Αφηρημένο

μεταστατικό καρκίνο παχέος εντέρου (mCRC) βασίζεται στην απόσπαση των επιθετικών κακοήθων κυττάρων από τον πρωτοπαθή όγκο στην κυκλοφορία του αίματος και, να συμπίπτει με το παρουσία αυτών των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTC) συνδέεται με κακή πρόγνωση. Σε αυτή την εργασία, ο μοριακός χαρακτηρισμός του CTC από ασθενείς mCRC προσεγγίστηκε, με σκοπό την κατανόηση της βιολογίας τους και βελτιώνοντας την κλινική χρησιμότητα τους στη διαχείριση των ασθενών με καρκίνο του παχέος. Για το σκοπό αυτό, EpCAM-based ανοσοαπομονώσεως της CTC συνδυάστηκε με ενίσχυση ολόκληρο το μεταγραφικό και ο υβριδισμός σε μικροσυστοιχίες cDNA. Η γονιδιακή έκφραση δεδομένα από ασθενείς mCRC, άπαξ το υπόβαθρο της μη ειδικής ανοσοαπομόνωση από μια ομάδα ελέγχου είχαν αφαιρεθεί, οδήγησε σε 410 γονίδια που χαρακτηρίζεται από τον πληθυσμό CTC. Βιοπληροφορική χρησιμοποιήθηκαν για τη βιολογική ερμηνεία των δεδομένων, αποκαλύπτοντας ότι CTC χαρακτηρίζονται από γονίδια που σχετίζονται με την κίνηση και προσκόλληση κυττάρου, θάνατο κυττάρου και τον πολλαπλασιασμό, και κυτταρική σηματοδότηση και την αλληλεπίδραση. RTqPCR σε ανεξάρτητη σειρά ασθενών mCRC και ελέγχων χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση ενός αριθμού γονιδίων που σχετίζονται με τις κύριες κυτταρικές λειτουργίες που χαρακτηρίζουν τον πληθυσμό CTC. Σύγκριση μεταξύ πρωτογενών καρκινωμάτων και των πνευμόνων και ηπατικές μεταστάσεις εμπλέκονται περαιτέρω τα γονίδια CTC στην προώθηση της μετάστασης. Επιπλέον, ο συσχετισμός της έκφρασης του γονιδίου-CTC με κλινικές παραμέτρους απέδειξαν την ανίχνευση και πρόγνωση σημασία. Εν κατακλείδι, ο μοριακός χαρακτηρισμός της CTC από ασθενείς mCRC και η ταυτοποίηση των διαγνωστικών και προγνωστικών βιοδεικτών αποτελούν μια καινοτόμο και πολλά υποσχόμενη προσέγγιση στην κλινική αντιμετώπιση αυτού του είδους των ασθενών

Παράθεση:. Barbazan J, Alonso-Alconada L , Muinelo-Romay L, Vieito M, Αμπάλο Α, Alonso-Nocelo M, et al. (2012) Μοριακός Χαρακτηρισμός των κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου σε Ανθρώπινα Μεταστατικό Καρκίνο του παχέος. PLoS ONE 7 (7): e40476. doi: 10.1371 /journal.pone.0040476

Επιμέλεια: Xin Wei Wang, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 του Ιανουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 8 Ιούν, 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιουλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Barbazan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο ήταν εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από το ισπανικό Υπουργείο Υγείας (CP08 /00142) και την Ευρωπαϊκή Επιτροπή Πρόγραμμα Fondo Europeo de Desarrollo Περιφερειακή (ΕΤΠΑ). Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. J. Barbazan και L. Alonso-Alconada είναι αποδέκτες των υποτροφιών από το ισπανικό Υπουργείο Παιδείας και Επιστημών και της κυβέρνησης της Χώρας των Βάσκων (Ισπανία), αντίστοιχα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη στις γυναίκες, με πάνω από 1,2 εκατομμύρια νέα κρούσματα καρκίνου εκτιμάται ότι έχουν συμβεί σε όλο τον κόσμο το 2008 [1]. Κλινικά, μακρινό διάδοση του όγκου και των μεταστάσεων είναι οι πιο σημαντικοί παράγοντες στην πρόγνωση: ενώ οι μη επεμβατικές στάδιο καρκινώματα θα παρουσιάσει ένα 90% πέντε χρόνια επιβίωσης, το στάδιο IV καρκινώματα με μακρινή μετάσταση συσχετίζονται με μια δραματική πτώση σε ποσοστό επιβίωσης 10% [2 ]. Κατά συνέπεια, οι νέες θεραπευτικές στρατηγικές βελτίωσης της αποτελεσματικότητας κατά της μεταστατικής νόσου και ακριβή βιοδεικτών για την παρακολούθηση των ασθενών με CRC αποτελούν σημαντικές προκλήσεις, σε συνδυασμό με την έγκαιρη ανίχνευση και τον έλεγχο σε πληθυσμούς υψηλού κινδύνου.

