από Tat-συγχωνευμένο scFv σε K-ras μεταλλαγμένα κύτταρα HCT116. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η νέα κύτταρο-διεισδυτική πεπτίδιο BR2 έχει μεγάλες δυνατότητες ως ένα χρήσιμο φορέα χορήγησης φαρμάκων με εξειδίκευση καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. Lim KJ, Sung BH, Shin JR, Lee YW, Kim DJ, Γιανγκ KS , et al. (2013) Ένας Καρκίνος συγκεκριμένο κελί διείσδυση πεπτιδίων, BR2, για την αποτελεσματική παράδοση ενός scFv σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (6): e66084. doi: 10.1371 /journal.pone.0066084

Συντάκτης: Robert W. Sobol, Πανεπιστήμιο του Pittsburgh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 του Νοέμβρη 2012? Αποδεκτές: 6 του Μάη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Lim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Intelligent Συνθετική Βιολογία Κέντρο της Global Frontier πρόγραμμα χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (2.011 έως 0.031.955). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα ευεργετικά αποτελέσματα πολλών ανακαλύφθηκαν πρόσφατα δυνητικών θεραπευτικών παραγόντων, όπως πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα, και υδρόφιλα φάρμακα, περιορίζονται λόγω της αδυναμίας τους να φθάσουν τα κατάλληλα ενδοκυτταρικά στόχους [1], [2]. Έτσι, πολυάριθμες προσεγγίσεις, όπως μικροέγχυση, eletroporation, λιποσωμικό σκεύασμα και τη χρήση ιικών φορέων έχουν εξερευνηθεί να προωθήσει την αποτελεσματική παροχή φαρμάκου [3], [4]. Μια σημαντική ανησυχία σχετικά με αυτές τις τεχνικές είναι φτωχή επιλεκτικότητα κυττάρων τους [4], [5]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη ενός συστήματος παροχής φαρμάκου στόχου-ειδικό αποτελεί πρωταρχικό μέλημα για τη βελτίωση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των φαρμάκων με παράλληλη μείωση της αποτελεσματικής τους δόσεις και οι παρενέργειες [6], [7].

πεπτίδια κυττάρων διείσδυσης ( ΠΠΚ), που αναφέρεται επίσης ως πεδία μεταγωγής πρωτεΐνης, επέστησαν ιδιαίτερη προσοχή ως εναλλακτική ενδοκυτταρική όχημα παροχής φαρμάκου μετά την ανακάλυψη της πρώτης CPP, Tat, το 1988 [8]. ΠΠΚ είναι βραχέα πεπτίδια που αποτελούνται από λιγότερα από 30 αμινοξέα και που αποτελείται κυρίως από τις βασικές, θετικά φορτισμένα αμινοξέα (π.χ. Arg, Lys και His) που έχουν την ικανότητα να μετατοπίζεται διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης και να παραδώσει μια ποικιλία κυτταρικών αδιαπέραστο φορτίων σε ολόκληρη η κυτταρική μεμβράνη [9], συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών [10], τα νουκλεϊκά οξέα [11], siRNA [12], πεπτιδικά νουκλεϊκά οξέα (PNAs) [13], οι μικρές θεραπευτικά μόριο [14], οι κβαντικές κουκίδες [15], και MRI αντίθεσης παράγοντες [16]. Αν και ο ακριβής μηχανισμός είναι άγνωστος ΠΠΚ, πρόσφατες μελέτες μηχανισμού σημαίνει ότι η κυτταρική πρόσληψη των αποτελεσμάτων τους από μια αρχική ταχεία ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση με τη μεμβράνη του πλάσματος ακολουθούμενη από πρόσληψη ενδοσωμιακό [17], [18].

Χρήση CPP για την ενδοκυτταρική διανομή από ένα ευρύ φάσμα των μακρομορίων είναι μια ισχυρή προσέγγιση λόγω της προσαρμοστικότητάς τους σε συνδυασμό με την εύκολη λειτουργοποίηση συνδέονται φορτίων και την υψηλή απόδοση παροχής σε διάφορες κυτταρικές σειρές, ξεπερνώντας τις προκλήσεις που αντιμετωπίζουν συχνά με άλλες μεθόδους παράδοσης [19], [20]. Ως εκ τούτου, πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην ανάπτυξη νέων ΠΠΚ? ο αριθμός των διαθέσιμων ΠΠΚ με διαφορετικά χαρακτηριστικά, όπως αυξημένη σταθερότητα και αποτελεσματική παράδοση του φορτίου, συνεχίζει να αυξάνεται [17].

Αν και το δυναμικό των ΠΠΚ ως παράγοντες διανομής είναι μεγάλο, έλλειψη εξειδίκευσης των κυττάρων, κυτταροτοξικών αποτελεσμάτων και απροσδόκητες παρενέργειες είναι σοβαρές ανησυχίες για την ανάπτυξή τους ως οχήματα χορήγησης φαρμάκων [21]. Για τη θεραπεία του καρκίνου, η ειδικότητα CPP κυττάρων είναι ιδιαίτερα σημαντική έτσι ώστε οι παρενέργειες στα φυσιολογικά κύτταρα ελαχιστοποιείται [22], [23]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια έντονη ανάγκη για την ανάπτυξη του καρκίνου-ειδικών και μη τοξικά CPP για αποτελεσματικές θεραπείες για τον καρκίνο.

