Αφηρημένο

NPRL2, ένα από τα ογκοκατασταλτικά γονίδια που διαμένουν σε 120 -Kb ομόζυγη περιοχή διαγραφής του ανθρώπινου χρωμοσώματος μπάντα 3p21.3, έχει υψηλό βαθμό ομολογίας αλληλουχίας αμινοξέων με τη ρυθμιστική περμεάση άζωτο 2 (NPR2) γονίδιο ζύμης, και οι μεταλλάξεις του

NPRL2

σε κύτταρα ζύμης συνδέονται με αντοχή στη σισπλατίνη μεσολάβηση θανάτωση κυττάρων. Προηγουμένως, δείξαμε ότι η αποκατάσταση του NPRL2 σε NPRL2-αρνητικών και cisplatin κυττάρων ανθεκτικών επαναευαισθητοποιήσουν καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα στη θεραπεία της σισπλατίνης

in vitro και in vivo

. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η ευαισθητοποίηση των κυττάρων μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) στη σισπλατίνη με NPRL2 επιτυγχάνεται μέσω της ρύθμισης των βασικών στοιχείων στην οδό οδοφράγματος βλάβη του DNA. NPRL2 να φωσφορυλιώνει αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαχθεί (ΑΤΜ) κινάση που ενεργοποιείται από τη σισπλατίνη και την προώθηση του σχηματισμού κατάντη γ-H2AX

in vitro

και

in vivo

, η οποία εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της απόπτωσης ταυτόχρονα με την αρχική εμφάνιση της υψηλής DNA θραύσματα μοριακού βάρους. Επιπλέον, αυτός ο συνδυασμός θεραπείας οδηγεί σε υψηλότερη δραστηριότητα κινάσης Chk1 και Chk2 από ό, τι θεραπεία μόνο με σισπλατίνη και μπορεί να ενεργοποιήσει Chk2 στον υπεζωκότα μεταστάσεις ξενομοσχεύματος όγκου σε ποντίκια. Ενεργοποιημένος Chk1 και Chk2 αυξάνουν την έκφραση των πρωτεϊνών σημείου ελέγχου κύκλου κυττάρου, συμπεριλαμβανομένων cdc25A και Cdc25C, οδηγώντας σε υψηλότερα επίπεδα G2 /M σύλληψης σε κύτταρα όγκου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NPRL2 και σισπλατίνη σε σύγκριση με καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με μόνο σισπλατίνη. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η έκτοπη έκφραση NPRL2 ενεργοποιεί τη βλάβη του DNA οδοφράγματος της οδού στην σισπλατίνη ανθεκτικά και NPRL2-αρνητικά κύτταρα? ως εκ τούτου, ο συνδυασμός των NPRL2 και cisplatin μπορεί επαναευαισθητοποιήσουν αρνηθέντων σισπλατίνης στη σισπλατίνη θεραπεία μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού σημείου ελέγχου βλάβης του DNA, οδηγώντας σε κυτταρικό σύλληψη στη G2 /M φάση και επαγωγή απόπτωσης. Η άμεση επίπτωση αυτής της μελέτης είναι ότι η θεραπεία συνδυασμού με NPRL2 και σισπλατίνη μπορεί να ξεπεράσει την αντίσταση σισπλατίνη και την ενίσχυση της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας

Παράθεση:. Jayachandran G, Ueda Κ, Wang Β, Roth JA, Ji L (2010)

NPRL2

ευαισθητοποιεί τα Ανθρώπινα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), κύτταρα με Cisplatin Θεραπεία ρυθμίζοντας βασικά στοιχεία στην οδό επιδιόρθωσης του DNA. PLoS ONE 5 (8): e11994. doi: 10.1371 /journal.pone.0011994

Επιμέλεια: Kerstin Borgmann, Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου-Eppendorf, Γερμανία

Ελήφθη: 7, Δεκέμβρη, 2009? Αποδεκτές: 9 Ιούλη του 2010? Δημοσιεύθηκε: 5 Αυγούστου 2010

Copyright: © 2010 Jayachandran et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, SPORE P50CA70907, R01CA116322 και MMHCC U01CA10535201? επιχορηγήσεις από το Υπουργείο Άμυνας καρκίνο του πνεύμονα Πρόγραμμα ΠΡΟΟΠΤΙΚΗ (DAMD17-02-1-0706)? Το Πανεπιστήμιο του Τέξας Μ D. Anderson Κέντρο Καρκίνου Υποστήριξη πυρήνα Grant (CA-16672)? και μια επιχορήγηση από τα χρήματα διακανονισμού καπνού όπως ιδιοποιηθεί από το κρατικό νομοθετικό σώμα του Τέξας. Οι οργανισμοί χρηματοδότησης είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

NPRL2 /Gene 21

(GenBank # AF040707), το οποίο έχει μήκος 1351 bp και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη υπολειμμάτων 380 αμινοξέων, είναι ένα από τα γονίδια καταστολέα όγκου προσδιορίζονται σε 120 -Kb ομόζυγη περιοχή διαγραφή στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 3p21.3 ζώνη [1], [2]. Η συχνή και πρόωρη απώλεια της ετεροζυγωτίας και τα επικαλυπτόμενα ομόζυγη εξαλείψεις που παρατηρούνται στην περιοχή 3p21.3 στον πνεύμονα και του μαστού υποδεικνύουν έναν κρίσιμο ρόλο ενός ή περισσοτέρων 3p21.3 γονίδια στο μοριακή παθογένεση αυτών των καρκίνων [1], [3] .

