Αφηρημένο

Η φθοροπυριμιδίνες 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και FdUrd (5-φθοροδεοξυουριδίνη? φλοξουριδίνη) αποτελούν τη ραχοκοκαλιά της σχήματα χημειοθεραπείας για τον καρκίνο του παχέος εντέρου και άλλων όγκων. Παρά την ευρεία χρήση τους, παραμένει ασαφές το πώς αυτοί οι παράγοντες σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα. Εδώ, έχουμε αναλύσει τις οδούς σημείου ελέγχου και επιδιόρθωσης του DNA που επηρεάζουν την άνω και κάτω τελεία απαντήσεις όγκου σε 5-FU και FdUrd. Αυτές οι μελέτες καταδεικνύουν ότι τόσο FdUrd και 5-FU ενεργοποιήσετε την ATR και ΑΤΜ οδοφράγματος οδών σηματοδότησης, υποδεικνύοντας ότι προκαλούν γενοτοξική βλάβη. Αξιοσημείωτα, όμως, η εξάντληση του ΑΤΜ ή ATR δεν ευαισθητοποιεί κύτταρα καρκίνου κόλου σε 5-FU, ενώ οι εν λόγω σημείο ελέγχου οδοί προάγουν την επιβίωση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με FdUrd, γεγονός που υποδηλώνει ότι FdUrd εξασκεί κυτταροτοξικότητα διακόπτοντας την αντιγραφή του DNA ή /και την πρόκληση βλάβης του DNA, ενώ 5-FU δεν το κάνει. Βρήκαμε επίσης ότι η απενεργοποίηση του μονοπατιού επιδιόρθωση βάσης εκτομή (BER) με τη μείωση ΧΚΧΧ1 ή APE1 ευαισθητοποιημένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σε FdUrd αλλά όχι 5-FU. Συνεπής με ένα ρόλο για το μονοπάτι ΚΑΚ, δείχνουμε ότι μικρό μόριο πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης 1/2 αναστολείς (PARP), AZD2281 και ΑΒΤ-888, αξιοσημείωτα ευαισθητοποιημένα τόσο επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων (MMR) -proficient και ελλιπή ως καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές προς FdUrd αλλά όχι σε 5-FU. Λαμβανόμενες μαζί, αυτές οι μελέτες αποδεικνύουν ότι οι ρόλοι του genotoxin επαγόμενη σηματοδότηση οδοφράγματος και επιδιόρθωση του DNA διαφέρουν σημαντικά για αυτούς τους παράγοντες και επίσης να προτείνει μια νέα προσέγγιση στη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου στην οποία FdUrd συνδυάζεται με ένα μικρό μόριο αναστολέα PARP.

Παράθεση: Geng L, Huehls AM, Wagner JM, Huntoon CJ, Karnitz LM (2011) Checkpoint Σηματοδοσίας, Βάση Αποκοπή Επισκευή και PARP προαγωγή της επιβίωσης του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα επεξεργασμένα με 5-φθοροδεοξυουριδίνη, αλλά όχι 5-φθοριοουρακίλη. PLoS ONE 6 (12): e28862. doi: 10.1371 /journal.pone.0028862

Επιμέλεια: Abbes Belkhiri, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2, Αύγ, 2011? Αποδεκτές: 16 Νοεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 15, Δεκεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Geng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορηγήσεις R01-CA084321 (LK), Ρ50-CA136393 (LK), GT32-M072474 (AH), η Mayo Clinic Eagles Πιλοτικό Βραβείο Έργου, και η Mayo Clinic. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

5-φθοροουρακίλη έχει δραστικότητα σε πολλαπλές καρκίνους και είναι ένα από τα πιο ευρέως συνταγογραφούμενο αντικαρκινικών παραγόντων, αλλά πιο συχνή η χρήση της είναι σε καρκίνο του παχέος εντέρου, όπου είναι η βάση για όλες τις σύγχρονες θεραπείες του καρκίνου του παχέος εντέρου. Μετά την πρόσληψη σε κύτταρα, 5-FU υποβάλλεται σύμπλεγμα μεταβολικών αντιδράσεων (Σχήμα 1Α? Rev στο [1]..) Για να παραχθεί 3 γνωστών κυτταροτοξικών μεταβολίτες: FUTP (5-φθοροουριδίνης τριφωσφορική), FdUMP (5-μονοφωσφορική δεοξυουριδίνη), και FdUTP ( τριφωσφορική 5-δεοξυουριδίνη). Η FUTP επηρεάζει το μεταβολισμό του RNA μετά την ενσωμάτωσή του σε κυτταρικό RNA, όπου διαταράσσει snRNA, tRNA, rRNA και την επεξεργασία, καθώς και την ριβονουκλεολυτική δραστηριότητα του εξωσωμάτων και pseudouridylation του RNA [2] – [8].

( Α) Μεταβολισμός του 5-FU και FdUrd. (Β, C) ΗΤ29 (Β) και HCT-8 κύτταρα (C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU (80 μΜ, ΗΤ29 κύτταρα? 200 μΜ HCT-8 κύτταρα), FdUrd (40 μΜ και για τις δύο κυτταρικές σειρές), ή 10 mM υδροξυουρία (HU) για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. κυτταρικά εκχυλίσματα στυπώθηκαν για φωσφο-Ser317-Chk1 (Ρ-Chk1), φωσφο-Thr68-Chk2 (Ρ-Chk2), Chk1 ή Chk2. TS, θυμιδυλική συνθάση? TP, θυμιδίνης φωσφορυλάσης? UP, ουριδίνη φωσφορυλάση? Ηνωμένο Βασίλειο, ουριδίνη κινάσης? OPRT, οροτική φωσφοριβοσυλτρανσφεράση? RR, ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση? FUR, 5-φθοροουριδίνης? FUMP, 5-φθοροουριδίνη μονοφωσφορική? FUDP, 5-φθοροουριδίνης διφωσφορική? FUTP, 5-φθοροουριδίνης τριφωσφορική? FdUMP, 5-φθοροδεοξυουριδίνη μονοφωσφορική? FdUDP, 5-φθοροδεοξυουριδίνη διφωσφορική? FdUTP, 5-φθοροδεοξυουριδίνη τριφωσφορική.