Η εξάπλωση του καρκίνου βασίζεται στην η αποκόλληση των επιθετικών κακοήθων κυττάρων από τον πρωτογενή όγκο στην κυκλοφορία του αίματος ως κύρια πηγή του περαιτέρω μετάσταση [3]. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTC) κατέχουν ή αποκτούν την ικανότητα να αποφύγει το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή και να επιτευχθεί ένα μακρινό όργανο, συνήθως το συκώτι στη CRC, όπου δημιουργία ενός δευτερεύοντα χώρο της ανάπτυξης του όγκου σε ένα εξαιρετικά αναποτελεσματικό, αλλά δραματική διαδικασία [4]. Να συμπίπτει, η παρουσία της CTC στο περιφερικό αίμα έχει συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων CRC [5], [6]. Όπως τεκμαρτή ιδρυτές στην παραγωγή της μετάστασης, CTC γίνονται ένα πεδίο ενδιαφέροντος, και η κατανόηση της βιολογίας τους, μπορεί να ανοίξει νέες προοπτικές στην ογκολογία. Όσον αφορά το μοριακό χαρακτηρισμό τους, τα τελευταία χρόνια ένας αριθμός ομάδων έχουν παρουσιάσει δεδομένα έκφρασης επικεντρώθηκε σε συγκεκριμένα γονίδια ή οδούς σηματοδότησης που σχετίζονται με τον καρκίνο για τη βελτίωση της ευαισθησίας και της ειδικότητας του εντοπισμού [7], [8]. Smirnov et al. προσέγγισε το προφίλ της CTC μέσω διάφορων μαστού, του προστάτη και του παχέος εντέρου μεταστατικό προοπτικές [9]. Επιπλέον, τα δεδομένα προκύπτουν σχετικά με τη δυνατότητα της μελέτης της βιολογίας και τη χρησιμότητα για την αξιολόγηση στοχευμένων θεραπειών με βάση το γονιδιακό προφίλ της CTC [10], [11].

Μέσα σε αυτό το σενάριο, που ορίζεται από μια περιορισμένη αποτελεσματικότητα της τρέχουσας χημειοθεραπείες στη θεραπεία του μεταστατικού CRC (mCRC) και CTC ως βασικών παραγόντων στη διαχείριση της μεταστατικής νόσου, ειδικά μοριακά προφίλ του πληθυσμού CTC πλησίασε. Ο συνδυασμός της CTC EpCAM-based ανοσοαπομόνωση και ακριβή εξαγωγή του RNA από τον πολύ μικρό αριθμό CTC συν ενίσχυσης ολόκληρο μεταγραφικό, κατέστησε δυνατή την υβριδίζονται cDNA από τον πληθυσμό CTC πάνω μικροσυστοιχίες έκφρασης των γονιδίων. Με την εφαρμογή αυτής της διαδικασίας σε μια ομάδα ασθενών mCRC σε σχέση με το υπόβαθρο της μη ειδικής απομονωμένων αιμοποιητικών κυττάρων, ο πληθυσμός της ανοσοαπομονωμένο CTC είχε προφίλ ειδικά. Εκτός από το μοριακό χαρακτηρισμό της CTC για την κατανόηση της βιολογίας του ενός κύρια πηγή μετάστασης σε CRC, τα δεδομένα αυτά παρέχονται πιθανούς θεραπευτικούς στόχους και διαγνωστικό /προγνωστικό βιοδείκτες.

Αποτελέσματα

CTC ανοσοαπομόνωσης και Μοριακής Profiling

οι διαδικασίες για τη CTC ανοσοαπομονώσεως, εκχύλιση RNA και ενίσχυση για hybridisa? σμού σε μικροσυστοιχίες cDNA απεικονίζονται στο Σχήμα 1Α. Εν συντομία, η CTC ήταν ανοσοαπομονωθούν από 7,5 ml περιφερικού αίματος από τη φάση IV ασθενείς mCRC (n = 6? Πίνακας S1). Μαγνητικά σφαιρίδια χρησιμοποιήθηκαν, τα οποία επικαλύφθηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης επιθηλιακής κυτταρικής προσκόλλησης μόριο (EpCAM), μία επιφάνεια μόριο εντόνως εκφρασμένο σε επιθήλιο-προήλθε όγκους όπως CRC. RNA από απομονωμένο CTC καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ που έχει σχεδιαστεί ειδικά για τα δείγματα χαμηλή αφθονία. Παράλληλα, το ίδιο πρωτόκολλο εφαρμόζεται σε δείγματα αίματος από υγιείς δότες (η = 3) για τον καθορισμό της γραμμής βάσης του υποβάθρου από μη ειδική ανοσοαπομόνωση μη-CTC. Πριν από την ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου, η παρουσία των απομονωμένων CTC επιβεβαιώθηκε με άμεση οπτικοποίηση ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας ένα κοκτέιλ αντισωμάτων έναντι κυτοκερατίνες 8, 18 και 19 (Σχήμα S1), και με συνδυασμό των δύο βιοδείκτες επικυρωθεί για την ακριβή ποσοτικοποίηση της CTC σε mCRC ασθενείς (GAPDH-CD45? [12]) (Mann-Whitney U, ρ-τιμή & lt? 0,05) (Σχήμα 1Β). Επιπλέον, η ακρίβεια της μεθοδολογίας αξιολογήθηκε ως το ποσοστό ανάκτησης κατά τη διάρκεια ανοσοαπομονώσεως οδήγησε σε ένα μέσο όρο 91,56% (Μέθοδοι S1).

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας που χρησιμοποιείται για την CTC μοριακό χαρακτηρισμό. CTC απομονώθηκαν από 7,5 ml περιφερικού αίματος με ανοσομαγνητικό διαχωρισμό χρησιμοποιώντας αντι-ΕρΟΑΜ επικαλυμμένα μαγνητικά σφαιρίδια. Απομονωμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε εκχύλιση RNA που ακολουθείται από μια διαδικασία ενίσχυσης ολόκληρο μεταγραφικό (WTA). Τέλος ενισχυμένο cDNA υβριδοποιήθηκε σε συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης Agilent. (Β) επίπεδα GAPDH-CD45 σε ελέγχους και ασθενείς με mCRC μετράται με PCR σε πραγματικό χρόνο. Οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή της κάθε ομάδας (* p & lt? 0,05). (C) Spearman ανάλυση συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων GAPDH-CD45 που λαμβάνονται τόσο από δεδομένα μετά την ποικιλία και qPCR προηγούμενο στην WTA ενίσχυση. γράφημα εξόδου ανάλυση (D) SAM που εμφανίζουν διαφορές γονιδιακή έκφραση μεταξύ της ομάδας των ασθενών και ελέγχων. Dots υπογράμμισε αντιστοιχούν σε γονίδια με στατιστικά σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης στην ομάδα των ασθενών σε σύγκριση με το υπόβαθρο του ελέγχου, που θεωρείται ότι χαρακτηρίζουν τον πληθυσμό της CTC από mCRC.

Η

Για να χαρακτηρίζουν τον πληθυσμό CTC απομονωμένες από ασθενείς mCRC, τη μεθοδολογία που περιγράφεται από Gonzalez-Roca et al. προσαρμόστηκε, για την ακριβή προφίλ γονιδιακής έκφρασης των πολύ μικρών πληθυσμών κυττάρων [13]. Βασικά, καθαρισμένο RNA κατεργάστηκε περαιτέρω με DNaseI, ενισχύθηκε με τη χρήση της μεθόδου ενίσχυσης μεταγραφικό WTA2 σύνολο και συμπληρωματικό DNA σημάνθηκε και υβριδοποιήθηκε σε συστοιχίες έκφραση Agilent (Σχήμα 1Α) (Gene Expression Omnibus, GEO Accession number:. GSE31023). Μετά την αρχική προ-επεξεργασία των πρώτων στοιχείων, κατά μέσο όρο 21.070 κηλίδες διηθήθηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια που περιγράφονται στο Υλικά & amp? Μέθοδοι, που αντιπροσώπευε 47,35% των κηλίδων στην μικροσυστοιχία με μέγιστο αριθμό 32 443 και τουλάχιστον 13 247. Μετά διήθηση, ο συντελεστής% διακύμανσης (CV) για να αναπαραχθεί ανιχνευτές κυμαίνονταν από 5,98% έως 12,13%. Η κανονικοποίηση σε κάθε μικροσυστοιχία διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Loess, η οποία υποθέτει ότι τα περισσότερα γονίδια σε μικροσυστοιχίες δεν εκφράζονται διαφορικά σε σύγκριση με τον έλεγχο, έτσι κανονικοποίηση μεταξύ όλων των δεδομένων μικροσυστοιχιών έγινε με τη μέθοδο Aquantile υλοποιείται στο πακέτο Limma του R στατιστικής λογισμικό. Η μέθοδος αυτή διασφαλίζεται ότι οι τιμές Α (μέση ένταση) είχε την ίδια εμπειρική κατανομή σε μικροσυστοιχίες αφήνοντας τιμές Μ (log-αναλογίες) αμετάβλητη. ανάλυση συσχέτισης των επιπέδων RTqPCR GAPDH-CD45 πριν και μετά την ενίσχυση έδειξε μία ισχυρή γραμμικότητα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενίσχυσης μεταγραφικό (συντελεστής Spearman: 0,8667? p-value & lt? 0.005). (Εικόνα 1Γ)

Το επόμενο βήμα που εμπλέκονται προφίλ γονιδιακής έκφρασης των CTC απομονώθηκαν από ασθενείς mCRC στο πλαίσιο των μολυσματικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανοσοαπομόνωσης. Για το σκοπό αυτό, οι εντάσεις κανονικοποιημένη έκφρασης των γονιδίων από ασθενείς mCRC και από την ομάδα των ελέγχων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας λογισμικό MeV (MultiExperiment Viewer) (βλέπε Methods S1). Τα σήματα που λαμβάνονται από υγιείς μάρτυρες θεωρήθηκαν ως φόντο από μη ειδικά απομονωμένα κύτταρα του αίματος, τα οποία ήταν κυρίως λεμφοκύτταρα. Το σήμα που λαμβάνεται από ασθενείς mCRC αντιπροσώπευε το άθροισμα αυτής της μη-ειδικής φόντο συν το συγκεκριμένο μοτίβο έκφρασης των γονιδίων της CTC. Αφαιρώντας αυτό το φόντο, ο πληθυσμός που μολύνουν μη-CTC απομακρύνθηκε, και τα προκύπτοντα γονίδια που δείχνουν στατιστικώς σημαντική έκφραση θεωρήθηκαν για τον χαρακτηρισμό του πληθυσμού CTC από mCRC ασθενείς (Σχήμα 1Α). Να συμπίπτει, όλοι οι σημαντικοί γονίδια που παρουσιάζονται θετική έκφραση σε ασθενείς mCRC μετά αφαίρεση του υποβάθρου από υγιείς δότες (Σχήμα 1 D), η οποία ήταν σύμφωνη με την παρουσία της CTC μόνο στα δείγματα mCRC. Η στρατηγική αυτή οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός τελικού συνόλου 410 γονίδια που ήταν ειδικά για τον πληθυσμό CTC (Πίνακας S2), με ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης σαφώς διακρίσεις μεταξύ των ασθενών mCRC και τους ελέγχους (Εικόνα 2Α).

(Α) Ιεραρχική συσταδοποίηση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ των ασθενών (n = 6) και τους ελέγχους (η = 3) (ειδικά γονίδια CTC). (Β) RTqPCR επικύρωση έντεκα γονίδια που επιλέγονται από τα δεδομένα πίνακα. διαφορές CD45-κανονικοποιημένη αλλαγή φορές μεταξύ των ασθενών mCRC (n = 20) και των υγιών μαρτύρων (n = 10) (γκρι μπάρα) σε CTC εμπλουτισμένο κλάσμα (μαύρες ράβδοι? *** ρ & lt? 0,0001). Αξίζει να σημειωθεί, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των ασθενών mCRC (n = 5) και τους ελέγχους (n = 5) στο υπόλοιπο κλάσμα μετά CTC ανοσοαπομονώσεως (λευκές ράβδοι).

