Αφηρημένο

Σκοπός

nonequilibrium ατμοσφαιρική πίεση πλάσματος (NEAPP) θεραπεία έχει πρόσφατα επικεντρώθηκε ως νέο ιατρική πρακτική. Χρησιμοποιώντας κύτταρα με αντίσταση αποκτήσει paclitaxel /σισπλατίνη, θα διευκρινιστεί επιδράσεις της έμμεσης NEAPP ενεργοποιούνται μέσο (NEAPP-AM) η έκθεση για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου

στο vitr

o και

in vivo

.

Μέθοδοι

Χρήση χρόνιας paclitaxel /σισπλατίνη ανθεκτικά καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα, εφαρμόσαμε έμμεση NEAPP εκτεθειμένο μέσον στα κύτταρα και

ξενομόσχευμα

όγκους σε ένα μοντέλο ποντικού. Επιπλέον, εξετάσαμε το ρόλο των αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ή καθαριστές τους στα προαναφερθέντα κύτταρα EOC.

Αποτελέσματα

αξιολόγησε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και NOS2 NOS3 εκτίθενται σε NEAPP- ΑΜ, το οποίο παρασκευάστηκε προηγουμένως με ακτινοβολία με NEAPP για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Σε κύτταρα NOS2, βιωσιμότητα μειώθηκε κατά περίπου 30% μετά NEAPP-ΑΜ θεραπεία 120-sec (

P

& lt? 0,01). Οι ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις της NEAPP-ΑΜ πλήρως αναστέλλονται με αγωγή κυστεΐνη Ν-ακετυλο, ενώ L-buthionine- [S, R] -sulfoximine, ένας αναστολέας του περισυλλέκτη ROS χρησιμοποιείται με NEAPP-ΑΜ, μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά 85% μετά NEAPP-ΑΜ επεξεργασία 60-sec (

P

& lt? 0,05) και κατά 52% μετά από 120 δευτερόλεπτα, σε σύγκριση με τον έλεγχο (

P

& lt? 0,01). Στο μοντέλο ποντικού υποδόριου όγκου-σχηματισμό, NEAPP-ΑΜ ένεση είχε σαν αποτέλεσμα μια μέση αναστολή της κυτταρικής εμβολιάστηκαν όγκου NOS2 κατά 66% (

P

& lt? 0,05) και κύτταρο-εμβολιάστηκαν όγκου NOS2TR κατά 52% (

P

& lt? 0,05), σε σύγκριση με τον έλεγχο

Συμπέρασμα

έδειξε ότι μέσο πλάσματος ενεργοποιημένης είχε επίσης ένα αποτέλεσμα κατά του όγκου επί χημειο-ανθεκτικά κύτταρα.

in vitro

και

in vivo

. Έμμεση θεραπεία του πλάσματος είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική επιλογή για την EOC και μπορεί να συμβάλει στην καλύτερη ασθενή πρόγνωση για το μέλλον

Παράθεση:. Ουτσούμι F, Kajiyama Η, Nakamura Κ, Tanaka H, ​​Mizuno Μ, Ishikawa K, et al . (2013) Επίδραση Έμμεση nonequilibrium Ατμοσφαιρική Plasma πίεση για αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα κατά της χρόνιας χημειοθεραπείες-Resistant καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 8 (12): e81576. doi: 10.1371 /journal.pone.0081576

Επιμέλεια: Mohammed Yousfi, Πανεπιστήμιο Paul Sabatier, Γαλλία

Ελήφθη: 15 Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 15 του Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Ουτσούμι et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα σε καινοτόμους τομείς, Grant Νο 24108008 από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Δρ Kano είναι πρόεδρος της NU Eco-Engineering Co., Ltd. Όλοι οι συγγραφείς είναι εφευρέτες σε διεθνή αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας. Το όνομά δίπλωμα ευρεσιτεχνίας (τίτλος): «Αντικαρκινική Λύση και Anticancer Drug και Μέθοδοι Παραγωγής Αυτών» και τον αριθμό PCT /JP2013 /001139, η οποία εφόσον συνάπτονται, θα ανήκουν στο Πανεπιστήμιο Ναγκόγια και NU Eco. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Τα επιθηλιακά καρκινώματος των ωοθηκών (EOC) είναι η πέμπτη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται και παραμένει μια από τις πιο επιθετικών όγκων όλων των γυναικολογικών κακοηθειών στις δυτικές χώρες. Σύμφωνα με Στατιστικές καρκίνου του 2012, εκτιμήθηκε ότι 15.500 έχασαν τη ζωή τους από την ασθένεια στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Η πλειοψηφία των ασθενών με ΕΓΚ έχουν προχωρημένο ενδοπεριτοναϊκή μεταστατική νόσο κατά τη διάγνωση δεδομένου ότι αυτό το καρκίνωμα παραμένει συχνά κλινικά σιωπηλή. Δεδομένου ότι διαπιστώθηκε η θεραπευτική στρατηγική που αποτελείται από μέγιστο κυτταρομειωτική χειρουργική ακολουθούμενη από ταξάνη συν πλατίνα χημειοθεραπεία, η βραχυπρόθεσμη πρόγνωση των ασθενών με EOC έχει βελτιωθεί. Ωστόσο, παρά την ευαισθησία συγκριτικά υψηλού επιπέδου EOC σε πακλιταξέλη, η πρόγνωση του προχωρημένου ή υποτροπιάζουσες περιπτώσεις παραμένει φτωχή, επειδή περισσότερες περιπτώσεις θνησιμότητας είναι το αποτέλεσμα της μετάστασης που είναι ανθεκτική σε αυτούς τους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Αν και διάφορες πρόσθετες μοριακή στόχευση θεραπειών, συμπεριλαμβανομένων των αντι-αγγειογενετική παράγοντες, έχουν διερευνηθεί, προκειμένου να ξεπεραστούν τέτοια αντίσταση πακλιταξέλη, το αποτέλεσμα αυτής της θεραπείας δεν είναι ικανοποιητική [2], [3].

