Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά όπως πλευράς πληθυσμού κυττάρων (SP) έχουν εντοπιστεί σε πολλές συμπαγείς όγκους? Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις έρευνες εκτελούνται με τη χρήση καθιερωμένων κυτταρικών γραμμών καρκίνου. Τα καρκινικά κύτταρα σε ιστό όγκου που περιέχει ινοβλάστες και πολλοί άλλοι τύποι κυττάρων είναι πολύ πιο περίπλοκη από ό, τι οποιαδήποτε καρκινική κυτταρική γραμμή. Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα SP εντοπίστηκαν στο λάρυγγα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (LSCC) κυτταρική σειρά Hep-2 σε πιλοτική μελέτη μας, είναι άγνωστο αν ο ιστός LSCC περιέχει κύτταρα SP. Σε αυτή τη μελέτη, τα κύτταρα LSCC (LSCCs) ήσαν πρωτεύοντος καλλιεργούμενου και καθαρίζεται από ένα χειρουργικά δείγμα LSCC προέρχεται από ένα καλά διαφοροποιημένο επιγλωττικού νεόπλασμα του ενός κινεζικού αρσενικό. Αυτό ακολουθήθηκε από την επαλήθευση του επιθηλίου-ειδικά χαρακτηριστικά, όπως υπερδομής και βιοδείκτες. Μια ξεχωριστή υποπληθυσμός SP (4,45 ± 1,07%) απομονώθηκε από την Hoechst ανάλυση 33.342 εκροή από καλλιεργημένα LSCCs με τη χρήση ενός κυτταρομέτρου ροής. Καρκίνος βλαστοκυττάρων (CSC) -associated προσδιορισμούς, συμπεριλαμβανομένων έκφραση της αυτο-ανανέωσης και γονίδια δείκτες CSC, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, σχηματισμό σφαιροειδές, αντίσταση χημειοθεραπεία, και ογκογονικότητα στη συνέχεια διεξήχθησαν μεταξύ SP και μη-SP (NSP) LSCCs.

In vitro

και

in vivo δοκιμασίες

αποκάλυψαν ότι τα κύτταρα SP εκδηλώνεται προτιμησιακή έκφραση της αυτο-ανανέωσης και γονίδια δείκτες CSC, υψηλότερη ικανότητα για πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, και το σχηματισμό σφαιροειδών? αυξημένη αντίσταση στη χημειοθεραπεία? και μεγαλύτερη ογκογονικότητας ξενομοσχεύματος σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια σε σύγκριση με τα κύτταρα NSP. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι πρωτογενείς καλλιεργήθηκαν και καθαρίστηκαν LSCCs περιέχουν καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με SP, το οποίο μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα πολύτιμο υπόδειγμα για την έρευνα CSC σε LSCC

Παράθεση:. Wu CP, Zhou L, Xie Μ, Du HD , Tian J, Sun S, et al. (2013) Ταυτοποίηση των Κυττάρων Stem-όπως ο καρκίνος Side Πληθυσμός σε καθαρισμένο Πρωτοβάθμια Καλλιεργημένα Ανθρώπινα λάρυγγα πλακωδών κυττάρων Καρκίνωμα επιθήλια. PLoS ONE 8 (6): e65750. doi: 10.1371 /journal.pone.0065750

Επιμέλεια: Jian Cao, Stony Brook University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26, Νοεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 29 Απρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα εν μέρει υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30872855) και το Ίδρυμα της Σαγκάης Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (12JC1402101). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος βλαστικά σαν πλευρά πληθυσμός κυττάρων (SP) έχουν επιτυχώς εντοπιστεί σε ένα ευρύ φάσμα συμπαγών όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού [1], [2], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [3] – [7], του πνεύμονα καρκίνος [8], [9], γαστρεντερικό καρκίνο [10] – [12], του καρκίνου του προστάτη [13], ο καρκίνος της χοληδόχου κύστης [14], τον καρκίνο των ωοθηκών [15], του καρκίνου του ενδομητρίου [16], του καρκίνου του παγκρέατος [17], [ ,,,0],18], ουρολογικές καρκίνος [19], [20], γλοιοβλάστωμα [21], το μελάνωμα [22], οστεοσάρκωμα [23], [24], τα μεσεγχυματικά νεοπλάσματα [25], ρινοφαρυγγικό καρκίνο [26], ο καρκίνος του στόματος [27], [28], και άλλους καρκίνους της κεφαλής και του αυχένα [29], [30]. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις έρευνες έχουν διεξαχθεί χρησιμοποιώντας καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Αν και ιδρύθηκε καρκινικές κυτταρικές σειρές είναι χρήσιμα εργαλεία στη βασική και προκλινική έρευνα για τον καρκίνο, είναι απλοποιημένη μιμείται σύνθετων, ετερογενών, στερεά καρκινικούς ιστούς. Τα καρκινικά κύτταρα σε πρωτογενείς ινοβλάστες ιστό όγκου που περιέχουν, τα κύτταρα στρώματος, λεμφοκύτταρα, και άλλοι τύποι κυττάρων είναι πολύ πιο πολύπλοκα από τα κύτταρα σε κάθε καρκινική κυτταρική γραμμή. Ως εκ τούτου, τα πρωτογενή καλλιεργημένα και καθαρίστηκε καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από τα καρκινικούς ιστούς μπορεί να είναι μια καλύτερη αντιπροσώπευση του αρχικού όγκου.

λαρυγγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (LSCC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες της περιοχής κεφαλής και τραχήλου. Τα τελευταία χρόνια, οι ασθενείς LSCC σε προχωρημένο στάδιο έχουν ακόμη την τάση να υποκύψει σε τοποπεριοχική υποτροπής και μακρινή μετάσταση. Καρκίνος βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν SP παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην έναρξη του όγκου, τη συντήρηση, την εξέλιξη, και υποτροπή [31] – [33]. Ως εκ τούτου, η συνεχής έρευνα σχετικά με τα κύτταρα SP για την ανάπτυξη νέων παραγόντων που στοχεύουν καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) χρειάζεται επειγόντως.