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι ένας ισχυρός αντιμικροβιακό πεπτίδιο, buforin IIb (RAGLQFPVG [RLLR]

3), έχει ισχυρή ικανότητα διείσδυσης σε κύτταρα και αντικαρκινική δράση έναντι διαφόρων κυτταρικών γραμμών καρκίνου [24], [25]. Ακόμα κι αν buforin IIb έδειξε εκλεκτική κυτταροτοξικότητα κατά των καρκινικών κυττάρων, επηρέασε επίσης τη βιωσιμότητα των φυσιολογικών κυττάρων σε υψηλές συγκεντρώσεις. Για την ανάπτυξη buforin IIb ως ένα αποτελεσματικό όχημα διανομής φαρμάκου, η κυτταροτοξικότητα του έναντι των φυσιολογικών κυττάρων θα πρέπει να ελαχιστοποιείται με ταυτόχρονη διατήρηση των καρκινικών κυττάρων ειδικότητα του.

Σε αυτή τη μελέτη, σχεδιάσαμε μία νέα ειδική για τον καρκίνο και μη τοξικά κυττάρου-διεισδυτική πεπτίδιο, BR2, με βάση το κύτταρο-διεισδυτική μοτίβο του buforin IIb και μελέτησαν το δυναμικό ως ένα αποτελεσματικό όχημα παροχής φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα με σύντηξη BR2 σε ένα μεταβλητό θραύσμα μονής αλυσίδας (scFv) αντίσωμα έναντι μεταλλαγμένο K-ras.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρική σειρά HeLa, ανθρώπινου παχέος εντέρου κυτταρική σειρά καρκίνου HCT116, κυττάρων μελανώματος γραμμή ποντικού Β16 /F10, ινοβλαστών κυτταρική γραμμή ποντικού ΝΙΗ 3Τ3, τα ανθρώπινα κερατινοκυττάρων κυτταρική γραμμή HaCat και την ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοβλαστών BJ ελήφθησαν όλα από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε ένα πλήρες μέσο [τροποποιημένο Eagle μέσο Dulbecco] (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) , 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συνθήκες υγρασίας στους 37 ° C με 5% CO

2.

Peptide Σχεδιασμός και Σύνθεση

Σχεδιάσαμε αρκετά παράγωγα του buforin IIb (BR3) με σταδιακή εξάλειψη του Ο-τερματικό τακτικές α-ελικοειδή επαναλήψεων μοτίβο RLLR του buforin IIb να δημιουργήσει ένα ειδικό καρκινικό κύτταρο και μη τοξικά CPP. Τα σχεδιασμένα πεπτίδια αποτελούνταν από διαφορετικούς αριθμούς C-τερματικού τακτικές α-ελικοειδή μοτίβο RLLR και ονομάστηκε BR1 και BR2 (Πίνακας 1).

Η

ΠΠΚ Tat, BR1, BR2, και BR3 συντέθηκαν χημικά ( Anygen, Kwangju, την Κορέα) σε ένα σύνθεσης πεπτιδίων MilliGen 9050. Το τμήμα της φθορεσκεΐνης (FITC) συνδέθηκε με το Ν-τελικό άκρο μέσω ενός αμινοεξανοϊκό οξύ διαχωριστή με κατεργασία ενός πεπτιδίου συνδεδεμένου με ρητίνη (0,1 mM) με FITC (0,1 mM) και διισοπροπυλαιθυλαμίνη (0.5 mM) σε Ν, Ν-διμεθυλοφορμαμίδιο ( DMF) για 12 ώρες. Όλα τα ακατέργαστα πεπτίδια καθαρίστηκαν και αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) επί στήλης C18, και τα καθαρισμένα πεπτίδια χαρακτηρίστηκαν με φασματομετρία μάζας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI-MS).

Συνεστιακό Laser μικροσκοπία σάρωσης

για να διερευνηθεί η ικανότητα διείσδυσης σε κύτταρα και την ενδοκυτταρική κατανομή των εσωτερικεύονται πεπτιδίων, ζουν συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη σε τρεις σειρές καρκίνου (HeLa, HCT116 και Β16 /F10) και τρεις κανονικές κυτταρικές γραμμές (HaCat, BJ και ΝΙΗ 3Τ3). Εν συντομία, τα κύτταρα (2 χ 10

5) τοποθετήθηκαν σε μια γυάλινη καλυπτρίδα τοποθετήθηκε σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων, αναπτύσσονται όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με FITC-επισημασμένα πεπτίδια (5 μΜ για κάθε κυτταρική γραμμή) για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS, ρΗ 7.4), και τοποθετημένα σε πλάκες μικροσκοπίου με διάλυμα στερέωσης φθορισμού (Dako Corp, Carpinteria, CA). Colocalization της BR2 με λυσοσώματα παρατηρήθηκε με τη χρήση LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probe, Eugene, OR). Για την αποφυγή των επιπτώσεων της αντικείμενα στερέωσης, που περιλαμβάνει τόσο την μεθανόλη και παραφορμαλδεϋδη, τα κύτταρα δεν είχαν καθοριστεί [26], [27]. Η κατανομή των ΡΙΤΟ-επισημασμένων πεπτιδίων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό λέιζερ σάρωσης Zeiss LSM 510 μικροσκόπιο (Jena, Germany) εξοπλισμένο με ένα 40 × 20 × και στόχο. Φθοροφόρα ήταν ενθουσιασμένος με ένα λέιζερ αργού (488 nm) για FITC και ένα λέιζερ HeNe (543 nm) για LysoTracker Red.