Plasma, κοινώς απασχολούνται στις φυσικές επιστήμες, είναι ουσιαστικά ένα ιονισμένο αέριο στο οποίο ιονίζεται ένα κλάσμα των ατόμων ή μορίων [4]. Πλάσμα ως ενεργό ιονισμένο μέσο που υπέστη η παροχή ενέργειας που περιέχει ελεύθερο επιβαρύνσεις, τις ελεύθερες ρίζες, συγκινημένος μόρια και ενεργητικά φωτόνια μπορούν να προκαλέσουν οι διαδικασίες συνήθως λαμβάνονται μέσω χημικής επεξεργασίας ή ακτινοθεραπεία [5]. Λόγω τεχνικών εξελίξεων, πλάσμα νέας γενιάς που ονομάζεται nonequilibrium πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης (NEAPP), επίσης γνωστή ως κρύο πλάσμα ή μη θερμικού πλάσματος, έχει πράγματι τεθεί πρακτική χρήση [6]. Πρόσφατα, η θεραπεία NEAPP έχει επικεντρωθεί σε ως νέο ιατρική πρακτική [7] – [9]. Στις αρχές τη χρήση πλάσματος στη ζωή-επιστήμη, θερμική πλάσματα χρησιμοποιήθηκαν για χειρουργικό εργαλείο και αποστείρωση. Σε πρόσφατες εφαρμογές του πλάσματος, οι ερευνητές εστιάζουν κυρίως στις επιδράσεις μη θερμικού πλάσματος που περιλαμβάνουν αντιδραστικά είδη της (RS) για τη βιολογική αντικείμενα. Υπήρξαν θεραπευτικές δοκιμές που εφαρμόζονται στους τομείς της αποστείρωσης ιστών, πήξη του αίματος, προώθηση επούλωσης πληγών, και οδοντιατρική λεύκανση [10] – [12]. Επιπλέον, αναφέρθηκε πρόσφατα ότι το πλάσμα που ασκείται αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε μία ποικιλία καρκινικών κυττάρων, επάγει απόπτωση, η οποία είναι γνωστή ως προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος [5], [13], [14]. Σύμφωνα με την εξέταση από Sensenig et al., Θεραπεία NEAPP επάγει απόπτωση μέσω ενός μονοπατιού που φαίνεται να εξαρτάται από την παραγωγή ενδοκυτταρικής ROS, που οδηγεί σε δοσοεξαρτώμενη βλάβη του DNA σε κύτταρα μελανώματος [14]. Επιπλέον, αντί για ένα άμεσο αποτέλεσμα επί των κυττάρων, η έκθεση σε μέσο υποβάλλεται σε επεξεργασία με το πλάσμα διαχωρίζεται από τα κύτταρα (έμμεση πλάσματος) οδήγησε σε μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων του μαστού θηλαστικών και κύτταρα HeLa μέσω της δημιουργίας ROS στο μέσο [13 ], [15]. Ήταν αξιοσημείωτο ότι στο διηλεκτρικό πλάσμα φράγμα, ένα είδος μη θερμικού πλάσματος που χρησιμοποιείται ως έμμεση πηγή πλάσματος, νηματώδη απορρίψεις έρχεται απευθείας σε επαφή με το μέσο ως αντίθετο ηλεκτρόδιο κατά ένα μονωτικό ηλεκτρόδιο τροφοδοτείται κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Ως εκ τούτου, οι ακριβείς ρόλοι των ιόντων και ριζών που δημιουργούνται ηλεκτρικές εκκενώσεις είναι άλυτα.

Από την άλλη πλευρά, η επιλεκτική στόχευση των κυττάρων όγκου πέρα ​​από περιβάλλοντα κανονικά κύτταρα είναι ζωτικής σημασίας για κάθε αντικαρκινικών θεραπευτικών στρατηγικών. Στην πρόσφατη έκθεσή μας, δύο ανεξάρτητες ανθρώπινες κυτταρικές σειρές EOC και φυσιολογικών ινοβλαστών κύτταρα επεξεργασμένα με υψηλής ροής NEAPP αξιολογήθηκαν με δοκιμασίες τοξικότητας και πολλαπλασιασμό. Ως αποτέλεσμα, και οι δύο τύποι κυττάρων ΕΓΚ discriminately σκοτώθηκαν μέσω επαγωγής ενισχυμένη απόπτωση, ενώ ινοβλαστών πλασματοκύτταρα αγωγή δεν υπέστησαν ζημιές [16]. Πιο πρόσφατα, αποδείξαμε επίσης ότι τα κύτταρα γλοιοβλαστώματος επιλεκτικά επάγονται να υποστούν απόπτωση όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με έμμεσο μέσο πλάσμα εκτίθενται μέσω ΑΚΤ κάτω ρύθμιση [17]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας κύτταρα με επίκτητη αντοχή paclitaxel /σισπλατίνη, που είχε καθοριστεί προηγουμένως [18], [19], μπορούμε διευκρινιστεί η επίδραση της έμμεσης NEAPP ενεργοποιημένης μέσο (NEAPP-AM) έκθεση σχετικά με τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου

στο vitr

o και

in vivo

. Επιπλέον, εξετάσαμε το ρόλο των αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ή καθαριστές τους σε χρόνιες αντινεοπλασματικών-ανθεκτικά κύτταρα EOC. Προτείνεται Μια πιθανή εφαρμογή της παρούσας τεχνολογικό τροπικότητα ως θεραπευτικό στόχο για ΕΓΚ

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Η NOS2 και NOS3. (επίσης γνωστή ως? TAOV) κυττάρων, που προέρχονται από ορώδες EOC, ιδρύθηκαν το ινστιτούτο μας [20], [21]. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% Βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS) και πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 .

