Αφηρημένο

Ιστορικό

PI3K /AKT είναι οδού αλλοιώσεις που συνδέονται με την ελλιπή απάντηση στην chemoradiation στον ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Αυτή η μελέτη διεξήχθη για να δοκιμαστεί για μεταλλάξεις στο μονοπάτι ΡΙ3Κ και να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα των αναστολέων ΑΚΤ στην πρόσληψη της γλυκόζης και η κυτταρική βιωσιμότητα.

Πειραματικός Σχεδιασμός

Μεταλλακτική ανάλυση του DNA από βιοψίες όγκων 140 προεπεξεργασίας και 8 ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές σειρές διεξήχθη. κύτταρα C33A (

PIK3CAR88Q

και

PTENR233 *

) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις των δύο αλλοστερικοί αναστολείς ΑΚΤ (SC-66 και MK-2206), με ή χωρίς το ανάλογο της γλυκόζης 2-δεοξυγλυκόζης (2 -DG). Η βιωσιμότητα των κυττάρων και την κατάσταση ενεργοποίησης της οδού ΑΚΤ /mTOR προσδιορίστηκαν σε απόκριση στη θεραπεία. Η πρόσληψη γλυκόζης αξιολογήθηκε με επώαση με

18F-φθοροδεοξυγλυκόζης (FDG). μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία μηδέν.

Αποτελέσματα

Ενεργοποίηση

PIK3CA

(E545K, E542K) και εντοπίστηκαν αδρανοποίηση

PTEN

(R233 *) μεταλλάξεις στον καρκίνο του ανθρώπου τραχήλου της μήτρας. SC-66 αποτελεσματικά ανέστειλε ΑΚΤ, mTOR και υποστρώματα mTOR στα κύτταρα C33A. SC-66 ανέστειλαν την πρόσληψη γλυκόζης μέσω μειωμένη παροχή GLUT1 και GLUT4 στην κυτταρική μεμβράνη. SC-66 (1 μg /ml-56%) και ΜΚ-2206 (30 μΜ-49%) κατεργασία μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων μέσω μιας μη-αποπτωτικό μηχανισμό. Μειώσεις στην βιωσιμότητα των κυττάρων ενισχύεται όταν οι αναστολείς ΑΚΤ συνδυάστηκαν με 2-DG. Η δοκιμασία μηδέν έδειξε μια σημαντική μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης κατά SC-66 της θεραπείας.

Συμπεράσματα

Η μεταλλάξεων φάσμα του μονοπατιού PI3K /AKT κατά του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας είναι πολύπλοκη. αναστολείς ΑΚΤ μπλοκάρει αποτελεσματικά mTORC1 /2, μειώνουν την πρόσληψη γλυκόζης, γλυκόλυση, και να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων

in vitro

. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι αναστολείς ΑΚΤ μπορεί να βελτιώσει την απόκριση σε chemoradiation στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Rashmi R, DeSelm C, Helms C, Bowcock Α, Rogers BE, Rader J, et al. Αναστολείς (2014) ΑΚΤ προάγουν θάνατο κυττάρου στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας μέσω διακοπής της mTOR Σηματοδοσίας και πρόσληψη γλυκόζης. PLoS ONE 9 (4): e92948. doi: 10.1371 /journal.pone.0092948

Επιμέλεια: Jin Ερ Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Αυγούστου, 2013? Αποδεκτές: 27, Φεβρουαρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 4η, Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Rashmi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεων από το NIH (ΗΠΑ ΝΙΗ 5K12HD00145910) για να Julie K. Schwarz, MD, PhD. CD υποστηρίχθηκε από την έρευνα Φοιτήτρια Ιατρικής Grant (# RMS113) από την Ακτινολογικής Εταιρείας Βορείου Αμερικής (Julie K. Schwarz μέντορας). Το Κέντρο Καρκίνου Siteman υποστηρίζεται από NCI Κέντρο Καρκίνου Υποστήριξη Grant # P30 CA91842. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παγκοσμίως, ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο τρίτος πιο συνηθισμένος γυναικείο καρκίνο, και κατέχει την τέταρτη θέση από την άποψη της θνησιμότητας [1]. Ταυτόχρονη chemoradiation (ακτινοβόληση της πυέλου με την ταυτόχρονη χορήγηση σισπλατίνης χημειοθεραπεία) είναι το πρότυπο της φροντίδας για τους ασθενείς με τοπικά προχωρημένο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι τα αποτελέσματα της μετα-θεραπείας [

18F] -φθορο-δεσοξυ-γλυκόζη-τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (FDG-PET) είναι προγνωστικά χωρίς εξέλιξη και η συνολική επιβίωση αποτελέσματα μετά chemoradiation [2] – [4 ]. Προς το παρόν δεν υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπευτικές επιλογές διαθέσιμες για ασθενείς των οποίων οι όγκοι αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν στις παραδοσιακές chemoradiation.

Πρόσφατα, εντοπίσαμε PI3K /AKT αλλαγές πορείας σε όγκους από ασθενείς με θετικό μετά τη θεραπεία FDG-PET. Παρατηρήσαμε επίσης υψηλά ρ-ΑΚΤ έκφραση σε δείγματα βιοψίας προ-επεξεργασία, και οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του p-ΑΚΤ είχε μειωθεί εκβάσεις επιβίωση και αυξημένη μεταστατική νόσο μετά πρότυπο chemoradiation [5]. Οι γενετικές αλλοιώσεις που οδηγούν στην ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /μονοπάτι mTOR σχετίζονται με την αντίσταση σε θεραπεία ποικιλία στερεών όγκων [6]. Αρκετοί αναστολείς ΡΙ3Κ /ΑΚΤ έχουν αξιολογηθεί σε κλινικές δοκιμές για καρκίνο του μαστού και άλλων καρκίνων με θετικές αποκρίσεις σε ασθενείς με ΡΙ3Κ /ΑΚΤ μεταβολές [7]. Υπάρχουν αναφορές που υποδηλώνει ότι οι καρκίνοι με

PIK3CA

μεταλλάξεις είναι πιο ευαίσθητα στην AKT ή PI3K /αναστολείς mTOR [8], [9].