In vitro κυτταροτοξικότητα

Δοκιμασία

Η κυτταροτοξικότητα πεπτιδίων σε κύτταρα θηλαστικών διερευνήθηκε με την αξιολόγηση της απελευθέρωσης της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) από καρκίνο και τα φυσιολογικά κύτταρα. Η ποσότητα της LDH που απελευθερώνεται από κατεστραμμένα κύτταρα εντός του υπερκειμένου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την κυτταροτοξικότητα Detection Kit (Roche Applied Science, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επιστρώθηκαν επί 96 φρεατίων μικροπλάκες (1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο) σε πλήρες DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C για να επιτρέψει για τη σύνδεση και την εξάπλωση των κυττάρων. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις πεπτιδίων (0-100 μΜ) και επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες στους 37 ° C. Το εξωκυτταρικό μέσο από κάθε φρεάτιο μεταφέρθηκαν σε ένα νέο μικροπλάκα και επωάστηκαν για 10 λεπτά με 100 μΙ καλά μίγμα /αντίδραση, ακολουθούμενο από ένα διάλυμα διακοπής. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm με τη χρήση ενός αναγνώστη πλάκας ELISA. απελευθέρωσης LDH από κύτταρα λύθηκαν με 0.2% Triton Χ-100 σε PBS ορίστηκε ως 100% διαρροή και την απελευθέρωση LDH από μη επεξεργασμένα κύτταρα ως διαρροή 0%.

Η αιμόλυση Δοκιμασία

Αιμολυτική δραστικότητα προσδιορίστηκε ως περιγράφεται από Aboudy

et al

με ελαφρές τροποποιήσεις [28].? 3 ml προσφάτως παρασκευασμένου ανθρώπινων ερυθροκυττάρων εκπλύθηκε με ισοτονικό PBS, ρΗ 7.4, έως ότου το χρώμα του υπερκειμένου έγινε διαυγές. Τα πλυμένα ερυθροκύτταρα αραιώθηκαν στη συνέχεια σε ένα τελικό όγκο 20 ml με το ίδιο ρυθμιστικό. Τα δείγματα πεπτιδίου (10 μΐ), σειριακά αραιωμένο σε PBS, προστέθηκαν σε 190 μΐ του αιωρήματος κυττάρων σε σωλήνες μικροφυγοκέντρησης. Μετά ήπια ανάμιξη, οι σωλήνες επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 4000 χ g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο (100 μΙ) απομακρύνθηκε σε ένα νέο σωλήνα και η απορρόφηση στα 567 nm προσδιορίστηκε. Η σχετική οπτική πυκνότητα, σε σύγκριση με εκείνη του εναιωρήματος κυττάρων σε επεξεργασία με 0,2% Triton Χ-100, ορίστηκε ως ποσοστό της αιμόλυσης. Το ποσοστό αιμόλυσης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: ποσοστό αιμόλυσης = [(Abs

567 nm σε διάλυμα πεπτιδίου – Abs

567 nm σε PBS) /(Abs

567 nm σε 0.2% Triton Χ-100 – Abs

567 nm σε PBS)] × 100

Χαρακτηρισμός πεπτιδίου πρόσληψης

πλάκες

Για να αξιολογηθεί η εσωτερικοποίηση του FITC-επισημασμένα πεπτίδια, κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων σε. μια πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και επωάστηκαν για 24 ώρες. FITC-επισημασμένα πεπτίδια, σε διάφορες συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 2 έως 10 μm, στη συνέχεια επωάστηκαν με τα κύτταρα για 30 λεπτά στους 37 ° C. Για τη σύγκριση της κυτταρικής πρόσληψης των πεπτιδίων, του καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FITC-επισημασμένα πεπτίδια (η κάθε μία, 10 μΜ) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS για να απομακρυνθεί η περίσσεια συμπλοκών εξωκυτταρικό. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θρυψίνη (1 mg /ml) για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν οποιαδήποτε εναπομείναντα πεπτίδια δεσμεύονται στην επιφάνεια του κυττάρου. Μετά θρυψινοποίηση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (1000 χ g για 5 λεπτά), επαναιωρούνται με 500 μΐ παγωμένου 2% FBS /PBS που περιείχε ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), και στη συνέχεια αναλύθηκαν αμέσως (10.000 συμβάντα /δείγμα) με φθορισμό ενεργοποιημένων διαλογή κυττάρων (FACS).

Για να κατανοήσουμε περαιτέρω το κύτταρο-διεισδυτική μηχανισμού των πεπτιδίων, εξετάσθηκαν οι επιδράσεις της θερμοκρασίας και μεταβολικών αναστολέων. Για να διευκρινιστεί η εξάρτηση θερμοκρασίας, κύτταρα HeLa επωάστηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά πριν από την προσθήκη των πεπτιδίων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FITC-επισημασμένα πεπτίδια (το καθένα, 5 μΜ) στους 4 ° C για 30 λεπτά. Για τη μελέτη της ενεργειακής εξάντληση, κύτταρα HeLa προεπωάστηκαν με αζίδιο του νατρίου (NaN

3, 10 mM) στους 37 ° C για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με FITC-επισημασμένα πεπτίδια (έκαστο, 5 μΜ) στους 37 ° C για . 30 λεπτά

για να μελετηθεί ο ρόλος της ενδοκύττωσης στην πρόσληψη πεπτιδίου, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με διάφορους αναστολείς ενδοκυττάρωση στους 37 ° C για 1 ώρα: (i) αμιλορίδη (5 mM), το οποίο είναι γνωστό να μπλοκάρει μακροπινοκυττάρωσης από αναστέλλοντας ένα κανάλι νατρίου? (Ii) νοκοδαζόλη (100 ng /ml), η οποία αναστέλλει την κλαθρίνη μεσολάβηση μονοπάτι? και (iii) μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (MßCD, 5 mM), η οποία αναστέλλει τις διαδικασίες σχεδία μεσολάβηση λιπιδίων με τη μείωση της χοληστερόλης από την μεμβράνη πλάσματος [29]. Όλοι οι αναστολείς αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ).