Ίδρυση του paclitaxel κυττάρων /σισπλατίνη ανθεκτικά ΕΓΚ

Τα κύτταρα NOS2TR και NOS2CR, που ιδρύθηκε από τη γονική κύτταρα NOS2 στο ινστιτούτο μας [18], [19], είχε αποκτήσει χρόνια αντίσταση στην πακλιταξέλη και σισπλατίνη, αντίστοιχα. Εκτός από αυτές τις γραμμές, έχουμε πρόσφατα δημιουργούνται άλλα δύο χρόνια paclitaxel /σισπλατίνη ανθεκτικών γραμμών από γονικά κύτταρα NOS3: NOS3TR (paclitaxel) και NOS3CR (σισπλατίνη). Εν συντομία, τα κύτταρα NOS3 πλύθηκαν επισταμένως με PBS, και μεταφέρθηκαν σε μέσο RPMI-1640 που περιείχε 10% FBS και πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα εκτίθενται συνεχώς σε πακλιταξέλη (Bristol Myers squib, Tokyo, Japan) ή σισπλατίνη (Nihon Kayaku, Tokyo, Japan) για περισσότερο από 6 μήνες, κατά την διάρκεια του οποίου χρόνου το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε 3-4 ημέρες και οι κυτταρικές καλλιέργειες ανακαλλιεργήθηκαν με θρυψινοποίηση μετά επετεύχθη υποσυρροής. Σταδιακά, αυτά τα κύτταρα εμφανίζονται αντίσταση στις ανασταλτικές της ανάπτυξης ιδιότητες του paclitaxel ή cisplatin. Αυτές οι κυτταρικές σειρές, που ορίζεται paclitaxel ή σισπλατίνη ανθεκτικά, καλλιεργήθηκαν για περαιτέρω 3 μήνες σε μέσο που περιέχει αυτές τις αντινεοπλασματικούς παράγοντες πριν μελέτες χαρακτηρισμού. Μέσα από αυτές τις διαδικασίες, που παράγεται τελικά τέσσερις σισπλατίνη ανθεκτικές κυτταρικές σειρές paclitaxel /ΕΓΚ {NOS2TR και NOS3TR (paclitaxel), NOS2CR και NOS3CR (σισπλατίνη)}. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα Πειραματικής προδιαγραφών και παραγωγής nonequilibrium ατμοσφαιρική πίεση σύστημα 5% CO

2.

μέσο πλάσματος που ενεργοποιείται (NEAPP-ΑΜ)

Οι λεπτομέρειες αυτού του πειραματικού συστήματος NEAPP, όπως φαίνεται στο Σχ. 1, περιγράφηκαν προηγουμένως. συνθήκες εκκένωσης ήταν στο αέριο αργό (2 στάνταρ λίτρα /λεπτό? SLM) ενθουσιασμένος με την εφαρμογή 10 kV ενός 60-Hz εμπορική παροχή ηλεκτρικού ρεύματος σε δύο ηλεκτρόδια με απόσταση 8 mm [16]. Εν συντομία, NEAPP με μια υπερ-υψηλής πυκνότητας ηλεκτρονίων (περίπου 2 × 10

16 εκατοστά

-3) παρέχεται χαρακτηριστικά με μια υπερ-υψηλής πυκνότητας O εκτιμάται γύρω στα 4 × 10

15 εκατοστά

-3 [22], [23]. Επιπλέον, η παραγωγή αντιδραστικών μορφών οξυγόνου (ROS), όπως ρίζες υδροξυλίου, απλή ριζών οξυγόνου, οξειδίων του αζώτου, και άζωτο, επιβεβαιώθηκαν με φασματοσκοπία οπτικής εκπομπής (OES). Έχουμε εκτεθεί παραπάνω NEAPP να RPMI-1640 χωριστά από τα κύτταρα, η οποία ορίζεται «nonequilibrium πλασμάτων ατμοσφαιρική πίεση ενεργοποιείται μέσο (NEAPP-ΑΜ). Η διαχωρισμένη απόσταση μεταξύ της πηγής πλάσματος και μέσον (L) είναι κρίσιμη για την αναπαραγωγή με συνέπεια τα δεδομένα, και έτσι όλα τα πειράματα διεξήχθησαν υπό τις ίδιες συνθήκες, L = 15 mm και όπου δεν υπάρχει απαλλαγή πλάσματος σε επαφή με το μέσο. Η διάρκεια της θεραπείας πλάσμα κυμαίνονταν από 0 σε 300 δευτερόλεπτα

in vitro

μελέτες. Έξι κ.εκ. RPMI-1640 τοποθετήθηκε σε 60-mm δίσκο. Το κέντρο σε κάθε τρυβλίο 60-mm υποβλήθηκε σε επεξεργασία για αρκετές φορές έκθεσης (30, 60, 120, 180, και 300 sec) με NEAPP, που υποδεικνύεται από NEAPP-ΑΜ-30, -60, -120, -180 και -300 αντιστοίχως παρακάτω. Για τη θεραπεία των ζώων, τέσσερις ml μέσου τοποθετήθηκε σε 21-mm πιάτο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NEAPP για 600 sec.