πιλοτική μελέτη εντοπίστηκαν καρκινικά βλαστικά-όπως SP κύτταρα μας στην κυτταρική σειρά LSCC Hep-2 [30] . Ωστόσο, είναι άγνωστο αν η LSCC συμπαγούς όγκου περιέχει κύτταρα SP. Σε αυτή τη μελέτη, για πρώτη φορά, χρησιμοποιήσαμε Hoechst ανάλυση 33342 εκροής για τον εντοπισμό των κυττάρων SP απευθείας από καθαρισμένα, πρωτογενή καλλιέργεια, καλά διαφοροποιημένα κύτταρα LSCC (LSCCs) που προέρχεται από ένα κινέζικο αρσενικό ασθενή που υφίσταται λαρυγγεκτομή για επιγλωττικδ καρκίνωμα. Βρήκαμε ότι τα πρωτεύοντα καλλιεργημένα LSCCs περιείχε επίσης μια ξεχωριστή υποπληθυσμό SP, η οποία αντιπροσώπευε 4,45 ± 1,07% του συνόλου των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, από το

in vitro

και

in vivo

δοκιμασίες, μπορούμε τεκμηριωμένο ότι τα κύτταρα SP έτρεφε περισσότερα καρκίνου ιδιότητες του στελέχους-όπως σε σύγκριση με κύτταρα μη-SP (NSP).

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

δείγμα όγκου που λαμβάνεται με την έγκριση της Επιτροπής Δεοντολογίας του μάτια, τα αυτιά, τη μύτη και το λαιμό Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Fudan, Σαγκάη της Κίνας. Υπογραφή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από τον ασθενή. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Ιατρική Πειραματική Επιτροπή Φροντίδας Ζώων της Σαγκάης. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Πληροφορίες ασθενούς

Ο ασθενής ήταν ένα μη επεξεργασμένο 68-year-old κινεζική αρσενικά που είχαν υποβληθεί σε λαρυγγεκτομή για πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα που απορρέουν από την επιγλωττίδα, Στάδιο IVa, T4aN2M0, με βάση την 6η έκδοση της Ένωσης για τη Διεθνή έλεγχο του Καρκίνου (UICC) σύστημα ταξινόμησης ΤΝΜ. Αξίζει να σημειωθεί, ότι δεν έχουν οικογενειακό ιστορικό καρκίνου κεφαλής και τραχήλου, αλλά δεν έχουν μια ιστορία 40-έτους του καπνίσματος και την ιστορία 30 ετών της χρήσης αλκοόλ.

Πρωτοβάθμια Πολιτισμού και καθαρισμός LSCCs

Ένα χειρουργικά δείγμα όγκου βυθίσθηκε σε ψυχρό τριπλό αλατόνερο ρυθμισμένο με αντιβιοτικό με φωσφορικό (PBS) που περιέχει 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και αμφοτερικίνη Β (10 μg /ml) (Invitrogen, Buffalo, ΝΥ, USA), και scissored σε μικρά τεμάχια, τα οποία στη συνέχεια διασπώνται ενζυματικά σε RPMI 1640 που περιέχει κολλαγενάση τύπου IV (Sigma) σε τελική συγκέντρωση 200 U /ml για τουλάχιστον 12 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα και υπόλοιπα θραύσματα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν και αιωρήθηκε σε BEGM ™ (βρογχικό μέσο επιθηλιακών κυτταρικής ανάπτυξης) (Catalog CC-3170? Lonza, Walkersville, MD, USA) συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Το εναιώρημα στη συνέχεια σπείρονται σε τριβλία petri των 60 mm σε μία υγροποιημένη 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Μετά από 3-4 ημέρες επώασης, ορισμένα από τα θραύσματα και κύτταρα προσκολλημένα στο πιάτο? εκείνους που δεν τηρούν πλένονται μακριά πριν ανανεώθηκε το μέσο. Οι ινοβλάστες απομακρύνονται με σύντομη έκθεση σε 0,25% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Invitrogen, Buffalo). Τα καρκινικά κύτταρα σχεδόν συρροή αποκολλήθηκαν με 0,25% θρυψίνη-ΕϋΤΑ και υποκαλλιεργήθηκαν. Τα κύτταρα αποθηκεύονται σε υγρό άζωτο από το πέρασμα 1.

μορφολογική εξέταση και Ανοσοκυτοχημεία

Καλλιεργημένα LSCCs εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης για μορφολογικά χαρακτηριστικά. Για την επικύρωση της επιθηλιακής προέλευσης, LSCCs αυξάνεται για 24 ώρες σε γυάλινες καλυπτρίδες καθηλώθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) επί 10 λεπτά και μετά επωάστηκαν σε 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) /10% φυσιολογικό ορό κατσίκας /0.3% Triton Χ- 100 (Boster, Wuhan, Κίνα) σε θερμοκρασία δωματίου για 40 λεπτά για να εμποδίσει μη ειδικές αλληλεπιδράσεις και διαπερατά τα κύτταρα. Τα μονοκλωνικά αντισώματα κατά της ανθρώπινης κυτοκερατίνης (CK) (pan) (1:50, κλωνοποιήσουν AE1 /AE3? Maixin Biotech, Fuzhou, Κίνα), κυτοκερατίνης 5 (CK5) (1:50, Κατάλογος C0246? Anbo, San Francisco, CA, USA ), και βιμεντίνη (1:50, κλώνος SP20? Maixin Biotech) προστέθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από την προσθήκη δευτερογενούς αντισώματος και επώαση στο σκοτάδι για 1 ώρα στους 37 ° πυρήνες Γ.Η βάφτηκαν με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης (DAPI, Boster, Wuhan, Κίνα). Το δευτερογενές αντίσωμα ήταν Cy3-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας /ανοσοσφαιρίνης κουνελιού (Ig) G βαριές και ελαφριές αλυσίδες (Η + L) ποντικού αντι. (1:100? Jackson, Lancaster, PA, USA)

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία

Ένα σφαιρίδιο που ελήφθη από τα συλλεχθέντα LSCCs στο πέρασμα 2 καθορίστηκε με 2,5% γλουταραλδεΰδη και σταθεροποιούνται στη συνέχεια εις 1% τετροξείδιο του οσμίου. Το δείγμα αφυδατώθηκε μέσω διαβαθμισμένης σειράς αλκοόλη και ενσωματωμένα σε ρητίνη. Εξαιρετικά λεπτές τομές κόβονται, χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο, και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα Philips CM120 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (TEM).