Η

Αντίθετα, FdUMP και FdUTP διαταράσσουν το μεταβολισμό του DNA. Αυτές οι μεταβολίτες που παράγονται μετά την μετατροπή της 5-FU να FdUrd (5-φθοροδεοξυουριδίνη? φλοξουριδίνη), το οποίο είναι επίσης ένα FDA εγκεκριμένο χημειοθεραπευτικό παράγοντα για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου [9] και συχνά θεωρείται ότι έχουν παρόμοιο μηχανισμό δράσης ως 5-FU. FdUrd είναι τότε φωσφορυλιώνεται σε FdUMP και φωσφορυλιώνεται περαιτέρω να FdUTP [1]. Η FdUMP αναστέλλει θυμιδυλική συνθάση (TS), η οποία εμποδίζει την μετατροπή του dUMP σε dTMP, τελικά προκαλώντας την εξάντληση των dTTP, τη συσσώρευση dUTP, και τη διάσπαση των αναλογιών dNTP. Σε αντίθεση, FdUTP, καθώς και η συσσωρευμένη dUTP, ενσωματώνονται στο DNA

Σύμφωνα με τις ικανότητές τους να διαταράξει τα επίπεδα dNTP, τόσο FdUrd και 5-FU ενεργοποιούν το μονοπάτι σηματοδότησης οδοφράγματος ATR [10] -. [17 ], ένα μονοπάτι που ενεργοποιείται όταν αντιγραφή του DNA αναστέλλεται και ότι παίζει επίσης κρίσιμο ρόλο στην προαγωγή της επιβίωσης των κυττάρων που βιώνουν άγχος αντιγραφή που παράγεται από διάσπαση dNTP ή /και των αλλοιώσεων του DNA [18]. Μόλις ενεργοποιηθεί, ATR φωσφορυλιώνει πολλαπλά υποστρώματα, συμπεριλαμβανομένων των Chk1. Οι συλλογικές δραστηριότητες της κινάσης της ATR και Chk1 ενορχηστρώσει το σημείο ελέγχου φάσης S και ρυθμίζουν την επιδιόρθωση του DNA για την προώθηση της βιωσιμότητας των κυττάρων και την ανάκτηση [19]. Επιπλέον, 5-FU και FdUrd προκαλέσει επίσης διπλή διάσπαση της έλικας του DNA [20], [21], η οποία με τη σειρά τους ενεργοποιούν το σημείο ελέγχου ΑΤΜ μονοπατιού σηματοδότησης. Η οδός ΑΤΜ ρυθμίζει επίσης την επιβίωση των κυττάρων είτε με επαγωγή απόπτωσης ή την πρόληψη της προόδου του κυτταρικού κύκλου και την ενεργοποίηση επιδιόρθωση του DNA, και τα δύο εκ των οποίων προάγει την επιβίωση [22]. Αξιοσημείωτα, όμως, παραμένει ασαφές αν οι οδοί checkpoint ATR ή /και ATM παίζουν σημαντικό ρόλο στον προσδιορισμό της επιβίωσης του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα, τα κύτταρα που στοχεύονται από την 5-FU και FdUrd σε ασθενείς, όταν αντιμετωπίζονται με αυτούς τους παράγοντες .

Η ουρακίλη και η 5-FU που ενσωματώνονται στο γονιδίωμα αναγνωρίζονται επίσης από οδούς επιδιόρθωσης του DNA 2 που μπορεί να παίζει ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με 5-FU και FdUrd. Μία οδός είναι η οδός επιδιόρθωσης βάση εκτομή (BER) [1], [23]. Σε αυτή την οδό, γονιδιωματικά ενσωματώνεται ουρακίλη και η 5-FU είναι πρώτα αναγνωρίζονται από γλυκοζυλασών ουρακίλη, η οποία εκτομή της βλάβης, αφήνοντας μια αβασική θέση. Η αβασική θέση περαιτέρω επεξεργασία από μία ενδονουκλεάση (π.χ., APE1), δημιουργώντας ένα μονόκλωνο διάλειμμα DNA που αναγνωρίζεται από πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράση, η οποία πολυ (ADPribosyl) εαυτό ates, καθώς και άλλες πρωτεΐνες επισκευής, την πρόσληψη ΧΚΧΧ1 και άλλες πρωτεΐνες που πλήρη επισκευή [24]. Οι έρευνες για τον ρόλο της BER σε κύτταρα κατεργασμένα με 5-FU ή FdUrd έφθασαν ανόμοιες συμπεράσματα χρησιμοποιώντας μια ευρεία ποικιλία συστημάτων μοντέλου. Δεδομένου ότι αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι η απενεργοποίηση BER προστατεύει, ευαισθητοποιεί, ή δεν έχει καμία επίδραση στην κυτταροτοξικότητα που επάγεται από 5-FU και FdUrd σε αυτά τα ποικίλα συστήματα, συμπεριλαμβανομένων ποντίκι [17], [23], [25] – [35], παραμένει ασαφές ποια, ενδεχομένως, ρόλο παίζει BER στην επιβίωση του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα που εκτίθενται σε 5-FU ή FdUrd.

το άλλο εμπλέκεται οδού επιδιόρθωσης είναι το σύστημα επιδιόρθωσης αναντιστοιχία (MMR).

In vitro

μελέτες έχουν δείξει ότι η οδός MMR μπορεί να αφαιρέσει 5-FU από τεχνητά υποστρώματα που περιέχουν 5-FU: G mispairs. Αξίζει να σημειωθεί, ωστόσο, μελέτες σε κύτταρα υποδεικνύουν ότι το εμβόλιο MMR παίζει μόνο ένα μικρό ρόλο στην εκτομή του 5-FU αλλοιώσεις στο γονιδίωμα [35]. Αναλύσεις των αποτελεσμάτων της οδού MMR στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά την αγωγή με 5-FU και FdUrd έχουν γενικά υποδεικνύεται ότι τα κύτταρα με ελαττωματικό MMR είναι πιο ανθεκτικά στην 5-FU και FdUrd [10], [36] – [38], ένα αποτέλεσμα συνεπής με το εύρημα ότι MMR-ελαττωματικός ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου δεν επωφελούνται από 5-FU θεραπεία [39].