Για να εξεταστούν οι επιδράσεις της αρνητικά φορτισμένα συστατικά στην κυτταρική επιφάνεια για το πεπτίδιο εσωτερίκευσης, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με γαγγλιοσίδες (μονοσιαλογαγγλιοσίτης GM3 από κυνόδοντα αίματος), θειική ηπαρίνη, ή σιαλικό οξύ (Neu5Ac, όλα από την Sigma) (20 μg /ml) για 30 λεπτά. Για την αναστολή της βιοσύνθεσης γαγγλιοσίδιο, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με D-

θρεο

-1-φαινυλ-2-hexadecanoyl αμινο-3-μορφολινο-1-προπανόλη (PPMP, 5 μΜ) για 48 ώρες.

Για όλους αυτές τις πειραματικές συνθήκες, κυτταρομετρία ροής αναλύσεις διεξήχθησαν με ζωντανά κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα Becton Dickinson κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (BD Biosciences, San Diego, CA). Σε κάθε περίπτωση, ο φθορισμός του 10.000 βιώσιμων κυττάρων αποκτήθηκαν. Βιώσιμα κύτταρα περιφραγμένο βασίζεται σε μια πλευρική και εμπρόσθια σκέδαση. Για την ανάλυση των δεδομένων, το λογισμικό WinMDI (Joe Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) χρησιμοποιήθηκε. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με t-test του Student σε διάστημα εμπιστοσύνης 95%.

Κλωνοποίηση και έκφραση των πρωτεϊνών σύντηξης πεπτιδίου-

Για να απασχολούν BR2 ως όχημα για την παράδοση των θεραπευτικών πρωτεϊνών, ένα cDNA του μεταβλητού θραύσματος γονιδίου Υ13-259 μονής αλυσίδας (scFv) συνετέθη σε Bioneer (Daejeon, Κορέα). Τα γονίδια Tat- ή BR2-συντηγμένο Υ13-259 scFv ελήφθησαν με ανασυνδυασμένο PCR. Τα ανασυνδυασμένα cDNA που κωδικοποιούν την αντι-Ras scFv, Tat-scFv και συντήξεις BR2-scFv υποβλήθηκαν σε πέψη με το

Nco

Ι και

EcoR

Ι (και οι δύο από την New England Biolabs, Beverly, ΜΑ), και κλωνοποιήθηκε στο

Nco

Ι και

EcoR

sites Ι του pET21c, παράγουν pscFv, pTat-scFv και pBR2-scFv, αντίστοιχα. Anti-Ras scFv, Tat-scFv και BR2-scFv πρωτεϊνών σύντηξης εκφράστηκαν σε

Ε. coli

Origami (DE3) μετά την επαγωγή με 0.1 mM IPTG για 4 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 3000 χ g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το σφαιρίδιο του κυττάρου επανααιωρήθηκε σε ρυθμιστικό φωσφορικού (10 mM φωσφορικό νάτριο, 150 mM NaCl, ρΗ 7,4)? κύτταρα διασπάσθηκαν με κατεργασία με υπερήχους στους 4 ° C (Β Braun μέσα, Allentown, ΡΑ). Ο αναστολέας πρωτεάσης φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF, 1 mM) προστέθηκε πριν από την κατεργασία με υπερήχους. Τα διαλυτά και αδιάλυτα κλάσματα διαχωρίζονται με φυγοκέντρηση στα 14.000 χ g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το σφαιρίδιο που περιέχει τα σώματα εγκλεισμού επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA και 1% Triton Χ-100, ρΗ 8.0) και φυγοκεντρείται στα 8000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C.

Τα πλυμένα έγκλειστα σωμάτια μετουσιώθηκαν και διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (0.3% Ν-λαουροϋλ σαρκοσίνη, 50 mM CAPS ρυθμιστικό και 0.3 Μ NaCl, ρΗ 11.0) επί 3 ώρες και φυγοκεντρήθηκε στα 14.000 χ g για 15 λεπτά στους 4 ° C . Όλες οι πρωτεΐνες καθαρίζεται με συγγένεια με τη χρήση της ρητίνης Νί-IDA αγαρόζης (ΕΛΠΙΣ Biotech, Daejeon, Κορέα). Εν συντομία, η Νι-IDA His-Bind ρητίνη συσκευάστηκε σε μια στήλη εξισορροπημένη με ρυθμιστικό διάλυμα (ίδιο με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης) σύνδεση. Το υπερκείμενο εφαρμόστηκε αργά στην στήλη, μετά την οποία πλύνετε ρυθμιστικό (0,3% Ν-λαουροϋλ σαρκοσίνη, 50 mM CAPS ρυθμιστικό διάλυμα, 150 mM NaCl, και 30 mM ιμιδαζολίου, ρΗ 11.0) εφαρμόστηκε. Οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (0.3% Ν-λαουροϋλ σαρκοσίνη, 50 mM CAPS ρυθμιστικό διάλυμα, 150 mM NaCl, και 250 mM ιμιδαζολίου, ρΗ 11,0) και αναλύθηκαν με 10% SDS-PAGE. Οι εκλουσθείσες πρωτεΐνες αναδιπλώθηκαν με διαπίδυση σε PBS που περιέχει 200 ​​mM NaCl, 10% γλυκερόλη, 1 mM GSH, 0,2 mM GSSG και 0.4 Μ αργινίνης με σταδιακή μείωση του ρΗ (ρΗ 10, ρΗ 9, ρΗ 8 και ρΗ 7,4). Κάθε βήμα διαπίδυση διεξήχθη στους 4 ° C για 12 ώρες έναντι 20 × όγκου του δείγματος για την απομάκρυνση του απορρυπαντικού εντελώς.