κυτταρομετρητή ροής για την καθαρότητα της Πρωτοβάθμιας Καλλιεργημένα LSCCs

Καλλιεργημένα LSCCs ήταν επεξεργασία με θρυψίνη, πλύθηκαν σε PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 4% PFA για 10 λεπτά, και επωάζονται σε 1% BSA /10% φυσιολογικό ορό κατσίκας /0.3% Triton Χ-100 (Boster) σε θερμοκρασία δωματίου για 40 λεπτά για να καταστούν διαπερατά τα κύτταρα και αποκλεισμό των μη ειδικών αλληλεπιδράσεις. Αυτό ακολουθήθηκε από επώαση σε PBS που περιέχει CK (PAN) -fluorescein ισοθειοκυανικό αντίσωμα (1:500, κλώνος C-11? Sigma) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ροή κυανό ADP κυτταρόμετρο (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Κύτταρα κατεργασμένα με PBS αντί του CK (PAN) χρησίμευσε ως έλεγχος.

Ανίχνευση και Απομόνωση SP και NSP κύτταρα χρησιμοποιώντας Κυτταρομετρία Ροής

Καλλιεργημένα LSCCs σε εκθετική φάση ανάπτυξης ξεπλύθηκαν σε PBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη, και αναστολή σε συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα /ml σε ψυχρό μέσο BEGM. Hoechst 33342 (Sigma) προστέθηκε σε μια τελική συγκέντρωση 5 μg /ml με την παρουσία ή απουσία του verapamil (Sigma) σε 50 μmol /l, προεπωάζονται για 30 λεπτά στους 37 ° C. Αυτό ακολουθήθηκε από μια 90-λεπτη επώαση στο σκοτάδι στους 37 ° C με ανακίνηση διάστημα. Μετά την πλύση, 1 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (Sigma) προστέθηκε σε αποκλείουν τα νεκρά κύτταρα, και τα δείγματα αναλύθηκαν σε μία ροή EPICS ALTRA κυτταρόμετρο (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA).

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Φρέσκο ​​ταξινομημένο SP και LSCCs NSP σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε 0.2 ml μέσου BEGM και μέσου χωρίς ορό (SFM? περιγράφεται στην ακόλουθη δοκιμασία σχηματισμού σφαιροειδές). Κάθε ομάδα επαναλήφθηκε σε 6 φρεάτια, και μέσο χωρίς κύτταρα χρησίμευσαν ως έλεγχος. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση των κυττάρων Μετρώντας Kit-8 (CCK-8? Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) οδηγίες, μετά του κατασκευαστή. Η επώαση διήρκεσε 3 ώρες, και η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν. απορρόφηση Υπεριώδους μετρήθηκε στα 450 nm με αναγνώστη πλακός ενζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR)

αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση ολικού RNA από απομονωμένα SP κύτταρα και NSP χρήση. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίων PrimeScript® RT με gDNA γόμα (Takara, Dalian, Κίνα). Real-time PCR έγινε με την SYBR® Προμίγματα κιτ Ex TaqTM (Takara) σε ένα μέσο Lightcycler 480 (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Ελβετία). Ο θερμικός κύκλος περιελάμβανε αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 30 s. Βήτα-ακτίνη (ACTB) χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. Ο τύπος 2

-ΔΔCT χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η σχετική έκφραση του mRNA του SP έναντι κυττάρων NSP. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Western Blot για CSC Markers

Περίπου 30 μg δειγμάτων πρωτεΐνης από κυτταρολύματα των ταξινομημένων SP και κύτταρα NSP αναλύθηκαν με τη χρήση ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλ θειικού πολυακρυλαμιδίου του νατρίου (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα), ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), και ανιχνεύθηκαν για μία νύχτα με πρωτεύον αντίσωμα (Epitomics, Burlingame, CA, USA) για CD44 (1:1,000 , 1998-1), CD24 (1:500, T3445), CD133 (1:1,000, 3621-1), ABCG2 (1:1,000, 3765-1), BMI1 (1:10,000, 5590-1), Oct4 ( 1:1,000, 2876-1), SOX2 (1:1,000, 2683-1), και Nanog (1:1,000, 3369 με 1). Goat αντι-κουνελιού IgG (Η + L) (1:5,000, Jackson) εφαρμόστηκε στη συνέχεια, που ακολουθείται από ανίχνευση του σήματος χρησιμοποιώντας BeyoECL Plus (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα). ACTB αντίσωμα (1:5,000, R1207-1? Huaan Biotech, Hangzhou, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει την ποσότητα του δείγματος φορτωθεί

Ο πολλαπλασιασμός Δοκιμασία

Κατάταξη σύμφωνα SP και NSP LSCCs σπάρθηκαν ως. περιγράφεται παραπάνω. Τις ημέρες 1, 3, 5, και 7 μετά τη διαλογή, την ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση της CCK-8, ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η επώαση διήρκεσε 3 ώρες, και η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν. απορρόφηση Υπεριώδους μετρήθηκε στα 450.