Λόγω των πολλαπλών μηχανισμών δράσης των 5-FU και FdUrd και το ευρύ φάσμα των πειραματικών συστημάτων που χρησιμοποιούνται σε αυτές οι μελέτες (συμπεριλαμβανομένων των μελετών σε κυτταρικές σειρές ποντικού και σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από όγκους που δεν είναι συνήθως σε επεξεργασία με 5-FU ή FdUrd), ξεκινήσαμε μελετών για την εξέταση των ρόλων των επιμέρους σηματοδότησης οδοφράγματος και τις οδούς επιδιόρθωσης του DNA στα ανθρώπινα κύτταρα που προέρχονται από ανθρώπινους όγκους. Στην πρώτη μας ανάλυση, βρήκαμε ότι το 5-FU και FdUrd έχουν πολύ διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [17]. Η απενεργοποίηση ATR ή BER ευαισθητοποιημένα αυτά τα κύτταρα να FdUrd, αλλά όχι 5-FU, υποδεικνύοντας ότι FdUrd σκοτώνει τα κύτταρα προκαλώντας βλάβη του DNA και ότι η 5-FU ασκεί κυτταροτοξικότητα της με έναν άλλο μηχανισμό, ενδεχομένως με διάσπαση του μεταβολισμού RNA. Αξίζει να σημειωθεί ότι, βρήκαμε επίσης ότι οι αναστολείς PARP, οι οποίες έχουν δείξει πρωτοφανή δράση ενάντια στους όγκους των ωοθηκών και άλλων όγκων που έχουν μεταλλαχθεί

BRCA1

και

BRCA2

[40] – [43], εξαιρετικά ευαισθητοποιημένα καρκίνο των ωοθηκών κυττάρων σε FdUrd αλλά όχι 5-FU [17]. Δεδομένου ότι FdUrd δραστηριοποιείται στον καρκίνο των ωοθηκών [44], [45], ότι τα ελαττώματα στο

BRCA1

και

BRCA2

(ή άλλα γονίδια στο ομόλογο οδού επιδιόρθωσης) είναι κοινά στον καρκίνο των ωοθηκών [ ,,,0],46], και ότι οι αναστολείς PARP θα έχει πιθανόν ένα ρόλο στη θεραπεία των καρκίνων των ωοθηκών [24], αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν μία νέα θεραπευτική στρατηγική για τον καρκίνο των ωοθηκών. Αξιοσημείωτα, όμως, η βιολογία του καρκίνου των ωοθηκών είναι πολύ διαφορετική από τη βιολογία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια συνήθως μεταλλαγμένα σε καρκίνους του κόλου (

APC, ρ53, ΡΙ3Κ, KRAS

) διαφέρουν από τα γονίδια που συνήθως μεταλλαγμένα σε καρκίνους των ωοθηκών (

NF1, RB1, CDK12, CCNE1, NOTCH

) [46], [47]. Επιπλέον, οι οδοί επιδιόρθωσης του DNA που διασπώνται σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου είναι πολύ διαφορετικές από εκείνες που διασπώνται σε καρκίνους των ωοθηκών. Για παράδειγμα, τα γονίδια που απαιτούνται για την αναντιστοιχία οδού επιδιόρθωσης (π.χ.,

MLH1

και

MSH2

) συχνά μεταλλάσσεται ή επιγενετικώς σιγήσει σε καρκίνους του παχέος εντέρου [39], [48], ενώ ελαττώματα ομόλογο ανασυνδυασμού (π.χ.,

BRCA1

και

BRCA2

μεταλλάξεις) συμβαίνουν σε καρκίνους των ωοθηκών [46], [47]. Τέλος, οι όγκοι των ωοθηκών και του παχέος εντέρου έχουν πολύ διαφορετικές αποκρίσεις σε 5-FU. Ενώ 5-FU έχει πολύ περιορισμένη δραστικότητα στον καρκίνο των ωοθηκών [49], [50], 5-FU είναι ο ακρογωνιαίος λίθος για όλες τις αγωγές χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία καρκίνων του παχέος εντέρου, λόγω της υψηλής δραστικότητας της σε αυτή τη νόσο. [1] Κατά συνέπεια, δεδομένου αυτά βιολογικές διαφορές μεταξύ των καρκίνων των ωοθηκών και του παχέος εντέρου, καθώς και το γεγονός ότι το 5-FU χρησιμοποιείται παγκοσμίως σε σχήματα χημειοθεραπείας του καρκίνου του παχέος εντέρου, έχουμε τώρα προσδιοριστεί πώς 5-FU και FdUrd σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου για να αποκτήσουν σημαντικές γνώσεις στις οποίες βασίζεται η βιολογία του αυτοί οι παράγοντες και να βελτιώσουν τη χρήση τους στην κλινική για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας. Για το σκοπό αυτό, έχουμε ξεκινήσει μια συστηματική ανάλυση των ρόλων των genotoxin που ενεργοποιείται σηματοδότηση σημείο ελέγχου, το μονοπάτι ΚΑΚ, και την οδό MMR με τη μείωση των βασικών ενδιάμεσων σηματοδότησης σε αυτές τις πορείες, χρησιμοποιώντας άκρως αποτελεσματική siRNAs. Αυτά τα ευρήματα φωτίζουν όχι μόνο περαιτέρω κατανόηση των οδών σηματοδότησης και επιδιόρθωσης του DNA που είναι σημαντικά σε αυτά τα κύτταρα, μπορούν επίσης αποκαλύπτουν ότι όγκου κόλου κύτταρα ευαισθητοποιημένα σε FdUrd από μικρές αναστολείς PARP μόριο που είναι σήμερα σε κλινικές δοκιμές, υποδεικνύοντας έτσι μία νέα θεραπευτική προσέγγιση που συνδυάζει FdUrd, ένα φάρμακο που έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου, με έναν αναστολέα PARP, μια αναδυόμενη κατηγορία παραγόντων με συναρπαστικές αντικαρκινική δράση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές γραμμές και καλλιέργεια

ΗΤ29, HCT-8, και HCT-116 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. HCT-116.ch2 και HCT-116.ch3 [51] κύτταρα από Scott Kaufmann (Mayo Clinic). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Mediatech) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Atlanta Biologicals) στους 37 ° C σε 5% CO

2. Για κλωνογονική προσδιορισμούς, το μέσο συμπληρώθηκε με 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Mediatech)

Υλικά |

αντιδραστήρια ήταν από τους ακόλουθους προμηθευτές:. 5-φθοριοουρακίλη (Pharmaceuticals ΑΡΡ ), FdUrd (Bedford Laboratories), ABT-888 (Σέλεκ Χημικά και ChemieTek), AZD2281 (ChemieTek), KU-55933 (Tocris Bioscience), γεμσιταβίνη (Eli Lilly), SuperSignal Pico Δύση (Thermo Scientific). Όλα τα άλλα υλικά ήταν από την Sigma-Aldrich

Αντισώματα είχαν ως εξής:. Φωσφο-Ser317-Chk1 (R &? D Systems)? φωσφο-Thr68-Chk2, ATR, υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένο IgG κουνελιού, και υπεροξειδάση κρένου-συνδεδεμένο IgG ποντικού (Cell Signaling)? Chk1 (Santa Cruz Biotechnology)? Chk2 και ΑΤΜ (Epitomics)? APE1 (Abcam)? ΧΚΧΧ1 (Bethyl Laboratories)? βήτα-ακτίνης (Sigma-Aldrich)? και HSP90, Δ Toft (Mayo Clinic, Rochester, MN).