Ο ρυθμιστής περμεάση άζωτο 2 (NPR2) γονίδιο ζύμης (GenBank # P39923) αναγνωρίστηκε ως νέο συστατικό που εμπλέκονται στην θανάτωση των κυττάρων προκαλείται από τη σισπλατίνη. Λόγω διακοπής του NPR2 δείχθηκε να προσδίδουν αντοχή σε σισπλατίνη, πίστευαν ότι NPRL2 μπορεί να χρησιμοποιήσει ένα παρόμοιο μηχανισμό για να μεσολαβήσει την κυτταροτοξικότητα των αντικαρκινικών φαρμάκων [4]. Πρόσφατα βρέθηκε ότι η επανέκφραση του NPRL2 σε NPRL2-αρνητικών και cisplatin κυττάρων ανθεκτικών ξαναευαισθητοποιημένου σημαντικά την απόκριση αυτών των κυττάρων στη θεραπεία σισπλατίνη, όπως αποδεικνύεται από μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και αυξημένη απόπτωση

in vitro

και

σε vivo

[5]. Ωστόσο, τα μοριακά γεγονότα υπεύθυνοι για επαναευαισθητοποίηση με σισπλατίνη από

NPRL2

δεν έχουν εντοπιστεί. Σε αυτή τη μελέτη, προσπαθούμε να καταλάβουμε τη μοριακή σύνδεση μεταξύ NPRL2 και σισπλατίνη στην υπερνίκηση της αντίστασης στα φάρμακα.

Τα αποτελέσματα της σισπλατίνης μεσολάβηση υψηλά επίπεδα βλάβης του DNA, που οδηγεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο ή τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου [6 ]. Τα δίκλωνα σπασίματα του DNA που προκαλείται από τη σισπλατίνη μεσολάβηση ενός κεντρικού DNA μονοπάτι βλάβη σηματοδότησης που ελέγχονται από την αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) κινάση, καθώς και αρκετές άλλες ζημιές που αποκρίνονται κινάσες DNA [7], [8]. Η φωσφορυλίωση του ΑΤΜ στη σερίνη-1981 έχει αποδειχθεί ότι φωσφορυλιώνει ιστόνη Η2ΑΧ [9], και το φωσφορυλίωση της ιστόνης Η2ΑΧ στη σερίνη-139 (γ-Η2ΑΧ) είναι απαραίτητη για την πρόσληψη μεσολαβητών όπως MDC1 (μεσολαβητής του σημείου ελέγχου βλάβης του DNA πρωτεΐνη 1), 53BP1 (πρωτεΐνη σύνδεσης ρ53 1), BRCA1 (καρκίνος του μαστού 1), και MRE11 (μειωτικού ανασυνδυασμού 11) -RAD50 (ακτινοβολία ευαίσθητος 50) -NBS1 (σύνδρομο θραύσης του Nijmegen 1) σύμπλοκο [10] – [13]. Φωσφο-ATM διευκολύνει την φωσφορυλίωση αυτών των μεσολαβητών, και ο σχηματισμός των πυρηνικών εστιών των ενεργοποιημένων μορίων προάγει τη μετάδοση του σήματος βλάβης του DNA σε κατάντη στόχους, όπως Chk1 (ελέγξτε σημείο κινάση 1), Chk2 (έλεγχος σημείο κινάση 2), και SMC1 (δομική συντήρηση των χρωμοσωμάτων 1) [14] – [16]. Chk1 και Chk2 εμπλέκονται σε διάφορες αποκρίσεις βλάβη του DNA, συμπεριλαμβανομένων σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, συντήρηση του γονιδιώματος, την επιδιόρθωση του DNA, και η απόπτωση [17].

Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η ευαισθητοποίηση των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κυττάρων σε σισπλατίνη με NPRL2 μπορεί να οφείλεται στην άμεση ρύθμιση των βασικών στοιχείων στην οδό οδοφράγματος βλάβη του DNA. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, αναλύσαμε αποτελέσματα της έκτοπη έκφραση της NPRL2 παρουσία ή απουσία του cisplatin παράγοντα προκαλούν βλάβη στο DNA στην κυτταρική ανάπτυξη του όγκου και απόπτωση σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC με ποικίλη κατάσταση του ενδογενούς γονιδίου NPRL2 και η έκφραση πρωτεΐνης και την ευαισθησία σισπλατίνη. Δείχνουμε ότι επανέκφραση του NPRL2 σε NPRL2 αρνητικά και σισπλατίνη-ανθεκτικά κύτταρα ενεργοποιεί σημαντικά αυτά τα βασικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων των ΑΤΜ, Chk και H2AX, και επανα-ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα με σισπλατίνη θεραπεία

in vitro

και

στο vivo

, οδηγώντας σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2 /M και επαγωγή της απόπτωσης. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης δανείσει επίσης πειραματική υποστήριξη για την υπόθεσή μας ότι NPRL2 μπορεί να λειτουργήσει όχι μόνο ως ένα προγνωστικό βιοδείκτη για την ευαισθησία στην σισπλατίνη, αλλά και ως θεραπευτικό μέσο για resensitizing μη ανταποκρινόμενοι στα καρκινικά κύτταρα να σισπλατίνη.

Υλικά και μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο NSCLC κυτταρικές σειρές Η1299 [5] και H322 [5], με περιγράφεται διάφορα 3p21.3 κατάσταση στο παρελθόν [18], [19], ήταν χρησιμοποιείται για

in vitro

και

in vivo πειράματα

. Η1299 και H322 είναι σισπλατίνη ανθεκτικά (50% ανασταλτική συγκέντρωση [IC

50] και IC

20 τιμές για τη σισπλατίνη σε Η1299 ήταν 7,6 και 3,0 μΜ, αντίστοιχα, και σε H322 ήταν 13,1 και 5,0 μΜ, αντίστοιχα, όπως αξιολογούνται με δοκιμασία ΧΤΤ) και δεν εκφράζουν NPRL2 πρωτεΐνη (όπως εκτιμάται με κηλίδωση Western) [5]. Ο NSCLC κυτταρική σειρά σισπλατίνη ευαίσθητα H1437 και σισπλατίνη ανθεκτική κυτταρική γραμμή H1437R έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [5].