Η

δοκιμασία χημειοευαισθησία

Ο προσδιορισμός paclitaxel /σισπλατίνη χημειο-ευαισθησίας πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 2000 κυττάρων σε έναν όγκο 100 μι μέσου καλλιέργειας που περιείχε 10% FBS. Μετά από επώαση για 24 ώρες στους 37 ° C, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο, ​​με ή χωρίς διάφορες συγκεντρώσεις του paclitaxel και σισπλατίνη. Μετά επιπλέον 72 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την υδατική One Λύση Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού kit (Promega, Madison, WI, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε κατόπιν σε 490 nm με αναγνώστη μικροπλακός (Multiskan Bichromatic? Labsystems, Helsinki, Finland). Οι τιμές IC50 δείχνουν τις συγκεντρώσεις με αποτέλεσμα τη μείωση κατά 50% στην αύξηση σε σχέση με την ανάπτυξη των κυττάρων ελέγχου.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η επίδραση της NEAPP-ΑΜ για τη βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε από το Υδατικό One Λύση Κυττάρου δοκιμασία Πολλαπλασιασμού kit (Promega, Madison, WI, USA) που περιγράφεται στο «δοκιμασία χημειοευαισθησίας». Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 100 μΐ πλήρους μέσου καλλιέργειας. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NEAPP-ΑΜ (30-300 sec /6 mL) επί 24 ώρες, και οι παραπάνω συνθήκες βελτιστοποιήθηκαν για την ανίχνευση της NEAPP-ΑΜ ευαισθησία των κυττάρων. Κάθε χρόνο ενεργοποιημένης για NEAPP-ΑΜ επαναλήφθηκε σε 6 φρεάτια. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Reactive οξειδωτικών ειδών (ROS) αναστολή και L-γ-γλουταμυλο-L-κυστεϊνυλο-γλυκίνης (GSH) εξάντληση

Για την αναστολή ROS, Ν-ακετυλο κυστεΐνη ( NAC, Sigma-Ardrich, St. Louis, ΜΟ, USA), ένα ενδοκυτταρικό ROS καθαριστής, χρησιμοποιήθηκε. Επιπλέον, η L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (BSO, Sigma-Ardrich, St. Louis, ΜΟ, USA) είναι ένας αναστολέας της σύνθεσης GSH. Είναι γνωστό ότι η GSH είναι το πιο άφθονο και αποτελεσματικό συστατικό του αμυντικού συστήματος κατά των ελευθέρων ριζών, συμπεριλαμβανομένων των ROS. Οι ενώσεις NAC και BSO προστέθηκαν στα κύτταρα σε μια τελική συγκέντρωση 4 και 2 mM σε PBS, αντίστοιχα. Ο απαιτούμενος όγκος του κάθε φαρμάκου προστέθηκε απευθείας σε πλήρες μέσο καλλιέργειας κυττάρων 2 ώρες πριν από τη θεραπεία NEAPP-ΑΜ και NEAPP-ΑΜ για να επιτευχθούν οι επιθυμητές τελικές συγκεντρώσεις, αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάσθηκε με τη «δοκιμασία βιωσιμότητα των κυττάρων».

δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης /κασπάσης-3/7 Δράση δοκιμασία

Η δραστικότητα της κασπάσης-3/7 προσδιορίστηκε με τη κασπάση CellEvent ™ -3/7 Αντιδραστήριο Πράσινη ανίχνευσης (Molecular Probes Invitrogen, Calsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. NOS2 και NOS2TR κύτταρα (1.5 × 10

4 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε ένα θάλαμο απεικόνισης 8 φρεατίων (Lab-Tek Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ), επωάζονται για 24 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NEAPP- ΑΜ ή μέσο χωρίς ορό ως έλεγχο. Μετά από 2 ώρες επώασης, αντιδραστήριο ανίχνευσης Πράσινη CellEvent ™ κασπάσης-3/7 προστέθηκαν στα φρεάτια σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ. Τέσσερις ώρες μετά την αγωγή NEAPP-ΑΜ, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με ένα ελαφρύ και ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Ανίχνευση των ενδοκυτταρικών ROS συσσώρευση

Η ενδοκυτταρική συσσώρευση ROS παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας διοξεική 5-6-χλωρομεθυλο-2’7′-dichlorodihydroflorescein, ακετυλεστέρας (CM -Η

2DCFDA? Molecular Probes Invitrogen, Calsbad, CA). Για την ανίχνευση της κυτταρικό επίπεδο ROS, CM-H

2DCFDA (4 μΜ) σε PBS φορτώθηκε επί 15 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Μετά τη φόρτωση, ρυθμιστικό αλλάχθηκε σε μέσο καλλιέργειας ή NEAPP-ΑΜ, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C, και παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. Η παραγωγή των ROS μπορούν να απεικονισθούν από τις αλλαγές στον φθορισμό λόγω της ενδοκυτταρικής παραγωγής του CM-DCF που προκαλείται από την οξείδωση του CM-H

2DCF.

Μελέτες σε ζώα

Ένα σύνολο 1 × 10

3 NOS2 και NOS2TR κύτταρα εναιωρήθηκαν σε 150 μL του μέσου χωρίς ορό και 150 μι Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), και χρησιμοποιούνται για να εμβολιάσουν υποδορίως δύο πλευρές του πλευρού του 8- εβδομάδων θηλυκών γυμνών ποντικών (BALB /C) (Ν = 12) (Japan SLC, Ναγκόγια, Ιαπωνία) με χρήση βελόνας 27-gauge, και στη συνέχεια διαιρέθηκαν τυχαία σε δύο ίσες ομάδες, αντίστοιχα. Αυτό το πρωτόκολλο πείραμα σε ζώα εγκρίθηκε από την Πειραματική επιτροπή Ζώων του Graduate School of Medicine, University Ναγκόγια.