Δοκιμασία Διαφοροποίησης

Απομονωμένα SP και τα κύτταρα NSP καλλιεργήθηκαν σε μέσο BEGM για 18 ημέρες κατά τις οποίες τα δείγματα restained με Hoechst 33342 την ημέρα 6, 12, και 18 να ποσοτικοποιηθεί το ποσοστό κυττάρων SP σε κάθε ομάδα. Χρησιμοποιήσαμε ένα κυτταρόμετρο ροής για την ανάλυση

σφαιροειδές Δοκιμασία Σχηματισμού

ταξινόμηση SP και κυττάρων NSP (5000 κύτταρα /ml) καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ StemPro_ NSC SFM (A10509-01?. Invitrogen, Carlsbad), με SFM που περιείχε κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (ϋΜΕΜ) /F12, 20 ng /ml παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών, και 20 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα. Επιπλέον, 1% 200 mmol /l L-γλουταμίνη (25030? Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) προστέθηκε. Μετά τη σπορά, το σφαιροειδές ικανότητα σχηματισμού των δύο υποσυνόλων παρατηρήθηκε την πάροδο του χρόνου.

Δοκιμασία ευαισθησίας φαρμάκου

ταξινόμηση SP και NSP LSCCs σπάρθηκαν σε 5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει BEGM σισπλατίνη (Pharmaceutical Factory, Nanjing, Κίνα) σε μία κλίση συγκέντρωσης (0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 μg /ml). Κάθε συγκέντρωση επαναλήφθηκε σε 6 φρεάτια. Τα άλλα φρεάτια 6 παράλληλα προεπωάστηκαν με 50 μmol /l verapamil ως χημειοευαισθητοποιητή να σισπλατίνη για 30 λεπτά στους 37 ° C. Μία συγκέντρωση 0 μg /ml χρησίμευσε ως έλεγχος. Ένα επιπλέον 6 φρεατίων που περιέχουν μέσο εξυπηρετούνται μόνο ως μάρτυρα. Τα κύτταρα, καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες, αξιολογήθηκαν με επώαση με CCK-8 για 3 ώρες. Το ποσοστό αναστολής (IR) εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο IR = -survival ποσοστό 100% (SR), και το SR μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο SR = (μέση απορρόφηση των φρεατίων δοκιμής /μέση απορρόφηση των φρεατίων ελέγχου) χ 100% .

ξενομοσχεύματος ογκογονικότητα Δοκιμασία

in vivo

Η

Άντρας μη παχύσαρκους διαβητικούς (NOD) /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID), ηλικίας 6-8 εβδομάδων (Slac Εργαστήριο Εταιρείας ζώων , Σαγκάη, Κίνα), ταΐστηκαν σε στρωτή ροή ντουλάπια κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων. Ταξινόμηση SP, κύτταρα NSP, και η μητρική LSCCs χωρίς διαλογή αιωρήθηκαν σε 0,2 ml PBS και εγχύεται εντός του μασχάλη κάθε ποντικού. Οι ποντικοί ψηλάφηση δύο φορές κάθε εβδομάδα για σχηματισμό όγκου και θανατώθηκαν 6 εβδομάδες αργότερα. Όλα τα οζίδια του όγκου είχαν φωτογραφηθεί, ζυγίζονται, και επιβεβαιώθηκε με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Ρ τιμές υπολογίστηκαν σύμφωνα με τα βάρη των όγκων SP σε σχέση με εκείνα των όγκων NSP.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. t του Student ή

Mann-Whitney

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε με GraphPad Prism έκδοση λογισμικού 5.00 για Windows (GraphPad Software, San Diego CA, USA) για να εξετάσει τις διαφορές. Οι τιμές των P & lt? 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

Μορφολογικά, Ανοσοκυτοχημική και μικροσκοπικών χαρακτηριστικών

Τα καλλιεργημένα LSCCs μεγάλωσε ως μονοστιβάδα σε ένα μοτίβο λιθόστρωτο, αποδεικνύοντας επιθηλιακά τους. προέλευση. Επιπλέον, εκτίθενται τυπικά χαρακτηριστικά των κακοήθων αλλαγής (Εικ. 1Α-C). Θετική χρώση του CK (ΡΑΝ) και CK5 και αρνητική χρώση του βιμεντίνης επιβεβαίωσαν επιθηλιακών καταγωγή τους (Σχ. 1 D-F). Το μικρογράφημα ηλεκτρονίων μετάδοσης αποκάλυψε τυπικά επιθηλιακά χαρακτηριστικά LSCCs, συμπεριλαμβανομένων πολλών μιτοχόνδρια, τραχύ ενδοπλασματικό reticuli, ριβοσώματα, μεγάλες ακανόνιστες πυρήνες με την πυρηνική μεμβράνη παρουσιάζει βαθιά εσοχή, και μικρολαχνών προεξοχές στην επιφάνεια του κυττάρου. Δέσμες tonofilaments στο κυτταρόπλασμα και πολυάριθμες δεσμοσώματα στα μεσοκυττάρια συνδέσεις παρατηρήθηκαν συχνά (Εικ. 1 G-I).

πλακώδη κύτταρα καρκινώματος (Α) λαρυγγικό (LSCCs) αυξήθηκαν απευθείας από το εκφύτευμα 48 ώρες μετά την σπορά , που περιβάλλεται από τους ινοβλάστες (βέλος). (Β) Στο χωρίο 1, LSCCs μεγάλωσε με συνυπάρχουσα ινοβλάστες (βέλος). (Γ) στο πέρασμα 4, LSCCs αυξήθηκε έντονα χωρίς ινοβλάστες και επέδειξαν τα τυπικά χαρακτηριστικά των κακοήθων αλλαγή, συμπεριλαμβανομένων πολλών μιτωτικά σχήματα, ένα μεγάλο λόγο πυρήνα προς κυτόπλασμα, εξέχοντες πολλαπλούς πυρηνίσκους, περιστασιακή πολυπύρηνα γιγαντιαία κύτταρα, κυτταροπλασματικά κενοτόπια, στρογγυλά και φωταύγειας κύτταρα, και πυρηνική ανωμαλία. Θετική χρώση κυτοκερατίνης (CK) (PAN) (D) και CK5 (Ε), και αρνητική χρώση του βιμεντίνης (F). Η υπερδομική χαρακτηριστικά (βέλη) του LSCCs δείχνει δεσμοσωμάτων στα διακυτταρικών συνδέσεων (G), tonofilaments στο κυτταρόπλασμα (H), και εσοχή πυρηνική μεμβράνη (Ι).