Τα αντισώματα, αντιδραστήρια, και τη δοσολογία

Anti-ATM (5C2), αντι- Chk1 (G-4), αντι-Chk2 (Η-300), αντι-cdc25A (F-6), αντι-κυκλίνης Β1 (GNS1), και αντι-κασπάση-2 (Η-19) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντι-φωσφο-Chk1 (Ser345), αντι-φωσφο-Chk2 (Thr68), αντι-φωσφο-Chk1 (Ser345), αντι-NBS1, αντι-φωσφο-NBS1 (Ser343), αντι-SMC1, αντι-φωσφο-Cdc25C ( Ser216), αντι-φωσφο-Cdc2 (Tyr15), αντι-κασπάση-3, και αντι-κασπάση-9 αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Anti-ATM πρωτεϊνικής κινάσης pS1981 ήταν από Ρόκλαντ Immunochemicals (Gilbertsville, PA), αντι-φωσφο-ιστόνης Η2ΑΧ (Ser139) ήταν από την Upstate Biotechnology (Lake Placid, ΝΥ), αντι-φωσφο-SMC1 ήταν από Novus Biologicals (Littleton, CO) και αντι-κασπάση-8 και αντι-πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) ήταν από BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA).

Για όλες κηλίδωση Western, αντι-β-ακτίνης (Sigma , St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η σισπλατίνη αγοράστηκε από τη Bristol-Myers Squibb Company (Princeton, NJ). ΫΟΤΑΡ χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση των φορέων πλασμιδίου σε κύτταρα Η1299 και H322. θεραπεία Cisplatin ήταν πάντα χορηγείται σε κύτταρα στο IC

20 δόσης (5). ΫΟΤΑΡ: χοληστερόλη (ϋΟΤΑΡ: Chol). (20 mM) σε 5% δεξτρόζη σε νερό, το οποίο χρησιμοποιείται για

in vivo

πειράματα, συνετέθη από το εργαστήριο μας με χρήση των τυποποιημένων διαδικασιών που περιγράφηκαν προηγουμένως [5]

Κατασκευή του πλασμιδίου φορέων που εκφράζουν NPRL2

NPRL2 cDNA αποκόπηκε από το πλασμίδιο pAd-RAP-NPRL2 [2] που περιέχει ανθρώπινο cDNA NPRL2 και συνδέθηκε εντός της θέσης πολυκλωνοποίησης του φορέα έκφρασης pdCpG-KGB2. Η στρατηγική κλωνοποίησης έχει περιγραφεί προηγουμένως [5]. Κενό φορέα (pdCpG-KGB2) και ένας φορέας πλασμίδιο που εκφράζει το γονίδιο LacZ χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. προηγουμένως Είχαμε επιβεβαίωσε ότι η διαμόλυνση με το φορέα αυτό NPRL2 θα μπορούσε πράγματι να εκφράσει εξωγενή πρωτεΐνη NPRL2

in vitro

και

in vivo

[5] με τη χρήση αντι-NPRL2 αντίσωμα αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, ΜΑ ).

χρώση ανοσοφθορισμού και με κυτταρομετρία ροής αναλύσεις για γ-H2AX

χρώση ανοσοφθορισμού εκτελέσθηκε σε κύτταρα καλλιεργούνται σε διαφάνειες θάλαμο. Κατά ορισθεί χρονικά σημεία, τα κύτταρα Η1299 σε επεξεργασία με NPRL2 με ή χωρίς σισπλατίνη σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και επωάστηκαν με αντι-φωσφο-ιστόνης Η2ΑΧ (Ser139) (1:100) αντισωμάτων σε 5% φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) με βόεια λευκωματίνη ορού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με ισοθειοκυανική γαϊδάρου αντι-ποντικού IgG-φλουορεσκεΐνη (FITC) (Santa Cruz Biotechnology) αραιωμένο 1:100 σε PBS για 45 min, και τα δείγματα τοποθετήθηκαν με Vectashield μέσο στερέωσης με 4 ‘, 6-diamidino- 2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) αιματοξυλίνης οι πυρήνες. Αμέσως, τα πλακίδια εξετάστηκαν με χρήση ενός μικροσκοπίου φθορισμού. Επίσης, μετά την επώαση του αντισώματος FITC, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και FITC-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Chk1 και Chk2 δραστικότητα κινάσης δοκιμασία

Chk1 και Chk2 δραστικότητα κινάσης σε κύτταρα Η1299 σε επεξεργασία με NPRL2 με ή χωρίς ένα IC

20 αξία της σισπλατίνης αξιολογήθηκαν με χρήση ενός K-LISA Checkpoint Activity Kit (EMD Biosciences, San Diego, CA), το οποίο είναι ένα ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) δοκιμασία με έδρα δραστηριότητα. Εν συντομία, Η1299 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πιάτα 60-mm σε 4 × 10

5 κύτταρα ανά τρυβλίο και την επόμενη ημέρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 4 μg του κενού φορέα ή NPRL2 με ή χωρίς 3,0 μΜ cisplatin. Μετά από 72 ώρες επώασης, λύματα κυττάρων παρασκευάστηκαν με χρήση του προσδιορισμού ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) /PBS ρυθμιστικό (1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% δωδεκυλθειικό νάτριο [SDS]). Τα κυτταρικά λύματα (0,5 ml με ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης 2 mg /ml) προ-καθαρίζεται με την προσθήκη 15 μΙ σφαιριδίων αγαρόζης πρωτεΐνης Α /πρωτεΐνης G-Plus (Santa Cruz Biotechnology) και επωάζονται για 15 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από φυγοκέντρηση, τα προ-καθαριστεί λύματα μεταφέρθηκαν σε ένα νέο σωλήνα με 20 μΐ Chk1 ή Chk2 αντίσωμα και περιστρέφεται για 1 ώρα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 50 μΙ σφαιριδίων αγαρόζης G-Plus πρωτεΐνη Α /πρωτεΐνης και περιστρέφεται για 90 λεπτά στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια αγαρόζης πλύθηκαν με ρυθμιστικό RIPA /PBS, και ένα Κ-LISA Checkpoint Activity Kit χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δραστικότητα προσδιορίστηκε με ανάγνωση της απορρόφησης σε διπλά μήκη κύματος 450 και 570 nm με χρήση ενός συμβατικού ανάγνωσης πλάκας ELISA.