Υποθέσαμε ότι οι αναστολείς PI3K /AKT θα βελτιώσει την απάντηση chemoradiation σε τραχήλου της μήτρας όγκους με PI3K /AKT οδό αλλαγές. Για να δοκιμαστεί για μεταλλάξεις στο μονοπάτι ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, αναλύσαμε 140 προεπεξεργασία τραχηλικές βιοψίες όγκων και 8 ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές γραμμές [10]. Στη συνέχεια επιλέγεται το αυχενικό C33A κυτταρική σειρά καρκίνου, το οποίο μεταλλάσσεται τόσο για

PIK3CA

και

PTEN

(

PIK3CA

R88Q,

PTEN

R233 *) και εκφράζει τα υψηλά επίπεδα της p-AKT κατά την έναρξη, για να εκτιμήσει την απάντηση σε δύο αλλοστερική αναστολείς ΑΚΤ, SC-66 και MK-2206.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Ο πληθυσμός της μελέτης περιελάμβανε 140 ασθενείς προοπτικά εγγεγραμμένοι σε τραπεζικό όγκου μελετών κατά τη στιγμή της διάγνωσης του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (Μαρ 1998 έως τον Ιούλιο του 2011). Έγκριση από το θεσμικό Γραφείο Προστασίας Ανθρωπίνων Έρευνας ελήφθη για τη μελέτη αυτή, και όλοι οι ασθενείς που υπογράφηκε ενημερωμένη συγκατάθεση. Κλινική παρακολούθηση, συμπεριλαμβανομένης της απεικόνισης FDG-PET έγινε για κάθε ασθενή, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3]. Κατά τη στιγμή της τελευταίας παρακολούθησης, 76 ασθενείς είχαν καμία ένδειξη της νόσου, και 8 ασθενείς ήταν στη ζωή με τη νόσο? 7 ασθενείς είχαν πεθάνει λόγω συνοδά νοσήματα? 2 ασθενείς είχαν πεθάνει λόγω τοξικότητας σχετιζόμενης με τη θεραπεία, και 47 ασθενείς είχαν πεθάνει λόγω καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Διάμεση παρακολούθηση των ασθενών ζωή κατά το χρόνο της τελευταίας παρακολούθησης ήταν 41 μήνες (εύρος 4 έως 161 μήνες).

Η στατιστική ανάλυση

Η επιβίωση και η επανεμφάνιση του όγκου μετρήθηκαν από την ολοκλήρωση της θεραπείας. Η μέθοδος Kaplan-Meier (προϊόν-όριο) χρησιμοποιήθηκε για να αντλήσει τις εκτιμήσεις της επιβίωσης [11]. Οι δοκιμές της ισοδυναμίας των εκτιμήσεων της επιβίωσης μεταξύ των ομάδων ασθενών έγιναν από τη γενικευμένη δοκιμασία log-rank Wilcoxon. Statview έκδοση 5.0.1 του λογισμικού (SAS Institute Inc., Cary, NC) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση.

ανάλυση μεταλλάξεων με τη χρήση MALDI-TOF

βιοψίες των όγκων τομές και εξετάζονται για το περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Tumor DNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους από τον ιστό Προμηθειών Πυρήνα διευκόλυνσης Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον. Δοκιμασίες για ένα υποσύνολο των 32 επιλεγμένων ογκογόνων μεταλλάξεων (

ΑΚΤ1

,

ΑΚΤ2

,

PIK3CA

και

PTEN

) από [10] έχουν επανασχεδιαστεί σε τρεις πολυπλέκτες του γονότυπου, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Δοκιμασία Designer Sequenom, η έκδοση 3.1.2.2. (Sequenom Inc, San Diego, CA). Οι πολυπλέκτες έχουν σχεδιαστεί να χρησιμοποιούν τη χημεία Iplex. Το σύστημα Sequenom MassARRAY (https://www.sequenom.com) απασχολεί MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser εκρόφηση /ιοντισμό – χρόνος πτήσης) φασματομετρία μάζας για τη μέτρηση μάζας διαφορές ακόλουθες προσθήκες μίας βάσης σε εκκινητές επέκτασης. Οι φασματικές κορυφές που αντιστοιχούν στην αναμενόμενη μάζα για κάθε εκτεταμένη αστάρι μετατραπεί σε κλήσεις γονότυπο του δείγματος. Χρησιμοποιώντας το πρότυπο πρωτόκολλο Iplex, ο πυρήνας Γονοτυπικές στο Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον (St. Louis, MO, USA) επεξεργασία 15 ng δείγματος DNA ανά πολυπλεξίας μέσω του συστήματος MassARRAY. Εμβαδά των κορυφών που αντιπροσωπεύουν φυσιολογικά και μεταλλαγμένα προσθήκες βάσεων ελήφθησαν από το φάσμα μάζας του κάθε δείγματος. Μια μετάλλαξη θεωρήθηκε παρούσα σε ένα δείγμα, όταν το μεταλλαγμένο κορυφή ήταν υπεύθυνες για το 25% ή περισσότερο των συνδυασμένων περιοχών κορυφής, και απουσιάζει όταν το μεταλλαγμένο περιοχή κορυφής ήταν λιγότερο από το 25% του συνόλου. Λίστα OncoMap μεταλλάξεις που εξετάστηκαν σε πολυπλέκτες μας είναι OM_00970-ΑΚΤ1-E17K, OM_00032-ΑΚΤ2-S302G, OM_00033-ΑΚΤ2-R371H, OM_00241-PIK3CA-R88Q, OM_00242-PIK3CA-N345K, OM_00243-PIK3CA-C420R, OM_00246A-PIK3CA -E545K, OM_00248-PIK3CA-H701P, OM_00249-PIK3CA-H1047L, OM_00250A-PIK3CA-H1047R, OM_00250B-PIK3CA-H1047R, OM_00251-PIK3CA-H1047Y, OM_01017-PIK3CA-E545A, OM_01018B-PIK3CA-N1068fs*4,OM_0102-PIK3CA-Y1021C,OM_00839-PTEN-R173C,OM_00840-PTEN-R173H,OM_00841-PTEN-R233*,OM_00842-PTEN-R335*, OM_01038-PTEN-K267fs * 9 OM_01039-PTEN-V317fs * 3, OM_01069-PTEN-K6fs * 4.