επιμολύνσεις κυττάρων και μικρές παρεμβολές (SI) RNAs

siRNAs επιμολύνονται με ηλεκτροδιάτρηση όπως περιγράφεται [17]. Τα διαμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες πριν από τη χρήση. Ακολουθίες siRNAs ήταν: ATM-1, 5′-GCACCAGUCCAGUAUUGGC-3 ‘[52]? ATR-2, 5’-CCUCCGUGAUGUUGCUUGA-3 ‘[53]? XRCC1-2, 5’-CUCGACUCACUGUGCAGAA-3 ‘[54]? APE1, 5’-GGACAGAGCCAGAGGCCAA-3 ‘? MLH1, 5’-GGAAGAUUCUGAUGUGGAA-3 ‘? MSH2, 5’-GAUCCUAAUCUCAGUGAAU-3 ‘? και λουσιφεράση, 5’-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 ‘[55].

Δοκιμασίες κλωνογονικότητας, κυτταρική λύση και η κυτταρική ακτινοβόληση

αναλύσεις κυτταρικού κύκλου, κλωνογονική προσδιορισμούς, κυτταρική λύση, ανοσοκηλίδωση και ανοσοχρώση διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [56], [57]. Για κλωνογόνο δοκιμασίες χρησιμοποιώντας μη-επιμολυσμένα κύτταρα, τοις εκατό επιβίωσης όλων των επιμέρους και συνδυασμός θεραπειών ομαλοποιήθηκαν προς κύτταρα που κατεργάζονται μόνο με όχημα. Για κλωνογενείς δοκιμασίες χρησιμοποιώντας κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA, τοις εκατό επιβίωσης σε κάθε συγκέντρωση φαρμάκου κανονικοποιήθηκαν με τον έλεγχο του οχήματος-θεραπεία για τη δεδομένη siRNA. Τα κύτταρα ακτινοβολούνται με RS-2000 Βιολογική Irradiator, Rad Πηγή (Suwanee, GA) 4-6 ώρες μετά την επίστρωση.

Αποτελέσματα

5-FU και FdUrd ενεργοποιήσετε την σηματοδότηση σημείο ελέγχου ATR και ΑΤΜ οδών σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

για να αξιολογήσει τα αποτελέσματα της 5-FU και FdUrd στις οδούς ΑΤΜ και ATR σημείο ελέγχου σηματοδότησης, συγκρίναμε τις ικανότητες αυτών των παραγόντων για να ενεργοποιήσετε το σημείο ελέγχου σηματοδότησης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου δύο: ΗΤ29, τα οποία έχουν ένα λειτουργικό MMR συστήματος, και HCT-8, οι οποίες έχουν μεταλλάξεις στο

MSH6

και MMR ανεπαρκή [58]. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συγκεντρώσεις κάθε παράγοντα που αναστέλλουν κλωνογονικότητας κατά 90% (IC

90) και, ως θετικός έλεγχος, η υδροξυουρία αναστολέα αναδιπλασιασμού. Η ενεργοποίηση των οδών ΑΤΜ και ATR στη συνέχεια αξιολογήθηκε με ανοσοστύπωμα για φωσφορυλιωμένη Chk1 και Chk2, δύο πρωτεϊνικές κινάσες που είναι φωσφορυλιωμένα και ενεργοποιούνται από ATR και ATM [59]. Αυτές οι μελέτες αποκάλυψαν ότι η 5-FU και FdUrd ενεργοποιείται έντονα Chk1 και Chk2 σε κύτταρα ΗΤ29 (Εικ. 1Β), με 5-FU προκαλεί ακόμη μεγαλύτερα επίπεδα φωσφορυλίωσης Chk1 από ό, τι FdUrd. Ομοίως, σε HCT-8 κυττάρων, αμφότεροι οι παράγοντες που επάγεται Chk1 φωσφορυλίωσης (Εικ. 1 C)? Ωστόσο, σε αυτά τα κύτταρα 5-FU που προκαλείται λιγότερο από ό, τι Chk1 FdUrd. Αναλύσεις της φωσφορυλίωσης Chk2 δεν ήταν δυνατόν, λόγω των πολύ χαμηλών επιπέδων Chk2 στα κύτταρα HCT-8 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι οι δύο παράγοντες προκαλούν γονοτοξική ζημιά που ενεργοποιεί το σημείο ελέγχου μονοπατιών σηματοδότησης σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

ATR και ATM προάγουν την επιβίωση του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα επεξεργασμένα με FdUrd αλλά όχι 5-FU