Παραγωγή σταθερών κλώνων κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα με σύντομης παρεμβολής RNA διαμεσολαβούμενη γονιδιακή σίγηση Chk2

Για να δημιουργηθούν κυτταρικές γραμμές με σταθερά νοκ ντάουν της έκφρασης Chk2, αρχικά προβλήθηκε τέσσερις σύντομες RNAs παρεμβολής (siRNAs) κλωνοποιήθηκε σε διπλό φορείς έκφρασης υποκινητή (U6-H1) αγοράστηκε από το Σύστημα Βιοεπιστημών (Mountain View, CA). Εν συντομία, ο φορέας υποβλήθηκε σε πέψη με BbsI και συνδέθηκε με το ανοπτημένο Chk2 siRNA σχεδιαστεί με βάση την web-based εργαλεία. Όλα τα oligos αίσθηση είχε AAAG στο 5 ‘άκρο, και όλα τα ολιγονουκλεοτίδια αντινόημα είχαν αλληλουχία ΑΑΑΑ στο 5’ άκρο. Συμπεριλάβαμε επίσης μία μεταλλαγμένη ως έλεγχος. Οι αλληλουχίες ήταν ως εξής: CHK2Si1: 5’aaagGAACCTGAGGACCAAG3 ‘? CHK2ASi1: 5’aaaaCTTGGTCC TCAGGTTC3 «? CHK2Si2: 5’aaagCGCCGTCCTTTGAATA 3 ‘? CHK2ASi2: 5’aaaaTATTC AAAGGACGGCG3 «? CHK2Si3: 5’aaagAACGGTATTATACAC CHK2ASi3: 5’aaaaGTG TATAATACCGTT 3 ‘? CHK2Si4: 5’aaagAGTTTCAAGATCTTCTGTC 3 ‘? CHK2ASi4: 5’a aaaGACAGAAGATCTTGAAACT 3 ‘? CHK2Simta: 5’aaagGCTAGCTAGTCGATC 3 ‘? CHK2Simtb: 5’aaaaGATCGACTAGCTAGC3 ». Σταθεροί κλώνοι επιλέχθηκαν με χρήση της πουρομυκίνης (1 μg /ml)? και μετά τη βεβαίωση, αυτές εξετάστηκαν για επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Chk2 σχέση με το μάρτυρα. Ο κλώνος με το καλύτερο αποτέλεσμα σίγηση (CHK2Si1 και CHK2ASi1) επιλέχθηκε για τις λειτουργικές μελέτες.

Παροδική σίγηση της γονιδιακής έκφρασης NPRL2 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα.

Για την παροδική εξουδετέρωση της έκφρασης NPRL2, χρησιμοποιήσαμε συνθετικά έλικος siRNAs διπλό για τη στόχευση του mRNA που κωδικοποιεί αλληλουχία NPRL2 και τα αντίστοιχα κωδικοποιημένα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν σαν μη-ειδικούς ελέγχους. Μια SMART-pool των τεσσάρων On-στόχο NPRL2 ειδικά siRNAs χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη: οι αλληλουχίες στόχους ήταν 5’GCAUCGAACACAAGAAGUA 3 ‘, 5’GCAAGACAGGCAUGAGCUA 3’, 5’GUACUACGGCGUUGUGACA 3 ‘, και 5’GAC CCAAGAUCACCUAUCA 3’. Αυτά τα siRNAs αγοράστηκαν από Dharmacon (Lafayette, CO). κύτταρα Η1299 συν-επιμολύνθηκαν με NPRL2 εκφράζουν πλασμίδιο και NPRL2-siRNAs, και κενό πλασμίδιο φορέα και κωδικοποιημένα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες, αντίστοιχα. Τα κύτταρα πρώτα διαμολύνονται με φορέα πλασμιδίου NPRL2 χρησιμοποιώντας Fugene 6 (Roche, Indianapolis, ΙΝ) με 2,5 μg του DNA για 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων. Έξι ώρες μετά την διαμόλυνση του πλασμιδίου, το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​ένα χωρίς αντιβιοτικά και τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με siRNAs χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης DharmaFECT με 50 μΜ του siRNA συμπλεγμένο με 5 μΐ DharmaFECTper καλά στο παραπάνω πλάκα 6 φρεατίων. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24, 48, και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση για την παρασκευή των προϊόντων λύσεως πρωτεΐνης αργού για ανάλυση Western blot.