καλλιέργειας κυττάρων και αντιδραστήρια

Ο καρκίνος του τραχήλου κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε μέσα ΙΜϋΜ (Life Technologies, CA) με 10% θερμοαπενεργοποιημένο FBS και επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. SC-66 αγοράστηκε από Biovision (Milpitas, CA) και ΜΚ-2206 από Σέλεκ Χημικών Προϊόντων (Houston, TX). 2-δεοξυ γλυκόζη, πρωτεάση και ο αναστολέας φωσφατάσης κοκτέιλ αγοράστηκαν από την Sigma (Saint Louis, ΜΟ). Όλα τα φάρμακα για κυτταρική καλλιέργεια διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, Sigma). siRNA ολιγονουκλεοτίδια εναντίον

ΑΚΤ1

,

ΑΚΤ2

και

RICTOR

αγοράστηκαν από Sigma (Saint Louis, ΜΟ).

Western και απομόνωση μεμβράνης

η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ και κατάντη στόχους της ΑΚΤ και mTOR μονοπάτι, με ή χωρίς SC-66 (6-10 μg /ml) και ΜΚ-2206 (0-2,5 μΜ) προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western με πρωτογενή αντισώματα ενάντια φωσφορυλιωμένων και συνολική μορφές του mTOR, p70S6K, 4Ε-BP1, S6, GSK3-β, FOXO ρΑΚΤ

Thr308, ρΑΚΤ

Thr450 και ρΑΚΤ

Ser473 (1:1000? Cell Signaling Technology, ΜΑ), το σύνολο των μορφών ΑΚΤ, mTOR και 4-EBP1 (1:1000, Cell Signaling Technology, ΜΑ), συνολικής μορφές ρ70δ6Κ και β-ακτίνης HRP από την Santa Cruz Biotechnology, CA και η συνολική μορφές PRAS40 και FOXO από Millipore (1:5000, Santa Cruz βιοτεχνολογία, CA). β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν με συζευγμένο με HRP αντι-κουνελιού (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ) ή αντι-ποντικού IgG πολυκλωνικού δευτερογενή αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, CA) για 1 ώρα σε RT. Για την ανίχνευση Pierce West Dura υπόστρωμα (Pierce Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ.

Κυτταρική βιωσιμότητα και Αννεξίνη χρώση

Για τα κύτταρα C33A δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας κατεργάστηκαν με τους αναστολείς αλλοστερικές ΑΚΤ SC-66 (0.0001 μg /ml-5 μg /ml) και ΜΚ-2206 (125 ηΜ-30 μΜ), με ή χωρίς την ανάλογη γλυκόζη 2-δεοξυγλυκόζης (2-DG) (5-20 mM) χρησιμοποιώντας τιτλοποίηση της δόσης και τα μαθήματα του χρόνου. Για τα πειράματα siRNA, C33A κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά και αξιολογήθηκαν για έκφραση πρωτείνης μετά από 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας Alamar Blue από Life Technologies, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αννεξίνη χρώση /7-AAD διεξήχθη 24 ώρες μετά τη θεραπεία, χρησιμοποιώντας ένα κιτ από την BD, Biosciences ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, και τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

προσδιορισμούς προσλήψεως FDG

Η FDG πρόσληψη δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [5]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν και προκατεργάστηκαν με το μπλοκ (κυτοχαλασίνη Β) για 30 λεπτά που ακολουθείται από αναστολείς ΑΚΤ για επιπλέον 30 λεπτά. Μετά από αυτό,

18FDG προστέθηκε σε γλυκόζη μέσο χωρίς για 1 ώρα. Τα κύτταρα πλύθηκαν, συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν σε μετρητή γάμμα.

ανοσοφθορισμού

Σε μια διαφάνεια θάλαμο (8 φρεατίων) 25.000 κύτταρα ήταν seeded και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SC-66 1 μg /ml για 3 h και σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 4% ρ-φορμαλδεΰδης από Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Sciences (Hatfield, ΡΑ) για 10 λεπτά. Οι πλάκες στη συνέχεια δεσμεύθηκαν σε 5% κανονικό ορό κατσίκας (Jackson ImmumoResearch, West Grove, ΡΑ) για 1 ώρα, που ακολουθείται από εκτεταμένες πλύσεις PBS. Στη συνέχεια, πρωτογενή αντισώματα GLUT1 και GLUT4 (Abcam, Cambridge, ΜΑ) προστέθηκαν ακολουθούμενα από δευτερεύον αντίσωμα συζυγές με Alexa Fluor 488 (Life Technologies, Inc., Grand Island, ΝΥ). Οι πλάκες τελικά τοποθετείται χρησιμοποιώντας Παρατείνει Gold αντι-fade (τεχνολογίες ζωής, Inc. Grand Island, Νέα Υόρκη).

δοκιμασίες Μεταβολικό

Το γαλακτικό δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κιτ από (Sigma, Saint Louis , ΜΟ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας μέσα καλλιέργειας συλλέχθηκαν μετά από αποπρωτεΐνωση με χρήση 10 kDa φίλτρα στήλης περιστροφής. ΑΤΡ και NADP /ΝΑΟΡΗ δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το εμπορικώς διαθέσιμο κιτ φθορισμομετρική από (Abcam, Cambridge, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης κυττάρου.

επούλωσης τραυμάτων

δοκιμασία

Ένα εκατομμύριο κύτταρα C33A απλώθηκαν σε 35 mm δίσκο καλλιέργειας ιστού και αναπτύχθηκαν σε συρροή. Δύο παράλληλες γρατσουνιές έγιναν με ρύγχος πιπέτας 200 μL ανά δίσκο και το πλάτος μηδέν μετρήθηκε να είναι η γραμμή βάσης [12]. Το πλάτος της πληγής μετρήθηκε σε ένα ελάχιστο έξι διαφορετικά σημεία για κάθε τραύμα. SC-66 (1 και 2,5 μg /ml) και ΜΚ-2206 (2.5 και 5 μΜ) προστέθηκαν για 24 ώρες. Το πλάτος των γρατσουνιές μετρήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Qcapture Pro και να προβληθούν χρησιμοποιώντας OLYMPUS 1 × 70 μικροσκόπιο. επούλωση Ποσοστό τραύματος υπολογίστηκε διαιρώντας το πλάτος μηδέν μετά την προσθήκη του φαρμάκου από το πλάτος ελέγχου μείον 100%. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SEM.