Western Blotting

Για την παρακολούθηση της μέσω πεπτιδίου ενδοκυτταρική πρόσληψη πρωτεϊνών scFv, το εσωτερικεύεται πρωτεΐνες σύντηξης εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. κύτταρα HCT116 (1 × 10

6) υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS, καθαρισμένο scFv, Tat-scFv, ή πρωτεΐνες σύντηξης BR2-scFv (η κάθε μία, 2 μΜ) για 2 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS (4 ° C), αποξέστηκαν σε 0,5 ml PBS και φυγοκεντρήθηκε στα 1000 χ g στους 4 ° C για 5 λεπτά. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (20 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Να

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM βήτα γλυκεροφωσφορικό, 1 mM Να

3νο

4, 1 μg /ml λευπεπτίνη και 1 mM PMSF (Cell Signaling Tech., Danvers, μΑ) και διατηρήθηκε σε πάγο για 30 λεπτά. Τα κυτταρολύματα κατόπιν φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 χ g στους 4 ° C για 15 λεπτά και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στα κυτταρικά εκχυλίσματα προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford [30] (Bio-Rad, Hercules, CA). 50 μg πρωτεΐνης από κυτταρικά εκχυλίσματα κλασματοποιήθηκε σε ένα 10% πήκτωμα SDS-PAGE. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης σε ρυθμιστικό μεταφοράς (192 mM γλυκίνη, 25 mM Tris-HCl, ρΗ 8,8, και 20% μεθανόλη [ν /ν]) με ηλεκτροστύπωση. Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα για 1 ώρα, η μεμβράνη επωάστηκε με μία 1:1,000-αραιωμένου αντι-His πρωτογενές αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), πλύθηκαν τρεις φορές με TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, και 0.5% Tween-20), και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) σε γάλα που περιέχει TTBS επί 1 ώρα. Μετά την τελική πλύση, η μεμβράνη στη συνέχεια εκτίθενται και ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (WESTSAVE GOLD? AbFrontier, Σεούλ, Κορέα).

κυτταρικού πολλαπλασιασμού δοκιμασίες (ΜΤΤ Δοκιμασία)

Για να εκτιμηθεί η αντι-πολλαπλασιαστική δράση των πεπτιδίων και αντι-Ras πρωτεϊνών σύντηξης scFv, κύτταρα HCT116 (K-ras μεταλλαγμένα κύτταρα) σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 100 μι ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με scFv ή πρωτεΐνες σύντηξης πεπτιδίου-scFv (0, 0,5, 1 και 2 μΜ) και επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού CellTiter 96® μη ραδιενεργά (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση του διαλύματος μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας Αναγνώστη Microplate (Bio-Rad). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε επεξεργασία με scFv ή πρωτεΐνες σύντηξης πεπτιδίου-scFv σε σύγκριση με την αγωγή με PBS μάρτυρα (100%). Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν.

Ανίχνευση απόπτωσης

κύτταρα HCT116 (1 × 10

6 /φρεάτιο σε ένα 6-φρεατίων) υποβλήθηκαν σε αγωγή με πεπτίδιο συντηγμένο scFvs (κάθε , 2 μΜ) ή ένα γνωστό σταυροσπορίνη απόπτωση επαγωγέα (0,5 μΜ) για 24 ώρες στους 37 ° C και τα κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Διασπασμένη πολυ (ADP ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), ένας δείκτης της απόπτωσης, ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western όπως περιγράφεται παραπάνω. Αντι-PARP και αντι-α-τουμπουλίνης αντισώματα (Cell Signaling Tech.) Χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1,000 ως πρωτεύοντα αντισώματα, ενώ κοχλιαρίας συζευγμένη με υπεροξειδάση IgG αντι-κουνελιού (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) χρησιμοποιήθηκε σε μια . 1:10,000 αραίωση ως δευτερογενές αντίσωμα

Επιπλέον, τα αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με χρώση με αννεξίνη V-FITC (150 ng /ml) και 7-αμινο ακτινομυκίνη D (7-AAD? BD Biosciences, San Diego, CA). 1 × 10

6 κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS, σταυροσπορίνη (0,5 μΜ), ή scFvs πεπτίδιο συγχωνευμένο (το καθένα, 2 μΜ) όπως περιγράφεται παραπάνω. Την καθορισμένη ώρα, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS (ρΗ 7.4), συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης συμπληρωμένο με Annexin-V fluos (1:100 αραιωμένο? BioBud, Σεούλ, Κορέα), και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε 25 ° C στο σκοτάδι. Για την ανίχνευση νέκρωση, 7ΑΑΌ προστέθηκε πριν από τη μέτρηση. Τα δείγματα αμέσως υποβλήθηκαν σε ανάλυση FACS με ροή FACSCalibur κυτταρόμετρο (FL1 και FL3) και λογισμικό WinMDI (Joe Trotter, Scripps Research Institute). 1 × 10