Ανοσοκαθίζηση-κηλίδος Western αναλύσεις

Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4 μg του κενού φορέα ή NPRL2 με ή χωρίς 3,0 μΜ cisplatin. Μετά από 72 ώρες επώασης, λύματα κυττάρων παρασκευάστηκαν με χρήση ρυθμιστικού διαλύματος RIPA /PBS (1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS). Μετά από αποκλεισμό με 1 μg κανονικής IgG και 20 μΙ πρωτεΐνης Α /πρωτεΐνης G-Plus σφαιρίδια αγαρόζης (Santa Cruz Biotechnology), πρωτεΐνη ανοσοκαταβυθίστηκε από 500 μg εκχυλίσματα με τη χρησιμοποίηση 2 μα αντι-Cdc2 ή αντι-κυκλίνης Β1 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology) και 30 μΙ σφαιριδίων αγαρόζης G-Plus πρωτεΐνης Α /πρωτεΐνης για 5 ώρες στους 4 ° C. Η αγαρόζη συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση και στη συνέχεια πλύθηκαν τέσσερις φορές με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα PBS. Στη συνέχεια, οι ανοσοϊζήματα επαναιωρήθηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS και θερμαίνεται με 50 mM DTT στους 95 ° C για 5 λεπτά? Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

Ανάλυση κινητική του κυτταρικού κύκλου

Οι αλλαγές στην κινητική του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα όγκου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NPRL2 με ή χωρίς σισπλατίνη αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (με χρήση ενός ενεργοποιημένων με φθορισμό ταξινομητή κυττάρων [FACS]) χρησιμοποιώντας ένα APO-BRDU KIT (BD Biosciences Pharmingen). Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 60-mm σε 4 × 10

5 κύτταρα ανά δίσκο? την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4 μg του κενού φορέα ή φορέα NPRL2 εκφράζουν με ή χωρίς σισπλατίνη. Κατά ορισθεί χρονικά σημεία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη. Μετά την ενσωμάτωση του 5-βρωμο-2′-δεοξυουριδίνη 5′-τριφωσφορικά (BrdUTPs), κύτταρα έγιναν ορατά με χρήση ΡΙΤΟ-επισημασμένο αντίσωμα αντι-BrdU. Η ποσότητα του ολικού κυτταρικού DNA ελήφθη με χρώση των κυττάρων με ΡΙ ρυθμιστικού /ΚΝάσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση FACS με τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλτρανσφεράσης μεσολάβηση δεοξυουριδίνη 5-τριφωσφορική (dUTP) nick-άκρο επισήμανση (χρώση TUNEL) για να προσδιοριστεί η κινητική του κυτταρικού κύκλου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

Μελέτες σε ζώα

Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν και τα πειράματα που εκτελούνται σύμφωνα με το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας και θεσμικές κατευθύνσεις που έχει θεσπίσει για τον Μηχανισμό των ζώων πυρήνα στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου. Τα ζώα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν γυναίκες

Νυ /ηυ

ποντίκια (ηλικίας 4-6 εβδομάδων) που αγοράστηκαν από Charles River Laboratories (Wilmington, ΜΑ). Πριν ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε 3.5 Gy του ολική ακτινοβόληση του σώματος από μια πηγή ακτινοβολίας καισίου-137 για να καταστήσει εντελώς το ανοσοποιητικό σύστημα άτριχων ποντικών από απόρριψη του ξενομεταμόσχευση όγκου. Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της συστηματικής χορήγησης NPRL2 και cisplatin σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο του υπεζωκότα διάδοσης, οι ποντικοί έλαβαν μια ενδοθωρακική ένεση (βελόνα 27-gauge) ενός εναιωρήματος κυττάρων H322 σε πυκνότητα 2 × 10

6 κύτταρα ανά 100 μΙ. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία στις ακόλουθες 4 ομάδες: Α, υποβάλλεται σε επεξεργασία με LacZ? Β, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με LacZ και σισπλατίνη? C, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NPRL2? και D, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NPRL2 και σισπλατίνη. . Κάθε ομάδα θεραπείας αποτελείτο από 2 ποντίκια

Την ημέρα 26, χορηγήσαμε διάφορες νανοσωματιδίων (DOTAP: Chol-DNA σύμπλοκο) ενδοφλεβίως στις φλέβες της ουράς όλων των ποντικών σε δόση 25 μg πλασμιδίου DNA (LacZ ή NPRL2 πλασμίδιο) και 10 nmol του ϋΟΤΑΡ: Chol κάθε σε 100 μΙ 5% δεξτρόζη σε νερό ανά ποντικό. Στις ομάδες Β και D, ενέθηκε cisplatin (2,5 mg /kg σωματικού βάρους) ενδοπεριτοναϊκώς μαζί με τα νανοσωματίδια. Για την εκτίμηση γ-Η2ΑΧ και φωσφο-Chk2 (Thr68) έκφραση σε όγκους, οι ποντικοί sscrificed 48 ώρες αργότερα, και οι υπεζωκότα όγκων (μεγαλύτερο από 5 mm) από κάθε ομάδα επιλέχθηκαν τυχαία συλλέχθηκαν και καταψύχθηκαν flash. γ-Η2ΑΧ έκφραση εκτιμήθηκε με αντι-φωσφο-ιστόνης Η2ΑΧ (Ser139) (1:100) αντίσωμα και γαϊδάρου αντι-ποντικού IgG-FITC. Τα δείγματα στη συνέχεια τοποθετείται με Vectashield με ϋΑΡΙ αιματοξυλίνης οι πυρήνες. Αμέσως, τα πλακίδια εξετάστηκαν με χρήση ενός μικροσκοπίου φθορισμού. Επίσης, η έκφραση φωσφο-Chk2 αναλύθηκε με αντι-φωσφο-Chk2 αντίσωμα (Thr68) (1:100) χρησιμοποιώντας ένα κιτ Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories) και ακολούθως εξετάστηκαν μικροσκοπικά.

Στατιστικές αναλύσεις

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές με εις διπλούν ή εις τριπλούν δείγματα. ANOVA και δοκιμή του Fisher χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση των τιμών των δειγμάτων δοκιμής και ελέγχου.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. StatView 5.0 του λογισμικού (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις.

