Αφηρημένο

Οι ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος συνήθως αναπτύσσουν εισβολή όγκου και μετάσταση στο αρχικό στάδιο. Αυτά τα κακοήθη συμπεριφορές θα μπορούσαν να προέρχονται από καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), αλλά ο υπεύθυνος στόχος είναι λιγότερο γνωστή για την αόρατη ΚΕΠ ειδικά για την εισβολή και τη μετάσταση. Έχουμε ήδη εξετάσει τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος των ΚΕΠ και κατασκεύασε ένα σύστημα απεικόνισης σε πραγματικό χρόνο για την ανθρώπινη παγκρεατική ΚΕΠ. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι τα ΚΕΠ ήταν πολύ μεταστατικό και δεσπόζει εντοπισμένη στο περιθώριο εισβολή όγκου σε ένα μοντέλο μετάσταση στο ήπαρ. Μικροσυστοιχιών και δοκιμασίες διαλογής siRNA έδειξαν ότι doublecortin-όπως κινάση 1 (DCLK1) ήταν εκφράζεται κυρίως με την τροποποίηση των ιστονών σε παγκρεατικά ΚΕΠ με επεμβατικές και μεταστατικό δυναμικό. Η υπερέκφραση του DCLK1 οδήγησε σε αμοιβαδοειδή μορφολογία, το οποίο προωθεί τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Νοκ ντάουν της DCLK1 βαθιά καταστολή in vivo μετάσταση στο ήπαρ του παγκρέατος ΚΕΠ. Κλινικά, DCLK1 υπερεκφράστηκε στις μεταστατικούς όγκους σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Οι μελέτες μας αποκάλυψαν ότι DCLK1 είναι απαραίτητη για την επεμβατική και μεταστατικές ιδιότητες των ΚΕΠ και μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη επιγενετική και θεραπευτικό στόχο στον ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος

Παράθεση:. Ito Η, Tanaka S, Akiyama Υ, Shimada S, Adikrisna R, Matsumura S, et al. (2016) κυρίαρχη έκφραση της DCLK1 σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα Επιταχύνει Όγκου εισβολή και τη μετάσταση. PLoS ONE 11 (1): e0146564. doi: 10.1371 /journal.pone.0146564

Επιμέλεια: Zhiqian Zhang, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο & amp? Ινστιτούτο, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 17 του Αυγούστου, 2015? Αποδεκτές: 18η Δεκεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 14, Γενάρη 2016

Copyright: © 2016 Ito et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πρόγραμμα για την Ανάπτυξη Καινοτόμων Έρευνας για τον Καρκίνο Therapeutics (P-Direct), μια Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα στην καινοτόμους τομείς, την επιστημονική Έρευνα (Α), Αμφισβήτηση αναγνωριστικής έρευνας από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών & amp? Τεχνολογία της Ιαπωνίας, και Υγείας & amp? Εργασίας Επιστημών Research Grant από το Υπουργείο Υγείας Εργασίας & amp? Πρόνοιας της Ιαπωνίας. Αριθμός: 22130005, 25253081, 15H01484, 15K15491. URL:. Https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Συντομογραφίες : CSC, καρκίνο βλαστικών κυττάρων? ODC, αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης? Gdeg, ZsGreen-επισημασμένο degron ODC? H3K4me3, της ιστόνης H3 λυσίνη 4 τρι-μεθυλίωση? H3K9me3, της ιστόνης H3 λυσίνη 9 tri-μεθυλίωση? H3K27me3, της ιστόνης H3 λυσίνη 27 tri-μεθυλίωση? FACS, ενεργοποιημένων με φθορισμό κυτταρική διαλογή? RT-PCR, αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφής? qRT-PCR, ποσοτικής RT-PCR? GAPDH, αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η πιο θανατηφόρα κοινή μορφή καρκίνου, επειδή είναι συνήθως διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο και είναι ανθεκτικό στη θεραπεία [1]. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης πέντε χρόνια μετά τη διάγνωση είναι περίπου 5-6%, που είναι το χαμηλότερο ποσοστό του κάθε καρκίνου [2]. Παρά πρόσφατα επινόησε χειρουργικές τεχνικές και αντικαρκινικά φάρμακα, η αποτελεσματικότητα της θεραπείας για τον καρκίνο του παγκρέατος δεν έχει βελτιωθεί σημαντικά κατά την τελευταία δεκαετία λόγω της τάσης για πρόωρη εισβολή και τη μετάσταση [3]. Αυτά τα υψηλά κακοήθη χαρακτηριστικά οφείλονται στην αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση ενός μικρού υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων με ιδιότητες στέλεχος-όπως, λεγόμενα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) [4, 5], τα οποία αναφέρονται επίσης και ως μεταστατικά βλαστοκύτταρα [6, 7]. Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν ότι η βλαστικών κυττάρων μοίρα καθορίζεται από επιγενετικών μηχανισμών συμπεριλαμβανομένης της τροποποίησης των ιστονών σε είτε φυσιολογικά κύτταρα [8] ή ΚΕΠ [9]. Το πιο σημαντικό, η ταυτοποίηση των μοριακών στόχων των ΚΕΠ αναμένεται να επιταχύνει την ανάπτυξη νέων στοχευμένων θεραπειών [10]. Παρά το γεγονός ότι αρκετές δεικτών κυτταρικής επιφάνειας έχουν αναγνωριστεί ως χαρακτηριστικό των παγκρεατικών ΚΕΠ [5, 11], θεραπευτικοί στόχοι της επεμβατικής και μεταστατική διαδικασία είναι ακόμα ασαφές σε παγκρεατικού καρκίνου [12, 13]. Αξιολογώντας θεραπευτικές στρατηγικές για τη στόχευση ΚΕΠ είναι δύσκολη λόγω της πολυπλοκότητας της ανακατασκευής μικτών πληθυσμών με διαφοροποιημένους απογόνους σε ένα ιεραρχικό τρόπο [14, 15]. Ένα σύστημα παρακολούθησης βασίζεται σε CSC-συγκεκριμένες λειτουργίες θα μπορούσε να είναι μία λύση στις δυσκολίες αυτές, και χρησιμοποιήσαμε τη χαμηλή δραστηριότητα πρωτεασώματος των ΚΕΠ για τη δημιουργία ενός τέτοιου συστήματος. Ανθρώπινα κύτταρα του μαστού και του καρκίνου του γλοιώματος είχαν κατασκευαστεί για να εκφράζουν σταθερά πράσινο φθορισμό σε σύντηξη με την degron της δεκαρβοξυλάσης ορνιθίνης (Gdeg), η οποία οδήγησε σε ενδοκυτταρική συσσώρευση πρωτεΐνη πράσινου φθορισμού Gdeg ως συνέπεια της χαμηλής δραστηριότητας του πρωτεασώματος 26S [16, 17] . Με τη χρήση αυτής της ιδιότητας, έχουμε ήδη κατασκευάσει ένα σύστημα απεικόνισης σε πραγματικό χρόνο για την ανθρώπινη ήπατος ΚΕΠ και κατέδειξε υψηλή μεταστατική ικανότητα τους με το σχηματισμό θέση [18]. σύστημα απεικόνισης μας χρησιμοποιήθηκε επίσης για την αποσαφήνιση των άκρως κακοήθη χαρακτηριστικά της ανθρώπινης παγκρεατικής ΚΕΠ [19]. Στην παρούσα μελέτη, αναγνωρίσαμε doublecortin-όπως κινάση 1 (DCLK1) ως μια πρωτεΐνη η οποία εκφράζεται κυρίως σε επεμβατικές και μεταστατικό ΚΕΠ. Το γονίδιο που σχετίζεται με την επιγενετική αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων H3K4me3 και την τροποποίηση των ιστονών H3K27me3. DCLK1 προηγουμένως αναφερθεί ότι είναι ένας υποψήφιος φυσιολογικό δείκτη βλαστικών κυττάρων στο έντερο [20, 21]. Ωστόσο, Nakanishi