Η

καθαρότητα και Διαλογής SP Cells σε καθαρισμένο πρωτοβάθμια καλλιεργημένα LSCCs

Η καθαρότητα των πρωτογενών καλλιεργημένων LSCCs καθορίζεται με κυτταρομετρία ροής ήταν 98,32 ± 0,93% (Σχ. 2Α, Β). Διαλογή κυττάρων διεξήχθη μετά την αφαίρεση των νεκρών κυττάρων και κυτταρικών υπολειμμάτων με βάση σήματα σκέδασης και φθορισμού ιωδιούχου προπιδίου. Η πύλη R2 έδειξε τα κύτταρα SP που ήταν Hoechst 33342 αρνητική /αμυδρό, και το R4 πύλη ανέφερε τα κύτταρα NSP που ήταν Hoechst 33342 θετικά. κύτταρα SP κατέλαβαν κάποια 4,45 ± 1,07% του συνόλου των κυττάρων. Όταν προεπωάστηκαν με βεραπαμίλη για 30 λεπτά, το ποσοστό των κυττάρων SP συρρικνώθηκαν σε 0,14 ± 0,13% του συνόλου των κυττάρων (Σχ. 2C, D). SP και NSP κύτταρα συλλέχθηκαν για μετέπειτα πειράματα. Η καθαρότητα του πρόσφατα ταξινομημένο SP και μη-SP κύτταρα ήταν 99,25 ± 0,23% και 98,98 ± 0,22%, αντίστοιχα (Σχ. 2Ε, F).

(Α) Καθαρότητα των καλλιεργημένων LSCCs καθορίζεται από τη ροή κυτταρομετρίας χρησιμοποιώντας κυτοκερατίνης (CK) (pan) (98,32 ± 0,93%) και (Β) έλεγχο. (Γ) Διαλογή του LSCCs χρησιμοποιώντας Hoechst 33342. Η R2 αντιπροσωπεύει την πύλη πλευρά πληθυσμού (SP) κύτταρα (4,45 ± 1,07% των συνολικών κυττάρων) και η πύλη R4 είναι η μη-SP κύτταρα (NSP). (Δ) Η αναλογία SP μετά τη θεραπεία βεραπαμίλη ήταν 0,14 ± 0,13%. Η καθαρότητα του πρόσφατα ταξινομηθεί SP (99.25 ± 0.23%) (Ε) και τα κύτταρα NSP (98,98 ± 0,22%) (F).

Η

τηλέφωνα Βιωσιμότητας μετά τη διαλογή

Δεν παρατηρήθηκε σημαντική ανιχνεύθηκαν διαφορές στην βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξύ του προσφάτως ταξινομημένο SP και LSCCs NSP διατηρείται σε τόσο μέσο BEGM και SFM (Ρ & gt? 0,05) (Εικ. 3Α), υποδεικνύοντας ότι η συγκέντρωση Hoechst (5 μg /ml) χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή δεν είχε δυνητικά μεταβάλλουν την κυτταρική βιωσιμότητα των ΜΑΠ LSCCs.

. (Α) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά τη διαλογή. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στη βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε μεταξύ των πλευρικών πληθυσμού (SP) και κύτταρα μη-SP (NSP) σε βρογχικά επιθηλιακά μέσο κυτταρικής ανάπτυξης (BEGM) και μέσο χωρίς ορό (SFM). Σχετική (Β) mRNA και τα επίπεδα (C) πρωτεΐνη της αυτο-ανανέωσης και γονίδια δείκτη CSC στο SP και κύτταρα NSP. (D) ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων του SP και NSP κύτταρα τόσο BEGM και SFM προσδιορίζεται από κινητό Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) (*** P & lt? 0.01, ** P & lt? 0,05, * P & gt? 0.05).

Η έκφραση της αυτο-ανανέωσης και γονίδια CSC Marker σε mRNA Επίπεδο

Οι σχετικές εκφράσεις mRNA της ABCG2, BMI1, Oct4, Nanog, SOX2, CD44, CD24, και CD133 σε ταξινομημένη SP και κύτταρα NSP προσδιορίστηκαν από qRT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα SP έδειξαν υψηλότερη έκφραση mRNA σε ABCG2, BMI1, Oct4, Nanog, SOX2, και CD44 σε σύγκριση με κύτταρα NSP. Ωστόσο, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά της έκφρασης CD24 και CD133 mRNA ανιχνεύθηκε μεταξύ του SP και κύτταρα NSP (Σχ. 3Β).

επιπέδων της πρωτεΐνης της CSC Μαρκαδόροι

κύτταρα SP βρέθηκαν να έχουν αυξημένη πρωτεΐνη επίπεδα CD44, ABCG2, BMI1, Oct4, SOX2 και Nanog σε σύγκριση με τα κύτταρα NSP. διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές των επιπέδων της πρωτεΐνης CD24 και CD133 μεταξύ SP και κύτταρα NSP (Σχ. 3C).

Η ανάπτυξη των κυττάρων Βαθμολογήστε

Τις ημέρες 1, 3, 5, και 7 μετά τη διαλογή, απορρόφηση των κυττάρων SP και NSP μετρήθηκε χρησιμοποιώντας CCK-8 για να προσδιοριστεί ο ρυθμός ανάπτυξης. Στο μέσο BEGM, τόσο SP και τα κύτταρα NSP πολλαπλασιάστηκαν την πάροδο του χρόνου. κύτταρα SP κατέληξε σε εκθετική φάση ανάπτυξης 3 ημέρες μετά τη σπορά και την ημέρα 7 είχαν φτάσει σε ένα οροπέδιο. Σε αντίθεση, τα κύτταρα NSP συνέχισε σιγά-σιγά αυξάνεται μέχρι την ημέρα 7 πριν από τη μετάβαση σε μια αναβάθμιση φάση (P & lt? 0.001). Στο SFM, τα κύτταρα SP πολλαπλασιαστεί σταθερά με ταχύτητα μικρότερη από ότι στην BEGM. Σε αντίθεση, τα κύτταρα NSP δύσκολα μεταδίδεται (Εικ. 3D).