Η

βιοπληροφορική ανάλυση με Ingenuity Pathway Ανάλυση ( ΙΡΑ) και Genecodis (για Gene Ontology), το λογισμικό υπηρέτησε να ερμηνεύσει την προκύπτουσα λίστα των γονιδίων που χαρακτηρίζουν τον πληθυσμό της CTC. Οι κύριες κυτταρικές λειτουργίες που ορίζονται από αυτές τις CTC-ειδικά γονίδια που σχετίζονται με την κίνηση των κυττάρων, κυτταρικής προσκόλλησης, κυτταρικό θάνατο και τον πολλαπλασιασμό, σηματοδότηση κυττάρου-κυττάρου και την αλληλεπίδραση, και κυτταροσκελετού αναδιοργάνωση (Σχήμα S2A και C). Είναι ενδιαφέρον ότι η ανάλυση ΙΡΑ κανονικών οδών, η οποία ήταν αντιπροσωπευτική αυτών των γονιδίων, τονίζεται επίσης έναν αριθμό γνωστών οδών σηματοδότησης που εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή και την προσκόλληση των κυττάρων, η πρωτεϊνική κινάση Α, RhoA, ιντεγκρίνες, ILK, ή ακτίνη κυτταροσκελετό σηματοδότηση μορίων (Σχήμα S2B). Επιπλέον, η ανάλυση των αλληλεπιδράσεων γονίδιο-γονίδιο καθίσταται βιολογικά δίκτυα που χαρακτηρίζουν τον πληθυσμό CTC από ασθενείς mCRC. Μεταξύ αυτών, ο καρκίνος και η κυτταρική κίνηση και μορφολογία βρέθηκαν να είναι οι κύριοι γεγονός που να σχετίζεται με ένα φαινότυπο CTC, ενώ αυτή η ερμηνεία μπορεί να ωθείται από τη σημαντική συμβολή του καρκίνου σε βάσεις δεδομένων (Εικόνα S3). Όλες αυτές οι αναλύσεις δείχνουν μια ισορροπία μεταξύ των γονιδίων υποκειμένων επιβίωση των κυττάρων, η αλληλεπίδραση με το περιβάλλον και την κυτταρική κίνηση και τις θεμελιώδεις βιολογικές διαδικασίες που πρέπει να συγκλίνουν στον πληθυσμό της CTC για την επιτυχή ανάπτυξη της μετάστασης σε CRC.

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR επικύρωση και αναγνώριση των διαγνωστικών και προγνωστικών Biomarkers

το επόμενο βήμα συμμετέχει η επικύρωση RTqPCR έντεκα γονίδια που παρουσιάζουν υψηλά ποσοστά log2 σε ασθενείς mCRC και λειτουργική συνάφεια στις βιολογικές διεργασίες που χαρακτηρίζουν τον πληθυσμό CTC σε ένα ανεξάρτητη σειρά ασθενών mCRC και ελέγχων. Η ειδική έκφραση των γονιδίων αυτών αξιολογήθηκε με σύγκριση των πληθυσμών CTC από την ομάδα των ασθενών mCRC (n = 20) με το φόντο από υγιείς μάρτυρες (n = 10), από τη στιγμή που είχε ομαλοποιηθεί σε CD45 ως δείκτης του unspecificity κατά τη διάρκεια της CTC απομόνωση. Αυτά τα γονίδια που περιλαμβάνονται ΑΡΡ, CLU και TIMP1, τα οποία συνδέονται με το κυτταρικό θάνατο και αντι-αποπτωτική δραστηριότητα? VCL, ITGB5, ΒΜΡ6 και TGFβ1, τα οποία είναι γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή και την κυτταρική μορφολογία? και TLN1, ITGB5, LIMS1, RSU1 και CD9, οι οποίες σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση. Όπως παρατηρείται στο Σχήμα 2Β (μαύρες μπάρες), το σύνολο των επιλεγμένων υποψήφια γονίδια επικυρώθηκαν σε αυτή τη νέα σειρά δειγμάτων από RTqPCR με σημαντικές διαφορές μεταξύ της ομάδας των ασθενών και της ομάδας ελέγχου (p-value & lt? 0.0001).

Είναι σημαντικό ότι, για να εξασφαλιστεί ότι η έκφραση των επιλεγμένων γονιδίων ήταν χαρακτηριστικό της CTC και όχι ένα τεχνούργημα λόγω της μεταβολής της έκφρασης του γονιδίου στα λεμφοκύτταρα σε ασθενείς με καρκίνο, η έκφραση τους συγκρίθηκε στο υπόλοιπο μη απομονωμένο κλάσμα μετά τον εμπλουτισμό CTC σε ένα σύνολο ασθενών mCRC (n = 5) και τους ελέγχους (η = 5). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β (λευκές ράβδοι), δεν βρέθηκαν διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων για τις έντεκα υποψήφια γονίδια, ενισχύοντας τους εξειδίκευση της έκφρασης στον πληθυσμό CTC. Όταν πέντε δείγματα στο CTC απομονώθηκε κλάσμα επιλέχθηκαν τυχαία, σημαντικά υψηλότερα επίπεδα βρέθηκαν σταθερά σε δείγματα mCRC, αποδεικνύοντας ότι η έλλειψη διαφορές μεταξύ ασθενών και μαρτύρων στο μη απομονωμένο κλάσμα δεν οφειλόταν σε δείγμα τεχνήματα μεγέθους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) .