et al

. μεταχειρισμένα πειράματα γενεαλογίας-εντοπισμό και έδειξε ότι DCLK1 σηματοδοτεί βλαστικά κύτταρα του όγκου που παράγουν συνεχώς απογόνους του όγκου [22]. Επιπλέον, Westphalen

et al

. χρησιμοποίησαν την ίδια στρατηγική και ανέφεραν τη σχέση μεταξύ μακρόβια DCLK1-θετικών κυττάρων και την έναρξη του καρκίνου του παχέος εντέρου [23]. Σύμφωνα με την πρόσφατη έκθεση της Bailey

et al

., Παγκρεατική νεοπλάσματα στα ποντίκια που εκφράζουν DCLK1 περιέχουν μορφολογικά και λειτουργικά διακριτές υποπληθυσμών με CSC-όπως ιδιότητες [24]. Χρησιμοποιώντας το παραπάνω σύστημα απεικόνισης και μεταστατικούς καρκίνους του παγκρέατος, οι μελέτες μας αποκάλυψαν ότι DCLK1 εκφράζεται έντονα σε ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ και σε κλινικά δείγματα και μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα θεραπευτικό στόχο.

Υλικά και Μέθοδοι

ρετροϊική μεταγωγή του ρεπόρτερ degron σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Η ακολουθία degron της αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης (ODC) αναγνωρίζεται άμεσα από πρωτεασώματα, η οποία οδηγεί στην άμεση καταστροφή των εμπλεκόμενων πρωτεϊνών [16]. Ο φορέας ρετροϊού έκφρασης pQCXIN-ZsGreen-cODC, που περιέχει πράσινο φθορισμό ZsGreen-επισημασμένο degron ODC (Gdeg), παρασχέθηκε ευγενώς από το Δρ Frank Pajonk (Jonsson Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου του UCLA, CA, USA). Ο φορέας επιμολύνθηκε σε Platinum συσκευασίας ρετροϊικού κυττάρων [25], και ο ρετροϊός συλλέγεται από το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Σταθερά επιμολυσμένα επελέγησαν με G418 (Geneticin? Promega, Madison, WI, USA), και η συσσώρευση ZsGreen-degronODC πρωτεΐνη (Gdeg) παρακολουθήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού και κυτταρομετρία ροής (κανάλι FITC). Για την επαλήθευση σταθερή επιμόλυνση, τα κύτταρα εκτέθηκαν στον αναστολέα πρωτεασώματος MG-132 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) για 12 ώρες. μικροσκοπία φθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας AxioObserver (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany), και οι εικόνες αποκτήθηκαν ψηφιακά χρησιμοποιώντας λογισμικό AxioVision (Carl Zeiss).

In vitro προσδιορισμούς μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής

Η διπλή δοκιμασία μετανάστευσης -chamber διεξήχθη με τη χρήση ενός θαλάμου Transwell [26] (πλάκα 24-φρεατίων, 8-μm πόρους? BD Biosciences, Canaan, CT, USA). Για τη δοκιμασία εισβολής, επικαλυμμένα με Matrigel (BD Biosciences) transwells (0.1 mg /mL) παρασκευάστηκαν με επώαση σε μέσο χωρίς ορό για 2 ώρες στους 37 ° C σε 24-φρεατίων. Η κάτω θάλαμος γέμισε με 0.8 mL μέσο καλλιέργειας χωρίς αντιβιοτικά. Στη συνέχεια, DCLK1 υψηλή έκφραση, άγριου τύπου, Gdeg

υψηλή, και Gdeg

υψηλής siDCLK1 κύτταρα όγκου (8 × 10

4 σε 0.3 mL μέσο χωρίς ορό) σπάρθηκαν εντός του άνω θαλάμου και επωάζεται στους 37 ° C για 24 ώρες. Τα καρκινικά κύτταρα στην άνω επιφάνεια του φίλτρου απομακρύνθηκαν με τη χρήση ενός μάκτρο βαμβάκι. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη και χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa, και ο αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν ή εισβάλλουν μέσα στην κάτω επιφάνεια μετρήθηκε σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία υψηλής μεγέθυνσης (100 Χ) για κάθε δείγμα. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