Διαφοροποίηση Ανάλυση

Τις ημέρες 6, 12, και 18 μετά τη σπορά, το καλλιεργημένο SP και κύτταρα NSP ήταν restained με Hoechst 33342 για να μετρούν τις διαφορές στην ικανότητα διαφοροποίησης τους. Τα δεδομένα έδειξαν ότι το ποσοστό των κυττάρων SP μειώθηκε σε καλλιέργεια πάροδο του χρόνου, στο 17,67 ± 1,45% κατά την ημέρα 6, 9,08 ± 0,61% την ημέρα 12, και 4,45 ± 0,63% κατά την ημέρα 18 (Σχ. 4Α-F). Την ημέρα 18, το ποσοστό των Hoechst 33342-θαμπό /αρνητικών κυττάρων σε καλλιεργημένα κύτταρα SP ήταν παρόμοια με εκείνη του αδιαχώριστα LSCCs, ενώ καλλιεργημένα κύτταρα NSP περιείχε μόνο 0,07 ± 0,03% των κυττάρων SP (Σχ. 4G-H), οι οποίες μπορεί να έχουν προκύψει από υπολειμματικά SP κύτταρα από την τελευταία διαλογής.

το ποσοστό του πληθυσμού πλευρά (SP) κύτταρα ανιχνεύονται σε καλλιεργημένα κύτταρα SP μειώθηκε με την πάροδο του χρόνου. Το ποσοστό των κυττάρων SP ήταν 17,67 ± 1,45% κατά την ημέρα 6 (Α, Β), 9,08 ± 0,61% κατά την ημέρα 12 (C, D), και 4,45 ± 0,63% κατά την ημέρα 18 (E, F). Αντίθετα, το ποσοστό των κυττάρων SP σε καλλιεργημένα μη-SP κύτταρα (NSP) ήταν 0,07 ± 0,03% (G, H).

Η

Σφαίρα Σχηματισμός

Απομονωμένα κύτταρα SP πολλαπλασιαστεί σταθερά στο μέσο καλλιέργειας βλαστικών κυττάρων. Πλωτή σφαίρες σε αιώρημα που παράγεται από ένα μόνο κύτταρο SP του LSCCs αυξάνεται σε μέγεθος συναρτήσει του χρόνου (Σχ. 5Α-C). Αντίθετα, μερικά κύτταρα NSP πέθαναν και άλλοι πολλαπλασιάζονται πολύ αργά και δεν μπορούσε να σχηματίσει οπτικά σφαίρες (Σχ. 5D).

Την ημέρα 3 (Α, × 100), ημέρα 5 (Β, × 100), και 7 ημέρες (C, χ 400), τα επιπλέοντα σφαιρικές συστάδες πλευρά πληθυσμού (SP) κύτταρα επεκτείνονται με σταδιακό τρόπο την πάροδο του χρόνου. Σε αντίθεση, τα κύτταρα μη-SP (NSP) δεν μπορούσε να σχηματίσει σφαιρικά συμπλέγματα αφού καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες (D, × 100). (Ε) Ευαισθησία πρόσφατα ταξινομημένο SP και NSP να σισπλατίνη. Το ποσοστό αναστολής (IR) των κυττάρων SP έδειξαν σημαντική διαφορά από κύτταρα NSP σε κάθε συγκέντρωση (Ρ & lt? 0.001), με την εξαίρεση των 11 μg /ml (Ρ & gt? 0,05). κύτταρα SP ήταν πιο ανθεκτικά στην σισπλατίνη από κύτταρα NSP? αυτό θα μπορούσε να αναστραφεί με βεραπαμίλη προεπεξεργασίας.

Η

Drug Ευαισθησία Διαφορές μεταξύ SP και NSP κύτταρα

Διαφορετικές συγκεντρώσεις σισπλατίνης χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των διαφορών της ευαισθησίας των ναρκωτικών μεταξύ SP και κύτταρα NSP στο η παρουσία ή απουσία του βεραπαμίλη, ένας αναστολέας της ABCG2 μεταφορέα κυτταρική επιφάνεια υπεύθυνος για χημειοθεραπευτική αντοχή. Όταν έλαβαν μόνο σισπλατίνη, τα κύτταρα SP έδειξε ισχυρή αντίσταση μέχρις ότου η συγκέντρωση σισπλατίνης φθάσει 9 μg /ml, και το IR των κυττάρων SP δεν έδειξε σημαντική διαφορά από NSP σε συγκέντρωση 11 μg /ml (Ρ & gt? 0,05). Σε σύγκριση με κύτταρα SP, ο IR κυττάρων NSP έδειξε σημαντική διαφορά σε κάθε συγκέντρωση (Ρ & lt? 0.001) εκτός από 11 μg /ml. Το IR των κυττάρων SP προεπεξεργασία με βεραπαμίλη αυξηθεί χωρίς σημαντική διαφορά σε σύγκριση με κύτταρα NSP (Ρ & gt? 0,05), αλλά με σημαντική διαφορά σε σχέση με τα κύτταρα SP χωρίς βεραπαμίλη προεπεξεργασίας (Ρ & lt? 0.001). Δεν αξιοσημείωτες αλλαγές ανιχνεύθηκαν στο IR κυττάρων NSP παρουσία ή απουσία του verapamil (Ρ & gt? 0,05). (Εικ. 5Ε)