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η συμμετοχή των υποψηφίων γονιδίων στο μεταστατικό δυναμικό του CTC σε CRC, η έκφραση τους συγκρίθηκε σε μια σειρά πρωτογενών καρκινωμάτων (n = 14) και των πνευμόνων (n = 7) και στο ήπαρ ( n = 7) μεταστάσεων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, όλα τα επιλεγμένα γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω σε σχέση με μεταστάσεις πρωτογενών βλαβών, με επτά από τα έντεκα γονίδια που παρουσιάζουν στατιστική σημαντικότητα. Μεταξύ αυτών, CLU και TIMP1 παρουσίασε ένα ειδικό ρύθμιση προς τα πάνω σε μετάσταση στο ήπαρ, υποδηλώνοντας έναν πιθανό ρόλο για αυτά τα γονίδια στον ιστό-ειδική ικανότητα του mCRC CTC να αποικίσουν το ήπαρ (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, τρεις από τις έντεκα επιλεγμένων γονιδίων απέδειξαν σημαντικά αυξημένη έκφραση στο μεταναστευτικό μέτωπο των πρωτογενών όγκων σε σύγκριση με το αντιστοιχισμένο μη επεμβατική επιφανειακή περιοχή, γεγονός που υποδηλώνει μια σύνδεση για την απόκτηση ενός επιθετικού φαινότυπο (Σχήμα 3C). Όλα αυτά τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν με τη στρατηγική που μοριακά προφίλ του CTC σε ασθενείς mCRC, επιβεβαιώνοντας την παρουσία του πληθυσμού CTC και την αποδοτική ανοσοαπομόνωση του CTC από ασθενείς mCRC, καθώς και την ικανότητα να χαρακτηρίσει ειδικά αυτά τα κύτταρα στο μοριακό επίπεδο.

(Α) διαφορές γονιδιακή έκφραση μεταξύ των πνευμόνων και ηπατικές μεταστάσεις από ασθενείς CRC (n = 14) και πρωτογενείς όγκους (n = 14) για τις έντεκα επικυρωμένες γονίδια. (Β) Οι διαφορές στην έκφραση γονιδίων για CLU και TIMP1 μεταξύ των πνευμόνων (n = 7) και το ήπαρ (η = 7) μεταστάσεις (Μ) σε σύγκριση με τον πρωτογενή όγκο. (C) Ειδική αυξητική ρύθμιση του TGFβ1, TIMP1 και CLU στο μεταναστευτικό μέτωπο του CRC πρωτοπαθών όγκων (n = 14) σε σύγκριση με την μη επεμβατική περιοχής (* ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01? *** Ρ & lt? 0.001).

η

Τέλος, η μοριακή προφίλ της CTC θα πρέπει να οδηγήσει στον εντοπισμό των δυνητικά αξιόπιστων βιοδεικτών για την ανίχνευση του πληθυσμού CTC από ασθενείς mCRC. Για να αξιολογηθεί αυτό το σημείο, η ακρίβεια των RTqPCR επικυρωμένων γονιδίων στην ανίχνευση της μεταστατικής νόσου αξιολογήθηκε στη σειρά των ασθενών mCRC και ελέγχων. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, το σύνολο των επικυρωμένων γονιδίων παρουσιάζονται εξαιρετική διακριτική τιμές σε όρους AUROC (τιμές που κυμαίνονται από 0,94 να 1? P-value & lt? 0,0001). Επιπλέον, και με την εξαίρεση των CD9 και TLN1, τα επιλεγμένα βιοδείκτες απέδειξε την άριστη συμπεριφορά ως δείκτες πρόβλεψης της εξέλιξης της νόσου. Τα δεδομένα αυτά εγγυώνται περαιτέρω μελέτες σε μεγάλες ομάδες ασθενών για τη χρήση αυτών των βιοδεικτών στην κλινική.

Η

Συζήτηση

Μοριακή προφίλ χρησιμοποιείται ευρέως ως μια ισχυρή στρατηγική για τον χαρακτηρισμό συγκεκριμένων τύπων όγκων, ειδικούς υποτύπους των καρκινωμάτων ή ειδικών συμβάντων που σχετίζονται με την καρκινογένεση. Εκτός από τη συμβολή στην κατανόηση των μοριακών γεγονότων που σχετίζονται με την γένεση και την εξέλιξη του καρκίνου, προφίλ έκφρασης των γονιδίων έχει οδηγήσει στην ταυτοποίηση θεραπευτικών στόχων και βιοδεικτών σε μια προσπάθεια να βελτιώσει τη διαχείριση των ασθενών με καρκίνο στο κλινικό περιβάλλον. Σε αυτό το έργο, έχουμε ως στόχο να αντιμετωπίσουμε με μια πολύ συγκεκριμένη και ελκυστική πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων που αποτελούν την αιτία της μετάστασης, τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTC). Ένας συνδυασμός της CTC ανοσοαπομονώσεως, ακριβή εξαγωγή RNA από πολύ μικρό αριθμό κυττάρων, την ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος και μαζική προφίλ γονιδιακής έκφρασης για τον χαρακτηρισμό και την ερμηνεία της βιολογίας της CTC στο μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου παρουσιάζεται εδώ. Για την επικύρωση τεχνικά αυτή τη στρατηγική, το προφίλ της CTC από ασθενείς mCRC προσεγγίστηκε αφαιρώντας το υπόβαθρο της μη ειδικής απομόνωση από μια ομάδα υγιών μαρτύρων. Η επόμενη πρόκληση είναι να συγκρίνει το προφίλ γονιδιακής έκφρασης του πληθυσμού CTC με τις πρωτογενείς CRC βλάβες και με τις εμφανείς μεταστάσεις, προκειμένου να κατανοήσουμε καλύτερα τους μηχανισμούς προσαρμογής των καρκινικών κυττάρων κατά τη διαδικασία της μετάστασης και την στιχομυθία με το περιβάλλον. Η αφαίρεση του φόντου από μια ομάδα ελέγχου ήταν, επίσης, θεωρείται ότι είναι πιο σημαντικό από ό, τι το παρασκήνιο από τους ίδιους τους ασθενείς mCRC, δεδομένου ότι θα απαιτήσει δύο γύρους απομόνωσης CTC μέσα στα ίδια δείγματα, που αντιπροσωπεύουν μια σημαντική πηγή τεχνικής αντικείμενα. Οι διαφορές στο υπόβαθρο δεν μπορούσε να αποκλεισθεί λόγω του συστημικού μεταστατική νόσο, αν και η ανάλυση του υπόλοιπου κλάσματος μετά την απομόνωση CTC δεν καθιστά καμία διαφορά εντός των επιλεγμένων γονιδίων.