ATM και ATR είναι τα δύο κορυφαία ρυθμιστές κινάσης της genotoxin που προκαλείται από σηματοδότηση σημείο ελέγχου. Για να προσδιοριστεί εάν είτε ΑΤΜ ή ΑΤΚ ενεργοποιούν οδούς που επηρεάζουν την επιβίωση των κυττάρων σε επεξεργασία με FdUrd ή 5-FU, εμείς παροδικά απεμπλουτισμένο ATM και ATR χρησιμοποιώντας siRNAs, και στη συνέχεια αξιολογείται η ικανότητα των κυττάρων σε επεξεργασία με διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις FdUrd ή 5-Fu για να πολλαπλασιάζονται χρησιμοποιώντας κλωνογενείς δοκιμασίες. Παραδόξως, η εξάντληση του ΑΤΜ ή ATR δεν ευαισθητοποιεί δύο κυτταρικές σειρές σε 5-FU (Σχ. 2Α και 2Β), έστω και αν αυτός ο παράγοντας ενεργοποιείται αυτές τις οδούς (βλέπε Εικ. 1Β και 1Γ). Μια πολύ διαφορετική εικόνα προέκυψε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FdUrd. Η εξάντληση του ATR ευαισθητοποιημένων δραματικά κύτταρα ΗΤ29 να FdUrd (Εικ. 2Β) και σε γεμσιταβίνη (Εικ. S1 Α), ένα ανάλογο νουκλεοζίτη που αναστέλλει ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης και διαταράσσει την αντιγραφή του DNA, όταν ενσωματώνονται σε DNA [60]. Σε αντίθεση, η εξάντληση ATM (Εικ. 2Α) και ο αναστολέας ATM KU-55933 [61] (Εικ. S1c), τα οποία αμφότερα ευαισθητοποιημένων σε ιονίζουσα ακτινοβολία (Εικ. S1B και το Σχήμα S1D), είχε ελάχιστα αποτελέσματα επί FdUrd κυτταροτοξικότητα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε HCT-8 και HCT-116 κύτταρα, στα οποία εξάντληση ATR ευαισθητοποιημένα δύο κυτταρικές σειρές να FdUrd αλλά όχι 5-FU (Εικ. 3).

(Α, Β) κυττάρων ΗΤ29, επιμολυσμένα με τον έλεγχο (Luc), ΑΤΜ (Α), ή ATR (Β) siRNAs, απλώθηκαν ως απλά κύτταρα, που εκτίθενται σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της 5-FU ή FdUrd για 24 ώρες, πλύθηκαν, καλλιεργήθηκαν για 10 d, και χρωματίστηκαν με Coomassie Blue. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επίσης διαδοχικά ανοσοστυπώθηκαν (ένθετα) για την ανίχνευση ΑΤΜ, ATR, και HSP90 (ως έλεγχος φόρτωσης). *, Μη ειδική ζώνη.

Η

(Α, Β) HCT-8 (Α) ή HCT-116 (Β) κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο (Luc) ή ATR siRNAs απλώθηκαν ως απλά κύτταρα, εκτεθειμένη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της 5-FU ή FdUrd για 24 ώρες, πλύθηκαν, καλλιεργήθηκαν για 10 d, και χρωματίστηκαν με Coomassie Blue. Επιμολυσμένα κύτταρα επίσης διαδοχικά ανοσοστυπώθηκαν για την ATR και HSP90 (α ελέγχου φόρτωσης). *, Μη-συγκεκριμένη ζώνη.

Η

Η διακοπή της ΚΑΚ με τη μείωση ΧΚΧΧ1 ευαισθητοποιεί σε FdUrd αλλά όχι 5-FU

5-FU και FdUrd προκαλέσει τη συσσώρευση ουρακίλη και 5-φθοριοουρακίλη σε γονιδιωματικό DNA [23], [62]. Μελέτες που χρησιμοποιούν καθαρισμένα γλυκοσυλάσες ουρακίλη έχουν δείξει ότι τα συνθετικά υποστρώματα που φέρουν ουρακίλη και η 5-φθοριοουρακίλη υποκαταστάτες είναι υποστρώματα για τα μηχανήματα ΚΑΚ [35], [63] – [70]. Επιπλέον, μια πρόσφατη έκθεση έδειξε ότι σε άθικτα κύτταρα, γλυκοζυλάσες ουρακίλη αφαιρέστε 5-FU από τα γονιδιώματα του καρκίνου του κόλον κύτταρα που εκτίθενται σε FdUrd [35]? Αξιοσημείωτα, όμως, σε αυτές τις μελέτες, η εξάντληση των γλυκοζυλασών δεν επηρέασε την ευαισθησία στην FdUrd. Ως εκ τούτου, να εξεταστεί κατά πόσον η απενεργοποίηση BER επηρέασε την ευαισθησία των κυττάρων ΗΤ29 σε FdUrd, χρησιμοποιήσαμε τα siRNA να καταστρέφουν ΧΚΧΧ1 και APE1, δύο κατάντη βασικοί συμμετέχοντες στην οδό ΚΑΚ, και εξέτασε την ευαισθησία τους σε FdUrd. Σημαντικά, εξάντληση των ΧΚΧΧ1 (Σχ. 4) και APE1 (Εικ. S2) ευαισθητοποιημένα κύτταρα να FdUrd. Σε αντίθεση, η εξάντληση ΧΚΧΧ1 δεν ευαισθητοποιούν αυτά τα κύτταρα σε 5-FU (Σχ. 4), υποδεικνύοντας έτσι ότι BER δεν παίζει ρόλο στην προώθηση της επιβίωσης των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με 5-FU και υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι η 5-FU ασκεί κυτταροτοξική του επιδράσεις ανεξάρτητα από την αντιγραφή ή βλάβη στο DNA.

ΗΤ29 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο (Luc) ή ΧΚΧΧ1 siRNA απλώθηκαν ως απλά κύτταρα, που εκτίθενται σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της 5-FU ή FdUrd για 24 ώρες, πλύθηκαν, καλλιεργήθηκαν για 10 d, και χρωματίστηκαν με Coomassie Blue. Επιμολυσμένα κύτταρα επίσης διαδοχικά ανοσοστυπώθηκαν για ΧΚΧΧ1 και βήτα-ακτίνη (έλεγχος φόρτωσης).

Η

Μικρά μόρια αναστολείς PARP ευαισθητοποιήσει παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα να FdUrd αλλά όχι 5-FU

Δεδομένου ότι ΧΚΧΧ1 και APE1 εξάντληση ευαισθητοποιημένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σε FdUrd, και ότι PARP παίζει ένα βασικό ρόλο στην BER, εμείς αιτιολογημένη ότι οι αναστολείς PARP μπορεί να ευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα κόλον να FdUrd. Ως εκ τούτου, εκτίθεται HCT-8 και ΗΤ29 κυττάρων σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις της FdUrd ή 5-FU μαζί με 3 μΜ ΑΒΤ-888 (veliparib [71]), μία συγκέντρωση που αναφέρθηκε προηγουμένως για την ευαισθητοποίηση πολλαπλές κυτταρικές γραμμές όγκου σε μια ποικιλία παραγόντων χημειοθεραπείας [17], [72]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, ΑΒΤ-888 σθεναρά ευαισθητοποιημένων HCT-8 και ΗΤ29 κύτταρα να FdUrd, ενώ ΑΒΤ-888 δεν μετέβαλε τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της 5-FU. Για να καταδειχθεί περαιτέρω ότι οι αναστολείς PARP ευαισθητοποιούν αυτά τα κύτταρα να FdUrd, ελέγξαμε επίσης τον αναστολέα PARP AZD2281 (olaparib [73]), το οποίο έχει δείξει πρωτοφανή δραστηριότητα σε εντατική αγωγή ασθενών με BRCA1- και BRCA2 με ανεπάρκεια όγκους [40] – [43] . Παρόμοια με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με ΑΒΤ-888, AZD2281 σθεναρά ευαισθητοποιημένα και τις δύο κυτταρικές γραμμές να FdUrd (Εικ. 5), υποστηρίζοντας περαιτέρω την ιδέα ότι η αναστολή PARP ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου να FdUrd.