Μια ομάδα ποντικών έλαβε 200 μL NEAPP-ΑΜ με υποδόρια ένεση σε κάθε πλευρά, και η άλλη ομάδα έλαβε ο ίδιος όγκος του μη-πλάσματος εκτεθεί RPMI-1640 ως ομάδα ελέγχου. Η NEAPP-ΑΜ παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Αυτές οι θεραπείες επαναλήφθηκαν 3 φορές την εβδομάδα, ουσιαστικά κάθε Δευτέρα, Τετάρτη, Παρασκευή και, από τις 24 ώρες μετά την ένεση των κυττάρων. Μόλις ένας όγκος άρχισε να αναπτύσσεται, μετρήθηκε με παχύμετρο και ο όγκος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: π /6 × (μεγαλύτερη διάμετρος) × (μικρότερη διάμετρο)

2. Στο τέλος του πειράματος (29 ημέρες μετά την εμφύτευση), ποντικοί θυσιάστηκαν και ιστούς όγκων συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν. Αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση πραγματοποιήθηκε τομών από όγκους ενσωματωμένες σε παραφίνη. Μορφολογικές διαφορές εκτιμήθηκαν με μικροσκοπία των χρωματισμένων τμημάτων σε αμφότερες τις ομάδες.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του μαθητή

t-test

. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων θεωρήθηκαν σημαντικές σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Επίδραση της NEAPP-ΑΜ στην κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα

Θα αξιολογούνται πρώτα το δυναμικό κατά του όγκου του NEAPP-ΑΜ για την ανάπτυξη των δύο διαφορετικών ανθρώπινων κυτταρικών σειρών EOC

in vitro

χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Το Σχήμα 2 Α-Β δείχνει την κυτταρική βιωσιμότητα του NOS2 και NOS3 κύτταρα εκτίθενται σε NEAPP-ΑΜ για 24 ώρες, το οποίο παρασκευάστηκε προηγουμένως με ακτινοβολία με NEAPP για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Σε κύτταρα NOS2, η βιωσιμότητα μειώθηκε κατά περίπου 30% όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NEAPP-ΑΜ-120, και 70% μετά από θεραπεία με NEAPP-ΑΜ-180 (

P

& lt? 0,01) σε σύγκριση με μη NEAPP-εκτεθειμένο μέσο θεραπείας. Μια παρόμοια τάση παρουσιάστηκε επίσης σε κύτταρα NOS3, στις οποίες ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά περίπου 30% μετά από θεραπεία με NEAPP-ΑΜ-60 (

P

& lt? 0,05), και το 90% μετά από θεραπεία με NEAPP-ΑΜ-120 (

P

& lt? 0,01). Αντίθετα, στην έκθεση για μικρότερη διάρκεια, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν ρυθμίζεται με αύξηση περίπου 20%.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων NOS2 και NOS3 αντιμετωπίζονται με NEAPP που ενεργοποιείται μέσο (NEAPP-ΑΜ), όπως μετράται από το δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. NOS2 (Α) και NOS3 (Β) ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO2. Μετά από 24 ώρες, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με NEAPP-ΑΜ και τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες. Τα ποσοστά των κυττάρων που επιβιώνουν από κάθε κυτταρική σειρά υπολογίστηκαν σε σχέση με τους μάρτυρες. Ο χρόνος έκθεσης στο πλάσμα για μηδέν προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο όρο, και οι ράβδοι δείχνουν SD. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0,01 έναντι του ελέγχου

Η

Ο ρόλος των ROS και αυξημένη ευαισθησία NEAPP-ΑΜ με BSO

Στη συνέχεια, εξετάσαμε κατά πόσο ROS παράγονται από NEAPP έχουν αντι -tumor αποτελέσματα. Για να ελεγχθεί ο ρόλος των ROS σε θεραπεία NEAPP-ΑΜ, τα κύτταρα NOS2 προεπωάστηκαν με NAC ή BSO, ακολουθούμενη από την προσθήκη του NEAPP-ΑΜ για τον υποδεικνυόμενο χρόνο έκθεσης. Η βιωσιμότητα των κυττάρων NOS2 προσδιορίστηκε 24 ώρες μετά την αγωγή NEAPP-ΑΜ χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, οι ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις της NEAPP-ΑΜ-180 ήταν πλήρως ανέστειλε για να προκατεργάζονται με NAC, ενώ η βιωσιμότητα μειώθηκε κατά περίπου 30% μετά NEAPP-ΑΜ-300 με NAC, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να υπάρχει ανεπαρκής μόρια NAC να καταργήσει δραστηριότητα ROS. Η BSO με NEAPP-ΑΜ μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων κάτω από όλες τις συνθήκες θεραπείας? ιδιαίτερα, BSO με NEAPP-AM-120 οδήγησε σε σημαντική μείωση κατά 50%, σε σύγκριση με τον έλεγχο (θεραπεία NEAPP-ΑΜ μόνο) (

P

& lt? 0,01). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ROS στα κύτταρα που παράγονται από NEAPP-AM παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην αντινεοπλασματική δράση ενάντια στα κύτταρα του ΕΓΚ

Α, Β:.

Επίδραση των ενδοκυττάριων διαμόρφωσης ROS από NAC και BSO επί NEAPP-ΑΜ-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Α: NOS2 κύτταρα προκατεργάστηκαν με NAC (4 mM) (Α) ή BSO (2 m Μ) (Β) για 2 ώρες και μετά εκτίθενται σε NEAPP-ΑΜ με NAC ή BSO για επιπλέον 24 ώρες. Η δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση. Κάθε στήλη αντιπροσωπεύει το μέσο και τα μπαρ είναι SD. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0,01 έναντι του ελέγχου χωρίς θεραπεία NAC