Όσον αφορά ανοσοαπομόνωση, και αν και CTC εμπλουτισμό με EpCAM -συζευγμένων αντισωμάτων έχει αποδειχθεί ότι είναι ανώτερη από άλλες μεθόδους κυτταρομετρίας και μια αξιόπιστη μέθοδο για την ανίχνευση σε ασθενείς CTC mCRC [14], αυτή η διαδικασία δέσμευσης CTC έχει εγείρει κάποια συζήτηση λόγω της εξάρτησης της τεχνικής αυτής για την έκφραση του EpCAM. που περιγράφηκε αρχικά πριν από 30 χρόνια ως κυρίαρχο αντιγόνο σε ιστό καρκινώματος ανθρώπινου κόλον, θεωρείται ότι μια μειωμένη έκφραση των επιθηλιακών δεικτών λαμβάνει χώρα κατά τη διάρκεια της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) που σχετίζεται με προσβολή όγκου [15]. Σημαντικά, EpCAM είναι προφανώς αναγκαία για τη διατήρηση διακριτά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων και, ενδεχομένως, ο φαινότυπος του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων [16]. CD133 + κυττάρων, επί του παρόντος ένα από τα καλύτερα δείκτες για τον χαρακτηρισμό των βλαστικών κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και ένα ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη που συσχετίζεται με χαμηλή επιβίωση, είναι θετικές για EpCAM [17]. Παρομοίως, αντισώματα έναντι EpCAM μπορεί να στοχεύσει αποτελεσματικά παχέος ογκογενή κύτταρα [18], που προσδίδει σημαντική αξία για την EpCAM απομονωμένο πληθυσμό CTC από την άποψη της θεραπευτικής παρέμβασης. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ αποδειχθεί οριστικά την αποτελεσματική απομόνωση της CTC από ασθενείς mCRC.

Ένα κύριο επίτευγμα αυτής της εργασίας ήταν η μετάφραση της μεθόδου που περιγράφεται από Gonzalez-Roca et al. για την ακριβή προφίλ έκφρασης των πολύ μικρών πληθυσμών κυττάρων [13], σε ένα κλινικά σχετικό κυτταρικό πληθυσμό. Ολόκληρο ενίσχυση μεταγραφικό επέτρεψε τον χαρακτηρισμό του πληθυσμού CTC απομονώθηκε από μεταστατικό ασθενείς CRC σε μοριακό επίπεδο. Μέχρι σήμερα, η πλειονότητα των μελετών έχουν περιγράψει τα επίπεδα έκφρασης ενός περιορισμένου αριθμού γονιδίων σε διαφορετικούς πληθυσμούς CTC, κυρίως για σκοπούς ανίχνευσης [19], [20]. Η προσέγγιση που χρησιμοποιείται εδώ επέτρεψε τη μοριακή προφίλ της CTC από mCRC, και τον ορισμό τους ως έναν πληθυσμό κυττάρων με τεκμαίρεται μεταναστευτικών και κόλλα δυνατότητες. Αυτό είναι σύμφωνο με έναν υποπληθυσμό νεοπλασματικών κυττάρων που πρέπει να αποκτήσει μια επιθετική και διεισδυτική φαινότυπο που επιτρέπει διαχωρισμό από την πρωτογενή βλάβη, που οδηγεί στην εισβολή του περιβάλλοντος στρώματος και ενδαγγείωση τους και την επιβίωση στη ροή του αίματος. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα μπορεί επίσης να εξαγγειώνονται και εμφυτεύσουν επιτυχώς στο απώτερο στόχο ιστό για να δημιουργήσει ένα μικρομεταστάσεων [19]. Ο κατάλογος των γονιδίων φαινοτυπικά χαρακτηρίζουν τον πληθυσμό της CTC από ασθενείς mCRC περιλαμβάνει τους υποψηφίους που σχετίζονται με όλες τις ανωτέρω περιγραφείσες λειτουργίες (Σχήμα 4), δικαιολογούν περαιτέρω μελέτες για να καθορίσουν επιπτώσεις τους στην μεταστατική συμπεριφορά του πληθυσμού CTC στο CRC. Τα γονίδια όπως VCL, ITGB5, ΒΜΡ6 ή TGFβ1 έχουν συσχετισθεί με την απόκτηση μιας επεμβατικής φαινότυπο [8], [21], [22], εν μέρει μέσω της EMT. Ομοίως, TLN1, APP, CD9, LIMS1 και RSU1 έχουν σχέση με την προσκόλληση και τη μετανάστευση, με CD9 διαμορφώνοντας τον εντοπισμό των TLN1, μια κρίσιμη ρυθμιστής της ενεργοποίησης ιντεγκρίνης, με εστιακό συμφύσεις [23], ή LIMS1 που σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση και ιντεγκρίνης σηματοδότηση, και, ειδικότερα, με RSU1 και της οδού της Ras κατά τη μετανάστευση των κυττάρων [24]. Ένα βασικό βήμα στη διαδικασία της διάδοσης του καρκίνου είναι η ικανότητα να μεταναστεύουν και να προχωρήσει προς και intravasate κοντά τριχοειδή αγγεία του αίματος. Μόλις στην κυκλοφορία, CTC πρέπει να ξεπεράσει το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή με την ενίσχυση της αντίστασης απόπτωση τους, μεταξύ άλλων μηχανισμών. Γονίδια όπως TIMP1 και CLU είναι βασικά μόρια που σχετίζονται με αυτή τη διαδικασία [25]. Είναι ενδιαφέρον, TIMP1 έχει συνδεθεί με τη διαδικασία της αντίστασης anoikis σε διαφορετικά μοντέλα καρκίνου, που επιτρέπει την διαφυγή του κυτταρικού θανάτου σε απουσία αγκύρωσης υποστρώματος [26]. Κατά την επίτευξη όργανο-στόχο, CTC πρέπει να είναι σε θέση να εξαγγειώνονται και σχηματίζουν αποικίες, και CD9 έχει περιγραφεί ως κρίσιμη για την διαδικασία της εμφύτευσης και μικρομεταστάσεων σχηματισμός που σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά των βλαστοκυττάρων, η οποία σχετίζεται με αυτά τα γεγονότα [27]. Είναι ενδιαφέρον, μια σημαντική επικάλυψη βρέθηκε με ένα συκώτι-ειδική μετάσταση υπογραφή στο CRC [28] (βλέπε πίνακα S4), γεγονός που υποδηλώνει μια ενεργή εμπλοκή στο δυναμικό τροπισμό και μικρομεταστάσεων της CTC σε αυτό το όργανο στο CRC. Ειδικότερα, και σύμφωνα με την συσχέτιση της έκφρασης TIMP1 στη CTC και μετάσταση ήπατος, έχει περιγραφεί ως ρυθμιστής του ήπατος μικροπεριβάλλον, αυξάνοντας την ευαισθησία αυτού του οργάνου σε κύτταρα όγκου [29]. Συνολικά, η συμμετοχή των επιλεγμένων γονιδίων στις ικανότητες μετάσταση της CTC έχει επίσης ενισχυθεί με τη ρύθμιση τους στον πνεύμονα και το συκώτι μεταστάσεις σε σύγκριση με πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνωμα.