HCT-8 ή ΗΤ29 κύτταρα απλώθηκαν ως απλά κύτταρα, που εκτίθενται σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της 5-FU ή FdUrd μαζί με 3 μΜ ΑΒΤ-888, 300 ηΜ AZD2281, ή όχημα για 24 ώρες. Μετά την πλύση, 3 μΜ ΑΒΤ-888 ή 300 ηΜ AZD2281 επανα-προστέθηκε, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 10 δ και χρωματίστηκαν με Coomassie Blue.

Η

Μικρές μόριο αναστολέα PARP ευαισθητοποίηση για FdUrd είναι ανεξάρτητη από MMR κατάσταση

Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι τα κύτταρα με βλάβες στο MMR είναι πιο ανθεκτικά στην FdUrd [10], [36] – [38]. Παρομοίως, ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με 5-FU δεν επωφελούνται από 5-FU-based χημειοθεραπείες [39], υποδηλώνοντας ότι ένα ανέπαφο MMR μονοπάτι προωθεί τη θανάτωση από την 5-FU. Επειδή συνδυάζοντας FdUrd με έναν αναστολέα PARP μπορεί να είναι μια πιθανή θεραπευτική στρατηγική, εμείς αιτιολογημένη ότι θα ήταν σημαντικό να προσδιοριστεί εάν τα κύτταρα του όγκου με ελαττώματα στο MMR, οι οποίες εμφανίζονται στο 15-20% των καρκίνων του παχέος εντέρου [39], ευαισθητοποιήθηκαν προς FdUrd από ένας αναστολέας PARP. Για να αξιολογηθεί πόσο MMR κατάσταση επηρεάζει την ευαισθησία του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων σε FdUrd μόνο και με τον συνδυασμό της FdUrd συν AZD2281 χρησιμοποιήσαμε δύο συστήματα μοντέλου. Για το πρώτο σύστημα μοντέλο, χρησιμοποιήσαμε τα siRNA να καταστρέφουν MSH2 και MLH1. Αμφότερα τα siRNAs ήταν πολύ αποτελεσματική, προκαλώντας σχεδόν πλήρη απώλεια MLH1 και MSH2 (Εικ. 6Α) και τη διατάραξη MNNG (Ν-μεθυλ-Ν’-νιτρο-Ν-νιτροζογουανιδίνη) προκληθείσα G2 /M σύλληψης (Εικ. S3), η οποία απαιτεί ένα λειτουργικό MMR μονοπάτι [51]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ΗΤ29 κύτταρα εξαντλούνται του MLH1 ή MSH2 ήταν σοβαρά ευαισθητοποιημένο σε FdUrd από AZD2281, και ήταν συγκρατημένα ανθεκτικά σε FdUrd μόνη της.

(Α) κύτταρα ΗΤ29 επιμολυσμένα με έλεγχο (Luc), MSH2 ή MLH1 sRNAs απλώθηκαν ως απλά κύτταρα, που εκτίθενται σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της 5-FU ή FdUrd για 24 ώρες, πλύθηκαν, καλλιεργήθηκαν για 10 d, και χρωματίστηκαν με Coomassie Blue. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επίσης διαδοχικά ανοσοστυπώθηκαν για MSH2 ή MLH1 και βήτα-ακτίνη (ένας μάρτυρας φόρτωσης). (Β) HCT116.ch2 και HCT116.ch3 κύτταρα εκτέθηκαν στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις FdUrd μαζί με όχημα ή 300 ηΜ AZD2281 για 24 ώρες. Μετά την πλύση, AZD2281 επανα-προστέθηκε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 8 d να επιτραπεί ο σχηματισμός αποικιών.

Η

Για το δεύτερο σύστημα μοντέλο, χρησιμοποιήσαμε τις συνδεμένες κύτταρα του παχέος εντέρου γραμμές, ΗΟΤ-116.ch2 και ΗΟΤ-116.ch3 [51]. Αυτές οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από γονικά κύτταρα HCT-116, τα οποία έχουν διαλληλικών απενεργοποίησης

MLH1

μεταλλάξεις που τα καθιστούν MMR-ανεπαρκή [74]. Τα HCT-116.ch3 κύτταρα περιέχουν ένα επιπλέον χρωμόσωμα 3, το οποίο κωδικοποιεί ένα λειτουργικό MLH1 που αποκαθιστά MMR. Τα HCT-116.ch2 κύτταρα, τα οποία χρησιμοποιούνται ως έλεγχος, περιέχει ένα επιπλέον χρωμόσωμα 2 και όπως τα γονικά κύτταρα είναι MMR-ανεπαρκή. Συνεπής με προηγουμένως δημοσιευμένα αποτελέσματα, τα ελλειμματικά κύτταρα ΗΟΤ-MMR 116.ch2 ήταν συγκρατημένα πιο ανθεκτικά στη FdUrd απο ότι ήταν τα ΗΟΤ-116.ch3 κύτταρα (Σχ. 6Β), τα οποία είναι ικανοί MMR [75]. Αξιοσημείωτα, όμως, AZD2281 ευαισθητοποιημένα σθεναρά και τις δύο κυτταρικές γραμμές να FdUrd. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου με ελαττώματα στην οδό της MMR μπορεί επίσης να ευαισθητοποιούνται προς FdUrd από ένα μικρό μόριο αναστολέα PARP.

Συζήτηση

5-FU είναι μεταξύ των πιο ευρέως χρησιμοποιούμενοι παράγοντες αντικαρκινικής χημειοθεραπείας, και (ή η καπεσιταβίνη προφάρμακο 5-FU) είναι η ραχοκοκαλιά όλων των καθεστώτων χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου [1], η τρίτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται στις Ηνωμένες Πολιτείες [76]. Παρά την ευρεία χρήση της στην αγωγή του καρκίνου του παχέος εντέρου, παραμένει ασαφές το πώς αυτός ο παράγοντας θανατώνει τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Ομοίως, FdUrd, η οποία συχνά θεωρείται ότι έχουν παρόμοιο μηχανισμό δράσης με την 5-FU, χρησιμοποιείται επίσης για τη θεραπεία όγκων του παχέος εντέρου, που έχουν κάνει μετάσταση στο ήπαρ. Να αποκτήσουν εικόνα για το πώς αυτοί οι παράγοντες επηρεάζουν τον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα πρέπει πρώτα διεξαχθεί ολοκληρωμένη ανάλυση των ρόλων των ΑΤΜ και ATR σημείο ελέγχου μονοπάτια στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που εκτίθενται σε 5-FU και FdUrd σηματοδότησης, και στη συνέχεια ανέλυσε το ρόλο του μονοπατιού ΚΑΚ, ένα οδού επιδιόρθωσης που αφαιρεί ανάλογα ουρακίλη και ουρακίλη που ενσωματώνεται εντός του γονιδιώματος. Έχουμε προηγουμένως σύγκριση των μηχανισμών με τους οποίους 5-FU και FdUrd σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Αξιοσημείωτα, όμως, η 5-FU έχει πολύ περιορισμένη κλινική δράση κατά του καρκίνου των ωοθηκών [49], [50], και οι οδοί επιδιόρθωσης του DNA που διασπώνται σε καρκίνο των ωοθηκών διαφέρουν από εκείνες που διασπώνται σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Συγκεκριμένα, οι καρκίνοι των ωοθηκών συχνά εμφανίζουν «BRCAness» λόγω ελαττωμάτων στο

BRCA1

ή

BRCA2

, ή άλλες ασαφώς καθοριζόμενες αλλαγές που διαταράσσουν το ομόλογο επισκευή ανασυνδυασμού του DNA οδού [46]. Σε αντίθεση, σε καρκίνους του παχέος εντέρου η οδός επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων συχνά μεταλλάσσεται ή σιγήσει [39], [48], και η οδός MMR έχει αναφερθεί ότι επηρεάζουν θανάτωση κυττάρων με 5-FU και FdUrd [36] – [38], [77 ], [78]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα έκθεση, έχουμε πραγματοποιήθηκε σύγκριση head-to-head αυτών των παραγόντων στο MMR-καλά και ελλιπή ως καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που έχουν εξαντληθεί από τις βασικές ενδιάμεσων σημείων ελέγχου σηματοδότησης και πορεία ΚΑΚ. Είναι σημαντικό, αυτές οι μηχανιστικές μελέτες έχουν αποκαλύψει νέες ιδέες για το πώς οι παράγοντες αυτοί σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου και εντόπισε μια πιθανή θεραπευτική στρατηγική κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Κατ ‘αρχάς, οι μελέτες μας έδειξαν την ATR-αλλά όχι το ΑΤΜ σημείο ελέγχου σηματοδότησης παίζει μονοπάτι ένα κρίσιμο ρόλο διευκολύνοντας την επιβίωση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με FdUrd. Αν και προηγούμενες μελέτες τεκμηριωμένο ότι FdUrd ενεργοποιεί τα ATM- και ATR-εξαρτώμενη σημεία ελέγχου [10], [13], [79], οι μελέτες αυτές δεν συνέκρινε τα αποτελέσματα του ΑΤΜ και ATR εξάντλησης για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου που εκτίθενται σε δύο παράγοντες. Εδώ έχουμε αντιμετωπίσει το ζήτημα αυτό. Παραδόξως, βρήκαμε ότι παρόλο που FdUrd έχει αναφερθεί ότι προκαλεί θραύσεις δίκλωνου DNA [20], [21], ATM έχει μόνο έναν δευτερεύοντα ρόλο στην FdUrd που προκαλείται από τη θανάτωσή τους. Σε αντίθεση, η εξάντληση ATR σοβαρά ευαισθητοποιημένα σε FdUrd, καταδεικνύοντας ότι η ATR διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη σταθεροποίηση στασιμότητα πιρούνια αντιγραφή και την πρόληψη κατάρρευσης τους, προωθώντας έτσι την επιβίωση των κυττάρων όταν τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με αναστολείς αντιγραφής, όπως το ανάλογο νουκλεοζίτη γεμσιταβίνη [60]. Ως εκ τούτου, οι παρούσες μελέτες δείχνουν ότι η διαταραχή της αντιγραφής του DNA που εμφανίζεται όταν TS αναστέλλεται και η επακόλουθη διαταραχή των επιπέδων dNTP είναι πιθανό ένα σημαντικό μηχανισμό με τον οποίο FdUrd προκαλεί κυτταροτοξικότητα.

Δεύτερον, τα παρόντα αποτελέσματα βοηθήσει να διευκρινιστεί η ρόλος του BER σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου που εκτίθενται σε 5-FU και FdUrd. Προηγούμενες μελέτες που εξετάζουν τον ρόλο του μονοπατιού BER έχουν βρει ανόμοια αποτελέσματα, με αυξημένη, μειωμένη ή φυσική ευαισθησία σε 5-FU ή FdUrd σε μία ποικιλία πειραματικά συστήματα [17], [23], [25] – [35]. Σε αντίθεση, τα παρόντα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εξάντληση ΧΚΧΧ1 ευαισθητοποιεί προς FdUrd αλλά όχι 5-FU. Αυτό το εύρημα, μαζί με δημοσιευμένες μελέτες μας δείχνουν ότι ένα άθικτο οδός BER προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με FdUrd [17], δείχνει ότι FdUrd προκαλεί αλλοιώσεις που είναι κυτταροτοξικές σε κάποια ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, τα δύο ισχυρά και εξαιρετικά εξειδικευμένοι αναστολείς μικρού μορίου της PARP ευαισθητοποιημένων επίσης να FdUrd. Αυτά τα αποτελέσματα είναι παρόμοια με αυτό που παρατηρήθηκε σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [17]. Ωστόσο, δεδομένου ότι ωοθηκών καρκινικά κύτταρα συχνά παρουσιάζουν BRCAness (λόγω ελαττωμάτων σε ομόλογο ανασυνδυασμό) [46], [80], ένα φαινότυπο που καθιστά τα κύτταρα εξαιρετικά ευαίσθητα σε αναστολείς PARP [81], παρέμεινε αναπάντητο ερώτημα αν οι αναστολείς PARP επίσης θα ευαισθητοποιηθούν FdUrd σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, οι οποίες δεν έχουν ελαττώματα σε ομόλογο ανασυνδυασμό. Θα πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι αν και τα ευρήματα ΧΚΧΧ1 μας υποστηρίζουν σθεναρά έναν προστατευτικό ρόλο για BER, τα αποτελέσματα των αναστολέων PARP μπορεί να είναι πιο περίπλοκη. PARP παίζει όχι μόνο ένα σημαντικό ρόλο στην BER αλλά συμμετέχει επίσης σε άλλες οδούς επιδιόρθωσης του DNA και την κυτταρική σηματοδότηση μονοπατιών, αυξάνοντας την πιθανότητα ότι η τεράστια ευαισθητοποίηση που παρατηρείται με τους αναστολείς PARP μπορεί να προέλθει από επιδράσεις στην BER, καθώς και άλλα κυτταρικά μονοπάτια.

Τρίτον, οι παρούσες μελέτες δείχνουν ότι καταστρέφουν τα κορυφαία ρυθμιστές του οδοφράγματος σηματοδότησης (ATR και ATM) ή η απενεργοποίηση των βασικών μελών του BER μονοπάτι (με ΧΚΧΧ1 και APE1 siRNAs ή αναστολείς PARP) δεν ευαισθητοποιηθούν 5-FU. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι το 5-FU ασκεί κυτταροτοξικά αποτελέσματα της ανεξάρτητα από τα αποτελέσματά της για την αντιγραφή ή την ακεραιότητα του DNA. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το αποτέλεσμα αυτό είναι σύμφωνο με μια σειρά από μελέτες που δείχνουν ότι το 5-FU προκαλεί θανάτωση κυττάρου με ενσωμάτωση σε RNA και να αναμειχθεί με το μεταβολισμό του RNA [82] – [89]. Αντίθετα, η διαπίστωση ότι η απενεργοποίηση των οδών ATR και BER ευαισθητοποιεί έντονα σε FdUrd, δείχνει ότι αυτός ο παράγοντας σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου κυρίως επηρεάζοντας τον μεταβολισμό του DNA, αποδεικνύοντας έτσι ότι το 5-FU και FdUrd έχουν πολύ διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης.

Τέλος, και το σημαντικότερο, αυτές οι μελέτες, οι οποίες ξεκίνησαν να προσδιορίσουν τις οδούς σημείου ελέγχου και επιδιόρθωσης του DNA που ρυθμίζουν κόλον αποκρίσεις όγκου σε FdUrd και 5-FU, έδειξε ότι ΚΑΚ ήταν μια κρίσιμη οδού επιδιόρθωσης όταν αυτά τα κύτταρα εκτέθηκαν σε FdUrd ( αλλά όχι 5-FU). Με βάση αυτά τα ευρήματα, και το γεγονός ότι οι αναστολείς PARP διαταράσσουν BER, μπορούμε στη συνέχεια ανακαλύψαμε ότι μικρού μορίου αναστολείς PARP σθεναρά ευαισθητοποιημένα MMR ανεπάρκεια και καρκίνο του παχέος εντέρου -proficient κύτταρα να FdUrd (αλλά όχι 5-FU). Αυτά τα ευρήματα μπορεί να έχει ιδιαίτερη σημασία σε όγκους με ελαττώματα στο MMR, τα οποία αντιπροσωπεύουν το 15-20% όλων των καρκίνων του παχέος εντέρου [39]. Προηγούμενες μελέτες βρήκαν ότι MMR με ανεπάρκεια κυτταρικές γραμμές είναι λιγότερο ευαίσθητα σε 5-FU και FdUrd. Συνεπής με αυτό το αποτέλεσμα, οι κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η 5-FU έχει περιορισμένη δράση έναντι MMR-ανεπαρκή καρκίνων του παχέος εντέρου σε σύγκριση με MMR-καλά όγκους [39]. Δεδομένου ότι 1) FdUrd έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου? και 2) υπάρχουν περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές για αυτούς τους όγκους, διότι οι όγκοι με ελαττώματα στο MMR θεωρούνται συνήθως να μην αποκρίνεται σε θεραπείες 5-FU που βασίζονται εύρημα μας ότι οι αναστολείς PARP σθεναρά ευαισθητοποιούν MMR-ανεπαρκή κύτταρα να FdUrd εγείρει την πιθανότητα ότι θεραπείες που συνδυάζουν FdUrd με έναν αναστολέα PARP μπορεί να έχει δραστικότητα έναντι αυτών των όγκων. Ομοίως, επειδή οι αναστολείς PARP ευαισθητοποιούν επίσης αναντιστοιχία ικανός όγκους να FdUrd, αυτός ο συνδυασμός φαρμάκων μπορεί επίσης να είναι χρήσιμες στη θεραπεία αυτών των όγκων. Περαιτέρω προκλινική και κλινική ανάπτυξη αυτού του συνδυασμού είναι δικαιολογημένη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Επιδράσεις της ATR και ΑΤΜ διαταραχές στην ευαισθησία σε γεμσιταβίνη και ιονίζουσα ακτινοβολία. (Α) εξάντληση ATR ευαισθητοποιεί σε γεμσιταβίνη. ΗΤ29 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο (Luc) ή ATR siRNAs από το πείραμα που φαίνεται στο Σχ. 2Β απλώθηκαν ως απλά κύτταρα, που εκτίθενται σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης για 24 ώρες, πλύθηκαν και καλλιεργήθηκαν για 10 d για να επιτρέψει το σχηματισμό αποικιών. (Β) ΑΤΜ depletions ευαισθητοποιήσει σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR). ΗΤ29 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο (Luc) ή ATM siRNAs από το πείραμα που φαίνεται στο Σχ. 2Α απλώθηκαν ως απλά κύτταρα, που εκτίθενται σε ενδεικνυόμενες δόσεις ιονίζουσας ακτινοβολίας, και καλλιεργήθηκαν για 10 d για να επιτρέψει το σχηματισμό αποικιών.