Αποτελέσματα

Πρόκληση δραστηριοτήτων κασπάσης στην ανταπόκριση στη θεραπεία με NPRL2 και σισπλατίνη

NPRL2 ευαισθητοποιεί cisplatin-ανθεκτικών κυττάρων (H1437R) στη σισπλατίνη που προκαλείται από απόπτωση (Σχήμα 1Α). Αυξημένη απόπτωση ανιχνεύθηκε σε όλα τα τρία NPRL2-αρνητικά, σισπλατίνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές σε επεξεργασία με εξαναγκασμένη έκφραση του NPRL2 και σισπλατίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η απόπτωση προκλήθηκε σε 33,4%, 42,0% και 21,8% των H1437R, Η1299 και κύτταρα H322, αντίστοιχα, μετά από συνδυασμένη θεραπείες. Χρησιμοποιήσαμε επίσης κηλίδωση Western για να προσδιοριστεί η ενεργοποίηση των κασπασών σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με κενό φορέα, κενό φορέα συν σισπλατίνη, NPRL2, ή NPRL2 συν cisplatin (Σχήμα 1Β). Caspase-3, -8, -9 και ενεργοποιήθηκαν μόνο σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με NPRL2 και σισπλατίνη, όπως φαίνεται από τα προϊόντα διάσπασης. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-2 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη ή NPRL2 μόνες, καθώς και το συνδυασμό.

(Α) Επαγωγή απόπτωσης σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα NPRL2 παρουσία ή απουσία του cisplatin (CDDP) με ροή ανάλυση κυτταρομετρίας με χρώση TUNEL. Η αγωγή με PBS και κενό φορέα (EV) επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως εικονικές και αρνητικοί έλεγχοι, αντίστοιχα. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν ΠΒ του μέσου σε τρία ξεχωριστά πειράματα (*,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0.0005). (Β), η ενεργοποίηση των καταρρακτών κασπάσης σε Η1299 κύτταρα με ανάλυση κηλίδας Western. Αρκετές κασπάσες σε Η1299 κύτταρα εξετάστηκαν με κηλίδωση Western 72 ώρες μετά την αγωγή με κενό φορέα (EV) (με ή χωρίς τη σισπλατίνη) ή με NPRL2 (με ή χωρίς τη σισπλατίνη). Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με NPRL2 και σισπλατίνη, 3-κασπασών, -2, -8, -9 και και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) αποκόπηκαν. Επίσης, κασπάσης-2 ενεργοποιήθηκε με κατεργασία με μόνο NPRL2.

Η

Ενεργοποίηση των ΑΤΜ και NBS1 από NPRL2

Χρησιμοποιήσαμε ανάλυση Western κηλίδωση να αξιολογήσει την ενεργοποίηση των ΑΤΜ στην Η1299 κύτταρα απόκριση προς έκτοπη ενεργοποίηση NPRL2 παρουσία ή απουσία του cisplatin (Σχήμα 2Α). Σε Η1299 κύτταρα επιμολυσμένα με NPRL2, εντοπίσαμε ένα χαμηλό επίπεδο φωσφόρου ATM (Ser1981) που είχε ενεργοποιηθεί με κινάση ΑΤΜ? μετά την αγωγή με σισπλατίνη και NPRL2, το επίπεδο φωσφόρου ATM σημαντικά αυξημένη σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε Η1299 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με κενό φορέα ελέγχου και σισπλατίνη, ανιχνεύσαμε καμία αλλαγή στην έκφραση φωσφόρου-ATM σε σχέση με το μάρτυρα. Εξετάσαμε επίσης την έκφραση της φωσφο-NBS1 (Ser343) (Σχήμα 2Α), το οποίο φωσφορυλιώνεται από ενεργοποιημένα ΑΤΜ και προσλαμβάνονται σε θέσεις βλάβης του DNA για την προώθηση της μετάδοσης μιας σειράς σημάτων βλάβης του DNA σε μεταγενέστερους στόχους. Αν και φωσφο-NBS1 δεν ανιχνεύθηκε σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με κενό φορέα και σισπλατίνη, είναι ανιχνεύθηκε σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με NPRL2, και ουσιαστικά αυξημένη σε χρονο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από θεραπεία με NPRL2 και τη σισπλατίνη.

( Α), Επιδράσεις της έκτοπη έκφραση της NPRL2 στην έκφραση και την φωσφορυλίωση των κυττάρων ΑΤΜ και NBS1 proteins.H1229 αντιμετωπίζονται με έναν φορέα κενό φορέα (EV) και IC

20 δόση της σισπλατίνης (3,0 μΜ), NPRL2, ή NPRL2 και IC

20 δόση σισπλατίνης συλλέχθηκαν στις 24, 48, και 72 ώρες μετά την επεξεργασία και αναλύθηκαν για έκφραση του αταξία τελαγγειεκτασία μεταλλαγμένου (ΑΤΜ) κινάση, φωσφο-ATM (Ser1981), NBS1, και φωσφο-NBS1 (Ser343). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αυξήσεις σε φωσφο-ATM και φωσφο-NBS1 παρατηρήθηκαν σε κύτταρα κατεργασμένα με NPRL2 ή NPRL2 και σισπλατίνη σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά όχι σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τον έλεγχο κενό φορέα και σισπλατίνη. (Β), Effects of NPRL2 ειδικά siRNA (Si) για την έκφραση πρωτεϊνών NPRL2 και ATM υπό την παρουσία και απουσία του σισπλατίνη (CDDP). Το κωδικοποιημένο siRNA (Sc) χρησιμοποιήθηκε ως μη ειδικό έλεγχο.