In vitro

πρωτογενείς καλλιέργειες της CTC και

in vivo

μοντέλα για CTC στο CRC θα δώσει σίγουρα ερευνητές με αδιάσειστες αποδείξεις για την επικύρωση του ρόλου των γονιδίων αυτών στην ικανότητα της CTC για να δημιουργήσει μικρομεταστάσεων, και να καθορισμό στρατηγικών που στοχεύουν ειδικά τον πληθυσμό αυτό των μεταστατικών CTC.

από το προκύπτον σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών, μερικές από τις πιο σημαντικές γονίδια έδειξε σε σχέση με ορισμένα χαρακτηριστικά της διαδικασίας της μετάστασης.

η

Ομοίως, από την άποψη της βιοδείκτες για τη διαχείριση των ασθενών mCRC, το μοριακό προφίλ του CTC από ασθενείς mCRC καθίστανται πολύτιμα εργαλεία για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό της μεταστατικής νόσου, καθώς επίσης και για την πρόβλεψη της εξέλιξης της νόσου. Η υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία αποδεικνύεται από τις προαναφερόμενες επικυρωμένων γονιδίων στον πληθυσμό CTC από ασθενείς mCRC εγγυάται την μελέτη αυτών των βιοδεικτών στην αξιολόγηση των θεραπευτικών αποκρίσεων ή στην επιλογή των ασθενών για στοχευμένες θεραπείες.

Εν κατακλείδι, Αυτή η μελέτη περιγράφεται, στη γνώση μας, η πρώτη εξειδικευμένη μοριακή προφίλ της CTC που απομονώθηκαν από ασθενείς mCRC. Αυτή η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης εφαρμόστηκε στο χαρακτηρισμό αυτού του συγκεκριμένου πληθυσμού με υποτιθέμενη κόλλα, μεταναστευτικά και επεμβατικές δυνατότητες, καθώς και ένα διαμορφωμένο απόκριση σε κυτταρικό θάνατο για την επιτυχή ολοκλήρωση της διαδικασίας της μετάστασης. Επιπλέον, ο προσδιορισμός των θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν ειδικά τον πληθυσμό CTC θα πρέπει να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα στην εξάλειψη και την πρόληψη του CRC μετάσταση, ενώ ένα οπλοστάσιο των πολύ συγκεκριμένο και ευαίσθητο πολύτιμο δείκτες θα πρέπει να έχει αντίκτυπο στη διαχείριση και την παρακολούθηση της CRC ασθενείς με μεταστατικό.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Όλοι οι συμμετέχοντες υπέγραψαν μια ενημερωμένη συγκατάθεση ειδικά εγκεκριμένο για αυτή τη μελέτη από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Complexo HOSPITALARIO Universitario του Σαντιάγκο ντε Κομποστέλα (κωδικός έγκρισης: 2009/289). Τα κριτήρια ένταξης για τους ασθενείς mCRC ήταν η παρουσία μετρήσιμων mCRC και κατάσταση απόδοσης Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) όχι μεγαλύτερη από 2. υγιείς μάρτυρες με την απουσία ενός προηγούμενου επεισοδίου καρκίνο και μια εποχή ταιριάζουν με επιλέχθηκαν ασθενείς. Λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τους ασθενείς που περιλαμβάνονται στην ανάλυση είναι διαθέσιμη στον πίνακα S1.

CTC ανοσοαπομονώσεως

CTC απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ CELLection ™ Επιθηλιακός Εμπλουτίστε (Invitrogen, Dynal) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Εν συντομία, 7,5 mL αίματος από ασθενείς mCRC και υγιείς μάρτυρες επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C με 100 μΙ μαγνητικών σφαιριδίων. Μετά το πλύσιμο, CTC συζευγμένο με μαγνητικά σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν άμεσα σε 100 μΐ διαλύματος RNAlater® (Ambion) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι σε επεξεργασία για εξαγωγή RNA.