Αποτελέσματα

PI3K /AKT /mTOR μονοπάτι είναι ενεργή σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές

Μια ομάδα ανθρώπινου τραχηλικού καρκίνου κυτταρικές σειρές ελέγχθηκε για το πρότυπο έκφρασης και την κατάσταση ενεργοποίησης των μορίων μονοπατιού PI3K /AKT /mTOR. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν χωρίς καμία επεξεργασία και βασικής γραμμής στυπώματα Western διεξήχθησαν. P70S6K, ο δείκτης για την ενεργοποίηση της οδού mTOR, φωσφορυλιώθηκε σε πλειονότητα των κυτταρικών σειρών εκτός από HeLa, C41 και C33A όπου διαπιστώθηκε να φωσφορυλιωθεί ασθενώς (Εικ. 1Α). Φωσφορυλίωση 4Ε-ΒΡ1 και S6 βρέθηκαν να είναι χαμηλή στην πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών που μελετήθηκαν. Σε SiHa και SW756, τα επίπεδα έκφρασης των μη-φωσφορυλιωμένες μορφές της mTOR, p70S6K, 4Ε-ΒΡ1 και S6 ήταν χαμηλές σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές. Από την άλλη πλευρά, η φωσφορυλίωση της mTOR βρέθηκε να είναι παρόμοια σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 1Α). Baseline έκφραση φωσφορυλιωμένες μορφές της ΑΚΤ, όπως Ser473, Thr308 και Thr450 προσδιορίστηκαν. C33A εκφράζονται όλες τις τρεις μορφές ρ-ΑΚΤ. Για να προσδιορίσετε την κατάσταση του ανάντη ρυθμιστές της ΑΚΤ όπως PI3K και PTEN, αρχική τιμή p-PI3K και των επιπέδων p-PTEN εξετάστηκαν. Φωσφορυλιωμένη επίπεδο PTEN ήταν παρόμοια σε όλες τις κυτταρικές σειρές, εκτός από C33A όπου το επίπεδο των συνολικών μπάντα PTEN ήταν ελάχιστη. ΡΙ3Κ ενεργοποιήθηκε στην πλειοψηφία των κυτταρικών σειρών που μελετήθηκαν εδώ. SiHa παρουσίασαν πολύ χαμηλή ενεργοποίηση της PI3K (Εικ. 1Β). Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας έχουν ενεργοποιηθεί μονοπάτι mTOR υπό βασικές συνθήκες και μεγάλες διακυμάνσεις υπήρχαν σε ρ-ΑΚΤ επίπεδα.

(Α-Β) συστατικά mTOR μονοπάτι και φωσφορυλιωμένες μορφές ΑΚΤ δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά διαθέσιμα αντισωμάτων επί οκτώ τραχήλου λύματα κυττάρων καρκίνου παρασκευάζονται χωρίς καμία επεξεργασία. (C)

PIK3CA

,

ΑΚΤ

, και

PTEN

κατάστασης του γονιδίου μετάλλαξης των 8 ανθρώπινου καρκίνου του τραχήλου κυτταρικές σειρές.

Η

Sequenom ανάλυση μεταλλάξεων της PIK3CA, PTEN και τα γονίδια της ΑΚΤ σε καρκίνο του τραχήλου

για να ελέγξετε για μεταλλάξεις στο μονοπάτι PI3K /AKT, πραγματοποιήσαμε μια Sequenom ανάλυση μεταλλάξεων για ογκογόνους μεταλλάξεις σε γονίδια

PIK3CA

,

PTEN

και

ΑΚΤ

. Εμείς δεν εντόπισε κανένα

ΑΚΤ1

ή

ΑΚΤ2

μεταλλάξεις στα καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές. C33A έτρεφε μια R88Q

PIK3CA

μετάλλαξη. R88Q είναι μια μετάλλαξη ενεργοποίησης που βρέθηκαν στον τομέα ABD της ρ110α υπομονάδα του

PIK3CA

γονίδιο. Αυτό το ελάττωμα σχετίζεται με αυξημένη ενζυματική ενεργοποίηση της δραστικότητας της πρωτεΐνης και ΑΚΤ ΡΙ3Κ

in vitro

[13], [14]. Βρήκαμε ότι η E545K

PIK3CA

μετάλλαξη ήταν παρούσα στην ME-180 και τα κύτταρα CaSki (Εικ. 1Γ). Η

PIK3CA

μετάλλαξη E545K είναι μια μετάλλαξη ενεργοποίησης στην ελικοειδή τομέα της ρ110α υπομονάδα της PI3K πρωτεΐνης. Αυτή η μετάλλαξη είναι γνωστό για να προσδώσει αυξημένη δραστικότητα κινάσης και να ενεργοποιήσετε μόνιμα ΑΚΤ [15]. Βρήκαμε επίσης μια R173C

PTEN

γονιδιακή μετάλλαξη στο CaSki και

PTEN

R233 * μετάλλαξη στα κύτταρα C33A (Εικ. 1Γ). Η

PTEN

μετάλλαξη R173C σχετίζεται με μειωμένη δραστικότητα φωσφατάσης κατά PIP

3 [16]. Η

ΡΤΕΝ

R233 * μετάλλαξη στο εξόνιο 7 επάγει μια πρόωρη κωδικόνιο τερματισμού μέσα στο γονίδιο, το οποίο εξηγεί την απουσία του

ΡΤΕΝ

έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα C33A [17] (Εικ. 1Β).

Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Sequenom, μπορούμε στη συνέχεια ελέγχονται για μεταλλάξεις στο

PIK3CA

,

ΑΚΤ

και

PTEN

γονίδια σε 140 βιοψίες προεπεξεργασίας που συλλέγονται στην τράπεζα του όγκου μας. Εμείς δεν εντόπισε καμία προσδιορίστηκαν μετάλλαξη στο

ΑΚΤ

γονιδίου στον πληθυσμό των ασθενών μας. Βρήκαμε ότι οι όγκοι σε 7 από 140 ασθενείς που έτρεφε μια

PIK3CA

μετάλλαξη E545K και 1 στους 140 είχε ένα

PIK3CA

μετάλλαξη E542K. Βρήκαμε επίσης ότι 1 όγκου έτρεφε μια

PTEN

R233 * μετάλλαξη. Ασθενείς με E545K και E542K μεταλλάξεις στο

PIK3CA

βρέθηκαν να εμφανίζουν φτωχή πρόγνωση και βραχύτερη ελεύθερης νόσου επιβίωσης μετά την τυπική chemoradiation (ακτινοβόληση της πυέλου και ταυτόχρονη χημειοθεραπεία με σισπλατίνη) (p = 0.05, Εικ. 2).

καμπύλη Kaplan Meier για την επιβίωση χωρίς εξέλιξη για τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας με άγριου τύπου PIK3CA έναντι E545K ή E542K όγκους μεταλλαγμένου (p = 0.05).

Η

αναστολείς ΑΚΤ SC-66 και MK-2206 επάγει μη-αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα μεταλλαγμένο C33A PIK3CA και ΡΤΕΝ

Χρησιμοποιώντας κύτταρα C33A ως μοντέλο για την ΡΙ3Κ /ΑΚΤ μεταλλαγμένο καρκίνο του τραχήλου, προσδιορίσαμε αν η επιβίωση των κυττάρων του όγκου εξαρτιόταν από σηματοδότηση ΑΚΤ. C33A κύτταρα επωάστηκαν με αυξανόμενες δόσεις του SC-66 και ΜΚ-2206 και η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε μετά από 24 και 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε ξεκινώντας από 1 μg /ml του SC-66 μετά από 24 και 48 ώρες, σε 55% και 43% αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα στα 5 μg /ml του SC-66 βρέθηκε να είναι 15% μετά από 24 ώρες (Σχ. 3Α). C33A κύτταρα επίσης ευαίσθητα σε άλλο αναστολέα της ΑΚΤ αλλοστερική, MK-2206. Η βιωσιμότητα των κυττάρων βρέθηκε να μειώνει αρχίζοντας με την συγκέντρωση 15 μΜ (58%) και τη μείωση στο 2% κατά 48 h (Εικ. 3Β). Για να επιβεβαιώσετε ότι επηρεάζει στη βιωσιμότητα των κυττάρων οφείλονταν σε αναστολή ΑΚΤ όχι μακριά επιδράσεις στόχο του SC-66 και MK-2206, πραγματοποιήθηκαν πειράματα siRNA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, η βιωσιμότητα των κυττάρων C33A μειώθηκε σε παρόμοιο βαθμό όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα siRNA με αποτέλεσμα knockdown του

ΑΚΤ1

,

ΑΚΤ2

, και

RICTOR

(Σχ . 3D).

(Α-Β) C33A κύτταρα σπάρθηκαν σε 48 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενες δόσεις του SC-66 (0,0001-5 μg /ml) και ΜΚ-2206 (1,25 έως 30 μΜ ) εις τριπλούν για 24 και 48 ώρες. Η βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρήση Alamar Blue. Η επί τοις εκατό βιωσιμότητα υπολογίστηκε με βάση τους ελέγχους που έλαβαν φορέα. (Γ) C33A κύτταρα σπάρθηκαν σε 48 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με ολιγονουκλεοτίδια κατά

ΑΚΤ1

,

ΑΚΤ2

και

RICTOR

και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SC-66 (1 μg /ml) και ΜΚ-2206 (20 μΜ) εις τριπλούν για 24. η βιωσιμότητα μετρήθηκε με τη χρήση Alamar Blue. Τοις εκατό βιωσιμότητας υπολογίστηκε με βάση τους ελέγχους που έλαβαν φορέα και τον έλεγχο siRNA επιμολυσμένα ελέγχους, σ & lt? 0,001 για τη σύγκριση του ελέγχου siRNA έναντι siRNA για

ΑΚΤ1

,

ΑΚΤ2

και

RICTOR

, SC-661 μg /ml, ΜΚ-2206 20 μΜ. (D) C33A κύτταρα σπάρθηκαν σε 48 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με ολιγονουκλεοτίδια κατά

ΑΚΤ1

,

ΑΚΤ2

και

RICTOR

και παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης μετά από 48 ώρες και κηλίδες Western διεξήχθησαν. (Ε) C33A κύτταρα σε επεξεργασία με SC-66 (2,5 μg /ml) και ΜΚ-2206 25 μΜ για 24 ώρες και στη συνέχεια βάφονται με Annexin /7-AAD και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει βιωσιμότητα% των κυττάρων. (F) C33A κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με SC-66 (0,0001 μg /ml-0,1 μg /ml) με ή χωρίς 20 mM 2-DG για 48 ώρες.

Η

Για να διερευνήσουν τον μηχανισμό μέσω του οποίου ΑΚΤ αναστολείς προκαλεί κυτταρικό θάνατο, πραγματοποιήσαμε αννεξίνη χρώση /7-AAD. Κατά SC-66 (2,5 μg /ml) και ΜΚ-2206 (25 μΜ) αγωγή υπήρχαν πολύ λίγα κύτταρα με Αννεξίνη μόνο χρώση και το κλάσμα των κυττάρων με χρώση τόσο ήταν 35% και λιγότερο από 20%, αντίστοιχα. 7-AAD μόνο χρώση κοντά στο 80% σε κύτταρα κατεργασμένα ΜΚ-2206 (Σχ. 3Ε). Για την περαιτέρω επιπτώσεις σύνδεσμο του SC-66 μέσω της γλυκόζης αναστολή πρόσληψης, συνδυάσαμε SC-66 με 2-δεοξυ γλυκόζης (2-DG), ένα ανταγωνιστικός αναστολέας της πρόσληψης γλυκόζης. Με 48 ώρες μετά την αγωγή με SC-66 (0,01 μg /ml), η βιωσιμότητα ήταν στο 107%, αλλά με την προσθήκη 2-DG, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε στο 72% ρ & lt? 0.001 (Εικ. 3F). MK-2206 παρουσίασαν συνεργιστικά αποτελέσματα με 2-DG. Μετά από 24 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων σε επεξεργασία ΜΚ-2206 ήταν 78%, το οποίο μειώθηκε έως και 40% μετά την προσθήκη 20 mM 2-DG (ρ & lt? 0,001, Δεδομένα Α στο S1 File).