Η

Επίδραση της NEAPP-ΑΜ στην χημειο-ανθεκτικά κυτταρικές σειρές

Για να εκτιμηθεί αν η θεραπεία NEAPP-ΑΜ θα μπορούσε επηρεάζουν χημειο-ανθεκτικές κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιήσαμε πακλιταξέλη και σισπλατίνη-ανθεκτικά κύτταρα που παράγονται από NOS2 και NOS3 κύτταρα (κύτταρα NOS2TR, NOS2CR, NOS3TR και NOS3CR). Επιβεβαιώσαμε πρώτα την έκταση της αντίστασης σε paclitaxel ή σισπλατίνη αυτών των κυττάρων. Το Σχήμα 4 δείχνει την πακλιταξέλη ή σισπλατίνη ευαισθησία της ανάλυσης των γονικών NOS2 και ανθεκτικά κύτταρα NOS2TR. Marked χημειοαντίσταση στην πακλιταξέλη και σισπλατίνη σημειώθηκε σε κύτταρα NOS2TR και NOS2CR, σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα NOS2, αντίστοιχα. Οι τιμές IC50 αυτών των κυττάρων ήταν ως ακολούθως: πακλιταξέλη: 1,9 /231,8 κύτταρα σε NOS2 /NOS2TR, σισπλατίνη: 38.2 /135.6 σε κύτταρα NOS2 /NOS2CR. Παρόμοια αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν σε κύτταρα NOS3TR και NOS3CR {τιμή IC50: πακλιταξέλη: 0,9 /18,2 στα κύτταρα NOS3 /NOS3TR, σισπλατίνη: 38,2 /132,2 στα κύτταρα NOS3 /NOS3CR}. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε 24 ώρες μετά τη θεραπεία NEAPP-ΑΜ χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. ποσοστά πολλαπλασιασμό τόσο NOS2, και τα κύτταρα NOS2CR μειωθεί σε περίπου 70% μετά από θεραπεία NEAPP-ΑΜ-120. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού σε NOS2TR μειώνεται στο 9% μετά από αγωγή NEAPP-ΑΜ-120, είναι πιο ευαίσθητα σε NEAPP-ΑΜ. Επιπλέον, μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε και σε άλλες NOS3TR και NOS3CR κυττάρων (Σχήμα 5Β).

Α, Β

:. Δοκιμασία πακλιταξέλη-ευαισθησία σε ανθεκτικές NOS2TR (Α) και NOSCR κύτταρα ( Β) σε σύγκριση με γονικά κύτταρα NOS2.

C, D

: Δοκιμασία Σισπλατίνη ευαισθησίας σε ανθεκτικά NOS3TR (C) και τα κύτταρα NOS3CR (D) σε σύγκριση με γονικά κύτταρα NOS2. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει την μέση τιμή, και οι ράβδοι δείχνουν SD. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0,01 έναντι γονικών κυττάρων

Η

Η βιωσιμότητα των κυττάρων NOS2 (Α) NOS3 (Β), μητρικά κύτταρα και πακλιταξέλη

39 ή σισπλατίνη (CR) ανθεκτικά NOSTR και τα κύτταρα NOSCR επεξεργάστηκε με NEAPP-ΑΜ μετρήθηκε με τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD ενός αντιπροσωπευτικού τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01 σε σύγκριση με τον έλεγχο 0 sec

Η

Μια μηχανισμός NEAPP-ΑΜ-επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα NOS2 και NOS2TR

Στην προηγούμενη μας μελέτη, που προκαλείται από την άμεση NEAPP θεραπεία κυτταρικής απόπτωσης σε EOCs. Εμείς στη συνέχεια αξιολογείται κατά πόσον η κυτταροτοξική επίδραση των NEAPP-ΑΜ συνδέθηκε με την επαγωγή της απόπτωσης. Caspase-3/7 δραστηριότητα προσδιορίστηκε σε 4 ώρες μετά τη θεραπεία NEAPP-ΑΜ φορτώνοντας το φθορίζον υπόστρωμα CellEvent ™ κασπάσης-3 αντιδραστήριο ανίχνευσης /7 Green. Όπως αναμένεται, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, θεραπεία NEAPP-ΑΜ προκλήθηκαν μορφολογικές αλλαγές (συρρίκνωση, στρογγυλοποίηση και αποκόλληση από τα πιάτα), τα οποία ήταν χαρακτηριστική της απόπτωσης, και η ενεργοποίηση των caspase3 /7 στους δύο τύπους κυττάρων (Εικ. 6).

Η δραστικότητα της κασπάσης-3/7 προσδιορίστηκε με τη CellEvent ™ κασπάσης-3 Αντιδραστήριο /7 Πράσινο Ανίχνευση (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τέσσερις ώρες μετά την αγωγή NEAPP-ΑΜ, NOS2 (Α) και NOS2TR (Β) παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία και μικροσκοπία φθορισμού. Μορφολογικές αλλαγές αποτιμήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο. Υπήρχαν συρρίκνωση και διόγκωση κύτταρα επεξεργασμένα με NEAPP-ΑΜ, υποδεικνύοντας επαγωγή απόπτωσης. Η ράβδος κλίμακα αντιστοιχεί σε 100 μm.

Η

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι NEAPP-ΑΜ απόπτωση που επάγεται μέσω της κασπάσης-3/7 ενεργοποίησης.

Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία NEAPP επάνω -regulates την παραγωγή ενδοκυτταρικών ROS, με αποτέλεσμα την απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα. Προκειμένου να προσδιοριστεί ο ρόλος των ROS παίζει NEAPP-ΑΜ επαγόμενη απόπτωση, εξετάσαμε για πρώτη φορά την παραγωγή των ROS χρησιμοποιώντας το οξειδωτικό ευαίσθητο φθορίζοντα ανιχνευτή CM-H

2DCFDA. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η θεραπεία με NEAPP-ΑΜ αύξησε την ένταση του σήματος DCF σύγκριση με τον έλεγχο τόσο NOS2 και NOS2TR κύτταρα

Α, Β

(Εικ. 7):. Ανίχνευση ROS με ή χωρίς επεξεργασία NEAPP-ΑΜ. NOS2 (Α) και ROS2TR (Β) κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς NEAPP-ΑΜ με προφόρτιση του CM-H

2DCFDA. NOS2 (Α) και NOS2TR (Β) Τα κύτταρα με προεγκατεστημένο CM-H

2DCFDA για 15 λεπτά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NEAPP-ΑΜ. Εικόνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται. Το μπαρ κλίμακα αντιστοιχεί σε 100 μm.

Η

Ανάπτυξη-ανασταλτική δράση των NEAPP-ΑΜ σε ξενομοσχεύματα όγκου σε μοντέλο ποντικού

Τέλος διερευνήθηκε τις πιθανές αντικαρκινικές ιδιότητες της NEAPP-ΑΜ σε γυμνούς ποντικούς που έλαβαν υποδόρια ξενομεταμόσχευση. Οι πειραματικές συνθήκες της παρούσας

in vivo

μοντέλο τέθηκαν να εκτιμήσει αν NEAPP-ΑΜ θα μπορούσε να αναστείλει το σχηματισμό όγκων λόγω microdissemination. σχηματισμός υποδόρια όγκου παρατηρήθηκε τουλάχιστον περίπου 10 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των ποντικών με κύτταρα NOS2 ή NOS2TR. Στη συνέχεια, οι περιοδικές υποδορίως θεραπεία με NEAPP-ΑΜ διεξήχθη, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Όπως φαίνεται στο Σχ. 8, οι υπολογιζόμενες όγκοι του όγκου την ημέρα 28 ήταν 300 ± 136 (mm

3 ± SD) και 163 ± 91 στις ομάδες ελέγχου NOS2 και NOS2TR και 55 ± 60 και 104 ± 66 στις ομάδες NOS2 και NOS2TR κατεργάζεται με NEAPP -AM, αντίστοιχα (ρ = 0,0014 και 0,097, αντίστοιχα). NEAPP-ΑΜ ένεση είχε ως αποτέλεσμα μια μέση αναστολή NOS2 κυττάρου-εμβολιάστηκαν βάρος όγκου κατά 66% (

P

= 0.017) και κύτταρο-NOS2TR εμβολιάστηκαν όγκων κατά 52% (

P

= 0,014) , σε σύγκριση με τον έλεγχο. Κατά συνέπεια, NEAPP-ΑΜ μείωσε σημαντικά την αύξηση και των δύο γονικών και χημειο-ανθεκτικού όγκους EOC. Κατά τη διάρκεια του πειράματος, που επιβεβαίωσε ότι η διοίκηση NEAPP-ΑΜ ήταν μη τοξικό παρατηρώντας τα βάρη του ποντικιού, την επιβίωση και τη συμπεριφορά, και χωρίς επιπλοκές όπως αναφυλαξία και νέκρωση του δέρματος εντοπίστηκαν.

Α, Β

: Η μακροσκοπική παρατήρηση των γυμνών ποντικών που φέρουν υποδόρια NOS2 (Α) και NOS2TR (Β) όγκους και στις δύο πλευρές. Οι ποντικοί εγχύθηκαν με κύτταρα NOS2 και NOS2TR και στη συνέχεια έλαβαν μέσο μόνο ή NEAPP-ΑΜ. Ένα σύνολο 0.4 mL μέσου ή NEAPP-ΑΜ χορηγήθηκε τοπικά σε αμφότερες τις πλευρές των ποντικών τρεις φορές την εβδομάδα. Όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν στις 29 ημέρες μετά την εμφύτευση. Πράσινη βέλη δείχνουν το σχηματισμό όγκων.

C, D

: Οι χρονο-εξαρτώμενες μεταβολές στο μέγεθος του όγκου σε ξενομοσχεύτηκε μοντέλα φαίνεται, μόνο το μέσο (♦) ή NEAPP-ΑΜ (▪). Κάθε σημείο στο γράφημα γραμμή αναπαριστά το μέσο μέγεθος όγκου (mm

3) για κάθε ομάδα σε μια συγκεκριμένη ημέρα μετά την εμφύτευση, και οι μπάρες αντιπροσωπεύουν SD. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου.

E

: Το ραβδόγραμμα δείχνει το μέσο βάρος του όγκου των αποκοπεί NOS2 και NOS2TR όγκους από NEAPP-ΑΜ ή ομάδες ελέγχου. Ρ-τιμές έναντι της ομάδας ελέγχου ήταν 0,017 και 0,014 στις ομάδες NOS2 και NOS2TR αντίστοιχα.

F, G:

Η ιστολογική ανάλυση των όγκων. Αντιπροσωπευτικές εικόνες αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση τομών ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη από ξενομόσχευμα όγκων που εμφυτεύονται σε NOS2 (F) και NOS2TR (G). Μαύρο βέλη δείχνουν νεκρωτικό πυρήνα εντός του όγκου. Το μπαρ κλίμακα αντιστοιχεί σε 100 μm.

Η

Επίσης, παρατηρήθηκε ιστολογική διαφορές στα τμήματα του όγκου μεταξύ NEAPP-ΑΜ-θεραπεία και -untreated ομάδες και στις δύο κυτταρικές σειρές.

Θα πρέπει να είναι Σημειώνεται ότι θηλώδες ανάπτυξης, μια σαφή χαρακτήρα στο ορώδες αδενοκαρκίνωμα των ωοθηκών από την οποία NOS2 και NOS2TR ήταν απομονωμένες, ανιχνεύθηκε. Αντιθέτως, NEAPP-ΑΜ-αγωγή όγκων χάσει αυτό το χαρακτηριστικό. Ήταν μια ομοιότητα ότι και οι δύο ομάδες είχαν όγκου κεντρική νέκρωση. Σε υποδόριους όγκους που σχηματίζεται από τον εμβολιασμό των κυττάρων NOS2TR, σημειώσαμε την ίδια ιστολογική εμφάνιση όμοια με ορώδες αδενοκαρκίνωμα και κεντρική νέκρωση παρόλο που ήταν μικρότερο βαθμό με εκείνα των γονικών κυττάρων NOS2. Αυτό έδειξε ότι NEAPP-ΑΜ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό του όγκου, αλλά δεν υπήρχε καμία απόδειξη για να βοηθήσει τη διαλεύκανση των μηχανισμών αυτού του φαινομένου

in vivo

.