Γονιδιακής Έκφρασης Ανάλυση

Ολικό RNA από CTC εκχυλίστηκε με το ιικό RNA QIAmp μίνι κιτ (Qiagen), που έχει σχεδιαστεί ειδικά για τα δείγματα πολύ χαμηλή κυτταροβρίθεια. Το καθαρισμένο RNA ήταν δίπλα υποβάλλεται σε ολόκληρο αντίδραση ενίσχυσης μεταγραφικό (WTA2, Sigma Aldrich), Cy3 σημασμένο και υβριδοποιήθηκε επί Agilent 4 × 44 k συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης. επεξεργασία σήματος και φιλτραρίσματος καθώς και η ανάλυση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης περιγράφονται λεπτομερώς στο συμπληρωματικό υλικό. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης είναι προσβάσιμη στο Expression NCBI γονίδιο Omnibus (GEO) βάση δεδομένων (Αριθμός Προσχώρησης: GSE31023).

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR Επικύρωση

RTqPCR επικύρωση πραγματοποιήθηκε σε ένα ανεξάρτητο σύνολο 10 υγιείς μάρτυρες και 20 σταδίου IV ασθενείς με μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο (βλέπε πίνακα S1). CTC απομονώθηκαν όπως περιγράφεται και RNA καθαρίστηκε με ένα φορέα RNA για να βελτιώσει την απόδοση και τη σταθερότητα. cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας χημεία SuperScriptIII (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Την περαιτέρω βελτιστοποίηση της ευαισθησίας ανίχνευσης, πραγματοποιήσαμε ένα βήμα προενίσχυση με τη χρήση του κιτ TaqMan® προενισχυτή Master Mix (Applied Biosystems) με 14 κύκλους αντίδρασης. Προενισχυμένες προϊόντα υποβλήθηκαν σε TaqMan® πραγματικού χρόνου PCR ενίσχυση για έντεκα υποψήφια γονίδια (βλέπε Πίνακα S3 για λεπτομέρειες προσδιορισμού).

Επιπλέον, αξιολογήθηκε με RTqPCR τα επίπεδα έκφρασης των υποψήφια γονίδια στο κυτταρικό κλάσμα που απομένει κατά CTC ανοσοαπομονώσεως, σε 5 ασθενείς mCRC και 5 υγιείς μάρτυρες. Εν συντομία, πραγματοποιήσαμε ένα κόκκινο λύσεως αίμα στο κλάσμα που απομένει μετά την επώαση EpCAM ανοσο-σφαιριδίων και απομόνωση CTC, και το RNA καθαρίστηκε από τα υπόλοιπα εμπύρηνων κυττάρων του αίματος με το κιτ RNeasy μίνι (Qiagen). ποσότητα RNA και η καθαρότητα εκτιμήθηκε με μέτρηση NanoDrop, cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας MuLV σύστημα ανάστροφης μεταγραφάσης (Applied Biosystems) και TaqMan® qPCR διεξήχθη για τα έντεκα υποψήφια γονίδια.

Οι τιμές έκφρασης για κάθε γονίδιο κανονικοποιήθηκαν σε CD45 ως ένας δείκτης της μη ειδικής απομόνωσης. Διπλώστε διαφορές αλλαγή μεταξύ ασθενών και μαρτύρων αναλύθηκαν στατιστικά με το λογισμικό GraphPad Prism, εφαρμόζοντας το μη-παραμετρικό t-test Mann-Whitney και εξετάζει μια τιμή p & lt?. 0.05 ως σημαντική

Γονιδιακής Έκφρασης Ανάλυση σε πρωτοπαθείς όγκους και μεταστάσεις

Δημοτικό ορθοκολικό καρκίνωμα (n = 14) και μετάσταση (μετάσταση στο ήπαρ, n = 7? πνεύμονα μεταστάσεις, n = 7) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία από το Τμήμα Παθολογίας του Complexo HOSPITALARIO Universitario του Σαντιάγο ντε Κομποστέλα. Η επιφανειακή μη επεμβατική ζώνη και η βαθιά επεμβατική έκταση των πρωτογενών όγκων υποβλήθηκαν μακροσκοπικά ανατομή, εξασφαλίζοντας παρόμοια ποσοστά όγκου. RNA καθαρίστηκε (αντιδραστήριο TRIZOL, Invitrogen? RNeasy kit, Qiagen), συντέθηκε cDNA (MuLV αντίστροφη μεταγραφάση, Applied Biosystems), και γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε (TaqMan RTqPCR, Applied Biosystems). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με την έκφραση στο επιφανειακό μη επεμβατική περιοχή. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Μη-παραμετρικές Mann-Whitney t-test χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική σημαντικότητα θεωρώντας τιμή p & lt?. 0.05

Η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUROC) και Kaplan-Meier ανάλυση

Η ακρίβεια της τα έντεκα υποψήφια γονίδια ως βιοδεικτών για τη διάγνωση αξιολογήθηκε με καμπύλες ROC, ενώ οι καμπύλες Kaplan-Meier χτίστηκαν για την αξιολόγησή τους ως δείκτες για την πρόγνωση. Αποκοπής τιμές ορίστηκαν ως οι καλύτεροι-fit τιμές για κάθε δείκτη. Ασθενείς Επιβίωση Χωρίς Εξέλιξη φορές είχαν καθιερωθεί ως ο χρόνος που μεσολάβησε μεταξύ της έναρξης της γραμμής χημειοθεραπεία και την εξέλιξη της νόσου αξιολογήθηκε από την απεικόνιση, ή ασθενής νεκρός από οποιαδήποτε αιτία.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Εκπρόσωπος εικόνες των επιθηλιακών κυττάρων που απομονώνονται από το αίμα mCRC ασθενούς.