Ανώτατη Ογκογονικά Χωρητικότητα του SP Cells σε NOD /SCID ποντίκια

Χρησιμοποιήσαμε τα μη ταξινομημένα LSCCs για τον προκαταρκτικό πείραμα και επέλεξε 4 × 10

5 ως το μεγαλύτερο αριθμό εμβολιασμό κυττάρων για SP και NSP κύτταρα. Με τον αριθμό χαμηλότερη ενοφθαλμισμό κυττάρων (2 χ 10

4), κύτταρα SP σχηματίζονται δύο όγκοι (n = 4)? Σε αντίθεση, ο χαμηλότερος αριθμός των κυττάρων ένεση για κύτταρα NSP να σχηματίσουν δύο όγκους ήταν 2 × 10

5 (n = 4). ανιχνεύθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των βαρών των όγκων SP και όγκων NSP. Οι παθολογικές αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι οι δύο όγκοι που σχηματίζονται από SP και NSP κύτταρα ήταν καλά διαφοροποιημένα LSCCs, παρόμοια με τον αρχικό όγκο (Εικόνα 6?. Πίνακας 2).

(Α) Τα σημεία της ένεσης του μη παχύσαρκους διαβητικά (NOD) /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) ποντικούς. Αιματοξυλίνη και χρώση ηωσίνης των όγκων που προέρχονται από τον ασθενή (Β), ποντικοί (C, όγκος που σχηματίζεται από την πλευρά του πληθυσμού (SP)? D, όγκος που σχηματίζεται από μη-SP (NSP) κύτταρα). Τόσο τα πρωτότυπα και ξενομοσχεύτηκε όγκοι ήταν τυπικές, καλά διαφοροποιημένο, πλακώδες καρκίνωμα με κερατίνη μαργαριτάρια παρατηρούνται συχνά (βέλη). (Ε) με 2 × 10

5 κύτταρα εγχύονται, τα κύτταρα SP σχηματίζονται τέσσερις μεγαλύτερους όγκους (4/4), ενώ τα κύτταρα NSP σχηματίζονται δύο πολύ μικρότερους όγκους (2/4). (F) Στατιστική ανάλυση των SP και NSP όγκου βάρη σε διαφορετικές ένεση κυττάρων ποσότητες (*** P & lt? 0.01, ** P & lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη περιέγραψε την επιτυχή απομόνωση και ταυτοποίηση καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με SP απευθείας από ένα χειρουργικά δείγμα LSCC προέρχεται από ένα καλά διαφοροποιημένο επιγλωττικού νεοπλάσματος σε ένα κινέζικο άνδρα ασθενή. Παρά το γεγονός ότι πρωταρχική LSCCs είναι δύσκολο να πολιτισμό

in vitro

, πριν από την απομόνωση επιχειρήσαμε την αρχική καλλιέργεια των 40 δειγμάτων LSCC και πέτυχε σε μία περίπτωση. Στη συνέχεια καθαρίζεται των καλλιεργημένων LSCCs από επανειλημμένες διαφορική θρυψινοποίηση για την εξάλειψη συνυπάρχουν ινοβλάστες.

Η μονοστιβάδα και πλακόστρωτα μοτίβο LSCCs προσδιορίζονται με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης, θετική χρώση των CK (παν) και CK5, αρνητική χρώση της βιμεντίνης, και η επιθηλιακή υπερδομή (συμπεριλαμβανομένων tonofilaments και δεσμοσώματα) αποκάλυψε με μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου επιβεβαιώθηκε η επιθηλιακή γενεαλογία των καλλιεργημένων LSCCs (Εικ. 1).

Επειδή τα κακοήθη πλακώδη κύτταρα τα φαινοτυπικά καθορίζονται από κυτοκερατίνη, χρησιμοποιήσαμε μια ροή κυτταρόμετρο με CK (pAN) του αντισώματος για την αξιολόγηση της καθαρότητας των καλλιεργημένων LSCCs. Αν και τα αποτελέσματα θα πρέπει να είναι 100%, η καθαρότητα ήταν 98,32 ± 0,93%, η οποία μπορεί να είναι αποτέλεσμα της ατελούς αποτελεσματικότητα του αντισώματος (Σχ. 2Α, Β). Στη συνέχεια έδειξε ότι τα καθαρισμένα πρωτεύοντος καλλιεργούμενου LSCCs περιείχε μια διακριτή υποπληθυσμό SP (4,45 ± 1,07%), με βάση την ικανότητά τους να αποκλείουν την 33342 χρωστική Hoescht, και αυτή η χωρητικότητα θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από βεραπαμίλη, σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές ότι η Hoechst 33342 αποκλεισμός είναι βεραπαμίλη ευαίσθητα (Σχ. 2C-F).

Ως χρωστική δέσμευσης DNA, η Hoechst είναι τοξικό για τα κύτταρα, ιδιαίτερα σε υψηλές συγκεντρώσεις. Προκειμένου να εξαλειφθεί η ανησυχία ότι τα κύτταρα NSP προτίμηση διατηρούν κυτταροτοξική Hoechst 33342, η οποία θα μπορούσε να μεταβάλει την ικανότητα πολλαπλασιασμού, μία ανίχνευση κυτταρικής βιωσιμότητας διεξήχθη μετά τη διαλογή. Αποτελέσματα δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στην βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξύ του προσφάτως ταξινομημένο SP και κυττάρων NSP (Ρ & gt? 0,05) (Εικ. 3Α), υποδεικνύοντας ότι η κυτταρική βιωσιμότητα των NSP LSCCs δεν ενδέχεται να επηρεαστούν από 5 μg /ml Hoechst, μια συγκέντρωση που χρησιμοποιείται ευρέως έρευνα σε SP κυττάρου [34].