Συζήτηση

Πολλές ΕΓΚ ασθενείς ανταποκρίνονται καλά στην πλατίνα σε συνδυασμό με πακλιταξέλη, η οποία είναι η πρώτη επιλογή για EOC. Ωστόσο, οι περισσότεροι από αυτούς τους ασθενείς αναπτύσσουν υποτροπή και επίκτητη αντίσταση σε διάφορους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Παρά το γεγονός ότι αυτοί οι ασθενείς έλαβαν πράγματι επανειλημμένη ή άλλους τύπους κυτταροτοξικού παράγοντα με αξιοσημείωτα οδυνηρές παρενέργειες, αυτές οι θεραπείες δεν έχουν οδηγήσει σε ικανοποιητικό ογκολογική έκβαση. Αν οι ασθενείς αυτοί αντιμετωπίζονται αποτελεσματικά από εναλλακτικά, λιγότερο τοξική θεραπεία, θα μπορούσε να γλιτώσει περιττά επώδυνα συμπτώματα.

Στην προηγούμενη έκθεσή μας, αποδείξαμε ότι η άμεση ακτινοβολία του NEAPP μειώθηκαν σημαντικά τα ποσοστά πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ΕΓΚ σε σύγκριση με ινοβλάστες [16]. Αυτό υποδηλώνει ότι το πλάσμα μπορεί να θανατώνει επιλεκτικά EOC κυττάρων μέσω της επαγωγής της απόπτωσης. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τα γνωστά χαρακτηριστικά του ΕΓΚ, τη διάδοση και την εμφύτευση σε όλη την περιτοναϊκή κοιλότητα, ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) η θεραπεία μπορεί να είναι πιο πρακτική από κλινική άποψη. Αν εφαρμοστεί το πλάσμα ως μορφή θεραπείας IP, μια νέα θεραπευτική τεχνολογία μπορεί να αναπτυχθεί στόχευση ενδοπεριτοναϊκή μικροσκοπική ή /και μακροσκοπική όγκους, διευκολύνοντας υψηλότερη διείσδυση του όγκου και συσσώρευση κυτταροτοξικές επιδράσεις στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Επιβεβαιώσαμε πρόσφατα ότι NEAPP-ΑΜ παρουσιάζει επίσης ένα επιλεκτικό αποτέλεσμα κατά του όγκου σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος (U251SP), αλλά όχι φυσιολογικά ανθρώπινα αστροκύτταρα εγκεφάλου (ACBRI-371) [17], με την προϋπόθεση ότι NEAPP-ΑΜ θα δείξει τοξικότητα χαμηλού επιπέδου σε ένα ζωντανό σύστημα. Ωστόσο, δεν έχει υπάρξει καμία έκθεση σχετικά με την επίδραση του πλάσματος ή μέσο πλάσματος που ενεργοποιείται επί χημειο-ανθεκτικά κύτταρα, παρά το γεγονός ότι η επεξεργασία του πλάσματος έχει αναφερθεί ότι επάγει κυτταρικό θάνατο σε διάφορες καρκινικά κύτταρα [5], [14], [15] , [25]. Έτσι, στη σημερινή εξέταση μας, προσπαθήσαμε να ελέγξει αν το πλάσμα έχει επίσης μια επίδραση κατά του όγκου σε χημειο-ανθεκτικά EOC, το οποίο έχει προηγουμένως αποδειχθεί [18], [19].

Αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η πλάσματος παράγει μια μεγάλη ποσότητα ROS, που οδηγεί σε βλάβη του DNA και τον κυτταρικό θάνατο [5], [14], [15], [25]. Πράγματι, το σύστημα πλάσματος μας (NEAPP) έχει επίσης χαρακτηριστεί σε προηγούμενες εκθέσεις στο οποίο ορισμένα ROS, όπως ρίζες υδροξυλίου, απλή ριζών οξυγόνου, οξειδίων του αζώτου, και το άζωτο, ανιχνεύθηκαν στο πλάσμα με OES [16]. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε «nonequilibrium ατμοσφαιρική πίεση πλάσματος που ενεργοποιείται μέσο (NEAPP-ΑΜ)»? ως εκ τούτου, θα πρέπει να σημειώσουμε οποία αντιδραστικά είδη (RS) στην πρώτη υγρή φάση με τα αποτελέσματα κατά των όγκων σε EOCs. Έχει αναφερθεί ότι το ύδωρ εκτίθεται σε πλάσμα κατέστη όξινο, στο οποίο το υπεροξείδιο του υδρογόνου και του αζώτου /νιτρώδες οξύ διαλύθηκαν, με αποτέλεσμα την απενεργοποίηση του μικροβίου [26] – [28]. Επιπλέον, μεσαίου πλάσμα επεξεργασμένο επίσης ρυθμισμένα προς τα κάτω η βιωσιμότητα των κυττάρων με RS και δευτερεύοντα προϊόντα που παράγονται από υλικά στο μέσον, όπως καταδεικνύεται στις προηγούμενες εκθέσεις [13], [15]. Παρ ‘όλα αυτά, ελλείψει μιας καθιερωμένης γεννήτρια NEAPP, διάφορους ερευνητές έχουν αναπτύξει αυτές τις συσκευές.