4 κύτταρα ανά δείγμα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Ras Δοκιμασία Ενεργοποίησης

Για να μελετηθεί το πεπτίδιο-δοΡν σύντηξης πρωτεΐνης-εξαρτώμενη καταστολή της δραστηριότητας Ras, το επίπεδο της Ras -GTP (δραστική μορφή) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας ενεργοποίηση της Ras (Millipore, Billecia, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτή η μέθοδος βασίζεται σε μια επιλεκτική δέσμευση του Ras-GTP χρησιμοποιώντας το πεδίο σύνδεσης Ras (RBD) του Raf-1 (μία κινάση κατάντη του Ras) η οποία αποτυγχάνει να συνδεθεί Ras-ΑΕΠ (ανενεργή μορφή). Εν συντομία, 50 μΙ RBD πρωτεΐνη συντηγμένη με τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) επικαλύφθηκε σε μια 96 φρεατίων πλάκα γλουταθειόνη-επικαλύφθηκαν στους 4 ° C για 1 ώρα και πλύθηκε με TBST (50 mM Tris, 150 mM NaCl, και 0,05% Tween -20, ρΗ 7,6). κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με scFv, Tat-scFv, ή BR2-scFv για 1 ή 2 ώρες, μετά τις οποίες τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας 1 × Mg

2+ ρυθμιστικού λύσης /Wash (Millipore). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης υπολογίστηκε με τη δοκιμασία Bradford. Κυτταρολύματα περιέχει 50 μ§ πρωτεΐνης επωάστηκαν για 1 ώρα στα φρεάτια RBD-GST-επικαλυμμένες στους 25 ° C. Μετά από πλύση τρεις φορές με TBST, πρωτεύον διάλυμα αντίσωμα προστέθηκε και επωάστηκε στους 4 ° C για 1 ώρα. Μετά από πλύση με TBST, η δευτερεύουσα HRP-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού προστέθηκαν και επωάστηκαν στους 25 ° C για 1 ώρα. Μετά από μια τελική πλύση με TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, ρΗ 7,6), 50 μΙ των υποστρωμάτων χημιφωταύγειας προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. σήματα χημικής φωταύγειας από κάθε φρεάτιο παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναλυτή χημειοφωταύγειας Berthold (MicroLumat LB96P? Berthold Technologies, Oak Ridge, ΤΝ). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως σχετική δραστικότητα Ras.

Αποτελέσματα

BR2 εσωτερικοποιεί αποτελεσματικά σε διάφορες γραμμές Cancer Cell χωρίς κυτταροτοξικότητα για τα κανονικά κύτταρα

Η κυτταρική πρόσληψη και ενδοκυτταρική διανομή των σχεδιασμένων πεπτιδίων , BR1 και BR2, μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. BR2 έγινε εύκολα εσωτερικεύονται σε καρκινικά κύτταρα (HeLa, HCT116 και Β16 /F10) μέσα σε 30 λεπτά και διανέμονται σε όλη την κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων (Εικ. 1Α). Ωστόσο, ήταν πολύ φτωχά εσωτερικεύονται σε φυσιολογικά κύτταρα (HaCat, BJ και ΝΙΗ 3Τ3) υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες. Σε αντίθεση, BR1 εμφανίζεται αμελητέα επίπεδα κυτταρικής πρόσληψης τόσο καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι δεν μπορούσε να μετατοπίζονται κατά μήκος της κυτταρικής μεμβράνης (Σχ. 1Α). Ο φθορισμός από Tat-επεξεργασμένα κύτταρα επίσης σαφώς ανιχνεύθηκε τόσο στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα των καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων. Πιο Tat συσσωρευτεί στον πυρήνα από κυτταρόπλασμα, ενώ οι περισσότεροι BR2 ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένα στο ενδοκυτταρικές περιοχές (Εικ. 1Α).

(Α) Η ενδοκυτταρική διανομή του FITC-επισημασμένα πεπτίδια εξετάστηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία laser. Αμφότερα τα καρκινικά κύτταρα (HeLa, HCT116 και Β16 /F10) και φυσιολογικά κύτταρα (HaCat, BJ και ΝΙΗ 3Τ3) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 1 ημέρα πριν από το πείραμα για να φτάσει το 70% συρροή. Τα κύτταρα επωάστηκαν με FITC-επισημασμένα πεπτίδια (5 μΜ) για 30 λεπτά στους 37 ° C και πλύθηκαν τρεις φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). διανομή πεπτίδιο κατόπιν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό σάρωσης LSM 510 μικροσκόπιο λέιζερ εξοπλισμένο με ένα 40 × στόχο. (B, C)

In vitro

κυτταροτοξικότητα των πεπτιδίων. διαταραχή (Β) Μεμβράνη μετρήθηκε με γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) διαρροή από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές γραμμές 24 ώρες μετά την αγωγή πεπτιδίου. διαρροή LDH από κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα στα 10.000 κύτταρα /φρεάτιο μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1, 2, 5, 10, 20, 50 ή 100 μΜ πεπτιδίων επί 24 ώρες. απελευθέρωσης LDH από PBS επεξεργασμένα κύτταρα θεωρήθηκε ως 0% διαρροή και LDH αποδεσμεύεται από 0,2% Triton κύτταρα κατεργασμένα Χ-100 ως διαρροή 100%. (Γ) Η αιμολυτική δράση εκάστου πεπτιδίου κατά ανθρώπινα ερυθροκύτταρα αναλύθηκε σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις (0-200 μΜ) και σε σύγκριση με 0,2% Triton Χ-100 θετικός έλεγχος, για τις οποίες αιμόλυση προσδιορίστηκε ως 100%. γραμμές σφάλματος σε όλα τα στοιχεία που αντιπροσωπεύουν τα τυπικά σφάλματα των μέσων (n = 3).