μικροσυστοιχιών ανάλυση

Για την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης, 2 × 10

5 πρόσφατα ταξινομηθεί Gdeg

υψηλή και Gdeg

χαμηλή κύτταρα KLM1 ήταν μεταχειρισμένος. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από κάθε κυτταρικό τύπο με QIAZOL, μια RNeasy Micro Kit, και στήλες σπιν QIAshredder (QIAGEN, Hilden, Germany). Η ακεραιότητα του RNA που ελήφθη εκτιμήθηκε με φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-100 (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA), ένα 2100Bioanalyzer, και ένα Kit RNA6000Pico (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Σύμφωνα με την GeneChip®3’IVT Express Kit, πρωτόκολλο P /N702646 Rev.7 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), συμπληρωματικό DNA παρασκευάστηκε από 100 ng συνολικού RNA χρησιμοποιώντας επισήμανση στόχος ενός κύκλου και ένα κιτ αντιδραστηρίου ελέγχου (Affymetrix). Ο υβριδισμός και το σήμα ανίχνευσης του HG-U133 Plus 2.0 συστοιχίες (Affymetrix) πραγματοποιήθηκαν. Τα σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών της Gdeg

υψηλή και Gdeg

χαμηλή κύτταρα ομαλοποιούνται και σχολιασμένο με Έκφραση Κονσόλα Λογισμικό ™ (Affymetrix). Εκτιμώμενο επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ελήφθησαν ως τιμές log2-μεταμορφωθεί. Γονίδια εξαιρέθηκαν από την ανάλυση αν η κλήση ανίχνευσης ήταν «περιθωριακή» ή «απούσα» και στις δύο Gdeg

υψηλή και Gdeg

χαμηλή κύτταρα.

κατασιγάσει και υπερέκφραση του

DCLK1

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) που στοχεύουν τα υποψήφια γονίδια και ομελέτα siRNAs (siScr) δεν ταιριάζουν όλα τα ανθρώπινα γονίδια αγοράστηκαν από την Invitrogen. Φρέσκο ​​ταξινομημένο Gdeg

υψηλής κύτταρα (τόσο KLM1 και BxPC3) σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2,0 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων σε 2 κ.εκ. μέσου καλλιέργειας. Στη συνέχεια, η επιμόλυνση με siRNA διεξήχθη με χρήση RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [27]. Μετά την επιμόλυνση με διάφορες συγκεντρώσεις (10 ηΜ, 20 ηΜ), τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C σε ένα 5%

2 ατμόσφαιρα CO. Ο αριθμός των βιώσιμων και μη βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκε με αυτόματο μηχάνημα μέτρησης κυττάρων χρησιμοποιώντας αποκλεισμό κυανού τρυπανίου χρωστική (CYTORECON? Hirata, Tokyo, Japan). Στο χρονικό σημείο των 48 ωρών μετά την επιμόλυνση siRNA, κύτταρα αποκολλήθηκαν από κάθε πλάκα που θα χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω πειράματα. Οι αλληλουχίες στόχοι siRNA ήταν εκείνες από τις οθόνες RNAi υψηλής περιεκτικότητας γονιδιώματος σε επίπεδο [28]. Για την κατασκευή του φορέα έκφρασης shRNA (pSilencer

TM 2,1-U6 puro? Invitrogen) [29], τα κύτταρα KLM1-Gdeg (2.0 × 10

5) επιμολύνθηκαν με 2.5 μg πλασμιδίου με Lipofectamine2000 (Invitrogen). Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2 ημέρες, και σταθεροί μεταγωγείς απομονώθηκαν με επώαση σε μέσο που περιείχε 400 μg /mL πουρομυκίνη. Για να δημιουργήσετε παροδική καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν DCLK1, χρησιμοποιήσαμε pCMV6-AC-GFP (RG217050 TrueORF

TM cDNA κλώνοι και PrecisionShuttle

TM Vector System, ΟηΟεηε Technologies, Rockville, MD, USA). κύτταρα KLM1 επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine2000 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 48 ώρες, GFP-θετικά κύτταρα ταξινομήθηκαν για περαιτέρω πειράματα.

In vivo μελέτες της ογκογονικότητας και μετάστασης

Θηλυκά NOD.CB17-PRkdcScid /J ποντικούς, ηλικίας 5-6 εβδομάδων, αγοράστηκαν από την Charles River Laboratory (Kanagawa, Ιαπωνία). Η χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία ισοφλουράνιο που παρέχεται από τη μύτη κώνου εισπνοή. Διάφορες ποσότητες ταξινομημένα κύτταρα (1 × 10

2 προς 1 × 10

5 Gdeg

υψηλής KLM1 και Gdeg

χαμηλής KLM1? 1 × 10

2 προς 1 × 10

4 Gdeg

υψηλής BxPC3 και Gdeg

χαμηλής BxPC3) αναμίχθηκαν με Matrigel, και 100 μL εγχύθηκε υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές των ποντικών. σχηματισμός όγκων παρακολουθήθηκε στη συνέχεια κάθε 4 ημέρες για έως 10 εβδομάδες. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: όγκος = (μήκος) χ (πλάτος)

2/2. Κάθε ομάδα αποτελούνταν από 4-6 ποντικούς. Για την ανάλυση ηπατικών μεταστάσεων, το κοιλιακό δέρμα και τους μύες, περίπου 5 mm σε μήκος, οι χαραγμένοι ακριβώς έξω από τη μεσαία γραμμή. Η σπλήνα εξωτερικεύεται μέσω της τομής εφαρμόζοντας ήπια έλξη, και τα ταξινομημένα κύτταρα (Gdeg