σε σύγκριση με τα κύτταρα ΜΑΠ, κύτταρα SP έχουν αυξημένη έκφραση γονιδίων, όπως Oct4, Nanog, ΒΜΙ-1, ABCG2, και SOX2 [31], που εμπλέκονται στη ρύθμιση των βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα πέντε γονίδια λειτουργούν επίσης ως σημειωτές CSC σε στερεούς όγκους [35], [36]. Επιπλέον, CD44, CD24, CD133 και είναι καλά γνωστά δείκτες CSC σε στερεούς όγκους [37]. Ερευνήσαμε την έκφραση των γονιδίων σε οκτώ δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης. Συνεπής με προηγούμενες εκθέσεις, τα κύτταρα SP βρέθηκαν να έχουν σημαντικά προς τα πάνω ρυθμισμένη έκφραση Oct4, Nanog, ΒΜΙ-1, ABCG2, SOX2, και CD44 τόσο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης σε σύγκριση με τα κύτταρα NSP. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα NSP παρουσίασαν επίσης έκφραση της CD44 πρωτεΐνης, σε συνέπεια με αναφορές στο παρελθόν ότι CD44 εκφράζεται σε όλα σχεδόν τα καρκινικά κύτταρα? Αυτό αντανακλά την ασάφεια των CD44 στη συντήρηση CSC [38]. κύτταρα SP βρέθηκαν επίσης να έχουν παρόμοια έκφραση του CD24 και CD133 τόσο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε σύγκριση με κύτταρα NSP, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές ότι η CSC φαινότυποι για συμπαγείς όγκους μπορεί να μην είναι ομοιόμορφη μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνου ή ακόμη και όγκων του ιδίου ιστολογικού υποτύπου (Σχ. 3Β, C) [37].

αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης είναι βασικές ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων που θα τους επιτρέψουν να δημιουργήσουν απογόνους, συμπεριλαμβανομένων των ΚΕΠ, τα οποία φιλοξενούν απεριόριστο πολλαπλασιαστικό δυναμικό, και να φαινοτυπικά ποικίλα κύτταρα που αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του όγκου. Στην δοκιμασία πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα SP αυξήθηκε σημαντικά ταχύτερα από τα κύτταρα NSP τόσο BEGM και μέσο SFM (Σχ. 3D), επιβεβαιώνοντας την απεριόριστη πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων SP. Ασυμμετρία είναι ένας ιδιαίτερος τύπος κυτταρικής διαίρεσης με μια ελκυστική μηχανισμό CSC, διότι απαιτεί μόνο ένα τμήμα για τόσο αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης [39]. Στην δοκιμασία διαφοροποίησης, το ποσοστό των κυττάρων SP από καλλιεργημένα κύτταρα SP μειώθηκε σε καλλιέργεια πάροδο του χρόνου, με μία σταδιακή αύξηση του ποσοστού των κυττάρων NSP. Ακόμη και κατά την ημέρα 18, τα καλλιεργημένα κύτταρα NSP περιείχε μόνο 0,07 ± 0,03% SP κύτταρα (Σχ. 4), και αυτά μπορεί να έχουν προκύψει από υπολειμματικά SP κύτταρα από την τελευταία διαλογής. Αυτό υποδηλώνει ότι τα κύτταρα SP μπορούν να υποστούν ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση να αυτο-ανανέωση και παράγουν ετερογενή φαινοτύπους χαμηλής ογκογόνα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων NSP? Ωστόσο, τα κύτταρα δεν μπορούν να NSP αντίστροφα διαφοροποιηθούν σε κύτταρα SP.

Νευρικά βλαστικά κύτταρα έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε SFM και σχηματίζουν ένα νευροσφαιρών. Αυτές οι ιδιότητες έχουν αξιοποιηθεί για την επιλογή των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν σε ανθρώπινους καρκίνους, που αντιπροσωπεύεται κυρίως από καρκίνο του μαστού. Στη μελέτη μας, η ικανότητα των κυττάρων να παράγουν SP σφαιρικές αποικίες ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων NSP, σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες (Σχ. 5Α-Δ) [8], [30].

Στο φάρμακο δοκιμασία ευαισθησίας, μετρήσαμε τις διαφορές ευαισθησίας των ναρκωτικών μεταξύ SP και κύτταρα NSP. Ο μηχανισμός που ρυθμίζει την εκροή της Hoechst χρωστική ανατίθεται εν μέρει μέσω της έκφρασης της ΑΤΡ δέσμευσης πρωτεΐνης κασέτας (ABC), οι μεταφορείς, κυρίως ABCG2, που εμπλέκονται στην εκροή των χημειοθεραπευτικών παραγόντων [40], [41]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε βεραπαμίλη να εμποδίσει τον μεταφορέα ABCG2 μεμβράνη και παρατηρήθηκαν οι αλλαγές τοξικότητα της σισπλατίνης. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα SP ήταν πολύ πιο ανθεκτικά σε σισπλατίνη από κύτταρα NSP σε κάθε συγκέντρωση (Ρ & lt? 0.001) εκτός από 11 μg /ml (Ρ & gt? 0,05) Αυτή η κατάσταση θα μπορούσε να αναστραφεί δια προκατεργασίας με βεραπαμίλη, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να παίζει ο μεταφορέας ABCG2 ένα σημαντικό ρόλο στην αντοχή φαρμάκου (Εικ. 5Ε). Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι Mdr1a /b /Bcrp1 ποντικοί τριπλό knockout είναι βιώσιμες και εξακολουθούν να διατηρούν ορισμένα κύτταρα SP στο μυελό των οστών [42], υποδηλώνοντας ότι ο μηχανισμός με τον οποίο προσδιορίζεται ο φαινότυπος SP δεν ανατίθεται μόνο μέσω της έκφρασης πρωτεΐνες μεταφορείς ABC. Ως εκ τούτου, ο ακριβής μηχανισμός της Hoechst χρωστική αποκλεισμού παραμένει να διευκρινιστεί πλήρως.

Δεδομένα από ανεξάρτητα εργαστήρια, κυρίως με βάση τη μελέτη του καρκίνου κυτταρικές γραμμές, έχουν δείξει ότι, σε σύγκριση με τον πληθυσμό NSP, καρκινικά βλαστικά-όπως