Η

Για να εκτιμηθεί η

in vitro

κυτταροτοξικότητα των σχεδιασμένων πεπτιδίων, η διαρροή LDH μετρήθηκε σε καρκινικές κυτταρικές σειρές (HeLa, HCT116 και Β16 /F10) και φυσιολογικές κυτταρικές σειρές (HaCat, BJ και ΝΙΗ 3Τ3). θεραπεία BR2 (20-100 μΜ) συνδέθηκε με διαρροή LDH από τα καρκινικά κύτταρα? η διαρροή αυξάνεται σταδιακά με συγκεντρώσεις BR2, φθάνοντας περίπου 40-60% στα 100 μΜ (Εικ. 1Β

α-γ

). Ωστόσο, LDH διαρροή από τις BR2 επεξεργασμένα φυσιολογικά κύτταρα δεν ανιχνεύθηκε σε συγκεντρώσεις κάτω των 70 BR2 μΜ, και ένα ασθενές διαρροής (~ 17%) παρατηρήθηκε στα 100 μΜ (Εικ. 1 Β

d-f

). BR3 επάγεται σημαντική διαρροή LDH τόσο από καρκίνο (περ. 80-90%) και η κανονική κυτταρικές γραμμές (περ. 30%) ακόμα και στα 50 μΜ (Εικ. 1 Β

a-f

).

Για να εξετάσει περαιτέρω την κυτταροτοξικότητα των πεπτιδίων, εξετάστηκε επίσης η αιμολυτική δράση των BR1, BR2, BR3 και Tat εναντίον ανθρώπινα ερυθροκύτταρα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα διαρροή LDH, δεν αιμόλυση προκλήθηκε ακόμη και μετά τα ερυθροκύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Tat, BR1 ή BR2 κατά ≥200 μΜ, ενώ BR3 προκάλεσε αιμόλυση (≥5%) σε ≥25 μΜ (Εικ. 1 C). Στη συνέχεια, περίπου 34,3% των ερυθροκυττάρων λύθηκαν μετά από επεξεργασία με 200 μΜ BR3. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι BR2 διεισδύει αποτελεσματικά τα καρκινικά κύτταρα χωρίς κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε φυσιολογικά κύτταρα, ενώ Tat έδειξε παρόμοια διείσδυση σε δύο τύπους κυττάρων.

BR2 Διεισδύει Συγκεκριμένα καρκινικών κυττάρων σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο

Για να συγκριθεί η ποσότητα των πεπτιδίων εσωτερικεύονται σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, εκτελέσαμε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. BR2 ήταν εσωτερικεύεται πιο αποτελεσματικά σε καρκινικά κύτταρα (HeLa, HCT116 και Β16 /F10) από ό, τι στα φυσιολογικά κύτταρα (HaCat, BJ και ΝΙΗ 3Τ3)? περισσότερο από το 95% των BR2 επεξεργασμένου καρκινικά κύτταρα εσωτερικεύεται BR2, ενώ μόνο 23-34% των BR2 επεξεργασμένα φυσιολογικά κύτταρα έκανε. Ωστόσο, Tat διεισδύσει τόσο καρκίνου και φυσιολογικά κύτταρα χωρίς πολύ διάκριση (Εικ. 2Α). Ειδικά διείσδυση BR2 και Tat σε καρκινικά κύτταρα αναλύθηκε επίσης με την παρουσία και των δύο κυττάρων ινοβλαστών HeLa και BJ με συνεστιακή μικροσκοπία laser. BR2 ήταν προτίμηση προσλαμβάνονται εκλεκτικά από τα κύτταρα HeLa, ενώ η κυτταρική πρόσληψη του Tat ήταν παρόμοια και στις δύο κύτταρα ινοβλαστών HeLa και BJ (Εικ. S1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι η buforin-παράγωγο BR2 έχει εξειδίκευση καρκινικού κυττάρου, ενώ Tat δεν το κάνει.

(Α) Ανάλυση της κυτταρικής διείσδυσης αποδοτικότητα του κάθε πεπτιδίου σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. FITC-επισημασμένο Tat, BR1 και BR2 πεπτίδια (10 μΜ) προστέθηκαν σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων: HeLa, HCT116 και Β16 /F10 καρκινικά κύτταρα και HaCat, BJ και ΝΙΗ 3Τ3 φυσιολογικά κύτταρα. Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 37 ° C, οι FITC θετικά κύτταρα μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των κυττάρων με φθορισμό θετικού στο σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων. (Β) Ποσοτική εκτίμηση της κυτταρικής διείσδυσης του κάθε πεπτιδίου με κυτταρομετρία ροής. κύτταρα HeLa επωάστηκαν με FITC-επισημασμένα πεπτίδια σε συγκεντρώσεις των 1, 2, 5, ή 10 μΜ για 30 λεπτά στους 37 ° C. Στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και συλλέχθηκαν και κυτταρικού φθορισμού αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα ελέγχου δεν έλαβαν θεραπεία πεπτιδίου. Πριν από την ανάλυση, εξωκυτταρικό φθορισμός του δεσμευμένο σε επιφάνεια πεπτιδίων απομακρύνθηκε με κατεργασία με θρυψίνη (1 mg /ml για 10 λεπτά).