υψηλής KLM1, Gdeg

με χαμηλό KLM1 και Gdeg

υψηλής KLM1-shDCLK1, Gdeg

υψηλής BxPC3 και Gdeg

χαμηλής BxPC3? n = 6), διακόπτεται στη 1 × 10

6 κύτταρα ανά 100 μL PBS, εγχύθηκαν ακριβώς κάτω από την κάψουλα του κάτω πόλου χρησιμοποιώντας μια σύριγγα φυματίνης με βελόνα 30-gauge . Αιμόσταση αποκτήθηκε με την εφαρμογή απαλή πίεση (με μαλλί μπατονέτα) στο σημείο της ένεσης. Η σπλήνα ακολούθως επέστρεψε στην περιτοναϊκή κοιλότητα, και η κοιλία έκλεισε με τη χρήση δύο 6-0 μεταξωτά ράμματα τόσο μέσω του δέρματος και των μυών ταυτόχρονα [30, 31]. Παρατηρήσαμε αυτά τα ποντίκια για 8 εβδομάδες, και στη συνέχεια να διερευνηθεί κατά πόσον η μετάσταση είχε συμβεί [32]. Όλες οι in vivo διαδικασίες σε αυτή τη μελέτη είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου (άδεια No.0150044A).

Ασθενείς και δείγματα

Είμαστε εγγεγραμμένοι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε πρωτογενή και μεταστατικό (ήπαρ και τους πνεύμονες) εκτομή του όγκου για αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου στο Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου Νοσοκομείο μεταξύ των δειγμάτων Paired 2005 και 2013. χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις ανοσοϊστοχημική. Εκτομή ιστού μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 10% και ενσωματωμένα σε παραφίνη για ιστοπαθολογική ανάλυση σύμφωνα με τους γενικούς κανόνες για την κλινική και παθολογική μελέτη του πρωτοπαθούς καρκίνου του παγκρέατος. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Τόκιο Ιατρική και Οδοντιατρική του Πανεπιστημίου (Άδεια No.1080) και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι τιμές παρουσιάζονται ως ο μέσος ± SD εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. t-test δύο ουρών Student (για σύγκριση ανάμεσα σε ομάδες) ή μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (για σύγκριση τριών ή περισσότερων ομάδων) που ακολουθείται από Dunnett

post-hoc

τεστ χρησιμοποιήθηκαν για στατιστικές αναλύσεις. SPSS έκδοση λογισμικού 21.0 (SPSS, Chicago, IL) χρησιμοποιήθηκε. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Οπτικοποιούνται παγκρέατος ΚΕΠ είναι ιδιαίτερα ικανά μετάσταση στο ήπαρ

Σταθερή επιμόλυνση του ρεπόρτερ Gdeg σε δύο ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος γραμμές με διαφορετικές ογκογόνο δυναμικό της μετάστασης? KLM1 ως υψηλής ικανότητα των κυττάρων με μεταλλαγμένο KRAS, και BxPC3 όπως χαμηλή ικανότητα των κυττάρων με άγριου τύπου KRAS [33-35]. ΚΕΠ επισημαίνονται με δημοσιογράφο επέδειξε Gdeg

υψηλή πληθυσμιακή που αντιπροσωπεύουν περίπου το 1,0% του συνολικού αριθμού των κυττάρων (S1 Σχήμα). Στη δοκιμασία για το σχηματισμό σφαίρα [36], ο αριθμός των σφαιρών (& gt? 50 μm σε διάμετρο) που προέρχονται από Gdeg

υψηλής κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη του Gdeg

χαμηλή κυττάρων (ρ & lt? 0,01, Σχήμα 1Α και 1Β). Αυξημένη ογκογονικότητα ίη νίνο έχει επίσης χρησιμοποιηθεί ως ένα κομμάτι των κρίσιμων στοιχείων για την ύπαρξη των ΚΕΠ [4]. Έτσι, ένα ταξινομημένο πληθυσμός του Gdeg

υψηλή ή Gdeg

χαμηλή κυττάρων εγχύθηκε υποδορίως σε NOD ποντίκια /SCID. Για Gdeg

υψηλής κύτταρα που προέρχονται τόσο από τις κυτταρικές σειρές KLM1 και BxPC3, επιβεβαιώσαμε την εξαιρετικά κακοήθους δυναμικού (S2 σχήμα). Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές KLM1 και BxPC3, Gdeg

υψηλής κύτταρα είχαν σημαντικά μεγαλύτερη ικανότητα να μεταναστεύουν και να εισβάλλουν από Gdeg

χαμηλή κύτταρα σε έναν προσδιορισμό διπλού θαλάμου (p & lt? 0.01, Σχήμα 1Γ και 1Δ). Για να διερευνήσουν κατά πόσο τα κύτταρα Gdeg διαμεσολαβούν μετάσταση in vivo, Gdeg

υψηλή ή Gdeg

χαμηλή κύτταρα εγχέεται σπλήνες NOD /SCID ποντίκια (n = 6). Μετά από 8 εβδομάδες, επιβεβαιώθηκε οπτικά την παρουσία όγκων στο σπλήνα και μετρήθηκαν ο αριθμός των μεταστάσεων ήπατος. Βρήκαμε πολύ περισσότερο συκώτι μεταστατικούς όγκους στο Gdeg

υψηλή ομάδα από ό, τι στην ομάδα χαμηλού Gdeg

(p & lt? 0,05? Gdeg

υψηλής KLM1 κύτταρα, 5.3 ± 3.4 όγκους σε σχέση με Gdeg

χαμηλής κύτταρα KLM1, 0 ± 0 όγκους, ρ & lt? 0,01? Gdeg

υψηλής BxPC3 κύτταρα, 13,6 ± 5,1 όγκων έναντι Gdeg

χαμηλής BxPC3 κύτταρα, 2,2 ± 2,8 όγκοι) (Σχ 2Α και 2Β, 2F και 2G ). Παρατηρήσαμε επίσης κάποιες μικρο-μεταστάσεις στο ήπαρ των Gdeg

υψηλή ομάδες (Σχήμα 2C και 2Η), αλλά οφείλουμε να παρατηρήσουμε ότι δεν μεταστατικών όγκων παρατηρήθηκαν σε ποντίκια με ένεση Gdeg

με χαμηλό KLM1 κύτταρα. Ανάλυση ανοσοφθορισμού σαφώς αποκάλυψε Gdeg

υψηλής κύτταρα που εντοπίστηκαν στα περιθώρια του όγκου (Σχήμα 2D και 2Θ). Το ποσοστό των Gdeg

υψηλής κύτταρα στην περιοχή του περιθωρίου όγκου (MA? 200 μm) ήταν πολύ υψηλότερη από ότι στην κεντρική περιοχή του όγκου (CA) (Gdeg

υψηλής KLM1 όγκου? 26.1 ± 4.2% έναντι 4.1 ± 2,5%, Gdeg

υψηλής BxPC3 όγκου, 21,0 ± 1,9% έναντι 4,1 ± 0,2%, p & lt? 0,01) (Σχήμα 2Ε και 2J). Όπως και στην προηγούμενη μελέτη [11], τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι η ΚΕΠ έτειναν να εισβάλει περαιτέρω εκτός του όγκου.

(Α) Εκπρόσωπος μικροσκοπικές εικόνες από σφαίρες φαίνονται. Gdeg

υψηλής KLM1 και Gdeg

κύτταρα υψηλής BxPC3 σχηματίζεται πλήρης σφαίρες, αλλά Gdeg

με χαμηλό KLM1 και Gdeg

με χαμηλό BxPC3 κύτταρα δεν το έκανε. μπαρ κλίμακα, 50 μm. (Β) Ο αριθμός των σφαιρών (& gt? 50 μm σε διάμετρο) που παρατηρείται σε κάθε πηγάδι (n = 6). Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD. ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με Gdeg

υψηλή. t-test των δύο όψεων του Student για τη σύγκριση δύο ανεξάρτητες ομάδες. (Γ και Δ), της μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής αναλύθηκαν με μια δοκιμασία διπλού θαλάμου χρησιμοποιώντας Gdeg

υψηλής KLM1, Gdeg

με χαμηλό KLM1, Gdeg

υψηλής BxPC3, και Gdeg

χαμηλής BxPC3 κύτταρα. Αντιπροσωπευτικά μικροσκοπικές εικόνες. Ποσοτικοποίηση της μετανάστευσης και εισβολής παρουσιάζεται ως μέσος όρος ± SD για τρία ανεξάρτητα πειράματα. ** P & lt?. 0.01 σε σύγκριση με Gdeg

υψηλής κύτταρα

οι

(Α και F) Εκπρόσωπος του ήπατος μεταστατικοί όγκοι εμφανίζονται σε ποντίκια οκτώ εβδομάδων μετά την ένεση. (Β και G) ιστόγραμμα δείχνει τον μέσο αριθμό των όγκων στο ήπαρ (η = 6? Μέση ± SD). Και για τις δύο κυτταρικές σειρές, βρήκαμε μια σημαντική διαφορά μεταξύ των Gdeg

υψηλή και Gdeg

χαμηλή κύτταρα. * Ρ & lt? 0.05 στο (Β) και ** ρ & lt? 0,01 σε (G). (Γ και H) Μικροσκοπική εικόνες ήπατα που αποκόπηκαν, τεμαχίστηκαν, και χρωματίστηκαν με Η &? Ε απεικονίζονται. Μερικές μικρο-όγκοι ήταν παρόντες στο ήπαρ. μπαρ κλίμακα, 1000 μm. (D και Ι) φθορισμού μικροσκοπικές εικόνες του κύριου όγκου παρουσιάζεται. Και για τις δύο κυτταρικές σειρές, Gdeg

υψηλής κύτταρα εντοπίζονται κατά προτίμηση στα εισβολή περιθώρια όγκου. μπαρ κλίμακα, 200 μm. μεγεθύνονται εικόνες των εγκιβωτίζονται περιοχές δείχνονται. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (Ε και J) Το γράφημα δείχνει ότι το ποσοστό των Gdeg

υψηλής κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη στην οριακή περιοχή (MA) σε σχέση με την κεντρική περιοχή (CA? Μέση τιμή ± SD). ** P & lt? 0,01. Μετρήσαμε τρεις διαφορετικές περιοχές για κάθε περιοχή.

Η

Η υπερέκφραση του DCLK1 σε συνεργασία με την τροποποίηση των ιστονών είναι υπεύθυνη για την επεμβατική δυναμικό του παγκρέατος ΚΕΠ

Για να αποσαφηνίσει τις επεμβατικές και μεταστατικό δείκτες του παγκρέατος ΚΕΠ, συγκρίναμε τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης μεταξύ Gdeg

υψηλής κύτταρα και Gdeg

χαμηλή κύτταρα με μικροσυστοιχίες υβριδισμού (S1 Data). ανάλυση Scatterplot των 25.572 ανιχνευτές για την οποία η κλήση ανίχνευσης ήταν «παρών» έδειξε ότι 483 γονίδια ρυθμίζεται προς τα πάνω και 1.138 γονίδια ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά περισσότερο από 2 φορές σε Gdeg

υψηλής KLM1 κύτταρα σε σύγκριση με Gdeg

χαμηλής KLM1 κύτταρα. Με βάση την κατάταξη φορές αλλαγή στις Gdeg

υψηλής κύτταρα (Πίνακας 1), siRNA διαλογής για υποψήφια γονίδια αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα ανασταλτικά αποτελέσματα επί Gdeg

μετανάστευση υψηλή κυτταρική και εισβολή χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία διπλού θαλάμου. Κατά συνέπεια, μόνον το siRNA κατά DCLK1 μειώθηκαν σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε σύγκριση με ελέγχους και στις δύο KLM1 και BxPC3 Gdeg

υψηλής κύτταρα (ρ & lt? 0,01, Σχήμα 3Α και 3Β). DCLK1 ταυτοποιήθηκε ως ένα μόριο-στόχο που υπερεκφράζεται σε Gdeg

υψηλής κύτταρα με τη μετανάστευση και την επεμβατική ικανότητα σε σύγκριση με Gdeg

χαμηλή κύτταρα. QRT-PCR και Western αναλύσεις κηλίδωσης αποκάλυψε ότι DCLK1 mRNA και η πρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε Gdeg

υψηλής κύτταρα, αλλά όχι σε Gdeg

χαμηλή κύτταρα (S3 Εικ). Η ανοσοκυτταροχημική ανάλυση έδειξε DCLK1 πρωτεΐνη εντοπισμένη κυρίως στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 4Α και 4Β), και μειωμένη έκφραση DCLK1 επιβεβαιώθηκε με τη χρήση siRNA (S3 Σχ, Σχήμα 4C και 4D). Στη συνέχεια, εξετάσαμε επιγενετική πτυχές του

DCLK1

έκφραση διεξάγοντας ανοσοκαθίζηση χρωματίνης (μάρκας) ανάλυση των τριών βασικών δεικτών ιστόνης μεθυλίωση, H3K4me3, H3k9me3, και H3K27me3, στις δύο κυτταρικές σειρές Gdeg. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Ε, Gdeg

υψηλής κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα H3K4me3, η οποία συνδέεται με την ενεργό υποκινητές, από H3K27me3, η οποία συνδέεται με αθόρυβη προαγωγούς. Gdeg

χαμηλή κύτταρα ήταν σχεδόν δισθενή. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι

DCLK1

έκφραση σε κυτταρικές σειρές Gdeg ρυθμιζόταν από ιστόνης τροποποίηση των H3K4 και H3K27. Εμείς δεν βρήκε καμία διαφορά στα επίπεδα H3K9me3 μεταξύ Gdeg

υψηλή και Gdeg

χαμηλά σε αυτές τις κυτταρικές σειρές.

(Α) δοκιμασία διπλό θάλαμο της μετανάστευσης και της εισβολής και για τα δύο

υψηλή κυτταρικές σειρές Gdeg μετά τη θεραπεία. Αντιπροσωπευτικά μικροσκοπικές εικόνες. (Β) Ο αριθμός των μεταναστεύουν και εισβάλλουν κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο ήταν εντυπωσιακά καταστέλλεται και στις δύο Gdeg

υψηλής siDCLK1 κυτταρικές σειρές. #not σημαντική, ** ρ & lt?. 0.01, με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης ακολουθούμενη από τεστ Dunnett πολλαπλής σύγκρισης

Η

(Α και Β) Ανοσοκυτταροχημική αναλύσεις DCLK1 στις δύο κυτταρικές σειρές (αρχική μεγέθυνση × 200) δείχνονται. Gdeg

υψηλής κύτταρα εξέφρασαν DCLK1 πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, αλλά Gdeg

χαμηλή κύτταρα έδειξαν μόνο ασθενή έκφραση. μπαρ κλίμακα, 10 μm. (Γ και Δ) Ανοσοκυτταροχημική ανάλυση των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με

DCLK1

-ειδικές siRNA απεικονίζεται (αρχική μεγέθυνση χ 200). έκφραση της πρωτεΐνης DCLK1 μειώθηκε σε Gdeg

υψηλής κυττάρων μετά από επιμόλυνση με siDCLK1. μπαρ κλίμακα, 20 μm. (Ε) ανάλυση τσιπ εμφανίζεται. Και οι δύο Gdeg

υψηλή κυτταρικές γραμμές έντονα εμπλουτισμένα για H3K4me3 σε σύγκριση με H3K27me3 στο

DCLK1

περιοχή του υποκινητή. Ιστονών Η3 και IgG χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες για ανάλυση ChIP, αντίστοιχα.

Η

DCLK1 προωθεί μορφολογικές αλλαγές, η μετανάστευση και την εισβολή στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Για να διερεύνηση του ρόλου της DCLK1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, υιοθετήσαμε μια στρατηγική κέρδος-of-λειτουργία με τη χρήση κυττάρων KLM1 που παροδικά υπερεκφράζεται GFP-tagged DCLK1. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για νευρωνικές κυτταρικές γραμμές, ανάλυση ανοσοφθορισμού των KLM1-DCLK1-GFP κατέδειξε επικαλυπτόμενα πρότυπα έκφρασης DCLK1 με μικροσωληνίσκους με τη χρήση ενός α-τουμπουλίνης αντίσωμα [37] (Σχήμα 5Α). Η λειτουργία του DCLK1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μπορεί έτσι να είναι για τον έλεγχο της δράσης των μικροσωληνίσκων. Κίνηση και μορφολογικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων τέντωμα ψευδοπόδια ήταν σαφώς παρατηρήθηκαν σε time-lapse μικροσκοπικές εικόνες (Σχήμα 5Β). Κατά τη διάρκεια μιας περιόδου παρατήρησης 15 ωρών, η απόσταση μετανάστευση κυττάρων KLM1-DCLK1-GFP ήταν μεγαλύτερη από εκείνη των κυττάρων KLM1 άγριου τύπου (ρ & lt? 0,01, Σχήμα 5C). Στην δοκιμασία διπλού θαλάμου, ο αριθμός των μεταναστεύουν και εισβάλλουν κύτταρα KLM1-DCLK1-GFP ήταν υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων KLM1 άγριου τύπου (ρ & lt? 0,01, Σχήμα 5D). Επιπλέον, τα κύτταρα KLM1-DCLK1-GFP trans-βρίσκεται μέσω ταχύτατα εναλλασσόμενο κύκλους των μορφολογικών διαστολής και συστολής ονομάζεται amoeboid μετανάστευση (S1 Video) [38].

(Α) Ανοσοκυτοχημική ανάλυση έδειξε ότι DCLK1 ήταν κατά κύριο λόγο συνεργασία εντοπισμένη με α-τουμπουλίνης στα κύτταρα KLM1-DCLK1-GFP. μπαρ κλίμακα, 20 μm. μεγεθύνονται εικόνες των εγκιβωτίζονται περιοχών φαίνεται στη δεύτερη σειρά. μπαρ κλίμακα, 10 μm. (Β) κύτταρα Τέσσερις KLM1-DCLK1-GFP παρατηρήθηκαν με time-lapse φωτογραφία για 15 ώρες. Υιοθέτησαν ένα amoeboid μορφολογία όπως μετακινηθεί. μπαρ κλίμακα, 20 μm. Μια μεγεθυμένη εικόνα των περιοχών κουτιά δείχνεται στη γωνία. Λευκή βέλη σήμα τέντωμα ψευδοπόδια. μπαρ κλίμακα, 10 μm. Μετρήθηκαν τα ίχνη τους (εμφανίζονται ως κόκκινες διακεκομμένες γραμμές). (Γ) ιστόγραμμα δείχνει την μέση απόσταση της μετανάστευσης για κύτταρα φυσικού τύπου KLM1 (κύτταρα ελέγχου) και κύτταρα KLM1-DCLK1-GFP (η = 4 το καθένα, σημαίνουν ± SD). κύτταρα KLM1-DCLK1-GFP μετανάστευσε σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι τα κύτταρα ελέγχου. ** P & lt? 0,01. (Δ) Ο αριθμός των μεταναστεύουν και εισβάλλουν κύτταρα KLM1-DCLK1-GFP ήταν επίσης υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου. ** P & lt?. 0.01

Η

DCLK1 νοκ ντάουν οδηγεί σε μείωση του μεταστατική ικανότητα των παγκρεατικών ΚΕΠ

Για να επιβεβαιώσετε την in vivo απώλεια-του-λειτουργία ανάλυσης, σταθερά νοκ ντάουν της DCLK1 αξιολογήθηκε σε κύτταρα Gdeg-KLM1 χρησιμοποιώντας το

DCLK1

shRNA. Η ποιότητα της διαμόλυνσης επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR, κηλίδωση Western και ανοσοκυτταροχημικές αναλύσεις (Σχήμα 6Α-6C). Ο πληθυσμός του shDCLK1-Gdeg

κύτταρα υψηλής KLM1 ήταν μικρότερη από 0,5% του συνολικού αριθμού των κυττάρων (S1 Εικ). Ενέσαμε προσφάτως ταξινομημένο shDCLK1-Gdeg

κύτταρα υψηλής KLM1 σε σπλήνες NOD /SCID ποντίκια (η = 6). Σημαντικές ηπατικές μεταστάσεις ανιχνεύθηκαν μετά την ένεση του ελέγχου Gdeg

υψηλής κύτταρα, αλλά κατά τρόπο ενδιαφέροντα, δεν μεταστατικές αλλοιώσεις εντοπίστηκαν μετά την ένεση του shDCLK1-Gdeg

υψηλής κύτταρα, όπως προσδιορίζεται με μακροσκοπική και μικροσκοπική εξέταση (Σχ 6D). Αυτά τα αποτελέσματα να εννοηθεί ότι DCLK1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην μετάσταση στο ήπαρ σε ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος.

(Α και Β)

DCLK1

-ειδικές shRNA (shDCLK1) μειώθηκε σημαντικά DCLK1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε Gdeg

υψηλής KLM1 κύτταρα. ** P & lt? 0,01. (Γ) Μια σημαντική μείωση της DCLK1 ανοσολογική αντίδραση παρατηρήθηκε μετά από επιμόλυνση με shDCLK1 σε σύγκριση με Gdeg

υψηλή (ελέγχου). μπαρ κλίμακα, 20 μm. (D) Ορισμένοι όγκοι κατά μήκος της άκρης του ήπατος ήταν ορατά στο Gdeg

ομάδα υψηλού KLM1, αλλά δεν παρατηρήθηκαν όγκοι παρατηρήθηκαν στην shDCLK1-Gdeg

υψηλή ομάδας. Ο μέσος αριθμός των όγκων στο ήπαρ (η = 6 ποντικοί) που εμφανίζεται (μέση τιμή ± SD). Παρατηρήσαμε μια σημαντική διαφορά μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας shDCLK1. * P & lt?. 0.05

Η

κυρίαρχη έκφραση της DCLK1 σε μεταστατικούς όγκους είναι κλινικά αναγνωριστεί σε ασθενείς με παγκρεατικό καρκίνο

Μεταξύ 135 ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή 2005-2013 στην νοσοκομείο μας, έξι μεταστατικοί όγκοι αποκόπηκαν συγχρονισμένα ή metachronously. Αυτά τα έξι ζεύγη των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων εκτιμήθηκαν για την έκφραση του DCLK1. Πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκοι αποκόπηκαν συγχρονισμένα σε τρεις περιπτώσεις, και πρωτογενείς όγκους και metachronous απομακρυσμένων μεταστάσεων ξεχωριστά εκτομή στις άλλες τρεις περιπτώσεις (Πίνακας 2). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα καρκινικά κύτταρα που είχαν θετική χρώση για DCLK1 πρωτεΐνη σπάνια ανιχνεύεται σε πρωτογενείς όγκους, αλλά ήταν σαφώς ανιχνεύθηκαν σε μεταστατικούς όγκους (Σχήμα 7Α-7Ρ), και σε όλες τις περιπτώσεις, η βαθμολογία χρώσης ήταν υψηλότερη σε μεταστατικούς όγκους σε σχέση με πρωτοπαθείς όγκους (Σχήμα 7G). Στις περιπτώσεις 5 και 6 ειδικότερα, οι πρωτογενείς όγκοι εντελώς εκτομή και δεν έγινε καμία τοπική υποτροπή. Ωστόσο, ακόμη και αν αυτοί οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με επικουρική χημειοθεραπεία, μακρινή μετάσταση εμφανίστηκε. Στις δύο αυτές περιπτώσεις, η έκφραση DCLK1 ήταν πολύ υψηλότερη στο μεταστατικού όγκου από ό, τι στον πρωτογενή όγκο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι μεταστατικούς όγκους είναι ανθεκτικά στην συμβατική χημειοθεραπεία και ότι DCLK1 είναι ένας δείκτης του μεταστατικών όγκων.

(Α, C, και Ε) κατά την πρωτογενή αλλοιώσεων, λίγα καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά για DCLK1, και η χρώση ένταση ήταν αδύναμη (αριστερά? 100 ×, σωστά? 400 ×). (Β, D, και F) Σε μεταστατικών βλαβών (ήπατος ή πνεύμονα), ο αριθμός των DCLK1 κυττάρων που εκφράζουν ήταν υψηλότερη από ό, τι σε πρωτογενείς όγκους, και η ένταση της χρώσης ήταν ισχυρότερη (αριστερά? 100 ×, δεξιά? 400 ×). (Ζ) Σύγκριση των βαθμολογιών ανοσοχρώση μεταξύ πρωτογενών βλαβών και μεταστατικών βλαβών. Σε όλες τις έξι κλινικά δείγματα, DCLK1 ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε μεταστατική βλάβη από ό, τι στην κύρια βλάβη.

Η

Συζήτηση

DCLK1 αποτελείται από ένα Ν-τελικό άκρο που είναι 65 % παρόμοια με doublecortin (DCX) σε όλο το μήκος του DCX, αλλά DCLK1 περιέχει επίσης επιπλέον 360 αμινοξέα στο Ο-τερματικό τομέα, δημιουργώντας ένα υποθετικό Ca

2 + /καλμοδουλίνη κινάση πρωτεΐνης.

DCLK1

βρίσκεται στην περιοχή του χρωμοσώματος 13q13.3 [37]. Η

DCX

γονίδιο, το οποίο βρίσκεται στο χρωμόσωμα περιοχή Xq23, είναι μια σχετιζόμενη με μικροσωληνάριο πρωτεΐνης που απαιτείται για μετανάστευση των νευρικών προγονικών κυττάρων στον εγκεφαλικό φλοιό.

Μεταλλάξεις σε DCX οδηγούν σε φλοιώδη ελαττώματα πλαστικοποίηση στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο που καλούνται υποφλοιώδη ετεροτοπία μπάντα στα θηλυκά και κλασική lissencephalies στους άνδρες [39]. Μια προηγούμενη μελέτη το ποντίκι στο οποίο DCLK1 και /ή DCX χτυπήθηκε έξω αποκάλυψε ότι και οι δύο πρωτεΐνες έχουν γενετικά αντισταθμιστικά ρόλο στην νευρωνική μετανάστευση? Δηλαδή, οι

DCLK1

γονίδιο λειτουργίες σε ένα μερικώς περιττή μονοπάτι με DCX στο σχηματισμό αξονικών προεξοχών σε όλη τη μεσαία γραμμή και τη μετανάστευση των νευρώνων [40]. Βρήκαμε ότι υπερεκφράζεται DCLK1 προάγει τη μετανάστευση και την εισβολή σε κυτταρικές σειρές, και knockdown καταστέλλει αυτές τις ικανότητες. Εμείς εξέτασε προσεκτικά πώς τα αποτελέσματά μας σχετικά με DCLK1 ταιριάζει με τα αποτελέσματα του παρελθόντος σχετικά με μια νευρωνική ρόλο για DCLK1. Υπάρχουν αποδείξεις για την πιθανή εμπλοκή των γονιδίων καθοδήγησης άξονα σε παγκρεατικά καρκινογένεση [41], και τα αποτελέσματα αυτά είναι συνεπή με τα ευρήματα μας ότι εκφράζεται υψηλά DCLK1 είναι στενά συνδεδεμένη με την εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του παγκρέατος. Επιγενετική έλεγχος της έκφρασης των γονιδίων παίζει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της κυτταρικής τύχης. Ειδικότερα, η δομή της χρωματίνης ανώτερης τάξης αναδεικνύεται ως σημαντικός ρυθμιστής της διαφοροποιήσεως των βλαστικών κυττάρων [8], περιλαμβανομένης ακόμη και του παγκρέατος ανάπτυξης [42]. Κατά τη διάρκεια της επαγωγής της πλειοδυναμίας, κατάλληλων χρωματίνης αναδιαμόρφωση απαιτείται για έκφραση των γονιδίων των βλαστικών κυττάρων-ειδική. Επιπλέον, αρκετές μελέτες σε όγκους του εγκεφάλου, του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και καρκίνων του μαστού έχουν δείξει ότι η τροποποίηση των ιστονών είναι υπεύθυνη για την ιεραρχική δομή που περιλαμβάνει καρκινικά βλαστικά κύτταρα στην κορυφή [43-45]. Rheinbay

et al

. ανέφεραν την απώλεια H3K27me3 ενεργοποιεί μια οδό σηματοδότησης που απαιτούνται για τη συντήρηση και ογκογονικότητας ΚΕΠ γλοιοβλαστώματος [43]. Νοκ ντάουν της H3K20 μεθυλοτρανσφεράση PR-SET7 στο ήπαρ που προκαλείται από την αυθόρμητη ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος με ιδιότητες καρκίνο βλαστικών κυττάρων [44]. Westcott

et al

. ανέφερε ένα επιγενετικώς διακριτές υποπληθυσμό των νεοπλασματικών κυττάρων του μαστού με μια ενισχυμένη ικανότητα να εισβάλλουν συλλογικά [45]. Σε αυτή τη μελέτη, την ανάλυση ChIP αποκάλυψε ότι το

DCLK1 Ιστοσελίδα έναρξης της μεταγραφής και στις δύο Gdeg

υψηλή κυτταρικές σειρές ήταν πιο έντονα που σημειώνονται με τροποποίηση των ιστονών για την ενεργοποίηση γονιδίων (H3K4me3) από την καταστολή (H3K27me3).