Η

Η ειδικότητα του NPRL2 μεσολάβηση ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης ATM επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με πειράματα που χρησιμοποιούν το γονίδιο-ειδικό siRNAs να knockdown NPRL2 έκφραση παρουσία και απουσία σισπλατίνη σε αυτά τα κύτταρα Η1299 (Σχήμα 2Β). Έκτοπη ενεργοποίηση NPRL2 σε κύτταρα Η1299 NPRL2 ελλειμματικών ενεργοποιούνται ATM, όπως υποδεικνύεται από την υπερέκφραση φωσφο-ATM σε 24 ώρες και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τόσο παρουσία όσο και απουσία της σισπλατίνης. Νοκ ντάουν της έκφρασης NPRL2 από NPRL2 ειδικά siRNAs μειωθεί ή να μειωθεί το NPRL2 μεσολάβηση προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης φωσφο-ATM, σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία κωδικοποιημένα siRNA που ελέγχει στα ίδια χρονικά σημεία.

NPRL2 ενισχύει την έκφραση της γH2AX

in vitro

και

in vivo

Η

Χρησιμοποιήσαμε κηλίδωση Western για ένα χρόνο αξιολόγησης πορεία της έκφρασης πρωτεΐνης γ-Η2ΑΧ (Σχήμα 3Α). Σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με κενό φορέα και σισπλατίνη ή NPRL2, τα επίπεδα πρωτεΐνης γ-Η2ΑΧ αυξηθεί και ήταν το ίδιο με 24 και 48 ώρες μετά την αγωγή. Ωστόσο, μέχρι 72 ώρες, τα επίπεδα πρωτεΐνης γ-Η2ΑΧ σε κύτταρα επεξεργασμένα με κενό φορέα και σισπλατίνη μειώθηκε σημαντικά, ενώ τα επίπεδα σε κύτταρα κατεργασμένα με NPRL2 παρέμεινε σχεδόν τα ίδια με εκείνα στις 24 ώρες και 48-h χρονικά σημεία. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ένα συνδυασμό NPRL2 και σισπλατίνη, τα επίπεδα πρωτεΐνης γ-Η2ΑΧ αυξήθηκαν σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο.

H1229 κύτταρα επεξεργασμένα με ένα άδειο φορέα και IC

20 δόση της σισπλατίνης (3,0 μΜ) , NPRL2, ή NPRL2 και IC

20 δόση σισπλατίνης συλλέχθηκαν στις 24, 48, και 72 ώρες μετά τη θεραπεία. (Α) Western στύπωμα δείχνει αξιοσημείωτα ενισχυμένη έκφραση του γ-Η2ΑΧ σε κύτταρα επεξεργασμένα με NPRL2 και σισπλατίνη σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα με κενό φορέα και σισπλατίνη. έκφρασης (Β) γ-Η2ΑΧ εξετάστηκε στις 48 ώρες μετά την αγωγή με χρώση ανοσοφθορισμού και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. γ-Η2ΑΧ έκφραση ανιχνεύθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με κενό φορέα και σισπλατίνη ή NPRL2 αλλά όχι σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με μόνο κενό φορέα, και αυτή η έκφραση ενισχύθηκε δραματικά σε κύτταρα επεξεργασμένα με NPRL2 και σισπλατίνη. Μεγέθυνση: × 800. Η μέση ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) Ένταση Εξετάστηκε επίσης στις 24, 48, και 72 ώρες μετά τη θεραπεία. Σε αυτά τα τρία χρονικά σημεία, η έκφραση γ-Η2ΑΧ σε κύτταρα επεξεργασμένα με NPRL2 και σισπλατίνη ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι σε κύτταρα σε όλες τις άλλες θεραπείες (

P

& lt? 0,02 ή

P

& lt? 0,0005 ). Μπαρ, ΠΒ του μέσου όρου σε δύο επιμέρους πειράματα. έκφραση (Γ) γ-Η2ΑΧ αναλύθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο H322 υπεζωκότα διάδοσης, όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Τα υπεζωκότα καρκινικά κύτταρα από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με LacZ και σισπλατίνη ή NPRL2 ήταν ασθενώς χρωματισμένο? Αντίθετα, γ-Η2ΑΧ υπερεκφράζονται σε κύτταρα κατεργασμένα με NPRL2 + σισπλατίνη. Μεγέθυνση:. × 400

Η

Στη συνέχεια, χρώση ανοσοφθορισμού και κυτταρομετρική ανάλυση για έκφραση γ-Η2ΑΧ ροή στις 48 ώρες μετά έγινε κατεργασία (Σχήμα 3Β). Η έκφραση της έκφρασης πρωτεΐνης γ-Η2ΑΧ στους πυρήνες των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με αμφότερα NPRL2 και σισπλατίνη ενισχύθηκε σε σύγκριση με ότι σε όλες τις άλλες ομάδες. Επιπλέον, η μέση ένταση του FITC NPRL2 και θεραπεία σισπλατίνη ήταν σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με εκείνη όλων των άλλων θεραπειών (

P

& lt? 0,02). Κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας

έκφραση πρωτεΐνης

γ-Η2ΑΧ ήταν στη συνέχεια μετράται σε ένα ανθρώπινο NSCLC H322 ορθοτοπική υπεζωκότα ξενομοσχεύματος όγκου σε ποντίκια. Η κυτταρική σειρά H322 είναι NPRL2-αρνητικό και σισπλατίνη ανθεκτικά. Την ημέρα 26 μετά ενδοθωρακική ένεση κυττάρων H322, χορηγήσαμε NPRL2 ή LacZ νανοσωματιδίων στη φλέβα της ουράς με ή χωρίς ενδοπεριτοναϊκή ένεση σισπλατίνης. Οι υπεζωκότα όγκοι από τους ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με LacZ μαζί με σισπλατίνη ή NPRL2 ασθενώς χρωματισμένο για γ-Η2ΑΧ (Σχήμα 3C). Οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με NPRL2 και σισπλατίνη έδειξαν υψηλά επίπεδα γ-Η2ΑΧ (Σχήμα 3C).