Η

Η ένταση φθορισμού των κυττάρων πεπτιδίου επεξεργασμένου ενισχύθηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις BR2 ή Tat. Σε συγκεντρώσεις πάνω από 5 μΜ, BR2 τέθηκε πάνω από το 80% των κυττάρων HeLa εντός 30 λεπτών (Σχ. 2Β). BR2 διεισδύσει κύτταρα πιο αποτελεσματικά από ό, τι το πεπτίδιο Tat σε κάθε εξετασθείσα συγκέντρωση. Επιπλέον, BR2 εσωτερικοποίηση για όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου (HCT116 και Β16 /F10, τα δεδομένα δεν φαίνονται) φαίνεται να είναι ομοιογενής σε ολόκληρο τον πληθυσμό των κυττάρων ως μία μοναδική αιχμή στο ιστόγραμμα. Μεταξύ των πεπτιδίων, BR1 εμφανίζεται η χαμηλότερη πρόσληψη, υποδεικνύοντας την αδυναμία της να διεισδύσει στην κυτταρική μεμβράνη, ακόμη και στα 10 μΜ.

Αρχικό ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση με θετικά φορτισμένα BR2 και αρνητικά φορτισμένων γαγγλιοσίδες επί της μεμβράνης Cancer Cell είναι απαραίτητη για την Ενέργεια εξαρτώμενη Ενδοκυττάρωση του BR2

Ο μηχανισμός κυτταρικής πρόσληψης BR2 αναλύθηκε με HeLa, τα πιο αντιπροσωπευτικά και ευρέως χρησιμοποιούμενη κυτταρική σειρά καρκίνου, σε σύγκριση με εκείνα των άλλων πεπτιδίων κυττάρου-διεισδυτική. Εξετάσαμε πρώτα την επίδραση της θερμοκρασίας στην διείσδυση BR2. Η μείωση της θερμοκρασίας δραματικά μειωμένη πρόσληψη πεπτιδίου σε κύτταρα HeLa (σχήμα 3Α).? η κυτταρική πρόσληψη BR2 και Tat στους 4 ° C μειώθηκε κατά 88,5% και 31,6%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με εκείνη που παρατηρήθηκε στους 37 ° C. Επιπλέον, μια ενέργεια που εξαρτάται από την πρόσληψη των πεπτιδίων παρατηρήθηκε επίσης όταν το κυτταρικό πισίνα ΑΤΡ εξαντλημένο προεπώαση των κυττάρων με αζίδιο του νατρίου (NaN

3). εξάντληση του ΑΤΡ μείωσε επίσης την πρόσληψη BR2 και Tat σε κύτταρα HeLa, κατά 67,7% και 42,5%, αντίστοιχα (Σχ. 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τη συμμετοχή της ενδοκύττωσης για την πρόσληψη BR2 και Tat.

(Α) Επίδραση της χαμηλής θερμοκρασίας και της εξάντλησης της ενέργειας για την εσωτερίκευση του FITC-σημασμένα πεπτίδια σε κύτταρα HeLa. Τα κύτταρα HeLa είτε προεπωάζονται στους 4 ° C ή σε προεπεξεργασία με αζίδιο του νατρίου (NaN

3) να καταστρέφουν ΑΤΡ για 1 ώρα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με 5 μΜ Tat ή BR2 επί 30 λεπτά υπό τις ίδιες συνθήκες, όπως περιγράφεται στο Υλικά και μεθόδους. πρόσληψη πεπτιδίου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. (Β) Επιπτώσεις της ενδοκυτταρικής αναστολέων για την είσοδο της BR2 και Tat. Η επίδραση των ανασταλτικών φαρμάκων επί πρόσληψη πεπτιδίου προσδιορίστηκε με προεπώαση των κυττάρων HeLa με τους αναστολείς ενδοκυττάρωση νοκοδαζόλη, αμιλορίδη ή μεθυλ-β-κυκλοδεξτρίνη για 1 ώρα πριν από την προσθήκη του ΡΙΤΟ-επισημασμένων πεπτιδίων. Μετά τη θεραπεία πεπτιδίου για 30 λεπτά στους 37 ° C, FITC-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το ποσοστό των κυττάρων με φθορισμό θετικού στο σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± s.d. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Κοινός εντοπισμός του BR2 με δείκτη λυσοσωματικής LysoTracker κόκκινο DND-99 σε ζωντανά κύτταρα HeLa. Μετά από 30 λεπτά επώασης του BR2 (5 μΜ) με LysoTracker, ζωντανές εικόνες των κυττάρων HeLa ελήφθησαν με συνεστιακή μικροσκόπηση. (D) Αποτελέσματα της αρνητικά φορτισμένα μόρια (γαγγλιοσίδες, ηπαρίνες, και σιαλικά οξέα) στην πρόσληψη πεπτιδίου. (Α, Β) κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BR2 και Tat παρουσία των γαγγλιοσιδίων, ηπαρίνες, ή σιαλικά οξέα (το καθένα, 20 μg /ml) για 30 λεπτά. Στο (c, d), κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με PPMP (5 μΜ) για να καταστρέφουν γαγγλιοσίδες. Κυτταρική πρόσληψη της BR2 και Tat προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ.