Αφηρημένο

Cytoglobin είναι ένα ενδοκυτταρικό σφαιρίνης άγνωστης λειτουργίας που εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα της γενεαλογίας μυοϊνοβλάστη. Πιθανές λειτουργίες των cytoglobin περιλαμβάνουν ρυθμιστικούς ενδοκυτταρικών οξυγόνου και την αποτοξίνωση των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου. Προηγούμενη εργασία στο εργαστήριο μας απέδειξε ότι cytoglobin παρέχει προστασία από οξειδωτική προκαλούμενη βλάβη του DNA όταν εκφράζεται επί

in vitro

, αλλά η σημασία αυτού σε περισσότερα φυσιολογικώς σχετικό μοντέλα της νόσου είναι άγνωστη. Cytoglobin είναι υποψήφια για την tylosis με οισοφαγικό καρκίνο γονίδιο, και η έκφρασή του είναι ισχυρά ρυθμισμένα προς τα κάτω σε μη-καρκινικές οισοφαγικό βιοψίες από ασθενείς με TOC σε σύγκριση με την κανονική βιοψίες. Ως εκ τούτου, οισοφαγική κύτταρα παρέχουν ένα ιδανικό πειραματικό μοντέλο για τη δοκιμή υπόθεσή μας ότι μειορρύθμιση της έκφρασης cytoglobin ευαισθητοποιεί κύτταρα να τις βλαβερές συνέπειες της αντιδραστικά είδη οξυγόνου, ιδιαίτερα οξειδωτική βλάβη του DNA, και ότι αυτό θα μπορούσε δυνητικά να συμβάλει στην φαινότυπο TOC. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την υπόθεση αυτή με χειρισμό cytoglobin έκφραση τόσο σε φυσιολογικές όσο και του οισοφάγου καρκινικές κυτταρικές σειρές, οι οποίες έχουν κανονικές φυσιολογικές και καθόλου έκφραση του cytoglobin αντίστοιχα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα, πάνω από την έκφραση της cytoglobin σε καρκινικές κυτταρικές σειρές που παρέχει προστασία από χημικά που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες, αλλά αυτό παρατηρήθηκε μόνο σε μη φυσιολογικές συγκεντρώσεις cytoglobin. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση των cytoglobin σε φυσιολογικά κύτταρα του οισοφάγου είχε καμία επίδραση στην ευαισθησία τους σε οξειδωτικό στρες, όπως αξιολογείται από έναν αριθμό τελικών σημείων. Είμαστε επομένως στο συμπέρασμα ότι η κανονική φυσιολογικές συγκεντρώσεις της cytoglobin δεν προσφέρουν προστασία των κυττάρων από αντιδραστικά είδη οξυγόνου, τουλάχιστον στο σημερινό πειραματικό μοντέλο

Παράθεση:. McRonald FE, JM κινδύνου, Hodges NJ (2012) Προστασία από ενδοκυτταρικού οξειδωτικού στρες από Cytoglobin στην Κανονική και καρκινικά κύτταρα οισοφάγου. PLoS ONE 7 (2): e30587. doi: 10.1371 /journal.pone.0030587

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Νοέμβρη 2011? Αποδεκτές: 22 του Δεκέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 16η Φεβρουαρίου 2012 |

Copyright: © 2012 McRonald et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Cancer Research UK επιχορήγηση έργου C7738 /A10476. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cytoglobin είναι ένα μέλος της οικογένειας σφαιρίνης του haemoproteins που περιλαμβάνουν αιμοσφαιρίνη και μυοσφαιρίνη, καθώς και την πιο πρόσφατα εντοπίστηκαν neuroglobin που εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα του ΚΝΣ [1]. Η κρυσταλλική δομή της cytoglobin έχει λυθεί και μελετηθεί λεπτομερώς [2], [3], [4] δείχνουν ότι η cytoglobin έχει πολλές ομοιότητες με άλλες σφαιρίνες, συμπεριλαμβανομένου του κλασικού τριών-over-τρία άλφα ελικοειδή φορές σφαιρίνης και ένα P

O2 (συνάφεια οξυγόνου) περίπου 0,2 Torr, παρόμοια με εκείνη της μυοσφαιρίνης [π.χ. 5], [6]. Η υψηλή συγγένεια του cytoglobin για οξυγόνο έχει οδηγήσει στην πρόταση ότι cytoglobin μπορεί να χρησιμεύσει ως «ενδοκυτταρικό« σύστημα μεταφοράς οξυγόνου. Σε αυτό το σενάριο, cytoglobin προτείνεται για την παροχή οξυγόνου στα μιτοχόνδρια για να διατηρηθεί η οξειδωτική φωσφορυλίωση, με έναν τρόπο παρόμοιο με την λειτουργία της μυοσφαιρίνης στα μυϊκά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, συγγένεια οξυγόνου φαίνεται να είναι οξειδοαναγωγικά ευαίσθητη, και ρυθμίζεται από το σχηματισμό μιας γέφυρας δισουλφιδίου μεταξύ δύο εξωτερικών υπολειμμάτων κυστεΐνης (Cys Β2 και Cys Ε9). Η οξειδοαναγωγική-ευαίσθητου χαρακτήρα της συγγένειας cytoglobin οξυγόνου υποδηλώνει έναν πιθανό ρόλο της cytoglobin ως οξυγόνο «νεροχύτη /εφεδρεία», σύμφωνα με την οποία το οξυγόνο απελευθερώνεται μόνο όταν τα κύτταρα να γίνει υποξικό. Αν και αυτά είναι ελκυστικά υποθέσεις, cytoglobin φαίνεται να περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό σε κύτταρα ενός ινοβλαστών προέλευσης με μη εμφανή συσχέτιση μεταξύ της μεταβολικής δραστηριότητας των ιστών και των επιπέδων έκφρασης cytoglobin οποία, σε κάθε περίπτωση, είναι μάλλον χαμηλή στους περισσότερους τύπους κυττάρων διερευνώνται έκφραση [7] , [8]. Τα ευρήματα αυτά έχουν οδηγήσει στην αναζήτηση εναλλακτικών φυσιολογική λειτουργία (ες) για cytoglobin.

Cytoglobin εντοπίστηκε για πρώτη φορά το 2001 [9] κατά τη διάρκεια μιας πρωτεομική οθόνη των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων που απομονώνονται από ινωτικού ήπατος αρουραίου ιστών και μάλιστα ήταν αρχικά που ονομάζεται πρωτεΐνη σύνδεσης ενεργοποίησης αστεροειδών κυττάρων (STAP) σε αναγνώριση του γεγονότος αυτού [9]. Μεταγενέστερη εργασία – τόσο

in vitro

και

in vivo

[10] – [13], και πιο πρόσφατα με τη χρήση διαγονιδιακών ζώων που υπερεκφράζουν cytoglobin [14], [15] φαίνεται να επιβεβαιώνουν ότι cytoglobin παίζει ένα ρόλο στην ινωτικής απόκρισης σε έναν αριθμό οργάνων, συμπεριλαμβανομένων του ήπατος και των νεφρών. Αν και ο ακριβής ρόλος της cytoglobin στην ίνωση μένει να καθοριστεί, διαταράξεις της ομοιόστασης οξειδοαναγωγής είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο χαρακτηριστικό της ίνωσης και δεν υπάρχουν επαρκή στοιχεία (ιδιαίτερα όσον αφορά στους πνεύμονες και τα νεφρά) ότι η εξέλιξη των ινωδών αλλοιώσεων περιλαμβάνει κύκλους της βλάβης από επαναιμάτωση οξειδωτικής μετά την υποξία των ιστών. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι cytoglobin έκφραση μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω από την υποξία [16] – [19]. Ως εκ τούτου, φαίνεται πιθανό ότι cytoglobin εμπλέκεται στην προσαρμοστική απόκριση που σχετίζεται με αυτόν τον τραυματισμό.

Σχετικά με τα ευρήματα σε ινώδη νόσο, υπάρχει επίσης μια αναδυόμενη σώμα της μηχανιστικής στοιχεία που να δείχνουν ότι η cytoglobin μπορεί να προσφέρει προστασία από το οξειδωτικό κυτταρική ζημία υπό άλλες συνθήκες, πιθανώς ως αποτέλεσμα της ικανότητάς της να σκουπίζω αντιδραστικά είδη οξυγόνου [20] – [23]. Πράγματι, η εργασία στο εργαστήριό μας έχει δείξει ότι η υπερέκφραση του cytoglobin μειώνει τα επίπεδα της χημικά επαγόμενης αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) και παρέχει προστασία από προ-οξειδωτικό προκαλούμενη βλάβη (λιπιδική υπεροξείδωση και οξειδωτική διάσπαση της έλικας του DNA) [24]. Σε περαιτέρω υποστήριξη για ένα ρόλο στην αποτοξίνωση του ROS, έχει αναφερθεί ότι cytoglobin έχει δραστικότητα υπεροξειδάσης [9]. Είναι ενδιαφέρον, πιο πρόσφατα έχει αναφερθεί ότι τρισθενούς σιδήρου cytoglobin έχει ψευδο-υπεροξειδάσης δραστικότητα έναντι λιπίδια, γεγονός που υποδηλώνει ότι, υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες, ο κύκλος εργασιών των μορίων σηματοδότησης λιπιδίου που βασίζονται σε κύτταρα μπορεί επίσης να είναι μέρος ενός cytoglobin εξαρτώμενη αντιοξειδωτικό απόκριση [25]. Επιπλέον, ένα άλλο σπονδυλωτό σφαιρίνη, σφαιρίνης Χ, έχει βρεθεί ότι σχετίζεται μεμβράνη και ενδεχομένως εμπλέκονται στην προστασία των λιπιδίων από οξείδωση [26].

Περιέργως, εκτός από τους πιθανούς ρόλους συζητήθηκε παραπάνω, το γονίδιο cytoglobin (

CYGB

) είναι επίσης ένα γονίδιο καταστολής όγκων υποψήφιος [27], [28], [29] και έχουμε εντοπίσει

CYGB

ως υποψήφια tylosis με καρκίνο του οισοφάγου (

TOC

) γονίδιο [30] – [33]. Αν και

CYGB

δεν μεταλλάσσεται σε τυλώδες άτομα [31] ή σε μία σειρά από σποραδικά καρκινώματα του οισοφάγου πλακωδών κυττάρων [34], έχουμε δείξει ότι η έκφραση του έντονα προς τα κάτω σε μη καρκινικά οισοφαγικό βιοψίες από ασθενείς με TOC σε σύγκριση με το κανονικό βιοψίες [33].

CYGB

είναι επίσης μεθυλιωμένα και προς τα κάτω σε σποραδικές οισοφάγου, του πνεύμονα και κεφαλής και τραχήλου [27], [28], [33]. Πρόσφατα, μειορύθμιση της cytoglobin έχει επίσης αποδειχθεί ότι προάγει την καρκινογένεση που επάγεται χημικώς στο ήπαρ τρωκτικών [35].

Υπάρχουν πειστικές αποδείξεις ότι η οξειδωτική βλάβη στο DNA (π.χ. 8-οξο δεοξυγουανοσίνη), εάν δεν επισκευαστεί, συμβάλλει ο σχηματισμός των μεταλλάξεων που είναι γνωστό ότι είναι σημαντικές στην αιτιολογία της ανθρώπινης καρκινογένεσης [36], [37]. Ως εκ τούτου, υποθέτουν ότι η απώλεια της έκφρασης cytoglobin θα καθιστούσε οισοφάγου κύτταρα πιο ευαίσθητα στις επιβλαβείς συνέπειες των ROS, και ότι αυτό συμβάλλει στην παρατηρούμενη φαινότυπο του

TOC

. Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε την υπόθεση αυτή με χειρισμό cytoglobin έκφραση σε αμφότερες τις κανονικές του οισοφάγου επιθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του οισοφάγου πλακώδες καρκίνωμα, οι οποίες έχουν κανονικές φυσιολογικές και όχι ενδογενής έκφραση του cytoglobin, αντίστοιχα.

Αποτελέσματα

Χειραγώγηση της έκφρασης cytoglobin

Real time RT-PCR έδειξε ότι το πλακώδες επιθήλιο του οισοφάγου καρκίνου κυτταρική σειρά ΤΕ-8 έχει εξαιρετικά χαμηλή ενδογενή επίπεδα CYGB έκφρασης (κάτω από 10

-5 σε σχέση με το β-ακτίνης (ACTB)), ενώ NE1 φυσιολογικό οισοφαγικό κερατινοκύτταρα εκφράζουν CYGB σε περίπου 0,1 × ACTB. Αυτό το φυσικό επίπεδο έκφρασης σε κύτταρα CYGB NE1 κρίθηκε ότι είναι το κανονικό φυσιολογικό επίπεδο, δεδομένου ότι είναι εντός της ίδιας τάξης μεγέθους με αυτό που παρατηρήθηκε σε ένα πάνελ κανονικών ιστών (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). έκφραση CYGB διαμορφωνόταν σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές είτε παροδική διαμόλυνση του γονιδίου (ΤΕ-8 κύτταρα) ή παροδική εξουδετέρωση χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA (κύτταρα NE1). Cytoglobin έκφραση τεχνητά επάγεται από περίπου 4 ή 7 τάξεις μεγέθους σε ΤΕ-8 κύτταρα, και μειώθηκε κατά περίπου πέντε φορές με siRNA knockdown σε κύτταρα NE1 (Σχήμα 1).

Τα επίπεδα έκφρασης CYGB, σε σύγκριση με την έκφραση ACTB, προσδιορίστηκαν με ανάλυση πραγματικού χρόνου RT-PCR σε ένα παράλληλο δείγμα για κάθε κομήτη δοκιμασία εκτελείται. Συνεπώς, τα επίπεδα έκφρασης σχετίζονται άμεσα με τα δεδομένα κομήτη προσδιορισμού που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3. Ο γεωμετρικός μέσος όλων των πειραμάτων παρουσιάζεται για τόσο TE-8 κύτταρα (πορτοκαλί ράβδοι) και NE1 κυττάρων (ροζ ράβδοι).

Η

Χαρακτηρισμός των κυττάρων

Κανονική επιθηλίου του οισοφάγου (ΤΕ-8) κύτταρα (ΝΕ-1) και ο καρκίνος του οισοφάγου αναλύθηκαν για τα επίπεδα του οξειδωτικού στρες με τη χρήση της οξειδοαναγωγής ευαίσθητη ένωση 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξεικό (H2DCF -DA) παρουσία και απουσία μπουθειονίνης sulfoxamine (BSO).

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι BSO ήταν σε θέση να προκαλέσει οξειδωτικό στρες και στις δύο κυτταρικές σειρές ΤΕ-8 και NE1, με μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση απόκριση είναι εμφανής (Σχήμα 2). Στο ΤΕ-8 κύτταρα, αυτό επετεύχθη στατιστική σημασία μη υποβληθέντα σε χειρισμό κυττάρων (p = 0,0134) και CYGB επιμολυσμένα κύτταρα (p = 0,0034), αλλά όχι σε ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (p = 0.092). Παρ ‘όλα αυτά, μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε σε ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. Στην κανονική του οισοφάγου κυτταρική γραμμή NE1, ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα: σε αυτήν την περίπτωση η BSO εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση απόκριση οξειδωτικό στρες ήταν στατιστικά σημαντική σε όλες τις τρεις ομάδες των κυττάρων. BSO ήταν σε θέση να προκαλέσει οξειδωτικό στρες στα κύτταρα ελέγχου (ρ = 0.0032), αρνητικός έλεγχος κύτταρα κατεργασμένα siRNA (p = 0,0283), και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε siRNA knockdown του CYGB (p = 0,0077). Αν και μια τάση παρατηρήθηκε σε ΤΕ-8 κυττάρων προς υπερέκφραση CYGB να συνδέεται με χαμηλότερα επίπεδα ROS σε σύγκριση με ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα, αυτό δεν ήταν στατιστικά σημαντικό. Καμία επίδραση της CYGB νοκ ντάουν παρατηρήθηκε στα κύτταρα NE1. Ωστόσο, ως κύριο ζήτημα μας ήταν να δούμε ROS που σχετίζονται με βλάβες στο DNA, και όχι οξειδωτικό στρες

per se

, είμαστε δίπλα πραγματοποιήθηκε τον κομήτη δοκιμασία για τις δύο κυτταρικές σειρές: αυτό έχει το πρόσθετο πλεονέκτημα να είναι πολύ περισσότερο ευαίσθητος δείκτης της κυτταρικής οξειδωτικής βλάβης

το οξειδωτικό στρες μετρήθηκε σε:. ΤΕ-8 και b: τα κύτταρα NE1. Μέσος φθορισμός DCF είναι η μέση τιμή 5 επαναλήψεων. Όλες οι τιμές ομαλοποιήθηκαν στο επίπεδο που παρατηρείται στα κύτταρα ελέγχου χωρίς BSO. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM + 2020:. αντιδραστήριο επιμόλυνσης μόνο? + CYGB: κύτταρα επιμολυσμένα με πλήρους μήκους CYGB? κη siRNA: ομελέτα ελέγχου? CYGB k /d: CYGB siRNA. * Στατιστικά σημαντική συγκέντρωση-εξαρτώμενη απόκριση (ρ & lt? 0,05) ** Στατιστικά σημαντική συγκέντρωση-εξαρτώμενη απόκριση (ρ & lt? 0,01)

Η

Σχέση μεταξύ οξειδωτική βλάβη του DNA και cytoglobin έκφραση

Comet. δοκιμασία.

Στο ΤΕ-8 κυττάρων, έκφραση CYGB τεχνητά αποκαταστάθηκε με παροδική επιμόλυνση (Σχήμα 1). Η οξειδωτική βλάβη του DNA μετρήθηκε με τη κομήτη δοκιμασία σε κύτταρα με δύο διαφορετικά επίπεδα έκφρασης CYGB εκτός από τους ελέγχους βασικής γραμμής: τεχνητά υψηλή υπερέκφραση (περίπου 10

2-φορές σε σχέση με την έκφραση ACTB) και χαμηλή (περίπου φυσιολογικό) έκφραση (περίπου 10

-1-φορές σε σχέση με την έκφραση ACTB). Στα τεχνητά υψηλά επίπεδα έκφρασης CYGB, μια σημαντική μείωση σε οξειδωτική βλάβη του DNA παρατηρήθηκε υπό συνθήκες εξωγενούς οξειδωτικού στρες (1000 μΜ BSO) (p = 0,014), σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 3α) Υπήρξε επίσης μια σημαντική διαφορά στην οξειδωτική βλάβη του DNA μεταξύ των κυττάρων με χαμηλή /φυσιολογικές και υψηλά επίπεδα έκφρασης CYGB (p = 0,035). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ των ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα και εκείνοι με χαμηλά επίπεδα /φυσιολογικές έκφρασης CYGB (p = 0.074)? παρομοίως δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ ελέγχου και ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα (p = 0.455). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι CYGB ασκεί μία προστατευτική επίδραση έναντι κυτταρικών οξειδωτικές βλάβες μόνο σε τεχνητά υψηλές – μη φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης. Παρά το γεγονός ότι, αντίθετα με τη διαίσθηση, υπήρχε μια τάση προς αυξημένη οξειδωτική βλάβη του DNA, όταν CYGB εκφράστηκε σε χαμηλά /φυσιολογικά επίπεδα, η τάση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Σε NE1 κύτταρα, μείωση της έκφρασης CYGB κατά 90% χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA δεν είχε ως αποτέλεσμα καμία διαφορά στην οξειδωτική βλάβη του DNA: αυτό υποστηρίζει περαιτέρω την άποψη ότι CYGB εξασκεί μόνο κυτταροπροστατευτικά αποτελέσματα του σε τεχνητά υψηλές (μη φυσιολογικά) επίπεδα έκφρασης (σχήμα 3β)

κλώνο DNA-διαλείμματα (βασική γραμμή και οξειδωτική βλάβη-επαγόμενη) μετρήθηκαν με την FPG-τροποποιημένο κομήτη δοκιμασία σε:. TE-8 και β: NE-1 κυττάρων με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης CYGB (όπως φαίνεται στο Σχήμα 1). Μέση τιμή του διάμεσου τοις εκατό ένταση ουρά κομήτη φαίνεται. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. * Σημαντικά διαφορετικό από κάθε άλλο (ρ & lt? 0,05). # Σημαντικά διαφορετική μεταξύ τους (ρ & lt? 0,05).

Η

Cytoglobin και κυτταρική κινητικότητα

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η επίδραση cytoglobin κυτταρική κινητικότητα και η ικανότητα σχηματισμού αποικιών [29], ωστόσο, σε η τρέχουσα μελέτη καμία επίδραση της cytoglobin knockdown κατά την ανάπτυξη των κυττάρων ανιχνεύθηκε σε είτε NE1 οισοφάγου κερατινοκύτταρα ή CCD-18Co κολονική μυοϊνοβλάστες, είτε 25 ή 50 ώρες μετά τον τραυματισμό (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

Προηγούμενη εργασία σε άλλα εργαστήρια μας και έχει δείξει ότι cytoglobin έχει τη δυνατότητα να αποτοξινώσει αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

in vitro

όταν υπερεκφράζεται σε διάφορα συστήματα κυτταρικής καλλιέργειας [20], [21], [22 ], [24]. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση cytoglobin με RNAi έχει επίσης πρόσφατα δειχθεί ότι ευαισθητοποιεί κύτταρα γλοιώματος σε οξειδωτικό στρες, που προκαλείται τόσο από την αναστολή της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων με αντιμυκίνη Α, και ιονίζουσες ακτινοβολίες [23]. Περαιτέρω υποστήριξη για ένα ρόλο για cytoglobin στην αποτοξίνωση του ROS είναι η βιοχημική απόδειξη ότι η πρωτεΐνη cytoglobin κατέχει ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης, καθώς και αντιοξειδωτικές ιδιότητες και υπάρχουν ενδείξεις ότι και άλλα σφαιρίνες συμπεριλαμβανομένων neuroglobin και σφαιρίνης Χ μπορεί επίσης να έχει παρόμοιες ιδιότητες [20], [ ,,,0],26], [38], [39]. Ωστόσο, στην περίπτωση των cytoglobin, παραμένει αβέβαιο αν αυτό είναι ένα γνήσιο φυσιολογική λειτουργία του cytoglobin ή ένα κατασκεύασμα των πειραματικών μοντέλων που χρησιμοποιήθηκαν. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει «cytoglobin αναγωγάσης» έχει αναγνωριστεί ότι θα μπορούσε να μειώσει το Fe

3+ πίσω στο Fe

2+, έτσι δεν είναι σαφές πώς οξειδωμένα cytoglobin θα ανακυκλώνονται μέσα στα κύτταρα. Υπάρχουν επίσης ενδείξεις ότι cytoglobin έχει καταλυτική δράση ενάντια στα αντιδραστικά είδη αζώτου οξείδιο του αζώτου, που καταλύει τη μετατροπή του σε νιτρικό όπου ασκορβικό και κυτόχρωμα β (5) έχουν αναγνωριστεί ως πιθανές πηγές μείωση της ισχύος [40]. Αυτή η υποθετική δραστικότητα συσχετίζεται καλά με την παρατήρηση υψηλών επιπέδων έκφρασης cytoglobin σε ινοβλάστες και κύτταρα λείου μυός του αγγειακού συστήματος, όπου το μονοξείδιο του αζώτου είναι ένα πολύ γνωστό σηματοδότησης μοριακού που μεσολαβεί αγγειακό τόνο [41]. Ωστόσο, άλλες μελέτες έχουν θέσει υπό αμφισβήτηση εάν διοξυγενάσης μονοξείδιο του αζώτου είναι ένα φυσιολογικώς σχετικό ενζυμική δραστηριότητα του cytoglobin [42]. Επιπλέον, υπάρχει επίσης αναδύεται

in vivo

απόδειξη ενός προστατευτικού ρόλου των cytoglobin (και neuroglobin) έναντι του οξειδωτικού στρες, ειδικά σε μοντέλα ίνωσης που περιλαμβάνουν υποξικής επαναιμάτωση και μετέπειτα οξειδωτική βλάβη [10] – [15] .

Πολλά από τα στοιχεία αυτά έχουν παραχθεί σε πειραματικά μοντέλα, όπου εκφράζεται πάνω-cytoglobin, έτσι αν και αυτά είναι ενδιαφέροντα ευρήματα, φυσιολογική ενδιαφέρον τους παραμένει ασαφής. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε εάν cytoglobin έκφραση θα μπορούσε να αντέξει οικονομικά την προστασία από χημικά που προκαλείται από οξειδωτικές βλάβες του DNA σε καλλιεργημένα κύτταρα του οισοφάγου. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό γιατί

CYGB

ρυθμίζεται προς τα κάτω και στις δύο tylosis με καρκίνο του οισοφάγου και σποραδικές οισοφάγου καρκίνων [33] και, ως εκ τούτου η υπόθεση ότι η απώλεια της έκφρασης cytoglobin θα ευαισθητοποιούν αυτά τα κύτταρα σε βλάβη του DNA, και ότι αυτό μπορεί να εμπλέκονται στην αιτιολογία του καρκίνου του οισοφάγου. Όταν cytoglobin υπερεκφράστηκε σε ΤΕ-8 οισοφαγικό καρκινικές κυτταρικές γραμμές, οι οποίες έχουν μικρή ή καθόλου ενδογενή έκφραση cytoglobin, σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες παρατηρήσαμε στατιστικά σημαντική προστασία από BSO προκαλούμενη βλάβη οξειδωτική DNA όπως εκτιμάται από την FPG τροποποιημένου κομήτη δοκιμασίας. Αυτό το αποτέλεσμα όμως ήταν εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση: σε χαμηλότερα επίπεδα cytoglobin υπερέκφρασης είχε χαθεί η προστατευτική επίδραση. Σε συμφωνία με αυτό, knockdown των φυσιολογικών επιπέδων cytoglobin σε καλλιέργειες πρωτογενών NE1 οισοφάγου κύτταρα δεν να ευαισθητοποιηθούν BSO προκαλούμενη βλάβη οξειδωτική DNA όπως εκτιμάται από το ίδιο τελικό σημείο. Είναι ενδιαφέρον, έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι knockdown έκφρασης cytoglobin σε κύτταρα γλοιώματος με RNAi ανεβάζει τα επίπεδα του αντιμυκίνη Α-επαγόμενη υπεροξείδιο του υδρογόνου [23]. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε καμία σημαντική διαφορά στα επίπεδα της BSO που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες, όπως εκτιμάται από την οξείδωση της dichlorofluoroscein. Ο λόγος για αυτή τη διαφορά δεν είναι σαφής αλλά μπορεί να σχετίζεται είτε με το διαφορετικό κυτταρική γραμμή ή μέθοδος για την επαγωγή του οξειδωτικού στρες.

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι αν και η επαγωγή του cytoglobin έκφρασης, για παράδειγμα ως αποτέλεσμα της υποξίας ή σε ανταπόκριση σε οξειδωτική βλάβη, έχει τη δυνατότητα να είναι προστατευτική, στη μελέτη μας αυτή παρατηρήθηκε μόνο σε επίπεδα CYGB απίθανο να επιτευχθεί

in vivo

. Επιπλέον, δεν υπήρχε καμία ένδειξη μιας αυξημένης ευαισθησίας σε ROS ακόλουθα knockdown με RNAi σε κύτταρα που εκφράζουν cytoglobin σε φυσιολογικά επίπεδα. Ως εκ τούτου, μια κυτταροπροστατευτική ρόλο έναντι οξειδωτικής βλάβης που προκαλείται από το DNA δεν φαίνεται να είναι συνάρτηση της cytoglobin σε οισοφάγου κύτταρα και άλλες εξηγήσεις της λειτουργίας cytoglobin και η απώλεια της έκφρασης σε αυτό το μοντέλο ασθένειας απαιτούνται.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Κανονική οισοφάγου επιθηλιακά κύτταρα (ΒΑ-1, Ένα δώρο του καθηγητή GSW Τσάο, Τμήμα Ανατομίας, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ (βλέπε [43]) διατηρήθηκαν σε Τ

75 φιάλες καλλιέργειας χρησιμοποιώντας τα ελεύθερα μέσα ενημέρωσης κερατινοκυττάρων ορού (Gibco) συμπληρωμένο με εκχύλισμα υπόφυσης βοοειδούς (25 μg ml

-1) και ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (0,15 ng ml

-1). οι καλλιέργειες συνήθως χωρίζονται 1:03 περίπου κάθε 3-4 ημέρες χρησιμοποιώντας τρυψίνη-ΕϋΤΑ και αναστολέα θρυψίνης σόγιας (Gibco) σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο για την κερατινοκυττάρων μέσο χωρίς ορό. το οισοφαγικό καρκίνο κυτταρική σειρά ΤΕ-8 (ένα δώρο του καθηγητή Toshio Kudo, Cell Κέντρο πόρων Βιοϊατρικής Έρευνας , Πανεπιστήμιο Tohoku, Ιαπωνία, [44]) αναπτύχθηκε σε Τ

75 φιάλες καλλιέργειας με μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS και 2% L-Γλουταμίνη. TE-8 κύτταρα χωρίστηκαν ως απαραίτητο χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο θρυψίνη-ΕϋΤΑ. CCD-18Co κολονικής μυοϊνοβλάστες (που αγοράζεται από προϊόν ATCC ΝΟ: CRL-1459? [45]) αναπτύχθηκαν σε DMEM supplememented με 10% FBS, 1% Ε-γλουταμίνη και 1% μη απαραίτητα αμινοξέα (NEAAs). Αυτά τα κύτταρα χυμένο ως απαραίτητο χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο θρυψίνη-ΕϋΤΑ.

Cytoglobin knockdown

NE-1 κύτταρα ή κύτταρα CCD-18Co υποκαλλιεργήθηκαν σε έξι φρεατίων πλάκες (για comet assay) ή πλάκες δώδεκα φρεατίων (για ROS δοκιμασία και δοκιμασία επούλωση της πληγής), και αφέθηκε να φθάσει 60-70% συρροή πριν από την επιμόλυνση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 25 ηΜ τελική συγκέντρωση είτε ένας αρνητικός έλεγχος κωδικοποιημένο siRNA (Ambion? AM4611) ή CYGB siRNA (Qiagen? SI03228323 ή Ambion? S41571) χρησιμοποιώντας 15 μg ml

-1 αντιδραστήριο TransIT siQuest (Mirus Bio) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά RNAi knockdown, τα κύτταρα επωάστηκαν για 42 ώρες πριν από τη διεξαγωγή των πειραμάτων (24 ώρες για το πείραμα επούλωση πληγών). Η έκφραση του CYGB αναλύθηκε με RT-PCR (βλέπε παρακάτω).

Η υπερέκφραση του cytoglobin

TE-8 οισοφαγική κύτταρα πλακώδους καρκινώματος υποκαλλιεργήθηκαν σε έξι ή δώδεκα φρεατίων προηγουμένως. Παροδική επιμόλυνση

CYGB

επιτεύχθηκε με Transit αντιδραστήριο διαμόλυνσης 2020 (Mirus Bio) (2 μΙ ή 5 μl ανά φρεάτιο για πλάκες 12-φρεατίων ή 6-φρεατίων αντίστοιχα), και πλήρους μήκους

CYGB

κλώνος cDNA σε έναν φορέα pCMV6-AC (ΟηΟεηε) (0.6 μg ή 1.5 μg για πλάκες 12-φρεατίων ή 6-φρεατίων αντίστοιχα), σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο για το αντιδραστήριο διαμόλυνσης. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επωάστηκαν για 42 ώρες πριν από τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Η έκφραση του CYGB αναλύθηκε με RT-PCR (βλέπε παρακάτω).

εκχύλιση RNA, σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου και ανάλυση RT-PCR

Απομόνωση ολικού RNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα RNeasy MINIKIT ( Qiagen) με απευθείας λύση των κυττάρων στην πλάκα καλλιέργειας και ομογενοποίηση χρησιμοποιώντας QIAshredder σωλήνες. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα RETROscript Kit (Ambion) με, ολίγο dT ενάρκτες και 1 μg συνολικού RNA, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για RT-PCR ένα κύριο μίγμα παρασκευάζεται που περιέχει TaqMan 2 × κύριο μείγμα (Applied Biosystems), β-ακτίνης VIC /ΜΟΒ για την ενδογενή έλεγχο (Applied Biosystems 4326315E), CYGB αστάρι και το μείγμα ιχνηλατών (αίσθηση 5′-CTC ΤΑΤ GCC AAC TGC GAG GAC-3 ‘, αντι-νόημα 5′-AAC ΤΟΟ ΟΤΟ AAG TAC TGC TTG-3′ και ο ανιχνευτής FAM-5′-ΤΟΟ CCA TCC TGG TGA GGT TCT TTG TG-3’-μαύρη τρύπα αποσβεστήρα) στην RNase -δωρεάν νερό. Ένα πρότυπο πρωτόκολλο δύο σταδίων χρησιμοποιήθηκε για πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση (50 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από 50 κύκλους των 95 ° C για 15 λεπτά και 60 ° C για 1 λεπτό). Ο Κύκλος τιμές κατωφλίου (Ct) που λήφθηκαν χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της αξίας ποσοτικοποίηση πραγματικού χρόνου (RQ) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΔΔCt, με τιμές ACTB Ct και μη επεξεργασμένα /μη επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιούνται ως παράγοντες ομαλοποίησης.

FPG τροποποιημένο κομήτη δοκιμασία

Η μέθοδος αυτή βασίζεται σε εκείνη του Singh et al [46] με μικρές τροποποιήσεις [47]. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα πλύθηκαν σε ψυχρό PBS και απαλά αποξέστηκαν σε 1 ml φρέσκο ​​PBS (ΤΕ-8 κύτταρα) ή σε επεξεργασία με θρυψίνη (κύτταρα NE1). Μετά από φυγοκέντρηση (8000 rpm, 5 λεπτά) σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε PBS (150 μΐ). Ένα κλάσμα του εκ νέου αιωρημένα κύτταρα (30 μΐ) τοποθετήθηκε σε ένα αποστειρωμένο σωληνάριο που περιέχει χαμηλού σημείου τήξης αγαρόζη (300 μΐ) και αυτό το κυτταρικό εναιώρημα μεταφέρθηκε σε δυο υάλινων πλακιδίων μικροσκοπίου (150 μΐ ανά slide), προ-επικαλυμμένα με 0.5% κανονική αγαρόζη σημείο τήξης. Γυάλινες καλυπτρίδες προστέθηκαν και διαφάνειες τοποθετούνται σε ένα μεταλλικό δίσκο πάνω σε πάγο για 10 λεπτά. Οι καλυπτρίδες απομακρύνθηκαν και slides επωάστηκαν για 1 ώρα στους 4 ° C σε ρυθμιστικό λύσης (2,5 Μ NaCl, 0.1 Μ Να

2EDTA, βάση 10 mM Tris, 1% Ν νάτριο – λαουρυλο σαρκοσινικό, 10% DMSO και 1% Triton Χ -100). Τα πλακίδια πλύθηκαν (3 χ 5 λεπτά) με FPG Buffer (40 mM HEPES, 0.1 Μ KCl, 0,5 mM EDTA 0,2 mg /ml αλβουμίνη βόειου ορού, ρΗ 8,0) και επωάστηκαν με 1 μονάδα ενζύμου FPG (Trevigen) σε 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος FPG στους 37 ° C για 1 ώρα (πλακίδια ελέγχου επωάστηκαν με ρυθμιστικό FPG μόνο). Τα πλακίδια μεταφέρθηκαν σε οριζόντια δεξαμενή ηλεκτροφόρησης που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης (300 mM ΝβΟΗ και 1 mM Na

2EDTA, ρΗ 13,0) και το DNA αφέθηκε να χαλαρώσουν για 20 λεπτά. DNA υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση (25 V, 0,8 V cm

-1, 20 λεπτά) και ολισθαίνει εξουδετερώνεται με έκπλυση (3 χ 5 λεπτά) με ρυθμιστικό εξουδετέρωσης (0.4 Μ Tris, ρυθμισμένο σε ρΗ 7.5). Τα πλακίδια στη συνέχεια χρωματίζονται με SYBR Gold 50 μΙ (Invitrogen, 10 Χ διάλυμα σε ρυθμιστικό εξουδετέρωσης).

Τα πλακίδια εξετάστηκαν στα 320 × μεγέθυνση χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Zeiss Axiovert 10, Γερμανία), εφοδιασμένο με ένα 515 -560 nm διέγερση φίλτρο και ένα φίλτρο φραγμού στα 590 nm. Μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή USB (Merlin, Allied Vision Technologies) έλαβε τις εικόνες, οι οποίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα προσωπικό σύστημα ανάλυσης εικόνας βασισμένο σε υπολογιστή Comet δοκιμασία IV (Perceptive μέσα). Εικόνες από εκατό τυχαία επιλεγμένους πυρήνες αναλύθηκαν ανά slide. Μέτρηση του DNA τοις εκατό ουρά (TD%) επιλέχθηκε για να εκτιμήσει την έκταση της βλάβης του DNA, καθώς αυτό έχει αποδειχθεί ότι υποφέρουν πολύ λιγότερο από το δια-τρέχουν διακύμανση σε σχέση με άλλες κομήτη παραμέτρους, διότι είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητη από την τάση ηλεκτροφόρησης και να τρέξει του χρόνου [48] . Διάμεση τιμές τριών ξεχωριστών πειραμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ANOVA και post-hoc t-test του Student, όπως συνιστάται από Duez κ.ά. [49].

ROS δοκιμασία

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου αξιολογήθηκαν με μέτρηση η οξείδωση του οξειδοαναγωγικού ευαίσθητων βαφή 2 ‘, 7’-διοξική dichlorodihydrofluorescein (H2DCF-DA). Μετά από υδρόλυση από ενδοκυτταρικές εστεράσες, το προκύπτον H2DCF δεν είναι σε θέση να αφήσει το κύτταρο και στη συνέχεια οξειδώνεται με ROS για να σχηματίσει το φθορίζον μόριο DCF. Το επίπεδο του φθορισμού είναι ανάλογη με το βαθμό οξειδωτικού στρες στα κύτταρα. Προκειμένου να επάγει οξειδωτικό στρες τεχνητά, μπουθειονίνης σουλφοξιμίνη (BSO), η οποία αναστέλλει το στάδιο περιορισμού του ρυθμού στη σύνθεση της γλουταθειόνης, προστέθηκε στα καλλιεργούμενα κύτταρα για 24 ώρες πριν από το πείραμα στα 100 ή 1000 μΜ.

εν συντομία, μετά θεραπείες 2 ‘, 7’-διοξική dichlorodihydrofluorescein (τελική συγκέντρωση 10 μΜ για ΤΕ-8 κύτταρα? 1 μΜ ή 0.1 μΜ για κύτταρα NE1) προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψινοποίηση, σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντριση και επαναιωρήθηκαν σε PBS. ένταση φθορισμού δείγμα αναλύθηκε (FITC κανάλι) χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής FACScalibur ™ (Becton Dickinson) και λογισμικό Pro CellQuestTM (Becton Dickinson). Κύτταρα χωρίς φθορίζουσα χρωστική χρησιμοποιήθηκαν ως ένας αρνητικός έλεγχος για τη διόρθωση υποβάθρου αυτοφθορισμό.

Επούλωση Δοκιμασία

NE1 οισοφαγική κερατινοκυττάρων και CCD-18Co κολονικής μυοϊνοβλάστες αναπτύχθηκαν σε τρυβλία δώδεκα καλά, και υποβάλλεται σε RNAi knockdown του CYGB όπως περιγράφηκε προηγουμένως, χρησιμοποιώντας τόσο Ambion και Qiagen siRNAs να CYGB, και ένα κωδικοποιημένο ελέγχου siRNA. Κάθε συνθήκη επαναλήφθηκε έξι φορές για κάθε κυτταρική γραμμή. Το κυτταρικό στρώμα αποξέσθηκε σε ένα σταυρό σχήμα χρησιμοποιώντας αποστειρωμένη πιπέτα στις 24 ώρες μετά τη knockdown. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε 1, 25 και 50 ώρες μετά τον τραυματισμό με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή USB. Εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό TScratch [50], στην οποία αναλύθηκαν οι μεταβολές στο ποσοστό του Open περιοχή του τραύματος (OWA).