Ενεργοποίηση των Chk1 και Chk2 από NPRL2 και σισπλατίνη

in vitro

και

in vivo

Εξετάσαμε την φωσφορυλίωση της Chk1 στο Ser-345 και Chk2 σε Thr-68 με κηλίδωση Western (Εικόνα 4Α). Σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με κενό φορέα και σισπλατίνη ή NPRL2, φωσφορυλιωμένη Chk1 αυξήθηκε με χρονο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με NPRL2 και σισπλατίνη, η έκφραση Chk1 ενισχύθηκε σε μεγάλο βαθμό. Αν και φωσφορυλιωμένη Chk2 δεν ανιχνεύθηκε σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με κενό φορέα και σισπλατίνη, είναι σαφώς αυξημένη σε χρονο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα κατεργασμένα με NPRL2 ή NPRL2 με σισπλατίνη. Αξιολογήσαμε έκφραση πρωτεΐνης φωσφο-Chk2 στις ορθοτοπική ξενομοσχεύματα όγκου με ανοσοϊστοχημική χρώση των καρκινικών κυττάρων από κάθε ομάδα (Σχήμα 4Β). Τα καρκινικά κύτταρα από τους ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με LacZ ή LacZ και σισπλατίνη είχαν χρώση πολύ χαμηλού επιπέδου. Για όγκους που έλαβαν θεραπεία με NPRL2, έκφραση φωσφο-Chk2 ανιχνεύθηκε σε χαμηλό επίπεδο (Σχήμα 4Β). Η θεραπεία με συνδυασμό NPRL2 και σισπλατίνη που προκαλείται από υψηλή έκφραση φωσφο-Chk2.

(Α) H1229 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με άδειο φορέα και IC

20 σισπλατίνης (3,0 μΜ), NPRL2, ή NPRL2 + με IC

20 δόση σισπλατίνης συλλέχθηκαν στις 24, 48, και 72 ώρες μετά την επεξεργασία και αναλύθηκαν για έκφραση της Chk1, Ρ-Chk1 (Ser345), Chk2, και Ρ-Chk2 (Thr68). Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με κενό φορέα και IC

20 δόση της σισπλατίνης ή NPRL2, Ρ-Chk1 αυξήθηκαν σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε αντίθεση, με εκείνους που έλαβαν NPRL2 και IC

20 δόση σισπλατίνης, Ρ-Chk1 ήταν δραματικά αυξημένη. Αν και Ρ-Chk2 δεν ανιχνεύθηκε σε Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με κενό φορέα και IC

20 δόση σισπλατίνης, ήταν σαφώς αυξημένη σε χρονο-εξαρτώμενο τρόπο με εκείνους που έλαβαν NPRL2 ή NPRL2 + IC

20 δόση σισπλατίνης. (Β) Ρ-Chk2 έκφραση ανοσοϊστοχημικά αναλύθηκε σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο H322 υπεζωκότα διάδοσης, όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Ρ-Chk2 έκφραση ανιχνεύθηκε σε ελαφρώς υπεζωκότα καρκινικά κύτταρα από ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με NPRL2 νανοσωματίδια, αλλά όχι σε εκείνους που έλαβαν με LacZ ή LacZ + σισπλατίνη. Αντίθετα, η θεραπεία με νανοσωματίδια NPRL2 και σισπλατίνη επήγαγε υψηλούς φωσφο-Chk2 έκφραση σε κύτταρα όγκου. Μεγέθυνση: × 400. (Γ) Η δραστικότητα κινάσης της Chk1 και Chk2 σε Η1299 κύτταρα κατεργασμένα με κενό φορέα + IC

20 δόση σισπλατίνης, NPRL2 ή NPRL2 + IC

20 δόση σισπλατίνης αναλύθηκε με τη χρήση ενός K-LISA Kit Checkpoint Δραστηριότητα , ένα ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) δοκιμασία έδρα δραστηριότητα. δραστικότητα Chk1 κινάσης ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα κατεργασμένα με NPRL2 + σισπλατίνη σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα με άδειο φορέα ή κενό φορέα + σισπλατίνη (

P

& lt? 0.003). δραστικότητα Chk2 κινάσης εντονότερα ενισχυμένη σε κύτταρα κατεργασμένα με NPRL2 ή NPRL2 + σισπλατίνη σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα με άδειο φορέα ή κενό φορέα + σισπλατίνη (

P

& lt? 0,0001). Μπαρ, ΠΒ της μέσης σε τέσσερις επιμέρους πειράματα.

Η

Μετρήσαμε επίσης τη δραστηριότητα κινάσης της Chk2 και Chk1 στο Η1299 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με NPRL2 με ή χωρίς σισπλατίνη με τη χρήση του Κιτ K-LISA Checkpoint Δραστηριότητα , μία δοκιμασία δραστικότητας κινάσης ELISA που βασίζεται. δραστικότητα κινάσης Chk2 σε κύτταρα κατεργασμένα με NPRL2 ή NPRL2 και σισπλατίνη έντονα ενισχυμένη σε σύγκριση με την δραστικότητα σε κύτταρα κατεργασμένα με κενό φορέα, με ή χωρίς σισπλατίνη (

P

& lt? 0.0001) (Σχήμα 4C). δραστικότητα κινάσης Chk1 στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με NPRL2 και σισπλατίνη ήταν ισχυρότερη από ό, τι στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με άδειο φορέα με ή χωρίς σισπλατίνη (

P

& lt? 0.003). (Σχήμα 4C)

Για να ορίσετε περαιτέρω η φύση του Chk2 αλληλεπίδρασης με NPRL2, αναλύσαμε την επίδραση της έκφρασης NPRL2 και Chk2 επί της απόπτωσης χρησιμοποιώντας Chk2-ειδικό siRNA (Σχήμα 5Α) για να χτυπήσει κάτω έκφραση Chk2 σε κύτταρα σισπλατίνη ανθεκτικά H1437 (H1437R) (Σχήμα 5Β). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.