SC-66 και MK-2206 ανέστειλε mTOR /AKT οδό αποτελεσματικά σε C33A κύτταρα

για να διερευνήσει τις επιπτώσεις της αναστολής ΑΚΤ στην mTOR και κατάντη των στόχων της στα κύτταρα C33A, εξετάσαμε την κατάσταση φωσφορυλίωσης των συστατικών mTOR μονοπάτι με κηλίδα Western και χρησιμοποιήθηκαν p70S6K ως δείκτης για την ενεργοποίηση του mTOR [18]. SC-66 ανέστειλε πλήρως φωσφορυλίωση p70S6K από 3 ώρες (Σχ. 4Α). MK-2206 ανέστειλε την ενεργοποίηση p70S6K, αλλά υπήρχε μικρή επανενεργοποίηση από 4 ώρες. MK-2206 ανέστειλε συστατικά μονοπάτι του mTOR, όπως mTOR, 4Ε-BP1 και S6 αποτελεσματικά από 2 ώρες. MK-2206 της αναστολής του μονοπατιού mTOR φαίνεται να είναι παροδική ως p70S6K ήταν ακόμα ενεργή μετά από 4 ώρες (Data D στο S3 αρχείου). SC-66 και ΜΚ-2206 ανέστειλε αποτελεσματικά όλα τα τρία φωσφορυλιωμένες μορφές της ΑΚΤ (Thr308, Thr450 και Ser 473) σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο προτείνοντας ότι το ΜΚ-2206 δρα κυρίως μέσω mTORC1 (Σχ. 4C και τα Δεδομένα F στο S3 File). Αυτό υποστηρίζεται από την παρατήρηση ότι SC-66 ήταν περισσότερο αποτελεσματική στην αναστολή υποστρώματα ΑΚΤ όπως Pras 40, GSK3-β και FOXO1 (Εικ. 4Β) σε σύγκριση με ΜΚ-2206, ιδίως PRAS40 η οποία είναι σε mTORC1 συγκρότημα [19] (Data Ε σε S3 File). P70S6K φωσφορυλιώθηκε μετά από 4 ώρες από ΜΚ-2206 αγωγή υποδηλώνοντας η αναστολή mTOR μονοπάτι ήταν παροδική (Συμπληρωματικό δεδομένα).

(Α-Ο) C33A κύτταρα σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του SC-66 (6-10 μg /ml) για 3 ώρες και κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν για western blot.

Η

Η ραπαμυκίνη, έναν αναστολέα mTOR, ανακουφίζει αναστολές ανατροφοδότηση και επάγει φωσφορυλίωση της ΑΚΤ Ser473 σε mTORC2-εξαρτώμενο τρόπο που οδηγεί σε περαιτέρω ενεργοποίηση ΑΚΤ [20 ]. Για να δοκιμαστεί για το σκοπό αυτό με τη χρήση αναστολέων μας πραγματοποιήσαμε μια μακρύτερη επώαση των κυττάρων με SC-66 για 18-24 ώρες. Βρήκαμε ότι p70S6K, ο δείκτης της ενεργοποίησης mTOR, μειώθηκε ακόμη και μετά τη θεραπεία 18 και 24 ώρες. SC-66 θεραπεία μειωμένη ενεργοποίηση των υποστρωμάτων ΑΚΤ, Thr308 και Thr450 by18 και 24 ώρες. επίπεδα Thr308 είχε ανεβεί σε σύγκριση με το δείγμα 3 ώρες, αλλά εξακολουθεί να εμφανίζεται πτωτική τάση σε 18-24 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όλα αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η SC-66 αναστέλλεται αποτελεσματικά τόσο mTORC1 /2 και ΑΚΤ. MK-2206 βρέθηκε να δρα κυρίως μέσω mTORC1 οδού με μικρή επανενεργοποίηση της οδού μετά από 4 ώρες.

SC-66 ανέστειλε την πρόσληψη γλυκόζης και μετατόπιση της μεμβράνης των μεταφορέων γλυκόζης

Η πρόσληψη γλυκόζης ελέγχθηκε εκτελώντας

in vitro

FDG προσδιορισμοί προσλήψεως υπό την παρουσία και απουσία του SC-66 (35 μg /ml). Βρήκαμε πρόσληψη σημαντικά ότι το SC-66 ανέστειλε γλυκόζης όπως αποδεικνύεται από μειωμένη μετρήσεις ανά λεπτό (Εικ. 5Α). Περαιτέρω προσδιορίσαμε την επίδραση του SC-66 για glut1 και GLUT4 μετατόπιση στη μεμβράνη. Για το σκοπό αυτό μια κλασματοποίηση κυτταρόπλασμα μεμβράνη διεξήχθη μετά την κατεργασία των κυττάρων με SC-66 (5 μg /ml) για 24 ώρες. SC-66 ανέστειλε GLUT1 και GLUT4 μετατόπιση από το κυτταρόπλασμα στη μεμβράνη, όπως προσδιορίζεται με κηλίδα Western (Εικ. 5C). Εμείς επιβεβαίωσε αυτό με ανοσοφθορισμού χρώση (Εικ. 5D). Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι mTOR αναστολή από SC-66 είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης μέσω GLUT1 και GLUT4 κατοχής εντός κυτταρόπλασμα.

Α) C33A κύτταρα σε επεξεργασία με SC-66 (35 μg /ml) ή μπλοκ (κυτοχαλασίνης Β) για 30 λεπτά πριν από την επώαση με το

18F-φθοροδεοξυγλυκόζης όπως περιγράφεται στο τμήμα των μεθόδων. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει μετρήσεις ανά τιμές λεπτό, σ & lt? 0,01 για τη σύγκριση της FDG μόνο (μόνο κύτταρα) έναντι FDG + SC-66. Β) C33A κύτταρα σε επεξεργασία με SC-66 (0-5 μg /ml) για 3 ώρες και 24 και τα επίπεδα GLUT1 αναλύθηκαν με western blot. Γ) C33A κύτταρα σε επεξεργασία με SC-66 (0, 1 και 5 μg /ml) για 24 ώρες. Μεμβράνη και κυτοσόλιο κλάσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ (MemPER) από Πιρς Biotechnology. Αυτά τα υποκυτταρικά κλάσματα κατόπιν αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και επωάζεται στους 65 ° C για 20 λεπτά πριν από τη φόρτωσή τους στο τζελ Western Blot για GLUT1 και GLUT4. Δ) ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα C33A μετά τη θεραπεία τους με SC-66 (1 μg /ml) για 3 ώρες σε μια διαφάνεια θάλαμο.

Η

αναστολέα ΑΚΤ SC-66 αναστέλλει τη γλυκόλυση

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή της ΑΚΤ οδήγησε σε μειωμένη γλυκόλυση, μετρήσαμε τα επίπεδα ATP και NADPH μετά από SC-66 της θεραπείας. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα ΑΤΡ μειώθηκαν σημαντικά μετά SC-66 θεραπεία, και τα επίπεδα NADPH αυξήθηκαν, γεγονός που υποδηλώνει ότι εναλλακτικά μονοπάτια του μεταβολισμού της γλυκόζης, όπως πεντόζης φωσφορικού διακλάδωσης, μπορεί να είναι πιο ενεργή σε κύτταρα C33A όταν σηματοδότηση ΑΚΤ καταστέλλεται (Σχ. 6Α και 6Β). Τα συνολικά επίπεδα γαλακτικού μειώθηκαν επίσης σε κύτταρα C33A μετά από θεραπεία με SC-66 (Σχ. 6C και 6D). Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η αναστολή της ΑΚΤ καταστέλλει γλυκόλυση στα κύτταρα C33A. Για να αξιολογηθούν για μεταγενέστερους επιδράσεις στο μεταβολισμό των κυττάρων του όγκου, παρακολουθήσαμε την κατάσταση ενεργοποίησης ενός υποστρώματος του ΑΚΤ, ΑΤΡ-κιτρική λυάση (ACL) μετά SC-66 αγωγή. C33A κύτταρα επωάστηκαν με αυξανόμενες δόσεις του SC-66 και στυπώματα Western διεξήχθησαν. SC-66 ανέστειλε ACL φωσφορυλίωση από 5 και 24 ωρών, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της ΑΚΤ μπορεί επίσης να επηρεάσει και άλλες πτυχές του μεταβολισμού των κυττάρων του όγκου, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης των λιπιδίων (Εικ. 6Ε).

(Α-Β) C33A κύτταρα σπάρθηκαν σε Τ

φιάλες καλλιέργειας 2 ιστού, αντιμετωπίζονται με SC-66 και ενδοκυτταρικά επίπεδα NADPH και ΑΤΡ προσδιορίστηκαν 25 εκατοστά. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει τα επίπεδα ΑΤΡ και ΝΑϋΡΗ μΜ βασίζεται στο πρότυπο καμπύλη, ρ & lt? 0,01 για τη σύγκριση του ελέγχου έναντι SC-66 10 μg /ml 1 και 3 ώρες και ρ & lt? 0,001 για τον έλεγχο έναντι 30 μg /ml για τα επίπεδα ΑΤΡ? ρ & lt? 0,01 για τη σύγκριση του ελέγχου έναντι SC-66 5 μg /ml 3 ώρες και ρ & lt? 0,01 έλεγχος έναντι 10 μg /ml 3 ώρες για τα επίπεδα NADPH. (C-D) C33A κύτταρα σπάρθηκαν σε Τ 25 cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SC-66 και αποβάλλεται επίπεδα γαλακτικού μετρήθηκαν σε συγκεντρώσεις ηΜ χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη, ρ & lt? 0,001 για τη σύγκριση του ελέγχου έναντι SC -66 5 και 10 μg /ml. (Ε) C33A κύτταρα σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του SC-66 (0-5 μg /ml) για 5 ώρες και 24 ώρες και τα προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν για western blot.

Η

SC-66 μειώνει τη μετανάστευση κυττάρων C33A in vitro

υπάρχουν αναφορές που δείχνουν το ρόλο της ΑΚΤ στη μεταστατική διαδικασία συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης των κυττάρων και εισβολή [21]. Για τη μελέτη των επιπτώσεων της SC-66 και MK-2206 για τη μετανάστευση των κυττάρων που έλαβαν κύτταρα με 1 μg /ml SC-66 και 2,5 μΜ ΜΚ-2206 για 24 ώρες και εκτελείται μια δοκιμασία μηδέν. Βρήκαμε ότι η SC-66 ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων περίπου 50% σε σύγκριση με τον έλεγχο, ενώ MK-2206 δεν είχε καμία επίδραση (Εικ. 7).

C33A κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με Α) SC-66 (1 και 2.5 μg /ml) και Β) ΜΚ-2206 (2.5 και 5 μΜ) για 24 ώρες. επούλωση τοις εκατό του τραύματος υπολογίστηκε όπως περιγράφεται στην ενότητα μεθόδους, σ & lt? 0,0001 για τη σύγκριση του ελέγχου σε σχέση με 1 μα SC-66 και ρ & lt? 0,0001 για τον έλεγχο έναντι 2,5 μα SC-66

Η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε ανάλυση μεταλλάξεων του 140 βιοψιών προεπεξεργασίας όγκου και 8 ανθρώπινα τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές γραμμές για τη διαλογή μεταλλάξεων στο μονοπάτι ΡΙ3Κ /ΑΚΤ. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη, με τις γνώσεις μας, να αναλύσουν διεξοδικά μεταλλάξεις στο μονοπάτι ΡΙ3Κ /ΑΚΤ στον ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Εντοπίσαμε πολλαπλές μεταλλάξεις στο μονοπάτι PI3K /AKT σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, συμπεριλαμβανομένων ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

PIK3CA

(E545K, E542K) και αδρανοποίηση μεταλλάξεις στο

PTEN

(R233 *). Μεταλλακτική ανάλυση της αυχενικής καρκινικών κυτταρικών σειρών αποκάλυψε επιπλέον ελαττώματα. κύτταρα C33A έχουν τόσο R233 *

PTEN

μετάλλαξη και ένα R88Q

PIK3CA

μετάλλαξη [22].

Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε επίσης για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα με αλλοιωμένη ενεργοποίηση ΑΚΤ θα είναι ευαίσθητο σε αναστολείς ΑΚΤ. SC-66 και ΜΚ-2206 που προκαλείται αποτελεσματικά κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα C33A μέσω ενός μη-αποπτωτικό μηχανισμό. SC-66 βρέθηκε να είναι ένας ισχυρός αναστολέας mTORC1 /2. SC-66 ανέστειλαν αποτελεσματικά p70S6K και υποστρώματα 4Ε-ΒΡ1 mTORC1, εκτός από την αναστολή της Ser473 και φωσφορυλίωση Thr308 της ΑΚΤ, και την ενεργοποίηση των υποστρωμάτων ΑΚΤ όπως PRAS40, GSK3-β και FOXO. SC-66 εμφανίζονται συνεργιστικά αποτελέσματα με 2-DG, και SC-66 αναστέλλεται περαιτέρω κατάντη γεγονότα όπως μετατόπιση των μεταφορέων γλυκόζης στη μεμβράνη η οποία οδήγησε σε μειωμένη πρόσληψη γλυκόζης. Επιπλέον, η αναστολή της ΑΚΤ μειωμένη γλυκόλυση, όπως αποδεικνύεται από τα μειωμένα επίπεδα ΑΤΡ και γαλακτικό, και αυξημένη δραστικότητα των εναλλακτικών μεταβολικών οδών με αποτέλεσμα αυξημένη κυτταρική NADPH. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι αναστολείς ΑΚΤ μειώσει τραχήλου της βιωσιμότητας του καρκίνου παρεμβαίνοντας στο μεταβολισμό της γλυκόζης κυτταρική. Υποθέτουμε ότι οι καρκίνοι του τραχήλου της μήτρας με ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού μεταβολές εξαρτώνται από υψηλούς ρυθμούς πρόσληψης γλυκόζης και γλυκόλυση για την επιβίωση. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ενεργοποίηση του Akt από

ΡΤΕΝ

απώλεια και /ή

PIK3CA

μεταλλάξεις θα παρακάμψει την ανάγκη για την ενεργοποίηση των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα (δηλ IGF-1 R) για την κίνηση της ΡΙ3Κ /AKT /mTOR καταρράκτη σηματοδότησης. Με τον τρόπο αυτό, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα είναι σε θέση να ρυθμίζουν προς τα πάνω κατά την εισαγωγή και το μεταβολισμό της γλυκόζης ακόμη και εν απουσία των κατάλληλων εξωτερικών σημάτων.

Προηγουμένως έχει δειχθεί ότι η αναστολή της mTORC2 οδηγεί σε ταχεία αναστολή της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ Ser473, η οποία επιταχύνει τη διαδικασία αποσταθεροποίηση θέση φωσφορυλίωσης Thr308 [23]. Σύμφωνα με αυτό, παρατηρήσαμε επίσης ότι η SC-66 μεσολαβεί μια ταυτόχρονη μείωση της φωσφορυλίωσης της Ser473 και Thr308 σε κύτταρα C33A. Προγενέστερες εργασίες από άλλους προτείνει ότι αποφωσφορυλίωση ΑΚΤ σε Thr308 θέση οδηγεί σε πιο βαθιά αναστολή της λειτουργίας ΑΚΤ απ ‘ότι θα φανεί από αποφωσφορυλίωση του ΑΚΤ σε Ser473 και μόνο [23]. Thr308 είναι ένα υπόλειμμα σε ένα κλειδί Τ-θηλιά της πρωτεΐνης ΑΚΤ και θεωρείται ως καλύτερος δείκτης της δραστηριότητας κινάσης ΑΚΤ. Υπάρχουν ασύμφωνα στοιχεία σχετικά με την φωσφορυλίωση και ΑΚΤ δραστικότητα κινάσης Ser473 [24], [25]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η SC-66 αναστέλλει όλες τις τρεις φωσφορυλιωμένες μορφές της ΑΚΤ.

Υπάρχουν αναφορές ότι mTORC2 απαιτείται για την ανάπτυξη ορισμένων μορφών καρκίνου με

PTEN

απώλεια [26]. κύτταρα C33A είναι

PTEN

ελαττωματικό, και βρήκαμε ότι το SC-66 είναι ένας ισχυρός αναστολέας mTORC2. Η

ΡΤΕΝ

R233 * μετάλλαξη βρίσκεται σε κύτταρα C33A μπορεί να οδηγήσει σε μεγαλύτερη ενδοκυτταρική συσσώρευση PIP

3 καταλήγοντας σε αυξημένη σηματοδότηση ΡΙ3Κ και PDK-1-μεσολαβούμενη ΑΚΤ Thr308 φωσφορυλίωσης [25], [27], [ ,,,0],28]. Θεωρούμε ότι η SC-66 ασκεί ανασταλτική δράση της επί της φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ Thr308 έμμεσα δρώντας ως αναστολέας PDK-1. SC-66 μπορεί να μην είναι τόσο αποτελεσματική ως αναστολέας της PDK-1, όπως είναι για mTOR και AKT, και αυτό εξηγεί τα ελαφρώς υψηλότερα επίπεδα Thr308 παρατηρήθηκε μετά από περισσότερο από επώαση. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η SC-66 είναι ένας ισχυρός επαγωγέας κυτταρικού θανάτου από 24 ώρες, έτσι επανενεργοποίηση της ΑΚΤ μπορεί να μην είναι ένα θέμα

in vivo

.